Mutations 13 NOV 2014.ppt [Mode de compatibilité] · de la prolifération cellulaire Pr. A. CALENDER - 2014. 07/12/2014 7 Loss of heterozygosity with polymorphic markers surrounding

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Pr. A. CALENDER - 2014


Toute variation de séquence est MUTATION, susceptible de conduire à l’expressiond’une protéine anormale ou une NON expression de celle-ci et de ce fait à une maladie

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http://www.hgvs.org/


General recommandations


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HGVS General recommandations (1)


Description of a variant should be preceded by a letter indicating the type of referencesequence used. Several different reference sequences can be used

• "c." for a coding DNA sequence (like c.76A>T)• "g." for a genomic sequence (like g.476A>T)• "m." for a mitochondrial sequence (like m.8993T>C)

• "n" for a non-coding RNA reference sequence (gene producing an RNA transcriptbut not a protein)

• "r." for an RNA sequence (like r.76a>u)• "p." for a protein sequence (like p.Lys76Asn)

DNA-levelin capitals, starting with a number referring to the firstnucleotide affected (like c.76A>T or g.476A>T)RNA-levelin lower-case, starting with a number referring to thefirst nucleotide affected (like r.76a>u)protein levelin capitals, starting with a letter referring to first theamino acid affected (like p.Lys76Asn)

Alanine Ala ACysteine Cys CAspartic AciD Asp DGlutamic Acid Glu EPhenylalanine Phe FGlycine Gly G HistidineHis H Isoleucine Ile ILysine Lys KLeucine Leu LMethionine Met MAsparagiNe Asn NProline Pro PGlutamine Gln QARginine Arg RSerine Ser SThreonine Thr TValine Val VTryptophan Trp WTYrosine Tyr Y


Coding DNA Reference Sequence

• there is no nucleotide 0

• nucleotide 1 is the A of the ATG-translation initiation codon

• the nucleotide 5' of the ATG-translation initiation codon is -1

• the nucleotide 3' of the translation stop codon is *1

• Intronic nucleotides

• beginning of the intron; the number of the last nucleotide of the preceding exon,a plus sign and the position in the intron, like c.77+1G, c.77+2T, etc.• end of the intron; the number of the first nucleotide of the following exon, aminus sign and the position upstream in the intron, like c.78-1G.• in the middle of the intron, numbering changes from "c.77+.." to "c.78-.."; forintrons with an uneven number of nucleotides the central nucleotide is the lastdescribed with a "+"


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Specific changes

• ">" indicates a substitution at DNA level (like c.76A>T)

• "_" (underscore) indicates a range of affected residues, separating the first and last residue affected

(like c.76_78delACT)

• "del" indicates a deletion (like c.76delA)

• "dup" indicates a duplication (like c.76dupA); duplicating insertions are described as duplications,

not as insertions; ACTTTGTGCC to ACTTTGTGGCC is described as c.8dupG

• "ins" indicates a insertion (like c.76_77insG)

• "inv" indicates an inversion (like c.76_83inv)

• "con" indicates a conversion (like c.123_678 con « MEN1 »)



Elles génèrent un codon STOP parmiles 3 possibles dans le système universeldu code génétique soit TAA, TGA ou TAG

Nomenclature

c. ou g.1624 C >T p.Gln542terp.Q542X

Une substitution d’une base a pourconséquence le changement de la signification

en amino acide du codon

Nomenclature

c. ou g.1324 A >C p.His542Prop.H542P

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Il peut s’agir de délétion (del), d’insertion (ins), deduplications (non multiples de 3) ou de

réarrangements plus complexes

c.924 ins Cg.1484 delGc.1213_1231del17pbg.692_693del / c.92_93del

Nomenclature

Les mutations “frameshift” aboutissentgénéralement à un codon STOP prématuré situé plusou moins loin en aval de la délétion ou de l’insertion


c.924 ins AAA ou c.924 ins 3bpg.2484 ins AAAp.312insLys

Nomenclature

Les mutations ‘dites’ en phase ne modifient pas en théorie le cadre de lecture, car basées sur une délétion ouinsertion d’un nombre “multiple de 3” de bases. Cela est vrai pour les petites insertions ou délétions, mais plus pour

les anomalies de grande taille (+ de 12 bp ??) car l’ajout ou la disparition d’un grand nombre d’acides aminés peutmodifier la structure de la protéine et induire une dégradation active de celle-ci (perte d’expression)

ATG CCC GAA GTGTAC GGG CTT CACM P E V

ATG AAA CCC GAA GTGTAC TTT GGG CTT CACM K P E V

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Ex: intra exonic deletion of the MeCP2 gene in RETT syndrome - MeCP2 DEL (exon4)

Pièges du diagnostic en biologie moléculaire (PCR), ces délétions doivent être envisagées dans lesmaladies avec haplo-insuffisance dès lors que les recherches conventionnelles en séquençage

s’avèrent négatives, notamment dans les exons


Nombre de loci, outre ceux liés au chromosome X peuvent se retrouver en hémizygotie dufait de la délétion du second allèle, notamment dans les génomes des tumeurs

PERTE D’HETEROZYGOTIE

Caractéristique retrouvée (analysée) au niveau des gènes impliqués dans lescancers et dont la fonction physiologique est la régulation physiologique négative

de la prolifération cellulairePr. A. CALENDER - 2014

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Loss of heterozygosity with polymorphic markerssurrounding the MEN1 locus in 11q13 suggests that

MEN1 is a growth suppressor gene (Knudson)

PYGM ‘caga’ repeatLocated 70 Kb downstream

of MEN1



MEN1 gene

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MUTATIONS PONCTUELLES DES SITES D’EPISSAGE (1)

Elles surviennent aux jonctions EXON-INTRON et INTRON-EXON constituées de 2 basesconsensus présentes chez tous les organismes supérieurs :

- EXONS-INTRON : site donneur GT- INTRON-EXON : site accepteur AG

L’analyse de l’ARNm est le seul moyen de confirmer l’effet fonctionnel de ces mutations : excisionaberrante de tout ou partie de l’exon pour les altérations Du site donneur, rétention partielle del’intron pour le site accepteur, ou toute autre modification conditionnée par les sites cryptiques

d’épissage adjacents

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MUTATIONS PONCTUELLES DES SITES D’EPISSAGE (2)

L’épissage n’est pas un phénomène passif mais controlé par le spliceosome, complexede proteines régulatrices et de snRNA (small RNA)

Il est possible que des mutations ponctuelles situées au delà des sites DONNEUR etACCEPTEUR puissent influer le phénomène d’épissage

Ex : mutation ponctuelle située au milieu d’un intron peut modifier une séquenceconsensus de fixation d’un facteur d’épissage

Nomenclature

N° nucléotide extrême de l’exon - IVS +/- nbre nucléotides > Nucléot.1>nucléot.2

c.612 ivs12+1 G > A

c.613 ivs12-2 A > C

EXON 12 EXON 13

Intron 12

GT AG

+ -

Nombre des mutations de type NON SENS, en décalage de cadre de lecture aveccodon STOP prématuré, et probablement des sites donneurs / accepteurs

d ’épissage confèrent à l ’ARN messager une conformation qui pourrait stimuler leprocessus de ‘ mRNA decay ’


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MUTATIONS « DYNAMIQUES » (1)

Maladies par expansion de “triplets”

EPM : épilepsie myocloniqueFRAXA : retard mental lié à l’X-fragileFRDA : ataxie de FriedreichHD : maladie de HuntingtonSCA(…) : ataxie spinocérébélleuses 1-7DM : dystrophie myotonique de Steinert

Ces séquences sont susceptibles de se déstabiliser par“slippage” et l’amplification anormale est à l’origine desyndrome cliniques graves


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MUTATIONS « DYNAMIQUES » (2)

normales malades

Nbre de répétitions

Maladies Séquence

11-34 40-200Huntington’s diseaseGène HD

CAG

6-54 200-1300Syndrome de l’X Fragilegène FMR-1

CGG

Maladies par expansion de “triplets”

Fils atteint

Normal


EFFETS FONCTIONNELS DES MUTATIONS EN FONCTION DELEUR POSITION DANS LE GENE (1)

Régions promotrices - 5’

D D

Région 3’ UTR

Gène

Exons Introns

Mutations dans les sites régulateurs / promoteurs

Sous expression du gène (méthylation, mutation affectant un siteconsensus de fixation du complexe d’initiation)

Fusion-dérégulation dans les réarrangement du type translocation,inversion, délétion ...


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D D

Région 3’ UTR

Gène

Exons Introns

Mutations exoniques

Modification de la signification d’un aa avec induction d’effet dominant-négatif et/oumodification de substrat et /ou déviation métabolique

Truncations proteiques (effet délétère)

Effet de délocalisation intra-cellulaire de la protéine (F508 dans CFTR)

Effet de la maturation et/ou stabilité post-transcriptionnelle et/oupost-traductionnelle


Mutations des sites d’épissage et intronique

Inactivation d’un site donneur d’épissage avec lecture “traductionnelle” d’un intron

Inactivation d’un site donneur ou accepteur d’épissage avec excision aberrante d’un exon

Activation d’un site cryptique d’épissage avec gain ou perte d’une séquence codante(ivs1-110G>A de la -globine)



D D

Région 3’ UTR

Gène

Exons Introns


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D D

Région 3’ UTR

Gène

Exons Introns

Mutations des sites régulateurs en 3’ (mal connus)

Altération du codon de terminaison et élongation protéiqueanormale (Hb constant spring TAA > CAA)

Altérations des signaux de polyadénylation > instabilité de l’ARNm


EFFETS FONCTIONNELS DES MUTATIONS ENFONCTION DE LEUR POSITION DANS LE GENE (5)


D D

Région 3’ UTR

Gène

Exons Introns

Mutations extra-géniques ou effets trans

Mal identifiées, il s’agit de mutations intervenant sur un gène ou uneséquence proche ou distante du gène de la maladie et influant pareffet “trans” sur celui-ci. Ex : Méthylation de la région FRAXA > FMR-2 associées > Retard mentaux


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Techniques de biologiemoléculaire utilisées dans

un cadre diagnostique

Pr. A. CALENDER – Jeudi 8 novembre 2012

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Introduction

Diagnostic clinique

Confirmation par l’analyse génétique

Traitement et suivi adapté Étude des apparentés

Exclusiondesapparentésnonporteurs dela mutation

Traitement etsuivi adapté etprécoce desapparentésporteurs de lamutation

Analyses génétiques

Etude du génome

Cytogénétique conventionnelle« Etude à l’échelle du chromosome »Etude du caryotypeFish …

Biologie moléculaire« Etude à l’échelle du nucléotide »SéquençagedHPLC, HRMMultiplex

Cytogénétique moléculaireCGH array

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Diagnostic génétique

Recherche d'anomalies au niveau de l'ADNgénomique des patients.

Anomalie pathogène → diagnostic etsuivi du patient

Variant non classifié → nécessité de testfonctionnel afin d'évaluer son caractèrepathogène

Biologie moléculaire

• Mutation de petite taille :

– Mutation ponctuelle

– Délétion / duplication /insertion de petite taille

• Grands réarrangements :

– Délétion/duplication totale d’un gène

– Délétion / duplication d’un ou plusieurs exons

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Plan

• Recherche de mutation de petite taille– Techniques de criblage

• Technique dHPLC• Technique HRM

– Technique de Confirmation = Séquençage

• Classification des variants– Analyse In silico– Analyse ARNm

• Techniques quantitatives et semi-quantitatives– PCR en temps réels

• Fluorophore lié à ADN double brin• Hydrolyse de sondes

– Techniques de recherche des grands réarrangements• MLPA• MPLC

Techniques de criblage

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Méthodes de criblage

QUAND?

• Pour les gènes de grande taille

• Pour les pathologies avec de nombreux patients

POURQUOI?

• Analyse plus rapide

• Lecture et analyse des résultats plus facile

• Gain de temps technique

• Gain sur les coûts de réactifs

Gène d’intérêt

Principe de formation des Hétéroduplexes 1/2

Amplification par PCRà partir d’amorcesspécifiques

Dénaturation de l’ADNdouble brin parChauffage à 95°C

Variant génétique

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Renaturation en ADN double brinpar refroidissement progressif

Homoduplexes

Principe de formation des Hétéroduplexes 2/2

Hétéroduplexes

Mésappariements

Conditions d’obtention des hétéroduplexes

• PCR très spécifique :

– Taq Polymerase proofreading

– protocole PCR Touchdown

• Analyses par comparaison entre deuxrésultats

• Propriétés thermiques différentes deshomoduplexes:

– dHPLC: Température d’analyse spécifique

– HRM: Courbe de dénaturation

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Technique dHPLC

• dHPLC: denaturing Hight PerformanceLiquid Chromatography

• Développée depuis 2000

• Un seul fournisseur : Transgenomic®

• Plusieurs conditions d’utilisation:– Dénaturantes (80°C) (simple-brin)

– Non dénaturantes (50°C) (double-brins)

– Semi dénaturantes (double-brins)

Principe de la technique dHPLC 1/2

Rétention sur Colonne dHPLC des acides nucléiques

Phase mobile:TEAA et ACN

Interactionhydrophobeentre PS-DVBet TEAA

PhaseStationnaire:PS-DVB

Interactionionique entreTEAA etADN

PS-DVB Phase stationnaire

PS-DVB

Homoduplexe Hétéroduplexe

Flot Flot

Flot dePhasemobile

Flot dePhasemobile

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Principe de la technique dHPLC 2/2

Élution des mésappariements et des homoduplexes

Augmentationprogressive dela concentrationen ACN

Élution ensecond deshomoduplexes

PS-DVB

ACN

ACN

ACN

ACN

Flot Flot

Flot Flot

ACN

ACN

Élution enpremier deshétéroduplexes

Appareils de dHPLC

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Principe de l’appareil dHPLC

• Chromatographieliquide

• Comme les HPLCclassique

• Phase solidespécifique aux acidesnucléiques

INJECTION

RETENTIONSEPARATION

DETECTION

Résultats dHPLC 1/2

A T C GA TCG

Hétéroduplexes Homoduplexes

Détection desADN par UV

Analyseinformatique

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Résultats dHPLC 2/2

• Analyse par comparaison avec le profil d’unéchantillon non atteint

• Choix des paramètres d’analyses très délicat

Avantages et inconvénients de la dHPLC

• Mise au point délicate (PCR et technique)

• Maintenance importante

• Analyse nécessite expérience de l’opérateur

• Pas de reproductibilité parfaite

• Très bonne sensibilité

• Préparation rapide

• Lecture rapide

• Appareil semi-automatique

• Plusieurs applications possibles

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Applications dHPLC

• Genotypage

• Criblage de mutations

• Gene mapping (par génotypage multiple)

• Détection de méthylation (après traitementau bisulfite)

Technique HRM

• HRM: Hight Resolution Melting

• Développée depuis 2003

• Plusieurs fournisseurs

• Mesure d’une fluorescence émise par desfluorophores (dyes)

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Appareils de HRM

Principe et caractéristiques duRotorGene Q

Gamme detempérature

25 - 99°C

Vitesse detempérature

+/- 2,5°C

Précision detempérature

+/- 0,02 °C

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Étapes

• Amplification en présence d’un fluorophoreintercalant l’ADN

• Formation des hétéroduplexes

• Dénaturation de l’amplicon avec mesurede la fluorescence en temps réel

• Analyse des courbes de fusion obtenues

Nécessité de dyes saturants

Dyes nonsaturants

Dyessaturants

Réincorporationdu dye

Fluorescencenon linéaire à lacourbe dedénaturation desADN

Réincorporation impossible Linéarité entre fluorescence et courbede dénaturation des ADN

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Principe de la HRM

1

2

3

Fluorescenceen %

Dye émet de la fluorescence quand:

•Incorporation sur ADN double-brins

•Excitation par une source d’énergie

ADN se dénature Relargage du dye Fin de la fluorescence

Températureen °C

Courbes de visualisation

des résultats 1/4

Courbes de fusion brutes

Permettent de voir:• Homogénéité entres les courbes• PCR inefficaces• Vérification « Blanc de PCR »

Standardisation de la fluorescence parrapport à la valeur la plus forte

Résultats sous forme de %

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Courbes dérivées

Permettent de :• Voir la spécificité de la PCR• Placer les fenêtres denormalisation

Courbes de visualisationdes résultats 2/4

Courbes normalisées


des résultats 3/4

• Obtenues aprèsnormalisation

• Permettent de comparerles courbes entres elles

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Courbes des différences


des résultats 4/4

Obtenues par comparaisoninformatique point par pointavec une ou plusieurscourbes de référence

Permettent de comparerles courbes avec uneréférence connue(généralement le WT)

Variant 1

Variant 2Variant 3

Résultats HRM

Dérivé mathématique des courbesnormalisées par rapport à une courbede référence

Analyse par comparaison avec le profil d’unéchantillon non atteint

Variant 1

Variant 2

Variant 3

Normalisation des courbes :mise à niveau des intensitésdes courbes

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Avantages et inconvénients de la HRM

• Très bonne sensibilité

• Lecture rapide

• Préparation rapide

• Maintenance simple

• Cadence importante

• Mise au point PCR délicate

• Analyse nécessite expérience de l’opérateur

• Moins performant sur fragments >300pb

• Appareils non polyvalents

Applications HRM

• Genotypage

• Criblage de mutations

• Diagnostic microbiologique

• Quantification ARN

• Etude de la compatibilité HLA

• Détection de méthylation (après traitement aubisulfite)

• Contrôle de l’amplification PCR

• Caractérisation de clones

• Détection d’hétéroplasmie de l’ADN mitochondrial

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Séquençage

Séquençage direct

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Principe séquençage 1/3

Cible et amplification de la région à étudier par PCR puis séquençage


Au vue du nombre de copie, au final, statistiquement, toutes les bases sont marquées

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Séquenceurs 1/2

Séquenceur à 16 capillaires =16échantillons en même temps

Électrophorèse des fragments d’ADN dansun tube très fin (=capillaire) remplit de geld’acrylamide (=polymère)

Migration des fragments ADN chargé (–)grâce à leur phosphate vers l’electrode (+)

Détection par excitation au laser desfluorophores couplés aux ddNTP

Conversion des longueurs d’onde lues endonnées biologiques (1 longueur d’onde = 1nucléotide)

Séquenceurs 2/2

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Fonctionnement du séquenceurcapillaire 1/3


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Injection électrocinétique


Nappe decapillaires

Sens de l’electrophorèse

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Détection du signal 2/2

Détection du signal 1/2

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• Pour connaître la séquence des ADN, on fait synthétiser un brin d'ADN parune enzyme spécifique.

• L'enzyme commence son travail à partir de l'extrémité 3' d'une sondehybridée qui sert d'amorce. Elle ajoute des nucléotides complémentaires de ceuxdu brin d'ADN qu'elle copie.

• On lui donne pour substrats des désoxynucléotides triphosphates normauxmélangés avec des didésoxynucléotides dont la fonction alcool secondaire en 3'est réduite ce qui empêche la synthèse de se poursuivre au delà.

• Les didésoxynucléotides incorporés en dernier sont marqués spécifiquementpar des molécules fluorescentes (vert pour didésoxyA, bleu pour didésoxyC,jaune pour didésoxyG et rouge pour didésoxyT)

• On sépare ensuite les fragments synthétisés dans un champ électrique(électrophorèse : les ADN sont des anions, ils vont donc vers le pôle +), enfonction de leur longueur (les plus petits vont plus vite).

• On lit ensuite les taches successives, identifiées par leur couleur, ce qui révèlela séquence des fragments synthétisés.

Résultats du séquenceur

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Résultats du séquençage

Substitutionhétérozygotte

Substitutionhomozygotte

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Délétionhétérozygotte

Limites du séquençage 1/2

• On ne trouve que ce que l’on cherche

• Délétions ou duplications non mises en évidence

Exon 3

Exon 3

Allèle 1

Allèle 2

Zone étudiée

Exon 3Allèle 1

Allèle 2

Zone étudiée

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Limites du séquençage 2/2

• Mosaïques difficilement détectables

• Coûteux et très longs

Classification des variants

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Diagnostic des modifications non classifiées

• Sont considérées comme mutations pathogènes :

– Codon stop (décalage du cadre de lecture ou substitution)

– Variation au niveau des sites consensus d’épissage (10%

des mutations)

– Variation de novo

– Modification déjà décrite comme pathogène dans lalittérature.

• Problèmes :

– Séquençage principalement des séquences codantes etdes jonctions introns-exons.

– Comment considérer une modification non classifiée?

Exemples de variants non classifiés

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

c.30G>T p.L10L c.1314C>T p.T438TSilent/

PM

c.1-22C>Ac.1-16G>Ac.1-10G>A

UpstreamATG

Deepintronic

c.600C>T p.G200G

c.654+55delC

c.654+82C>T

c.825-41C>T

ATG TGA

Gène MEN1 : - 10 exons- exon 1 non codant- début de l’exon 2 non codant.

Effet potentiel sur le processus d’épissage

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Rappel des bases de l’épissage

Baralle &Baralle, J Med Genet, 2005

ARNprémessager

ARNm

Site donneurSite de

branchementSite accepteur

Rappel des bases de l’épissage

Wang & Cooper, Nature Reviews Genetics, 2007

Autres séquences consensus jouant un rôle dans l’épissage :• ESE (exonic splicing enhancer)• ESS (exonic splicing silencer)• ISE (intronic splicing enhancer)• ISS (intronic splicing silencer)

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Mutations pouvant avoir un effet surl’épissage

Tous les variants peuvent potentiellementaffecter l’épissage

• Variants des sites consensus d’épissage (exonou intron)

• Variants introniques ou exoniques hors des sitesconsensus d’épissage

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Conséquences des variants sur le mécanismed’épissage

Houdayer & Stoppa-Lyonnet, med & sci, 2005

Conséquences des variants sur le mécanismed’épissage

Ars et al., hum mol genet, 2000

Gène NF1 : ~50% des mutations affectent le processus d’épissage

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Techniques d’étude des anomaliesd’épissage

• Analyse de l’ADN génomique

• Analyse in silico

• Analyse de l’ARNm

Analyse de l’ADN génomique

• Séquençage de l’ADN :

– Parties codantes

– Jonctions intron-exon.

• Avantages :

– Robustesse de la molécule d’ADN

– Facilité de l’extraction

– Systématisation des techniques de séquençage.

• Inconvénients :

– Anomalies hors zones séquencées non détectées

– Difficulté d’interprétation de certaines modifications(30% pour BRCA1).

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Analyses in silico

• Matrices permettant d’identifier les sites régulateursde l'épissage :

– Splice Site Prediction (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)

– MaxEntScan(http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html)

– GeneSplicer (http://www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html)

– Splice Site Finder (http://www.genet.sickkids.on.ca/~ali/splicesitefinder.html)

– ESE Finder (http://www.exon.cshl.org/ESE/index.html)

– Rescue ESE (http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-exe/)

– Human Splicing Finder (http://www.umd.be/HSF) .

• Avantages :

– Screening informatique rapide.


– Relativement efficaces pour les modifications des sitesconsensus d’épissage

– Insuffisante pour les autres modifications.

Analyse de l’ARNm

• Méthodes d’analyse de l’ARN:

– Analyse directe de l’ARNm

– Utilisation de la technique des minigènes.

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Analyse directe de l’ARNm

Patient Témoin

• Technique d'étude :

– Extraction d'ARN total issu de sangou de cellules d’une lignéelymphoblastoïde établie à partir dusang du patient

– Reverse transcription de l'ARNm enADNc puis amplification par PCR

– Dépôt sur gel d’agarose afin dedétecter un (ou des) ADNc detaille(s) anormale(s)

– Séquençage des ADNc de tailleanormale.


Contrôle Exon 8Exon 7

Exon 8Patient Intron 7

149 nucléotides

Exon 7

La substitution d'un nucléotide du site donneur d'épissageentraîne la rétention de l'intron.

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• Avantages :

– Puissance diagnostique de l’ARNm

– Si l’ARNm est disponible, technique envisageable dansun laboratoire de diagnostic.


– Fragilité de l’ARNm

– Impossible si le prélèvement est dégradé ou lorsd’envoi d’ADN déjà extrait

– Nécessité d’établir des lignées lymphoblastoïdes danscertains cas.

Analyse de l’ARNm par la technique desminigènes 1/2

• PCR du fragment d’intérêt à partir de l’ADN du patient

• Les amorces avec sites de clivage d’enzymes de restriction

• clonage dans un vecteur d’expression (pcDNA, pcINeo…).

Tournier et al., Hum Mutat, 2008

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Analyse de l’ARNm par la technique desminigènes 2/2


•Transformation de bactériespour l’amplification du vecteur

•Extraction de l’ADNplasmidique à partir desbactéries

•Transfection transitoire(HeLa, HEK293…)

• Extraction de l’ARNm

• Analyse par RT-PCR.

Analyse de l’ARNm par la technique desminigènes

• Avantages :

– Robustesse de l’ADN

– Puissance diagnostique de l’ARN.


– Technique longue

– Génération d’OGM

– Actuellement non envisageable dans un laboratoire dediagnostic.

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Classification des variants : conclusions

• L’analyse des séquences codantes de l’ADN n’est passuffisante pour détecter toutes les mutations.

• Dans certains cas, le processus d’épissage peut être affecté.

• Les outils bioinformatiques sont potentiellement prometteursmais non suffisants actuellement.

• L’analyse de l’ARNm par la technique des minigènes restedifficilement envisageable en diagnostic de "routine".

PCR en temps réel

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Principe de la qPCR

• Détection et quantification d’un émetteurfluorescent pendant le processusd’amplification

• Augmentation de la fluorescenceproportionnelle à la quantité d’ampliconproduite durant la réaction (lors de laphase exponentielle)

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PCR en temps réel 1/2

2 types de technologies de détection :

• Fluorophore lié à ADN double brin

= SybR Green

• Sondes fluorescentes par hydrolyse desondes = TaqMan

• Permet une mesure de la quantité d’ADN dans unéchantillon

• Mesure de la fluorescence en fin de chaque cycle

Phaseexponentielle

Sortie du bruit de fond : Cycle de sortie (Ct)

PCR en temps réel 2/2

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CT value

• CT “cycle treshold”

• Le CT est le nombrede cycles nécessairespour que lafluorescence atteigneun certain seuil

• Il existe une relationlinéaire entre la valeurdu Ct et le log dunombe de copies

CT

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SybR Green 1/2

• SybR Green va s’intercaler dans la double hélice ADN

• Réaction de PCR standard + SYBR Green• Émission de fluorescence uniquement quand intercalé à

l’ADN• Augmentation de la fluorescence à chaque cycle

• Mesure de la fluorescence en fin de chaque cycle

• Phase exponentielle = quantitatif avec un facteur 2 àchaque cycle

• Comparaison avec une gamme obtenue sur un gènetémoin Quantification

SybR Green 2/2

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Sonde TaqMan

Reporter Quencher5 ’ 3 ’Fluorescéine ou FAM TAMRA

488 nm

520 nm

570 nm

Principe: Lors de la PCR, 3 oligonucléotides simples brins sontajoutés au milieu réactionnel

• Les deux amorces permettant l’amplification (amorce directeet amorce inverse complémentaire

• Une sonde qui peut s’hybrider sur une séquencecorrespondant au produit de PCR amplifié (spécificité!!)

La sonde contient deux fluorophores: un reporter qui est excité par le laser,et un quencher dont la longueur d’onde d’excitation correspond à lalongueur d’onde d’émission du reporter. Lorsque les deux fluorophores sontà proximité, le quencher absorbe la fluorescence du reporter.

488 nm

FAM

570 nm

488 nm 520 nm

TAMRA

5’ 3’

5’

Hybridation

Elongation

Mesure à la fin de l’étaped’élongation

Pendant la PCR, la sonde s’hybride sur l’ADN simple brin lors del’étape d’hybridation des amorces

488 nm 570 nm

5’ 3’

3’ 5’

Taq: ADN polymérase5’-3’ et ActivitéExonucléase 5’-3’

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Sonde TaqMan

Exemple de TaqMan

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Autres techniques qPCR

• HybProbe

• Molecular Beacons

• Scorpion primers

• Eclipse probe

• Amplifluor Chemistry

• LUX primers

• BD Qzyme primers

• …

RT- PCR : Reverse Transcriptase PCR

ARN : matrice d'amplification

- transformation d’ARNm en cDNA sous l’action d’unetranscriptase reverse

- amplification du cDNA par PCR.

Trois types d’amorces :- oligo dT qui s’hybrident sur la queue poly A des ARNm- amorces d’hexanucleotides qui s’hybrident à différentsendroits de l’ARNm- amorce spécifique de l’ARNm à étudier

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AAAAAAAA

TTTTTTTTRT

AAAAAAAA

AAAAAAAA

RT

Trois types d’amorces

Applications qPCR

• Quantification d’ADN et ARN

• Détection et quantification microbienne

• Gene Expression

• Genotypage

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Techniques derecherche de grands

réarrangements

Grands réarrangements

• Délétion ou duplication

1 copie 2 copies 3 copiesdélétion duplication

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Only if ligation happened, a functional PCR strand appears, so that amplification only happens if target DNA ispresent in the sample. The amount of PCR product is proportional to the amount of target DNA present in the

sample, making the technique suitable for quantitative measurements. The stuffer sequences are varied in lengthso that a range of up to 50 targets can be amplified and separated in a single experiment

MLPA

Subtelomeric del1p36)detected by MLPA

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Résultats MLPA

Résultats MLPA

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Principe MPLC

• PCR multiplexe

• Sur appareil dHPLC

• Marquage par fluorescence : intégrationd’un fluorophore directement dans laphase mobile modules supplémentaires

• Séparation par des tailles différentes

Résultats MPLC 1/2

Exon 2 VHL Exon 3 VHL

Exon 1 VHL

Exon 24 NF1

Patient sain

Patient sain et patient muté délétion des exons 2 et 3

Patient sain et patient mutéaprès normalisation

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Exons 8 et 2 BHD

Exons 11 et 10 BHD

Exons 7 et 6 BHD

Exon 1 BHD

Exons 4 et 5 BHD

Exons 14, 12+13 et 9 BHD

Ti 305

MPLC BHD

Résultats MPLC 2/2

Conclusions

• Outils moléculaires utilisés doivent être adaptésà ce qui est recherché

• Certains variants nécessitent d’autres analyses :corrélation dans la famille, étude sur unepopulation témoin…

• Techniques de routine pour l’instant maisd’autres approches sont en développement :analyse génomique par MS, Next generationSequencing Plateform…

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MUTATION ?

AGT GGTAcide aspartique Glycine

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MUTATION, CONTAMINATION ?

DELETION DE 5 pb !

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Documents

Mutations 13 NOV 2014.ppt [Mode de compatibilité] · de la prolifération cellulaire Pr. A. CALENDER - 2014. 07/12/2014 7 Loss of heterozygosity with polymorphic markers surrounding