Nouveaux lipides bicaténaires polyfonctionnels. Enjeux

THESE

Présentée

à l’Université de Strasbourg

en vue de l’obtention du grade de

Docteur de l’Université de Strasbourg

Discipline : Chimie et Biologie

par

Benoît HILBOLD

Nouveaux lipides bicaténaires polyfonctionnels.

Enjeux synthétiques et analytiques.

Applications biochimiques.

Soutenue le 9 décembre 2011 devant la commission d’examen :

Professeur Jean-Claude Gesquière Rapporteur Docteur Aurélien Roux Rapporteur Professeur Laurence Ehret-Sabatier Examinateur Professeur Line Bourel-Bonnet Co-directeur de thèse Docteur Eve-Isabelle Pécheur Co-directeur de thèse

THESE

Présentée

à l’Université de Strasbourg

en vue de l’obtention du grade de

Docteur de l’Université de Strasbourg

Discipline : Chimie

par

Benoît HILBOLD

Nouveaux lipides bicaténaires polyfonctionnels.

Enjeux synthétiques et analytiques.

Applications biochimique.

Soutenue le 9 décembre 2011 devant la commission d’examen :

Professeur Jean-Claude Gesquière Rapporteur Docteur Aurélien Roux Rapporteur Professeur Laurence Ehret-Sabatier Examinateur Professeur Line Bourel-Bonnet Co-directeur de thèse Docteur Eve-Isabelle Pécheur Co-directeur de thèse

« à ma femme,

à mes parents… »

Remerciements

- i -

Remerciements

Remerciements

- iii -

Les différents travaux décrits dans ce manuscrit ont été réalisés au sein de

l’équipe de Biovectorologie à la Faculté de Pharmacie de Strasbourg sous la

direction du Pr. Line Bourel-Bonnet et au sein de l’équipe RMN et virus de

l’hépatite C dirigée par le Dr. François Penin à l’IBCP de Lyon sous la direction

du Dr. Eve-Isabelle Pécheur. Je tiens à les remercier tous les trois très

chaleureusement, et plus particulièrement Eve et Line de m’avoir accueilli et

permis de travailler au sein de leur laboratoire pendant ces trois années. Line,

Eve merci de m’avoir fait confiance dans mes choix, merci de m’avoir formé et

transmis votre passion pour la recherche. Merci pour votre encadrement et pour

les nombreuses discussions qui ont permis l’avancement du projet, merci de

m’avoir soutenu dans les moments de doute. Eve, merci de m’avoir initié à

l’étude et à la manipulation de biomatériaux, Line merci pour ton engagement sur

les différents sujets développés durant ces trois années et pour la révision

judicieuse de mon manuscrit. Merci à vous deux de m’avoir permis de réaliser ce

projet, cette thèse qui me tenait à cœur depuis plusieurs années.

J’exprime toute ma gratitude au Dr. Luc Lebeau, directeur de l’UMR 7199,

au Dr. Benoit Frisch, directeur de l’équipe de Biovectorologie de Strasbourg et au

Pr. Gilbert Deléage, directeur de l’IBCP de Lyon de m’avoir intégré au sein de

leur unité et sans qui rien n’aurait été possible.

Je tiens également à remercier tous les collaborateurs que j’ai pu rencontrer

durant cette thèse et qui m’ont apporté un peu de leur savoir, de leur savoir-

faire et de leur convivialité :

- merci à toute l’équipe du Dr. François Penin : Marie, Aurélie, Julie, Marie-

Laure, Carole, Birgit, Jenny, Roland et Mihayl et tous les autres que j’ai

croisés dans les couloirs pour leurs conseils et leurs discussions

scientifiques mais aussi pour leur accueil chaleureux et tous les bons

moments passés à Lyon,

Remerciements

- iv -

- merci à l’équipe du Dr. Attilio Di Pietro de l’IBCP de Lyon et plus

particulièrement au Dr. Pierre Falson, au Dr. Frédéric Huché et au Dr.

Moez Rhimi pour m’avoir fourni la BmrA et pour leurs conseils techniques,

- merci au Dr. Frédéric Halgand de m’avoir accueilli à Marseille et à Jean-

Marc Strub pour avoir analysé mes protéines, m’avoir conseillé et expliqué

les techniques existantes en spectrométrie de masse.

- merci au Service Commun d’Analyse de la Faculté de Pharmacie, Patrick

Wehrung, Cyril Antheaume et Pascale Buisine pour les analyses de mes

molécules.

Je remercie également tous les permanents, thésards et stagiaires des

différentes équipes de la faculté de Pharmacie pour leurs discussions et conseils

scientifiques et les différents moments partagés autour d’un repas, d’une pause

café…

Un grand merci à Christophe Ehret, Nicolas Zill et à tous les autres pour les

moments conviviaux et scientifiques, et pour les parties de Uno partagées à la

cafét de Pharma.

Une ‘’spéciale dédicace’’ pour mon collègue et ami Jean-Sébastien

Thomann, à sa femme ainsi qu’à son petit Willi, bon vent…

Merci aussi à mes amis et à mes amis musiciens pour tous les moments de

détente durant cette thèse.

Pour finir mille mercis à ma femme Stéphanie pour son soutien

inconditionnel et sa confiance, quelle magnifique et heureuse rencontre : vive la

science.

Et merci à sa famille et à ma famille pour m’avoir soutenu durant ces trois

années et m’avoir permis d’accomplir ce challenge.

Abréviations

- v -

Abréviations

Abréviations

- vii -

5,6-CTMR 5,6-carboxytétraméthylrhodamine 9-BBN 9-Borabicyclo[3.3.1]nonane ACN acétonitrile AcOEt acétate d’éthyle ADN acide désoxyribonucléique ARN acide ribonucléique ARNm acide ribonucléique messager Biotine-SS-COOH acide 3-[2-N-(biotinyl)aminoéthyldithio]propanoïque BmrA Bacillus multidrug resistance ATP Boc tert-butoxycarbonyl- Boc-L-Dpr-OH acide N-alpha-t-butyloxycarbonyl-L-2,3-

diaminopropionique bR bactériorhodopsine BSA bovin serum albumin nBuLi nButyl lithium CES chromatographie d’exclusion stérique CCM chromatographie sur couche mince CDCl3 chloroforme deutéré Chol cholestérol Da/kDa dalton/kilo dalton DAG diacylglycérole DIBAL hydrure de diisobutylaluminium DIEA N,N-Diisopropyléthylamine DOG dioléylglycérole ESI electrospray ionisation FC 12 dodécylphosphocholine GCMS gaz chromatography mass spectrometry GE gel d’électrophorèse Glu-C V8 glutamyl endopeptidase Hepes acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthanesulfonate HPLC chromatographie liquide haute performance HRMS spectrométrie de masse à haute résolution Kb kilo paires de base LC liquid chromatography LC-MS liquid chromatography mass spectrometry LiAlH4 tétrahydruroaluminate de lithium MALDI-TOF matrix – assisted laser desorption/ionisation time of flight MeOH méthanol NS2 protéine non-structurale 2 du virus de l’Hépatite C NTA acide nitrilotriacétique OMS organisation mondiale de la santé (WHO) PBS phosphate buffered saline PEG polyéthylèneglycole PM poids moléculaire ppm partie par million PyBOP benzotriazole-1-yl-oxy-trispyrrolidinophosphonium

hexafluorophosphate R18 chlorure d’octadécylrhodamine Rdt rendement Rf rapport frontal RMN résonance magnétique nucléaire

Abréviations

- viii -

RP-HPLC chromatographie liquide à haute performance en phase inverse

SDS sodium dodécylsulfate SDS-PAGE sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis SLR sonde lipidique de référence SRAS syndrome respiratoire aigu sévère SUV small unilamellar vesicles TFA acide trifluoroacétique THF tétrahydrofurane THP tétrahydropyrane TIPS triisopropylsilane TMS tétraméthylsilane TPCK N-tosyl-L-phénylalanine chlorométhylcétone VHB virus de l’hépatite B VHC virus de l’hépatite C VHCpp pseudo-particule du virus de l’hépatite C v/v volume à volume

Sommaire

- ix -

Sommaire

Sommaire

- xi -

REMERCIEMENTS I

ABREVIATIONS V

SOMMAIRE IX

PREAMBULE 1

I. INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE 7

1. Les virus 9 1.1. Les caractéristiques d’un virus (définition de Lwoff) 9 1.2. Structure générale d’un virus 11

1.2.1) Le génome 11 1.2.2) La capside 11

1.3. Le cycle de réplication virale 12 1.3.1) L’attachement ou adsorption 13 1.3.2) La pénétration 13

a/ pénétration directe du génome par translocation 13 b/ par endocytose seule 13 c/ par fusion avec la membrane plasmique 14 d/ par endocytose puis fusion avec la membrane de l’endosome 14

1.3.3) La décapsidation 15 1.3.4) La réplication 15

a/ cas des virus à ADN 16 b/ cas des virus à ARN 17

1.3.5) L’assemblage et la maturation 17 1.3.6) La libération 18

2. La fusion virale 18 2.1. Les protéines de fusion virale 19

2.1.1) Les protéines de fusion de classe I 19 2.1.2) Les protéines de fusion de classe II 20 2.1.3) Les protéines de fusion de classe III 21

2.2. Le peptide de fusion 21 2.3. Les étapes de la fusion virale 22

3. Le concept du projet 24

4. Le virus de l’hépatite C 26

5. Le virus de l’hépatite B 30

6. Les protéines modèles utilisées 33 6.1. La bactériorhodopsine (bR) 33 6.2. La BmrA 35 6.3. Protéine NonStructurale 2 (NS2) du virus de l’Hépatite C 37

7. Le marquage d’affinité 39 7.1. Le photomarquage d’affinité 40

7.1.1) Les premiers exemples d’applications du photomarquage d’affinité 42 7.1.2) Caractéristiques du réactif de photomarquage 43

Sommaire

- xii -

7.2. Le Photomarquage hydrophobe de domaines protéiques membranaires 44 7.3. Chimie des carbènes et des nitrènes 46

7.3.1) Généralités 46 a/ Les azotures d’aryle 48 b/ Les azotures d’acyle 49 c/ Les azotures d’alkyle 49

7.3.3) Les carbènes 50 a/ Les composés diazo 50 b/ Les diazirines 51

7.4. Les benzophénones 52 7.4.1) Mécanisme d’activation – photoréduction du groupement carbonyle 53

7.5. Bilan 56

II. CONCEPTION ET SYNTHESE DES SONDES LIPIDIQUES 59

1. Conception générale d’une famille de sondes lipidiques 61

2. Conception et synthèse de la sonde lipidique de référence 62 2.1. La plateforme liaison (PFL) 63 2.2. Le fluorophore 66 2.3. Le dérivé photoactivable : synthèse de l’acide 6-(4-(4-n-hexyl benzoyl)phényl) hexanoique, C6-BP-C5-COOH (1) 67 2.4. Ordre d’introduction des fonctionnalités de la sonde sur la plateforme 68 2.5. Synthèse de la sonde lipidique de référence Rhod-Dpr(CO-C5-BP C6)-NH-C16H33 (5) 69

3. Synthèse d’analogues 71 3.1. Synthèse de sondes lipidiques fluorescentes avec un groupement photoactivable à distance variable 71

3.1.1) Synthèse des acides gras contenant le groupement benzophénone 72 a/ Synthèse de l’acide 11-(4-(4-méthylbenzoyl)phényl)undécanoique : C1-BP-C10-COOH (9) 72 b/ Synthèse de l’acide 2-(4-((4-décylphényl)(hydroxy)méthyl)phényl) acétique : C10-BP-C1-COOH (18) 77

3.1.2) Synthèse de deux nouvelles sondes lipidiques 84 3.2. Bilan 85 3.3. Synthèse d’une sonde lipidique photoactivable biotinylée 87 3.4. Synthèse de sondes lipidiques fluorescentes avec différentes plateformes de liaison 88

4. Partie expérimentale chimique 90 4.1. Indications générales 90

4.1.1) Solvants et réactifs 90 4.1.2) Matériels et méthodes 90

a/ Chromatographie 90 b/ Spectroscopie Infrarouge 91 c/ Spectroscopie de masse 91 d/ Point de fusion 92

4.2. Synthèse de la sonde lipidique de référence 93 4.3. Synthèse des acides gras contenant un groupement benzophénone 97 4.4. Synthèse des sondes lipidiques à partir des acides gras 9 et 18 110

III. CARACTERISATION, DEVELOPPEMENT ET OPTIMISATION 121

1. Caractérisation de l’activité des sondes lipidiques 123

Sommaire

- xiii -

1.1. Etude de la fluorescence 123 1.2. Capacité de photomarquage des sondes lipidiques 126

1.2.1) Conditions d’irradiation 126 1.2.2) Etude du photomarquage de la sonde lipidique de référence 126

a/ en solution organique 126 b/ sur les protéines membranaires 127

1.3. Optimisation des conditions opératoires 129 1.3.1) Influence du rapport protéine/sonde lipidique 129 1.3.2) Influence du temps d’incubation entre la BmrA et la sonde lipidique 131 1.3.3) Influence du temps d’irradiation entre la BmrA et la sonde lipidique 132

1.4. Etude du photomarquage des sondes lipidiques fluorescentes sur différentes protéines 133

2. Développement d’une méthode d’étude et d’identification de protéines 137 2.1. Introduction 137 2.2. Approche middle-down 142

2.2.1) Digestion enzymatique limitée des protéines 142 a/ Cas n° 1 : la BmrA 143 b/ Cas n° 2 : la bactériorhodopsine (bR) 143 c/ Cas n° 3 : NS2, une protéine de VHC 145

2.2.2) Purification et identification 146 a/ Purification et identification par SDS-PAGE : digestion trypsique ‘in-gel’ 146 b/ Purification et identification ‘en solution’ 150

2.3. Approche ‘’top-down’’ LC-ESI et MALDI-TOF 160 2.3.1) Analyse de la bR en LC-ESI et MALDI-TOF 160 2.3.2) Analyse de NS2 en LC-ESI et MALDI-TOF 161

3. Optimisation du procédé de photomarquage 163 3.1. Augmentation du rendement de photomarquage 163

3.1.1) Résultats 164 3.1.2) Discussion 166

3.2. Double purification de l’adduit de photomarquage 168

4. Partie expérimentale biochimique 172 4.1. Molécules utilisées 172 4.2. Formation des liposomes 172 4.3. Fluorimètre 173 4.4. Mesure de la fluorescence 173 4.5. Formation des micelles de détergents contenant les lipides outils 173 4.6. Irradiation 174 4.7. Digestion protéolytique des protéines membranaires photomarquées 174 4.8. Analyse des gels 175 4.9. Analyse HPLC 175 4.10. Purification de la protéine membranaire photomarquée dans un tampon 175 4.11. Spectrométrie de masse 176 4.12. Double purification 177

IV PROJETS ANNEXES 179

1. ‘’Click Chemistry’’ sans cuivre sur liposome : un couplage pH-indépendant 181 1.1. Synthèse de l’ancre DOGPEG4Cyclooctyne 183 1.2. Synthèse de la sonde N3PEG3CTMR 184 1.3. Couplage de la sonde fluorescente à la surface des liposomes 185

1.3.1) Quantification de la quantité de sonde fluorescente ayant réagi avec l’ancre 185

Sommaire

- xiv -

1.3.2) Influence de la concentration de l’ancre lipidique dans les liposomes après 24 h de couplage 187 1.3.3) Influence du pH sur la vitesse de réaction de couplage 188

1.4. Partie expérimentale 190

2. Synthèse de dérivés fluorescents de type diacylglycérole 194 2.1. Introduction 194 2.2. Résultats et discussion 196 2.3. Partie expérimentale 199

V. CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES 205

Préambule

- 1 -

Préambule

Préambule

- 3 -

De nouvelles souches de microorganismes virulents sont encore

découvertes de nos jours et d’autres n’ont toujours pas de traitement efficace.

Ces pathogènes notamment représentés par les virus, potentiellement mortels et

dont la transmission de l’animal à l’homme ou de l’homme à l’homme est

difficilement contrôlable sont de véritables menaces pour la santé humaine à

travers le monde (tableau 1).

Famille Nom Découverte Traitement Taux de létalité

Coronaviridae SRAS*-CoV 2002 Aucun traitement ni vaccin spécifique

11% Epidémie mondiale en 2003, 8422 cas recensés dont 916 mortels

Paramyxoviridae

Nipah 1999 Aucun traitement ni vaccin disponible

40 à 75 %

Hendra 1994 Vaccin en cours de

développement 50%

Filoviridae

Fièvre hémorragique à virus Ebola

1976 Aucun traitement ni vaccin spécifique

25 à 90 % 1850 cas recensés dont 1200 mortels

Fièvre hémorragique de Marburg

1967 Aucun traitement ni vaccin spécifique

> 80 % 562 cas recensés dont 469 mortels

Arénaviridae

Fièvre de Lassa 1969 Traitement à l'aide de la

ribavirine 1%

300000 à 500000 cas par an dont 5000 mortels en Afrique de l'Ouest

Junin 1950 Traitement à l'aide de

sérums de patients guéris

10 à 30 % si non traité, 1 % si traité

Or, ces virus sont insuffisamment décrits tant structurellement que

fonctionnellement. La découverte de thérapies anti-infectieuses nouvelles et

efficaces est absolument nécessaire dans ce contexte, et implique une définition

structurale la plus détaillée possible des cibles potentielles. Malheureusement

ces virus sont extrêmement difficiles à étudier du fait qu’ils doivent être

manipulés dans des laboratoires de niveau de sécurité 3 ou 4. Malgré ces

difficultés, la compréhension de l’interaction des protéines d’enveloppe de tels

pathogènes avec les membranes cellulaires-cibles pendant l’infection est

essentielle pour mieux caractériser le processus d’infection et essayer de

Tableau 1 : Exemple de virus pathogènes, source : www. who.int/fr/ consultée 07/09/2011. *Syndrome Respiratoire Aigu Sévère

Préambule

- 4 -

l’inhiber. Ces études sont indispensables pour la conception de nouveaux

médicaments antiviraux.

Certaines de ces protéines d’enveloppe, les protéines de fusion virale, sont

plus particulièrement impliquées dans l’étape de ‘’fusion virale’’. Cette étape

conduit à la libération du matériel génétique viral dans le cytoplasme de la

cellule-cible. Deux éléments structurels, communs à toutes les protéines de

fusion virale connues, jouent un rôle crucial lors de l’étape de fusion virale : le

peptide de fusion virale et le domaine transmembranaire de la protéine de fusion

virale.

La cartographie de ces régions-clés portées par la protéine de fusion virale

est donc cruciale pour la compréhension des relations structure/fonction au cours

du processus de fusion.

L’objectif de ce travail de thèse a été de concevoir et développer un nouvel

outil et une nouvelle méthode pour l’identification de ces zones hydrophobes

d’interaction, grâce à de nouvelles sondes lipidiques originales, photoactivables

et fluorescentes, réalisant un marquage covalent de photoaffinité.

La première partie de ce manuscrit est une introduction bibliographique sur

les virus, le marquage d’affinité et les protéines utilisées. Cette partie introduira

aussi le concept à développer pour répondre à la problématique posée.

La deuxième partie de cette thèse expose les résultats obtenus. Le premier

chapitre de cette partie décrit la conception et la synthèse des sondes lipidiques

originales. Le deuxième chapitre est consacré à la caractérisation, à la

vérification de la capacité de photomarquage des nouvelles sondes lipidiques et

au développement d’une méthode d’identification des zones hydrophobes de

protéines. Le troisième chapitre développe de nouvelles pistes pour améliorer

cette méthode d’identification.

Dans la troisième et dernière partie de ce manuscrit sont exposés deux

projets annexes développés au cours de cette thèse qui ont en commun avec le

sujet principal le développement de lipides bicaténaires polyfonctionnels. D’une

part, la synthèse d’une sonde fluorescente permettant le suivi d’expériences de

Préambule

- 5 -

nanobiophysique et d’autre part la synthèse d’une ancre lipidique fonctionnalisée

en vue de développer une nouvelle méthode de bioconjugaison pH-indépendant

à la surface de liposome par ‘’click chemistry’’ sans cuivre y sont exposées. Dans

les deux cas, il s’agit du développement d’outils originaux pour comprendre et

reconstituer des phénomènes biologiques.

I. Introduction bibliographique

- 7 -



- 9 -

L’inhibition de l’infection virale par des moyens thérapeutiques implique la

connaissance et la caractérisation détaillée du cycle de réplication du virus, de

son entrée dans une cellule-cible à sa propagation. Chaque étape de l’infection

virale peut être une cible potentielle pour développer de nouvelles stratégies

antivirales.

1. Les virus

Les virus sont des micro-organismes pathogènes de taille variable. Les plus

gros virus infectant l’homme ont une taille comprise entre 800 et 1000 nm pour

les Mimivirus et certaines formes d’Ebola virus, les plus petits comme les

Parvoviridae n’ont que 20 nm de diamètre. La notion de maladie virale remonte à

la fin du XIXe siècle. Les virus ont été identifiés pour la première fois en 1892 par

un biologiste russe Dmitry Ivanovsky comme étant des agents infectieux n’étant

ni des bactéries, ni des champignons et ni des parasites. Le premier virus

découvert fut celui de la mosaïque du tabac en 1898 par le chimiste Martinus

Beijerinck. Mais c’est seulement après la seconde guerre mondiale avec le

développement du microscope électronique que ces organismes microscopiques

ont pu être observés. C’est en 1957 qu’une définition claire et moderne des virus

fut énoncée par André Lwoff : «Les virus sont infectieux et potentiellement

pathogènes ; ce sont des entités nucléo-protéiques possédant un seul type

nucléique ; ils sont reproduits par la cellule à partir de leur matériel génétique, ils

sont incapables de croître et de se diviser ; ils sont dépourvus de système

enzymatique de production d’énergie»1.

1.1. Les caractéristiques d’un virus (définition de Lwoff)

Les virus sont des entités très hétérogènes mais ils possèdent quatre

caractères communs qui les distinguent des autres micro-organismes ou

organismes vivants :

1 J. M. Huraux, J. C. Nicolas, H. Agut, H. Peigue-Lafeuille (2003). Traité de virologie Médicale


- 10 -

- ils ne possèdent qu’un seul type d’acide nucléique à la fois : soit de l’ARN,

soit de l’ADN. Ces deux molécules ne coexistent pas ensemble dans le virus, ce

qui les distingue des cellules eucaryotes et procaryotes. L’acide nucléique viral

porte l’intégralité de l’information génétique du virus,

- ils se multiplient uniquement à partir de leur matériel génétique par

réplication de leur génome. Ils ne se multiplient pas par scissiparité (division

binaire) comme chez les bactéries ou par mitose comme chez les cellules

eucaryotes,

- ils présentent une structure particulaire, appelée le virion,

- ils sont doués de parasitisme intracellulaire absolu. Ils ne peuvent se

multiplier que grâce à une cellule-hôte vivante. Etant dépourvus de système

enzymatique ou énergétique, les virus ne peuvent pas s’autorépliquer. Ils sont

obligés de détourner le métabolisme cellulaire de la cellule qu’ils parasitent pour

se multiplier.

Tous les organismes vivants sont susceptibles d’être infectés par des virus

mais les différents organismes ne sont pas infectés par les mêmes virus. A

l’intérieur d’un organisme, les virus seront sélectifs d’un certain type cellulaire.

Chaque virus ne peut infecter qu’un nombre restreint d’espèces : c’est le

tropisme d’hôte. L’ensemble des cellules sensibles à un virus définit son spectre

d’hôtes. Cette spécificité est due à la reconnaissance de récepteurs spécifiques

de la cellule cible par le virus. Cette spécificité entre un virus et une cellule est

nécessaire pour que le virus, une fois la cellule infectée, ait à disposition la

bonne machinerie cellulaire pour pouvoir se répliquer.


- 11 -

1.2. Structure générale d’un virus

Toute particule virale est constituée d’au moins deux éléments constants et

obligatoires (fig. I.1).

1.2.1) Le génome

Le virus est toujours constitué d’un génome composé d’un filament d’acide

nucléique qui est soit de l’ADN ou soit de l’ARN. Ce génome peut être

monocaténaire (simple brin) ou bicaténaire (double brin). La taille du génome

diffère selon le type de celui-ci de 3 à 300 kpb pour les virus à ADN et seulement

10 à 20 kpb pour les virus à ARN. Cet acide nucléique code pour les diverses

protéines virales : des protéines de structure, des enzymes et des protéines de

régulation.

1.2.2) La capside

La capside est une enveloppe protéique qui entoure le génome. Cette

coque est capable d’assurer la protection et la survie du génome dans le milieu

extérieur. Elle peut être de différentes géométries (tubulaire à symétrie

hélicoïdale comme le virus de la mosaïque du tabac ou les myxovirus,

icosaédrique à symétrie cubique comme les adenovirus) ou ne pas avoir de

géométrie définie comme le virus de l’immunodéficience humaine. La structure

compacte composée de la capside entourant le génome est appelée

nucléocapside.

génome

enveloppe

capside

glycoprotéines

Figure I.1 : Structure générale d’un virus enveloppé d’après http://micro.magnet.fsu.edu consulté le 12/09/2011


- 12 -

Il existe deux types de virus : les virus nus limités à leur simple

nucléocapside comme les poliovirus et les virus enveloppés dont la

nucléocapside est entourée d’une structure périphérique. Cette structure est une

bicouche phospholipidique dérivée des membranes cellulaires provenant du

cytoplasme, de l’appareil de Golgi ou du noyau selon les virus. Des

glycoprotéines virales sont aussi ancrées dans la face externe de cette bicouche

lipidique.

La particule virale, appelée virion, correspond au stade où tous les

constituants structuraux du virus sont associés : elle correspond à la forme libre

du virus.

1.3. Le cycle de réplication virale

Les virus sont des parasites intracellulaires absolus, ils ne se multiplient pas

par division cellulaire car ce sont des entités acellulaires. La multiplication virale

est donc un phénomène complexe au cours duquel le virus va détourner le

métabolisme cellulaire de sa cellule hôte à son profit pour pouvoir se multiplier.

Le cycle de réplication de chaque espèce de virus est différent selon qu’il

s’agit d’un virus à ADN ou d’un virus à ARN mais il peut être résumé, en général,

en six étapes principales : l’attachement, la pénétration, la décapsidation, la

réplication, l’assemblage et la maturation, la libération des virus (fig. I.2).

Libération des virus

Réplication

Pénétration et décapsidation

Attachement

Assemblage et maturation

Figure I.2 : Cycle général de réplication d’un virus d’après les cours de virologie de l’Université Catholique de Louvain, http://www.afd-ld.org/~fdp_viro/index.htm, consulté le 03/08/2011


- 13 -

1.3.1) L’attachement ou adsorption

La première étape du cycle de réplication consiste en l’attachement du

virion à sa cellule-cible par liaison d’une protéine de surface du virus à des

récepteurs spécifiques situés sur la membrane cytoplasmique de la cellule-hôte.

Ce ligand viral est une glycoprotéine d’enveloppe dans le cas d’un virus

enveloppé ou correspond à une conformation particulière des protéines de la

capside dans le cas d’un virus nu.

1.3.2) La pénétration

Cette étape correspond à l’internalisation du virion dans la cellule hôte.

Plusieurs mécanismes de pénétration du virus dans sa cellule hôte existent selon

que celui-ci soit nu ou enveloppé :

a/ pénétration directe du génome par translocation

Ce procédé est plutôt rare, il est utilisé par une famille de virus nus : les

picornavirus. Il consiste en une libération directe par ‘’injection’’ du génome dans

le cytoplasme de la cellule sans que la capside ne pénètre dans le cytoplasme

de la cellule (fig. I.3 a).

b/ par endocytose seule

Ce mécanisme est aussi utilisé par les virus nus. Il consiste en

l’endocytose du virion une fois celui-ci fixé sur son récepteur (fig. I.3 b). Le virion

se retrouve alors dans une vésicule dans le cytoplasme de la cellule. La

délivrance de la capside ou du génome dans le cytoplasme de la cellule se fait

soit par franchissement de la membrane vésiculaire par le génome : comme

dans le cas du virus de la poliomyélite (fig. I.3 b i), soit par rupture de

l’endosome comme dans le cas des Rhinovirus (fig. I.3 b ii).


- 14 -

c/ par fusion avec la membrane plasmique

Ce procédé est propre aux virus pH-indépendants enveloppés. Le

mécanisme de fusion requiert une glycoprotéine d’enveloppe spécifique : la

protéine de fusion. L’enveloppe du virion fusionne directement avec la

membrane plasmique de la cellule hôte à pH neutre et libère sa nucléocapside

dans le cytoplasme de la cellule comme dans le cas du virus de

l’immunodéficience humaine (VIH) (fig. I.4 c).

d/ par endocytose puis fusion avec la membrane de l’endosome

Ce mécanisme de pénétration ne concerne que les virus pH-dépendants

enveloppés (fig. I.4 d). La fixation du virion sur son récepteur cellulaire entraine

l’endocytose de celui-ci. Le virus enveloppé se retrouve alors dans une vésicule

d’endocytose à l’intérieur du cytoplasme de la cellule-hôte. A un pH acide donné

et avec le concours d’une protéine de fusion, l’enveloppe du virus va fusionner

avec la membrane de la vésicule et délivrer sa nucléocapside dans le

cytoplasme de la cellule. Ce mécanisme de pénétration est utilisé par les virus

Influenza A et de l’Hépatite C.

a

b

ii

i

Figure I.3 : Pénétration d’un virus nu soit par translocation (a) soit par endocytose (b). En bleu la membrane plasmique d’après les cours de virologie de l’Université Catholique de Louvain, http://www.afd-ld.org/~fdp_viro/index.htm, consulté le 03/08/2011


- 15 -

Les glycoprotéines d’enveloppe, codés par le virus, jouent un rôle

primordial dans le mécanisme d’entrée du virus (chap. I.2.).

1.3.3) La décapsidation

Une fois que la nucléocapside se trouve dans le cytoplasme de la cellule, la

capside est dégradée (digérée par des enzymes cellulaires) pour libérer son

génome. Cette étape est nécessaire pour que le génome puisse livrer ses

informations génétiques à la machinerie cellulaire.

Ces trois étapes d’initiation de l’infection sont suivies par la phase de réplication

et d’expression du génome viral.

1.3.4) La réplication

La multiplication du virus s’effectue par duplication du matériel génétique ;

cette étape est couramment appelée ‘’réplication’’2.

Lors de cette étape, le génome viral a deux rôles distincts :

2 A. Mammette (2002). Virologie Médicale. Collection Azay, presse universitaire de Lyon

c

d

FusionpH-indépendante

Figure I.4 : Pénétration d’un virus enveloppé pH-indépendant (c) ou pH-dépendant (d). En bleu la membrane plasmique d’après les cours de virologie de l’Université Catholique de Louvain, http://www.afd-ld.org/~fdp_viro/index.htm, consulté le 03/08/2011


- 16 -

- Il est utilisé pour assurer l’expression des protéines virales nécessaires à

la réplication du virus, à la construction des capsides et de l’enveloppe des

nouveaux virus.

- Il est amplifié : c’est la réplication

L’objectif du virus, à cette étape, est de détourner et exploiter la machinerie

cellulaire de sa cellule-hôte pour synthétiser son propre ADN ou ARN c’est-à-dire

de répliquer son génome et produire les protéines virales (fig. I.5). Cette étape

s’accompagne dans certains cas d’une inhibition de la synthèse d’ARN ou d’ADN

cellulaire. Le mécanisme de cette réplication virale du génome est dépendant de

la structure et de la nature du matériel génétique : ARN ou ADN, génome

monocaténaire ou bicaténaire, segmenté ou non, circulaire ou linéaire.

a/ cas des virus à ADN

La transcription et la réplication du génome des virus à ADN s’effectuent

principalement dans le noyau.

La réplication du génome des virus à ADN double brin se calque, en

général, sur les mécanismes de la réplication du génome cellulaire. Le cycle viral

est divisé en deux phases : une phase précoce et une phase tardive sauf pour le

Figure I.5 : Stratégie de multiplication des virus en fonction de la nature du génome. (1) réplication du génome et (2) transcription (formation de l’ARNm (ARN+)) des virus à ADN. (4) réplication et (5) transcription des virus à ARN, (6) et (7) voies de transcription spécifique à certain virus à ARN. (3) traduction de l’ARN+ en protéine. D’après Mammette2


- 17 -

les Herpesviridae où il y a trois phases : une phase très précoce, une phase

précoce et une phase tardive.

Pendant la phase précoce, une petite partie du génome viral est transcrite

en protéines dites précoces. Celles-ci sont des protéines non structurales ou des

enzymes intervenant dans la réplication du génome viral comme la synthèse

d’un nouvel ADN viral. Puis le génome est répliqué.

Durant la phase tardive, le nouveau génome formé est transcrit

permettant la synthèse de protéines dites tardives. Celles-ci sont des protéines

de structure c’est-à-dire formant la capside ou l’enveloppe du virus.

b/ cas des virus à ARN

Les virus à ARN ont un cycle de réplication cytoplasmique. Le processus

de réplication est différent selon la nature de l’ARN génomique.

- Les virus à ARN positif (ARN +)

Leur génome se comporte comme un ARN messager, il est directement

traduit par les ribosomes cellulaires en protéines de capsides et en protéines non

structurales. Parmi ces protéines, une réplicase (ARN polymérase-ARN

dépendante) permet la synthèse de l’ARN complémentaire (ARN -) servant de

matrice pour la synthèse du nouveau génome : l’ARN +.

- Les virus à ARN négatif (ARN -)

Leur génome ne peut pas être traduit directement, il doit préalablement

être transcrit en ARN messager par une transcriptase virale (ARN polymérase

associée au virion). Cet ARN messager est ensuite traduit en protéines de

capsides et en protéines non structurales par les ribosomes cellulaires. Cette

ARN polymérase assure aussi la réplication du génome viral.

1.3.5) L’assemblage et la maturation

Après fabrication du nouveau génome par réplication, celui-ci est entouré

par de nouvelles protéines virales structurales synthétisées par la cellule pour


- 18 -

former sa capside. Ce phénomène s’appelle l’encapsidation du génome et

conduit à la formation de nouveaux virus.

1.3.6) La libération

Les nouveaux virus formés sortent de la cellule soit par bourgeonnement

cytoplasmique ou nucléaire pour les virus à enveloppe, soit par éclatement de la

cellule (lyse cellulaire) pour les virus nus.

Dans ce manuscrit, nous nous intéresserons plus particulièrement à l’étape

de pénétration des virus enveloppés dans leur cellule-cible, c’est-à-dire à la

fusion de l’enveloppe du virus avec la membrane de la cellule. Cette étape de

fusion est une des étapes-clés de l’infection virale.

2. La fusion virale

La fusion membranaire intervient dans de nombreux processus biologiques,

notamment dans le développement musculaire3, le transport intracellulaire4, la

neurotransmission5, la fécondation6 et l’infection virale7. La fusion est un

processus qui implique le rapprochement de deux membranes, leur fusion et la

formation d’un pore. Le processus de fusion membranaire est commun à tous les

virus enveloppés et nécessite trois étapes principales catalysées par des

glycoprotéines d’enveloppe du virus (fig. I.6).

3 M. C. Towler, S. J. Kaufman, F. M. Brodsky (2004). Membrane traffic in skeletal muscle. Traffic, 5, 129-139 4 J. E. Rothman (1994). Mechanism of Intracellular Protein-Transport. Nature 372, 55-63. 5 C. F. Gianinazzi, E. Raiteri, C. Collesi, F. Benfenati, O. Cremona (2005). Dynamics of secretion. Arch. Ital. Biol., 143, 133-142 6 F. J. Longo, R. Yanagimachi (1993). Detection of Sperm-Egg Fusion. Methods Enzymol., 221, 249-260 7 F. M. Hughson (1995). Molecular Mechanisms of Protein-Mediated Membrane-Fusion. Curr. Opin. Cell Biol., 5, 507-513


- 19 -

2.1. Les protéines de fusion virale

Les protéines de fusion virale sont des glycoprotéines enchâssées dans

l’enveloppe virale. Elles possèdent une structure hydrophobe. Une partie de

cette structure correspond au peptide de fusion viral.

Les glycoprotéines d’enveloppe des virus ont développé deux

caractéristiques indispensables au processus de fusion virale. Elles ont la

capacité de se lier à des récepteurs cellulaires spécifiques et leur structure inclut

un domaine peptidique de fusion permettant, une fois activé, d’engendrer la

fusion entre l’enveloppe du virus et la membrane de la cellule.

Les protéines de fusion virale sont divisées en trois classes essentiellement

basées sur leurs caractéristiques structurales aux différentes étapes de la fusion

virale8.

2.1.1) Les protéines de fusion de classe I

Les protéines de fusion de classe I comportent une structure en hélice et

le peptide de fusion est situé à l’extrémité N-terminale de la protéine à l’intérieur

de cette structure9. Les protéines de fusion de classe I diffèrent au niveau de leur

taille et de leur séquence peptidique en fonction de la famille virale qui l’exprime

mais l’arrangement structural en spicule et hélice est commun à toutes ces

protéines. Cette structure est déterminante lors de la fusion virale. Lorsque le

processus de fusion virale est déclenché, ces protéines s’assemblent en un

homotrimère sous la forme d’une épingle à cheveux de conformation stable :

cette conformation est emblématique des protéines de fusion de classe I. Ce

type de protéines de fusion virale est présent dans un grand nombre de famille

de virus comme celle des Orthomyxoviridae, des Retroviridae ou encore des

Filoviridae10.

8 F. L. Cosset, D. Lavillette (2011). Cell Entry of Enveloped Viruses. Adv. Genet., 73, 121-183 9 E. Teissier, F. Penin, E. I. Pécheur (2011). Targeting Cell Entry of Enveloped Viruses as an Antiviral Strategy. Molecules, 16, 221-250 10 M. Kielian, F. A. Rey (2006). Virus membrane-fusion proteins: More than one way to make hairpin. Nat. Rev. Microbiol., 4, 67-76


- 20 -

2.1.2) Les protéines de fusion de classe II

Les protéines de fusion de classe II sont composées d’une structure en

feuillet et le peptide de fusion est situé sur une boucle à l’intérieur de cette

structure8. Le réarrangement conformationnel observé lors de la fusion virale

avec ces protéines implique un changement d’état oligomérique : ces protéines

vont passer d’une structure pré-fusionnelle dimérique enchassée dans

l’enveloppe du virus à une structure post-fusionnelle trimérique allongée

présentant le peptide de fusion. Ces protéines de fusion sont exprimées par les

virus de la famille des Flaviviridae et des Togaviridae9.

Figure I.6 : Les trois étapes de la fusion virale en fonction des protéines de fusion virales de classe I (A), de classe II (B) et de classe III (C). Visualisation de leur changement de conformation de pré-fusionnelle à post-fusionnelle en passant par la conformation étirée. D’après Cosset et Lavilette8.


- 21 -

2.1.3) Les protéines de fusion de classe III

Les protéines de fusion de classe III ont une structure résultant d’une

combinaison d’hélice et de feuillet . Le peptide de fusion est situé sur une

boucle à l’extérieur de la structure protéique à l’extrémité d’un feuillet . Ces

protéines se présentent aussi sous une forme trimérique lors de la fusion virale.

Ces protéines de fusion sont exprimées par les virus de la famille des

Rhabdoviridae et des Herpesviridae10.

2.2. Le peptide de fusion

Le peptide de fusion est une courte séquence peptidique de 10 à 30 acides

aminés présente en position N-terminale ou interne aux protéines de fusion

virale12. Cette séquence est conservée au sein d’une même famille virale13.

Cette homologie de séquence peut être supérieure à 90 % pour une famille

donnée mais tombe à moins de 20 % pour l’alignement de séquences de

peptides de fusion de deux familles de virus différentes. Malgré cette disparité,

les peptides de fusion présentent une certaine similarité. Ils sont tous

majoritairement hydrophobes, contiennent des acides aminés comme des

alanines, des glycines mais aussi des thréonines ou des sérines14 et ont une

séquence globalement riche en glycines12.

Les peptides de fusion ont la capacité de déstabiliser une bicouche lipidique

(liposome ou membrane cellulaire). Ils induisent la fusion et la perméabilité de

celle-ci en s’y insérant de manière oblique dans la plupart des cas15. Cette

11 M. Backovic, T. S. Jardetzky (2009). Class III viral membrane fusion proteins. Curr. Opin. Struct. Biol., 19, 189-196 12 E. I. Pécheur, J. Sainte-Marie, A. Bienvenue, D. Hoekstra (1999). Peptides and membrane fusion: towards an understanding of the molecular mechanism of protein-induced fusion. J. Membrane Biol., 167, 1-17 13 J. M. Withe (1992). Membrane-Fusion. Science, 258, 917-924 14 V. D. Del Angel, F. Dupuis, J. P. Mornon, I. Callebaut (2002). Viral fusion peptides and identification of membrane-interacting sgments. Biochem. Biophys. Res. Commun., 293, 1153-1160 15 A. Colotto, I. Martin, J.M. Ruysschaert, A. Sen, S.W. Hui, R.M. Epand (1996). Structural study of the interaction between the SIV fusion peptide and model membranes. Biochemistry,35, 980-989


- 22 -

tendance à pénétrer dans les membranes est due à leur forte hydrophobicité16 et

à leur structure.

Cette courte séquence d’acides aminés joue un rôle crucial lors de la fusion

virale : si une mutation est induite sur le peptide de fusion, la protéine de fusion

virale perd sa capacité à fusionner.

2.3. Les étapes de la fusion virale

Le processus de fusion membranaire est divisé en plusieurs étapes (fig. I.6)

toutes défavorables d’un point de vue énergétique. Les glycoprotéines

d’enveloppe jouent un rôle majeur lors de ce processus de fusion. Leur

changement de conformation, de ‘’pré-fusionnelle’’ métastable à ‘’post-

fusionnelle’’ plus stable au cours du processus permet au système d’acquérir

suffisamment d’énergie pour déstabiliser la structure ordonnée en bicouches

lipidiques des deux membranes et permettre leur fusion ainsi que la formation

d’un pore. Les glycoprotéines d’enveloppe sont en conformation ‘’pré-

fusionnelle’’ avant le début du processus de fusion virale : le peptide de fusion

est protégé à l’intérieur de la structure.

La première étape de la fusion est le rapprochement de l’enveloppe du virus

de la membrane plasmique de la cellule cible. Ce rapprochement est défavorable

au niveau énergétique du fait des forces de répulsions électrostatiques qui

s’exercent entre les deux membranes mais aussi à cause de la présence de

molécules d’eau interférant dans le rapprochement de ces deux membranes

lipidiques. L’activation des glycoprotéines d’enveloppe par liaison à un récepteur

(pour les virus pH-indépendants) ou par acidification du compartiment

endosomal entraînant la protonation de certains résidus de la glycoprotéine (pour

les virus pH-dépendants) conduit à un réarrangement de celles-ci menant à

l’exposition du peptide de fusion vers l’extérieur de la structure multimérique

(chap. I 2.1.). Une fois le peptide de fusion exposé, celui-ci va interagir et

16 S. Nir, J. L. Nieva (2000). Interactions of peptides with liposomes: pore formation and fusion. Prog. Lipid. Res., 39, 181-206


- 23 -

déstabiliser la membrane de la cellule-cible. Les glycoprotéines d’enveloppe sont

alors en conformation étirée en une structure trimérique (fig. I.6).

La deuxième étape de ce processus consiste en la fusion des deux

monocouches les plus rapprochées en surface du virus et de la cellule formant

une hémifusion des deux membranes par basculement des protéines de fusion.

La fusion complète des deux bicouches lipidiques suivie de la formation

d’un pore est réalisée lors de la troisième étape du processus, les protéines de

fusion sont alors dans leur conformation la plus stable.

Ce pore ainsi formé permet la transmission du matériel génétique du virus

au cytoplasme de la cellule hôte : c’est le début du cycle d’infection virale.

Tous les virus ont développé des mécanismes variés pour atteindre le

même but : livrer leur génome à l’intérieur d’une cellule. Malgré la grande

diversité des acteurs viraux (glycoprotéines d’enveloppes de séquence et de

structure diverses) pour atteindre ce but, un mécanisme d’action général semble

être commun à tous les virus. L’activation de ces protéines de fusion virale

déclenche des changements conformationels conduisant d’abord à un

rapprochement des deux membranes puis à la déstabilisation de la membrane

cellulaire et finalement à la fusion des deux membranes et à la formation d’un

pore.


- 24 -

3. Le concept du projet

Les protéines membranaires représentent 20 à 30 % des protéines codées

par le génome. De nos jours, il est encore difficile, si ce n’est impossible, de

résoudre la structure tridimensionnelle de ces protéines dans leur configuration

membranaire directement sur le virus. C’est pour cette raison que les données

structurales des protéines de surface (glycoprotéines) des virus enveloppés ne

sont pas encore accessibles puisque leur structure est déterminée à partir de

protéines isolées. Ces protéines sont d’une importance primordiale lors du

ciblage cellulaire du virus (reconnaissance des récepteurs en surface des

cellules cibles) et lors de la fusion membranaire (cf. ci-dessus).

La caractérisation du processus d’entrée du virus dans la cellule cible et

donc la caractérisation de ces protéines d’enveloppe est primordiale pour la

compréhension fondamentale du cycle de réplication du virus et pour expliquer le

mécanisme de l’infection virale au niveau moléculaire.

La connaissance exacte et précise de ces mécanismes permettra de

développer de nouvelles stratégies antivirales ayant ces protéines ou ces

mécanismes pour cible.

Pour pouvoir identifier et caractériser une partie de ces protéines et en

particulier le peptide de fusion, nous avons développé une nouvelle stratégie.

Cette stratégie repose sur le marquage covalent de zones hydrophobes par une

approche appelée photomarquage covalent d’affinité hydrophobe. Le peptide de

fusion de certains virus a déjà été identifié grâce à cette méthode de

photomarquage hydrophobe d’affinité comme celui du virus Sendai17, du virus de

la rage ou encore de la stomatite vésiculeuse18. Les adduits formés après

photoréaction ont été détectés par radioactivité. Aujourd’hui l’utilisation de cette

technique est strictement réglementée et est même interdite dans les

laboratoires de niveau de sécurité 3 et 4. Cette méthode d’identification

17 S. L. Novick and D. Hoekstra (1988). Membrane penetration of Sendai virus glycoproteins during the early stages of fusion with lipisomes as determined by hydrophobic photoaffinity labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7433-7437 18 P. Durrer, Y. Gaudin, R. W. Ruigrok, R. Graf, J. Brunner (1995). Photolabeling identifies a putative fusion domain in the enveloppe of rabies and vesicular stomatitis viruses. J. Biol. Chem., 270, 17575-17581


- 25 -

historique développée dans les années 1980-1990 est donc limitée à l’étude de

certains pathogènes et nécessite des infrastructures spécifiques. De plus, à cette

époque, de petites molécules hydrophobes ayant une faible spécificité et une

mauvaise stabilité dans les membranes sont souvent utilisées ne permettant pas

un photomarquage efficace.

Pour pallier ces désavantages, notre stratégie repose sur l’utilisation de

nouvelles sondes lipidiques contenant un groupement photoactivable et un

traceur non radioactif, un groupement fluorescent pour la détection des adduits

formés lors de la réaction de marquage.

Cette stratégie est basée sur l’utilisation de pseudo-particules virales non

pathogènes (pseudo-particules virales du virus de l’hépatite C : VHCpp) ou de

virus entiers (virus de l’hépatite B : VHB) pouvant être manipulés dans un

laboratoire de niveau de sécurité 1 ou 2 moins contraignant présentant des

glycoprotéines de fusion virale. Ces entités sont mises en contact avec des

liposomes contenant une sonde lipidique mimant une cellule à infecter. Dans les

conditions optimales de température et de pH, la fusion est induite entre l’entité

(pseudo)virale et le liposome. Après photomarquage et digestion, l’identification

de l’adduit de photomarquage formé peut théoriquement être effectuée (fig. I.7).

Dans un premier temps, la capacité de photomarquage de nouvelles

sondes lipidiques a été testée sur des protéines modèles hydrophobes en

micelles de détergent.

optimisées

T

T

pseudo-particule virale ou virus

Conditions

Digestion + Liposome

T protéine de fusion virale

Photomarquage

peptide de fusion virale

Sonde lipidique

Identification

Figure I.7 : Méthode générale pour l’identification d’une région hydrophobe marquée. T = traceur


- 26 -

4. Le virus de l’hépatite C

Actuellement, l’organisation mondiale de la santé estime qu’environ 3 % de

la population mondiale a été infecté par le virus de l’hépatite C (VHC) et que 170

millions de personnes sont des porteurs chroniques, à risque de développer une

cirrhose hépatique et/ou un carcinome hépatocellulaire. En France on estime à

370 000 le nombre de personnes infectées par le VHC. 3 à 4 millions de

personnes sont contaminées chaque année et le virus est la cause d’environ 350

000 décès par an dans le monde. Le virus affecte plus particulièrement les

populations d’Afrique et d’Asie avec une prévalence moyenne supérieure à 3%

(allant même jusqu’à 20 % en Egypte) alors que la prévalence dans les pays

occidentaux n’est que de 1,5 % en moyenne19. Il n’existe, à ce jour, aucun vaccin

contre cette maladie et le seul traitement utilisé est une combinaison d’interféron-

et de ribavirine à laquelle ne sont sensibles que 50 % des patients20.

Le VHC fut identifié en 1989 par l’équipe de Houghton21 comme étant une

hépatite non A, non B. C’est un virus enveloppé pH-dépendant22 à ARN positif

simple brin de la famille des Flaviviridae avec un tropisme d’hôte restreint : seul

l’homme et le chimpanzé peuvent être infectés par le VHC.

Le diamètre des particules virales du VHC est de 40 à 60 nm23, ces

particules sont essentiellement composées d’un ARN génomique, d’une

bicouche lipidique contenant majoritairement deux glycoprotéines E1 et E2 et

des protéines de capside.

Le cycle viral du virus de l’hépatite C suit les 6 étapes classiques de la

multiplication d’un virus (fig. I.8 et pour plus de détails : chap I.1.3.) : (a) 19 Les chiffres présents dans ce paragraphe viennent de l’organisation mondiale de la santé : www.who.int consulté le 05/09/2011 20 D. Kwong, S. Cowherd, P. Mueller (2006). Beyond interferon and ribavirin: Antiviral therapies for hepatitis C virus. Drug Discovery Today, 3, 211-220 21 Q. L. Choo, G. Kuo, A. J. Weiner, L. R. Overby, D. W. Bradley, M. Houghton (1989). Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science, 244, 359-362 22 D. Lavillette, B. Bartosch, D. Nourrisson, G. Verney, F. L. Cosset, F. Penin, E. I. Pécheur (2006). Hepatitis C virus mediate low pH-dependant membrane fusion with liposomes. J. Biol. Chem., 281, 3909-3917 23 S. L. Tan, A. Pause, Y. Shi, N. Sonenberg (2002). Hepatitis C therapeutics: current status and emerging strategies. Nature Reviews, 1, 867-881


- 27 -

attachement et pénétration, (b) libération du génome, (c) et (d) transcription et

réplication de l’ARN, (e) assemblage et maturation et (f) libération des nouveaux

virions.

Les cellules hépatocytaires sont la principale cible du VHC mais de

multiples récepteurs ont été identifiés interagissant avec les protéines

d’enveloppe du VHC comme la tétraspanine CD81, le récepteur aux

lipoprotéines de faible densité (LDLR), le récepteur ‘’scavenger’’ SR-BI et la

claudin-124. Après l’attachement, l’entrée du virus se fait par endocytose. Etant

caractérisé comme un virus pH-dépendant22, l’acidification de l’endosome

provoque la fusion de l’enveloppe du virus avec la membrane de l’endosome et

la libération du génome dans le cytoplasme de la cellule. Les protéines

d’enveloppe de ce virus seraient des glycoprotéines de fusion de classe II et

elles possèderaient un peptide de fusion exposé en surface lors de la fusion

(pour le mécanisme global : chap. I.2). Toutefois, les mécanismes précis de

fusion du VHC restent inconnus à ce jour et le peptide de fusion n’a pas encore

été complètement caractérisé25.

24 D. Moradpour, F. Penin, C. M. Rice (2007). Replication of hepatitis C virus. Nature, 5, 453-463 25 R. S. Russell, K. Kawaguchi, J. C. Meunier, S. Takikawa, K. Faulk, J. Bukh, R. H. Purcell, S. U. Emerson (2009). Mutational analysis of hepatitis C virus E1 glycoprotein in retroviral pseudoparticules and cell-cultutre-derived H77/JFH1 chimeric infectious virus particules. J. Viral Hepat., 16, 621-632

Figure I.8 : cycle viral du virus de l’hépatite C d’après Moradpour et al.24


- 28 -

Le génome du VHC est composé d’un ARN positif simple brin de 9,6 kb

comportant deux régions non codantes en 5’ et 3’ et une longue phase de lecture

codant pour une polyprotéine précurseur d’environ 3000 acides aminés. Ce

précurseur protéique est clivé dans le réticulum endoplasmique en trois protéines

structurales (protéine de la capside et glycoprotéines de surface E1 et E2), six

enzymes et la protéine p726 (fig. I.9).

La transcription et la réplication du génome viral s’effectuent au niveau du

réticulum endoplasmique, la libération des nouveaux virions s’effectue par

bourgeonnement de la membrane plasmique.

Malgré plus de vingt ans d’études depuis sa découverte, ce virus reste

encore une énigme par de nombreux aspects. Ceci est dû au fait que le VHC est

un virus de classe 3, il doit donc être manipulé dans des conditions strictes de

sécurité ce qui rend son étude difficile. Le manque d’informations sur le VHC

vient aussi du fait des difficultés à en obtenir des quantités suffisantes : la

virémie des patients infectés est faible et le virion fragile. Pour pallier ces

désavantages, plusieurs modèles in vitro et in vivo ont été développés sans

satisfaction dans les années 1990 pour étudier le VHC. Mais récemment, au

cours des années 2000, deux nouveaux modèles intéressants ont été mis au

point : un modèle basé sur des pseudo-particules du VHC et un autre produisant

des virions VHC dérivés de la culture cellulaire.

26 F. Penin, J. Dubuisson, F. A. Rey, D. Moradpour, J. M. Pawlotsky (2004). Structural Biology of Hepatitis C Virus. Hepatology, 39, 5-19

Figure I.9 : organisation de l’ARN viral codant pour des protéines structurales (S) et non structurales (NS) d’après Penin et al.26


- 29 -

Les pseudo-particules du VHC (VHCpp) sont des particules virales non

pathogènes. Elles sont obtenues après transfection et bourgeonnement dans

des cellules et sont constituées d’une capside rétrovirale et d’une enveloppe

comportant deux glycoprotéines E1 et E2 en surface27.

La découverte d’un virus responsable d’une hépatite fulminante au Japon

en 2005 a permis de développer le premier modèle de réplication in vitro en

cellule hépatique du VHC28. Ce système de réplication permet donc de produire

le VHC en culture cellulaire et ces nouveaux virions produits peuvent infecter

d’autres cellules et les primates.

Les VHCcc sont donc potentiellement pathogènes et doivent être

manipulées en laboratoire de niveau de sécurité 3 contrairement aux VHCpp qui

peuvent se manipuler en laboratoire de niveau de sécurité 2 et qui restent donc

un excellent modèle simple et facilement utilisable pour l’étude des étapes

d’entrée du virus de l’hépatite C dans la cellule hôte lors de l’infection.

27 B. Bartosch, J. Dubuisson, F. L. Cosset (2003). Infectious Hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 enveloppe protein complexes. J. Exp. Med., 197, 633-642 28 T. Wakita, T. Pietschmann, T. Katol, T. Date, M. Miyamotol, Z. Zhaol, K. Murthy, A. Habermann, H. G. Kräusslich, M. Mizokami, R. Bartenschlager, T. J. Liang (2005). Production of infectioud hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nature Med., 11, 791-796


- 30 -

5. Le virus de l’hépatite B

Le virus de l’hépatite B (VHB) est un virus extrêmement contagieux

provoquant des infections du foie potentiellement mortelles. Plus de 2 milliards

de personnes ont été infectées par le VHB au cours de leur vie. Plus de 360

millions de celles-ci présentent des infections chroniques provoquant entre 50

000 et 700 000 décès par an. Cette maladie chronique du foie peut provoquer,

chez les patients atteints, un décès par cirrhose ou cancer du foie. Le premier

vaccin pour lutter contre le VHB appelé Hevac B®, a reçu son autorisation de

mise sur le marché en 1981, il est efficace à 95 % pour éviter l’infection par le

VHB et ses conséquences chroniques. D’autres vaccins ont été développés

depuis comme le GenHevac B®, le Engerix-B®, le Recombivax-HB® ou encore le

HB-VAX DNA®. Malgré l’existence de ces vaccins efficaces pour lutter contre

l’infection, de nombreuses personnes dans le monde sont encore infectées par le

virus. Différents traitements à base d’interférons ou d’inhibiteur de la polymérase

virale existent pour traiter ces personnes mais ces traitements restent chers (ce

qui pose problème pour les pays émergents) et souvent mal tolérés.

Le VHB est un virus enveloppé à ADN double brin de la famille des

Hepadnaviridae. C’est en 1970 que les premières images de virus issu de sérum

de patients présentant une hépatite virale associée à l’antigène « australia » ont

été publiées par Dane et son équipe29. Ce virus est composé de trois types de

particules virales morphologiquement différentes : des particules virales

complètes connues sous le nom de particules de Dane et des particules dites

subvirales soit d’une forme sphérique, soit filamenteuse.

Les particules virales complètes infectieuses d’environ 42 nm de diamètre

sont composées d’une enveloppe lipoprotéique portant des antigènes de surface

et d’une nucléocapside contenant le génome du virus et une polymérase. Le

29 D. S. Dane, C. H. Cameron, M. Briggs (1970). Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis. Lancet, 1, 695-698


- 31 -

génome du virus est constitué d’une petite molécule d’ADN de 3,2 kb30. Les

particules subvirales sont des enveloppes protéo-lipidiques vides non

infectieuses.

Le cycle viral du virus de l’hépatite B suit les 6 étapes classiques de la

multiplication d’un virus31 (fig. I.10 et pour plus de détails : chap I.1.3.) mais

certaines étapes et notamment l’attachement et l’entrée du virus restent encore

mal connues.

Après attachement du virion à la surface d’un hépatocyte, le virus de

l’hépatite B rentre dans la cellule où il rejoint le noyau pour délivrer son génome.

Dans le noyau, ce génome est complété et transcrit en ARN viral puis celui-ci est

traduit dans le cytoplasme de la cellule pour produire les différentes protéines

virales. Le brin d’ADN (-) du VHB est produit à partir de la polymérase ayant une

activité de transcriptase inverse, la polymérase virale assure ensuite l’initiation

de la synthèse du second brin d’ADN (+). A ce moment du cycle de réplication,

une partie des nouvelles nucléocapsides formées retournent au noyau afin 30 J. F. Hruska, D. A. Clayton, J. L. Ruenstein, W. S. Robinson (1977). Structur of Hepatitis B Dane particle DANN before and after the Dane particle DNA polymerase reaction. J. Virol., 21, 666-672 31 S. K. Fung, A. S. F. Lok (2004). Drug Insight: nucleoside and nucleotide analog inhibitors for hepatitis B. Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol., 1, 90-97

Figure I.10 : cycle viral du virus de l’hépatite B et d’après Fung and Lok31


- 32 -

d’amplifier le génome viral, l’autre partie est maturée et libérée par

bourgeonnement de la membrane cytoplasmique pour former de nouvelles

particules virales.


- 33 -

6. Les protéines modèles utilisées

L’étude du photomarquage d’affinité hydrophobe est d’abord effectuée sur

trois protéines modèles membranaires en détergent pour caractériser la capacité

de photomarquage hydrophobe des sondes lipidiques. Ces trois protéines sont la

bactériorhodopsine (bR), la BmrA et la protéine non structurale NS2 du virus de

l’hépatite C.

6.1. La bactériorhodopsine (bR)

La bactériorhodopsine (27099 Da) est l’unique protéine exprimée dans la

membrane plasmique pourpre de Halobacterium salinarium. Cette protéine est

un polypeptide de 248 acides aminés. La structure tridimensionnelle à haute

résolution (2,5 Å) de cette protéine obtenue par diffraction des rayons X est

connue depuis 199732 (Réf. PDB : 1AP9, Swiss-Prot : P02945). Elle est

constituée de sept hélices transmembranaires connectées entre elles par trois

boucles externes et trois boucles cytoplasmiques (fig. I.11).

32 E. Pebay-Peroula, G. Rummel, J. P. Rosenbusch, E. M. Landau (1997). X-ray structure of bacteriorhodopsin at 2.5 angstroms from microcrystals grown in lipidic cubic phases. Science, 277, 1676-1681

Figure I.11 : Structure tridimensionnelle de bR d’après le livre de D. Pol, Biologie-Géologie, 1, 2008.


- 34 -

Cette protéine contient une molécule de rétinaldéhyde (vitamine A

aldéhyde), en rouge sur la fig. I.11, attachée de manière covalente à l’acide

aminé Lysine216 par son amine primaire en via une liaison imine (fig. I.12).

70 % des acides aminés composant cette protéine sont hydrophobes33. bR

s’organise en homotrimère dans la membrane plasmique. C’est une pompe à

proton utilisant l’énergie fournie par la lumière pour générer un gradient de

protons à travers la membrane cellulaire : elle convertit l’énergie d’un photon en

un potentiel électrochimique (fig. I.11).

Cette protéine nous a été fournie par Sigma-Aldrich sous forme lyophilisée

en présence de détergents. Par la suite, la bR provenait de l’équipe du Dr.

Giuseppe Zaccai (Institut Laue Langevin, Grenoble) en solution sous forme de

micelles de détergent à cause d’une baisse de sa pureté chez Sigma-Aldrich :

jusqu’à 30% d’impuretés (fig. I.13 puits 2) ont été détectées après changement

de lot.

33 H. G. Khorana, G. E. Gerber, W. C. Herlihy, C. P. Gray, R. J. Anderegg, K. Nihei, K. Biemann (1979). Amino acid sequence of bacteriorhodopsin. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76, 5046-5050

Figure I.12 : Conformation all-trans du rétinaldéhyde lié à la lysine 216 de la bR par liaison imine

Figure I.13 : qualité de bR : M marqueur All-Blue standard, 1 lot 1 Sigma-Aldrich, 2 lot 2 Sigma Aldrich, 3 lot de Grenoble.

M 1 2 3

10

15

25

75 50 37

bR (27 kDa) impuretés


- 35 -

6.2. La BmrA

BmrA pour ‘’Bacillus multidrug resistance ATP’’, aussi connue sous le nom

de YvcC, est une protéine transmembranaire produite et exprimée par la bactérie

Bacillus subtilis dont la structure est partiellement connue34 (réf. Swiss-Prot

O06967). Il n’existe pas de structure tridimensionnelle à haute résolution

complète connue de cette protéine à ce jour mais une structure tridimensionnelle

à basse résolution (25 Å) est disponible35. C’est une protéine de la famille des

transporteurs MDR (MultiDrug Resistance) et de la super famille des

transporteurs ABC (ATP-binding Cassette). BmrA est un ‘’demi-transporteur’’ qui

fonctionne sous forme d’homodimères mais il existe aussi sous la forme

monomérique et tétramérique25. Chaque monomère est probablement composé

de 6 passages transmembranaires et est composé de 589 acides aminés pour

64519 Da (fig. I.14).

La BmrA nous a été fournie par l’équipe du Dr. A. Di Pietro et du Dr. P.

Falson (UMR CNRS 5086, IBCP Lyon), experte dans l’étude des transporteurs

ABC.

34 O. Dalmas, C. Orelle, A. E. Foucher, C. Geourjon, S. Crouzy, A. Di Pietro, J. M. Jault (2005). The Q-loop disengageq from the first intracellular loop during the catalytic cycle of the multidrug ABC transporter BmrA. J. Biol. Chem., 280, 36857-36864 35 M. Chami, E. Steinfels, C. Orelle, J. M. Jault, A. Di Pietro, J. L. Rigaud, S. Marco (2002). Three-dimensional structure by cryo-electron microscopy of YvcC, an homodimeric ATP-binding cassette transporter from Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 315, 1075-1085

Figure I.14 : structure probable de BmrA d’après Dalmas et al.34

membrane

extracellulaire

intracellulaire


- 36 -

La BmrA est une pompe membranaire capable de déplacer, dans les deux

sens, une grande variété de substances à travers la membrane de la cellule

telles que des lipides, des stérols ou encore des médicaments. Cette protéine est

notamment impliquée dans la résistance bactérienne aux antibiotiques. Le

transport de ces substances par la BmrA est fortement dépendant de son activité

ATPasique36.

L’utilisation d’une souche mutée d’E. Coli a permis de surexprimer BmrA en

membrane bactérienne37. Elle est ensuite purifiée via un His-tag (par ajout de la

séquence peptidique MSSSHHHHHH en position N-terminale) en micelles de

détergent par chromatographie d’affinité Ni-NTA-Agarose. La production et la

purification de cette protéine sont effectuées avec de bons rendements. Cela

nous permet d’avoir un approvisionnement régulier, suffisant et de bonne qualité

(fig. I.15) pour nos études futures.

36 E. Steinfels, C. Orelle, J. R. Fantino, O. Dalmas, J. L. Rigaud, F. Denizot, A. Di Pietro, J. M. Jault (2004). Characterization of YvcC (BmrA), a Multidrug ABC Transporter Constitutively Expressed in Bacillus subtilis. Biochemistry, 43, 7491-7502 37 E. Steinfels, C. Orelle, O. Dalmas, F. Penin, B. Miroux, A. Di Pietro, J. M. Jault (2002). Highly efficient over-production in E. Coli of YvcC, a multidrug-like ATP-Binding cassette transporter from Bacillus subtilis. Biochim. Biophys. Acta, 1565, 1-5

M 1

10

15

25

75 50 37

BmrA (66 kDa)

Figure I.15 : Gel SDS-PAGE de la BmrA après purification. M marqueur All-Blue standard, 1 BmrA.

BmrA sous la forme tétramérique (264 kDa)


- 37 -

6.3. Protéine NonStructurale 2 (NS2) du virus de l’Hépatite C

NS2 est une protéine membranaire non glycosylée de 217 acides aminés

de 23 KDa faisant partie du groupe des protéines non structurales du virus de

l’Hépatite C (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A et NS5B). Lors de sa synthèse par

le complexe de réplication, elle est enchâssée dans la membrane du réticulum

endoplasmique. Elle possède un domaine hydrophobe composé de trois

segments transmembranaires (acides aminés de 4 à 93) en position N-terminale

et un domaine cytoplasmique en position C-terminale (acides aminés de 94 à

217)38(fig. I.16).

La partie membranaire de NS2 semblerait participer au processus

d’assemblage des particules virales du virus de l’hépatite C39 et la partie

cytosolique avec une partie de la protéine NS3 forment une protéase : la NS2-3

cystéine protéase40.

Cette protéine est surexprimée en membrane bactérienne de E. Coli par l’équipe

de F. Penin (UMR CNRS 5086, IBCP Lyon) spécialiste de l’étude du virus de

38 V. Jirasko, R. Montserret, J. Y. Lee, J. Gouttenoire, D. Moradpour, F. Penin, R. Bartenschlager (2010). Structural and Fonctional Studies of Nonstructural Protein 2 of the Hepatitis C Virus Reveal Its Key Role as Organizer of Virion Assembly. PLoS Pathogens, 6, 1-22 39 C. I. Popescu, N. Callens, D. Trinel, P. Roingeard, D. Moradpour, V. Descamps, G. Duverlie, F. Penin, L. Héliot, Y. Rouillé, J. Dubuisson (2011). NS2 Protein of Hepatits C Virus Interacts with Structural and Non-Structural Proteins towards Virus Assembly.PLoS Pathogens, 7, 1-20 40 I. C. Lorenz (2010). The Hepatitis C Virus Nonstructural Protein 2 (NS2): An Up-and-Coming Antiviral Drug Target. Viruses, 2, 1635-1646

Figure I.16 : structure probable de NS2 d’après Jirasko et al.38


- 38 -

l’Hépatite C. Elle nous a été fournie sous une forme fusionnée avec de la

thiorédoxine et un His-tag. Ces modifications sont nécessaires pour sa

production et sa purification. Cette équipe nous a donc fourni une protéine

modifiée ayant une séquence peptidique de 359 acides aminés pour 39 KDa (fig.

I.17).

Ces trois protéines nous ont été fournies en micelles de détergent pour

permettre leur solubilisation et leur contact avec les sondes lipidiques dans un

tampon donné.

Au vu des quantités nécessaires de biomatériaux utiles à la validation et à

l’optimisation de notre stratégie de photomarquage, l’utilisation de ces protéines

a permis une avancée plus rapide du projet du fait de leur relative simplicité

d’approvisionnement et de leur facilité de manipulation en terme de la sécurité.

Ces trois protéines membranaires hydrophobes ont été utilisées avec les

sondes lipidiques pour valider la stratégie de photomarquage hydrophobe

développée au cours de cette thèse. L’utilisation de ces protéines purifiées

permet la simplification du modèle mis en place pour valider cette stratégie par

rapport à l’utilisation d’une pseudo-particule virale ou d’un virus complet.

37 50 75

M 1

10

15

25

NS2 (39 kDa)

Figure I.17 : Gel SDS-PAGE de NS2 après purification. M marqueur All-Blue standard, 1 NS2.


- 39 -

Figure I.18 : marquage d’affinité chimique : exemple de marquage ligand/récepteur d’après H. Bayley58

7. Le marquage d’affinité

Le marquage d’affinité a été développé pour étudier les interactions ligands/

récepteurs, lipides/lipides ou encore lipides/protéines. Le but de cette méthode

est d’identifier une cible spécifique (comme localiser des acides aminés formant

le site de liaison d’un récepteur, identifier la composition d’une membrane ou

encore marquer et/ou identifier une partie spécifique d’une protéine…) parmi un

mélange de cibles potentielles (fig. I.18).

Pour ce faire, la cible est incubée en présence de son ligand modifié par un

groupement fonctionnel réactif. Celui-ci est conçu pour réagir et se lier de façon

covalente avec un résidu spécifique de la cible et marquer celle-ci. Le premier

exemple impliquant cette méthodologie fut l’identification d’un résidu histidine

dans le site actif de la chymotrypsine avec la N-tosyl-L-phénylalanine

chlorométhylcétone (TPCK)41(fig. I.19). TPCK est un analogue réactif du substrat

naturel de la chymotrypsine. Il se lie au site actif de cette enzyme puis réagit de

manière covalente à une histidine et l’inhibe de manière irréversible42.

41 G. Schoellmann and E. Shaw (1963). Direct Evidence for the Presence of Histidine in the Active Center of Chymotrypsin. Biochemistry, 2, 252-255 42 J. M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer (2002). Section 8.5, Enzymes Can Be Inhibited by Specific Molecules. Biochemitry 5th edition, W H Freeman

Réaction non-spécifique

Reconnaissance

Ligand-récepteur

Liaison covalente

spécifique


- 40 -

Figure I.19 : marquage d’affinité de la chymotrypsine par la TPCK. En bleu le groupement spécifique du substrat permettant une interaction spécifique entre le site actif du récepteur (la chymotrypsine) et son ligand (le substrat). En rouge le groupement réactif permettant l’attachement irréversible du substrat modifié au récepteur. Schéma d’après Berg et al.42

Le défaut majeur de cette méthode réside dans le fait que le groupement

fonctionnel réactif du ligand modifié est disponible durant la phase d’incubation et

donc peut réagir ailleurs que sur la cible : du marquage non spécifique est donc

possible. Le deuxième désavantage de cette méthode est la disponibilité du

résidu spécifique du récepteur permettant la réaction entre le ligand et le

récepteur, et donc la création d’une liaison covalente entre eux. Si ce résidu n’est

pas ou peu disponible, l’attachement spécifique du ligand à la cible se fera peu,

voire pas du tout : un mauvais rendement de marquage sera donc à déplorer.

7.1. Le photomarquage d’affinité

Le photomarquage d’affinité, comme pour le marquage d’affinité, consiste à

marquer une molécule d’intérêt par une sonde possédant un groupement

photoréactif en formant une liaison covalente entre ces deux entités : le ligand

modifié et sa cible (fig. I.20). De nombreuses études ont été développées sur ce


- 41 -

Figure I.20 : Réaction de photomarquage entre une molécule d’intérêt et une sonde photoréactive

sujet à partir des années 1960 par Westheimer43 et son équipe mais aussi

notamment à Strasbourg par le Pr. M. Goeldner44,45 tant au niveau de la

modification du ligand que sur le groupement photoréactif.

Cette sonde photoréactive est une molécule, au départ, chimiquement

inerte masquant un intermédiaire hautement réactif. Cet intermédiaire est

démasqué par irradiation UV, à une longueur d’onde définie. Une fois démasqué,

ce groupement est capable de réagir avec une fonction chimique ou un substrat

présent dans son proche environnement en créant une liaison covalente.

La démocratisation de l’utilisation de cette technique par rapport à

l’utilisation du marquage d’affinité simple est due principalement à deux

avantages majeurs apportés par celle-ci. Le premier avantage de cette technique

est la bonne stabilité chimique de la plupart des réactifs photoactivables : ce sont

des molécules chimiquement inertes avant activation. Cette stabilité permet

d’effectuer un ciblage spécifique d’un environnement ou d’un composé donnés

avant la photoactivation des réactifs permettant le marquage et l’analyse de

ceux-ci. Le deuxième avantage de ces molécules photoréactives est

l’exceptionnelle réactivité des intermédiaires photoactivés et leur capacité à

réagir avec la majorité des groupements fonctionnels présents dans les

43 A. Singh, E. R. Thornton, F. H. Westheimer (1962). The Photolysis of Diazo-acetylchymotrypsin. J. Biol. Chem., 237, 3006-3008 44 B. L. Kieffer, M. P. Goeldner, C. G. Hirth (1981). Aryldiazonium salts as Photo-affinity labelling reagents for proteins. J. Chem. Soc., Chem. Commun., 398-399 45 F. Kotzyba-Hibert, I. Kapfer, M. Goeldner (1995). Recent Trends in Photoaffinity Labeling. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 34, 1296-1312


- 42 -

biomolécules46 et notamment avec les liaisons C-H qui sont normalement inertes

vis-à-vis des réactifs chimiques classiques. Cette méthode ne nécessite pas la

disponibilité d’un groupement fonctionnel particulier sur le site à marquer.

Malheureusement la complexité de la réaction de photomarquage conduit à

un mélange de produits de réaction (réarrangement intramoléculaire, réaction

avec le solvant…). Le but est, alors, de choisir le bon groupement photoréactif et

de l’intégrer dans la bonne sonde moléculaire pour limiter les réactions

secondaires et augmenter le rendement de la réaction de photomarquage.

7.1.1) Les premiers exemples d’applications du photomarquage d’affinité

- Identification d’un récepteur dans un mélange de protéines : l’identification

du récepteur de l’insuline présent à l’état de trace dans les membranes

plasmiques des cellules hépatiques a été réalisée en utilisant un dérivé de

l’insuline photoactivable et radioactif (le 4-azido-2-nitrophenyl-insuline) pour

pouvoir détecter l’adduit de photomarquage47. Deux sous-unités du récepteur de

l’insuline ont été identifiées à 135 et 90 KDa grâce à cette méthode.

- Identification d’un site de liaison au sein d’un polypeptide : après

dégradation enzymatique ou chimique d’une cible, la région marquée par un

réactif de photomarquage peut être identifiée et dans certains cas le site du

marquage peut être précisément localisé48.

- L’utilisation de réactifs de photomarquage hydrophobe pour marquer des

lipides ou des protéines membranaires permet l’étude de la structure et de la

composition des membranes49. Après activation à une longueur d’onde

spécifique, le réactif lipidique de photomarquage se lie de façon covalente avec

46 J. Brunner (1993). New photolabeling and crosslinking methods. Annu. Rev. Biochem., 62, 483-514 47 S. Jacobs, E. Hazum, Y. Shechter, P. Cuatrecasas (1979). Insulin receptor: covalent labeling and identificationof subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, 4918-4921 48 A. R. Kerlavage and S. S. Taylor (1980). Covalent modification of an Adenosine. J. Biol. Chem. 255, 8483-8488 49 R. Radhakrishnan, C. M. Gupta, B. Erni, R. J. Robson, W. Curatolo, A. Majumdar, A. H. Ross, Y. Takagaki, H. G. Khorana (1980). Phospholipids containing photoactivable groups in studies of biological membranes. Ann. N.Y. Acad. Sci. 346, 165-198


- 43 -

Figure I.21 : Exemple d’un réactif de photomarquage portant un groupement photoactivable d’après J. Brunner51

ses plus proches voisins. L’utilisation de ce type de réactif permet d’étudier des

complexes protéiques dans la membrane sans déstabiliser la bicouche lipidique.

7.1.2) Caractéristiques du réactif de photomarquage

Plusieurs caractéristiques sont indispensables aux réactifs de

photomarquage et au groupement photoactivable porté par celui-ci pour garantir

une capacité de photomarquage idéale en fonction de son utilisation (fig. I.21).

- Le réactif de photomarquage doit être stable chimiquement et

photochimiquement pour éviter sa dégradation au cours du temps pendant son

stockage. Il doit aussi être stable vis-à-vis des conditions opératoires utilisées

lors des expériences biochimiques (ciblage avant irradiation) : variation de pH,

conditions réductrices…. Le groupement photoactivable doit supporter les

conditions de synthèse, de purification et de caractérisation du réactif de

photomarquage s’il n’y est pas ajouté dans une dernière étape.

- Le groupement photoactivable porté par le réactif de photomarquage ne

doit pas perturber ou déstabiliser l’environnement de ciblage du réactif de

photomarquage. Par exemple, dans le cas d’un photomarquage entre un ligand

et un récepteur, le groupement photoactivable doit être assez petit pour ne pas

induire des perturbations stériques sur le ligand et baisser l’affinité de celui-ci

pour son récepteur.

- L’activation du groupement photoactivable par irradiation UV, à une

longueur d’onde donnée, ne doit pas endommager le système biologique à

étudier. Sachant que les protéines et les acides nucléiques absorbent en

dessous de 300 nm, le réactif de photomarquage doit être activable à une


- 44 -

longueur d’onde supérieure à 300 nm. Une fois activé, il doit réagir plus

rapidement avec la cible avant que celui-ci ne se dégrade.

- La photoactivation du réactif doit former une seule espèce intermédiaire

hautement réactive suffisamment stable pour ne pas conduire à un intermédiaire

réarrangé moins réactif et par là-même à baisser le rendement de

photomarquage.

- L’intermédiaire réactionnel produit par l’activation du groupement

photoactivable doit pouvoir former un adduit stable avec la cible voulue. Cet

adduit doit résister aux conditions expérimentales nécessaires pour

l’identification précise de la zone de marquage comme par exemple un clivage

chimique ou une digestion enzymatique.

7.2. Le Photomarquage hydrophobe de domaines protéiques

membranaires

L’objectif principal de ce marquage hydrophobe est de déterminer la nature

et la composition des lipides et des protéines enchâssées dans une membrane.

L’approche photochimique utilisant des molécules comportant un groupement

photoréactif (fig. I.22) a été développée pour la première fois au courant des

années 197050. Cette méthode permet l’étude structurale et fonctionnelle de

cibles biologiques hydrophobes comme les domaines transmembranaires de

protéines.

50 A. Klip and C. Gilter (1974). Photoactive covalent labeling of membrane components from within the lipid core. Biochem. Biophys. Res. Commun., 60, 1155-1162


- 45 -

Figure I.22 : Exemple de réactifs de photomarquage d’affinité d’après J. Brunner51

Pour ce type de photomarquage une importance toute particulière doit être

donnée à la réactivité du groupement photoactivable activé. Il est absolument

nécessaire que cette espèce chimique soit assez réactive pour s’additionner sur

une liaison C-H pour accroître le rendement de photomarquage des zones

hydrophobes des protéines membranaires. En effet cette partie est formée

principalement d’acides aminés à chaînes latérales aliphatiques chimiquement

inertes51.

La majorité des réactifs photoactivables est basée sur la chimie des

nitrènes ou des carbènes. Les précurseurs photoréactifs correspondant à cette

chimie sont les groupements azoture, diazo et diazirine. Un troisième réactif

photoactivable basé sur la chimie des cétones ,-insaturées et plus

51 J. Brunner (1989). Photochemical Labeling of Apolar Phase of Membranes. Methods in Enzymology, 172, 628-686


- 46 -

Figure I.23 : Les précurseurs photoréactifs et leur réactivité

particulièrement sur les aryl et diaryl cétones (benzophénones) a été développé

ultérieurement et fera l’objet d’un chapitre à part entière (fig. I.23).

7.3. Chimie des carbènes et des nitrènes

7.3.1) Généralités

Le problème majeur du photomarquage d’affinité hydrophobe de protéines

membranaires est la composition même de ces entités biologiques. Les

polypeptides membranaires les composant ne contiennent pas ou peu d’acides

aminés à chaîne latérale réactive. Il a donc fallu trouver des réactifs ou

intermédiaires chimiques ayant une grande réactivité et une faible sélectivité d’un

groupement chimique donné et pouvant réagir avec la plupart des acides aminés

ayant une chaîne latérale chimiquement inerte. Du fait de la production

d’intermédiaires hautement réactifs car déficitaires en électrons, la chimie des

carbènes et des nitrènes est donc apparue comme adaptée à cette

problématique.

Le carbène et le nitrène les plus simples sont respectivement le méthylène

et le nitrène : CH2 et NH. Ils correspondent au produit de l’abstraction de deux

atomes d’hydrogène sur le méthane ou sur l’ammoniac respectivement. Plus

généralement, les carbènes et les nitrènes sont des espèces neutres

(isoélectroniques) à six électrons de valence. C’est pour cela que ces espèces

sont des électrophiles forts, ils cherchent en permanence à compléter leur


- 47 -

couche de valence avec une paire d’électrons. En général, les carbènes sont

plus réactifs que leurs nitrènes correspondants mais finalement la chimie de ces

deux espèces reste assez similaire.

Les carbènes et les nitrènes existent sous deux états d’énergie différents :

l’état singulet et l’état triplet. C’est leur état électronique qui détermine le type de

réaction engendrée.

Les réactions possibles de l’intermédiaire à l’état singulet sont (1) l’attaque

électrophile -électronique (addition sur une double liaison C=C), (2) l’attaque

électrophile -électronique (insertion sur une liaison C-H), (3) l’attaque

électrophile sur un doublet électronique non liant, (4) des réarrangements

(réarrangement de Wolff fig. I.24).

Les réactions possibles de l’intermédiaire à l’état triplet sont (1) l’attaque

radicalaire sur une liaison (abstraction d'hydrogène), (2) l’attaque radicalaire

sur une liaison (addition sur une double liaison C=C pour former un diradical

triplet), (3) l’attaque radicalaire sur un doublet non liant.

L’irradiation directe aux ultraviolets des composés azoture, diazo et

diazirine conduit à l’état de transition singulet des nitrènes et carbènes

correspondants et ceci du fait que leurs précurseurs existent normalement à

l’état singulet (l’état de spin est conservé lors de la réaction de photomarquage).

Les intermédiaires à l’état triplet des carbènes et des nitrènes peuvent être

obtenus indirectement par la décomposition des azotures, composés diazo ou

diazirines initialement convertis à l’état triplet par un agent photosensible.

Figure I.24 : Réarrangement de Wolff


- 48 -

7.3.2) Les nitrènes

Les précurseurs photoréactifs correspondant aux nitrènes sont les

groupements azotures. Après photoactivation, ils génèrent une entité hautement

réactive composée d’un azote monovalent.

a/ Les azotures d’aryle

Les azotures d’aryle sont les premiers groupements photoactivables

utilisés dans la chimie de bioconjugaison52. Ils ont été fréquemment utilisés de

par leur facilité de synthèse, leur relativement bonne stabilité chimique et leurs

excellentes propriétés spectrales. La longueur d’onde d’activation de ces

composés avoisine 300 nm, celle-ci augmente si le cycle aromatique est

substitué.

Il a été clairement démontré que l’intermédiaire photoactivé d’un azoture

d’aryle non substitué conduit principalement à la formation d’un

azacyloheptatriène par une expansion de cycle intramoléculaire rapide. Les

azotures d’aryle ne réagissent donc pas via un nitrène mais via cette nouvelle

entité formée. Celle-ci est un bon électrophile mais reste moins réactive qu’un

nitrène. Finalement au lieu de réagir, non sélectivement, sur une liaison C-H, les

azacycloheptatriènes auront tendance à réagir préférentiellement avec des

nucléophiles tels que les amines (fig. I.25).

Les azotures d’aryle substitués par des fluors ou par d’autres halogènes

ont montré une meilleure efficacité de photomarquage car cette substitution rend

plus difficile la réaction d’expansion de cycle après formation du nitrène. Dans ce

52 G. W. J. Fleet, R. R. Porter, J. R. Knowles (1969). Affinity labeling of antibodies with aryl nitrene as reactive group. Nature 224, 511-512

Figure I.25 : Formation de l’intermédiaire azacycloheptatriène via une expansion de cycle


- 49 -

cas là, en irradiant une fonction azoture d’aryle substituée, celle-ci absorbe un

photon pour générer un nitrène en perdant une molécule de diazote. Ce nitrène

hautement réactif va arracher un proton d’une liaison C-H pour conduire au

produit d’insertion voulu (fig. I.26).

b/ Les azotures d’acyle

Ces composés ont, pour le photomarquage de matériel biologique, une

application limitée du fait de leur mauvaise stabilité. Ils sont rapidement

hydrolysés dans l’eau, leur longueur d’activation est inférieure à 300 nm, ce qui

engendre une dégradation du matériel biologique étudié et la plupart d’entre eux,

une fois activés sous la forme d’un nitrène sont sujets à des réarrangements

intramoléculaires notamment celui de Curtius (fig. I.27).

c/ Les azotures d’alkyle

Le maximum d’absorption de ces composés est aux alentours de 285 nm,

longueur d’onde non compatible avec l’utilisation de matériel biologique. De plus

l’insertion intermoléculaire sur une liaison C-H n’est pas observable en milieu

organique du fait d’un rapide réarrangement intramoléculaire. Une fois le nitrène

formé, une migration d’hydrogène est observée pour former une imine (fig. I.28).

Figure I.26 : Photodécomposition d’un azoture d’aryle générant un nitrène suivi de son insertion sur une liaison C-H

Figure I.27 : Réarrangement de Curtius


- 50 -

7.3.3) Les carbènes

Les précurseurs photoréactifs correspondant aux carbènes sont les

groupements diazo et diazirine. Après photoactivation, ils génèrent une entité

hautement réactive composée d’un carbone divalent (fig. I.29).

a/ Les composés diazo

Les premiers réactifs de photomarquage utilisés sont les esters d’acide

diazoacétique53 (fig. I.30 A). Ces composés ont deux désavantages majeurs : ils

ont une stabilité limitée même à l’obscurité et subissent, après photoactivation,

un réarrangement de Wolff (fig. I.24). L’introduction des esters d’acide 2-diazo-

3,3,3-trifluoropropionique (fig. I.30 B) a été une avancée majeure pour améliorer

la stabilité chimique et le rendement de photomarquage de ce type de

composés, la forme réarrangée est moins observée après irradiation.

D’autres composés diazo comme le p-toluène sulfonyldiazoacétate et le

(dansyldiazométhyl)phosphinate ont été développés (fig. I.31). Ces composés ne

53 A. Singh, E. R. Thornton, F. H. Westheimer P. C. (1962). The photolysis of Diazo-acetylchymotrypsin. J. Biol. Chem., 237, 3006-3008

Figure I.30 : A acide diazoacétique, B acide 2-diazo-3,3,3-trifluoropropionique

A B

Figure I.28 : Migration d’hydrogène 1,2

Figure I.29 : Structure d’un carbène


- 51 -

sont pas adaptés au photomarquage hydrophobe d’affinité car ils sont trop

polaires et trop encombrés.

Malheureusement la plupart des composés diazo ne sont pas idéaux pour

réaliser du photomarquage d’affinité car leur longueur d’onde d’activation est

inférieure à 300 nm.

b/ Les diazirines

Cette catégorie de composés a été découverte dans les années 196054, et

au début des années 1970, Smith et Knowles55 ont décrit pour la première fois la

synthèse du 3-aryl-3H-diazirine. Ces composés et leurs analogues comme le 3-

trifluorométhyl-3-aryldiazirine introduit comme réactif photoactivable dans les

années 1980, sont d’une remarquable stabilité vis-à-vis d’un grand nombre de

conditions chimiques (acide fort, base forte ou agent réducteur comme NaBH4) et

sont efficacement photoactivés dans le proche UV (activation de 350 à 380 nm)

pour générer un carbène très réactif (fig. I.32). Malheureusement l’irradiation des

diazirines conduit aussi à la formation d’un photoisomère : un composé diazo

linéaire moins réactif.

54 S. R. Paulsen (1960). 3,3-Dialkyl-diazacyclopropen. Angew. Chem., 72, 781 55 R. A. G. Smith and J. R. Knowles (1973). Aryldiazirine. Potential Reagents for photolabeling of biological receptor sites. J. Am. Chem. Soc., 95, 5072-5073

Figure I.31 : A p-toluène sulfonyldiazoacétate , B (dansyldiazométhyl)phosphinate

A B


- 52 -

H

N N

R

H

N N

R

H

R

H

R

N

N

h

*

h-N2

-N2

7.4. Les benzophénones

L’utilisation des aryl-cétones comme sondes photoactivables date du début

des années 1970 : la première application d’une benzophénone activée dans un

système biologique a été décrite en 1974 par l’équipe de Galardy56. Cependant,

leur potentiel comme sondes photoactivables a été longtemps sous-estimé. Elles

ont été redécouvertes et réutilisées comme sondes biochimiques au cours des

années 1980 : la benzophénone a été utilisée comme réactif photoactivable pour

fonctionnaliser des liaisons C-H dans les stéroïdes57. En 1983 seulement peu

d’exemples d’utilisation de la benzophénone comme sonde photoactivable ont

été décrits58. Trois années plus tard, les indices s’accumulent montrant l’utilité et

les avantages à utiliser les dérivés de la benzophénone pour obtenir des

modifications covalentes de nucléotides59. Ces dérivés photoactivables sont

maintenant largement utilisés pour des études d’interaction peptide-protéine. Ces

dérivés ont même montré une meilleure commodité d’utilisation que leurs

analogues azotures d’aryle ou diazirine précédemment employés.

56 R. E. Galardy, L. C. Craig, J. D. Jameison, M. P. Printz (1974). Photoaffinity labeling of peptide hormone binding sites. J. Biol. Chem., 249, 3510-3518 57 R. Brelow (1980). Biomimetic control of chemical selectivity. Acc. Chem. Res., 13, 170-177 58 H. Bayley (1983). Photogenerated reagents in biochemistry and molecular biology. Elsevier, 1-187 59 N. Williams, S. H. Ackerman, P. S. Coleman (1986). Benzophenone-ATP : A photoaffinity Label for active site of ATPases. Methods Enzymol., 126, 667-682

Figure I.32 : Schéma général de la photoactivation d’une 3-aryl-3H-diazirine.


- 53 -

L’utilisation généralisée de la benzophénone comme groupement

photoactivable est principalement attribuée à trois avantages chimiques et

biologiques. Le groupement benzophénone porté par un réactif de

photomarquage est chimiquement et photochimiquement plus stable que les

groupements diazo, azotures d’aryle et diazirines : il peut être manipulé à la

lumière du jour sans être dégradé. Ensuite la longueur d’onde d’activation de la

benzophénone se situe entre 350 et 360 nm évitant les longueurs d’onde

destructrices pour les protéines. Enfin les benzophénones réagissent

préférentiellement avec liaisons C-H chimiquement inertes même en présence

d’eau et en présence de la plupart des nucléophiles.

7.4.1) Mécanisme d’activation – photoréduction du groupement carbonyle

Ces dérivés sont activés entre 350 nm et 360 nm. L’irradiation de la

benzophénone dans cette zone de longueur d’onde permet l’absorption d’un

photon (fig. I.33). Il en résulte le transfert d’un électron de l’orbitale n sp2 non

liante de l’oxygène à l’orbitale * antiliante du groupement carbonyle pour former,

en cassant la double liaison, un diradical dans un état triplet.

O

R

R1

O

R

R1

hOH

R

R1

R

R1

HOO

R2 NH

NH

OR2

NH

OR2

H

+H-abstraction

Figure I.33 : Schéma général de la photoactivation de la benzophénone et insertion dans une protéine d’après Dorman and Prestwich60


- 54 -

Ce diradical formé est capable de réagir avec les liaisons C-H. Le déficit

électronique de l’orbitale n de l’atome d’oxygène engendre une entité

électrophile. Cet électrophile va interagir avec une liaison C-H d’une espèce

proche pour aboutir à l’abstraction de l’hydrogène de cette liaison pour compléter

son orbitale n. L’abstraction de l’hydrogène de l’acide aminé se produit sur le

carbone pour former l’entité radicalaire. Il en résulte deux nouvelles entités

radicalaires : un radical diphényl hydroxy méthyle et un acide aminé radicalaire.

Ces deux radicaux vont se recombiner via une liaison covalente pour former le

produit de photomarquage d’intérêt : l’insertion du groupement benzophénone

sur la protéine, un composé de type benzopinacol est ainsi formé. Si la molécule

ne trouve pas de donneur d’hydrogène à proximité (2,5 Å à 3,1 Å)60 ayant une

orientation favorable à une interaction, la réaction ne se produit pas. La

benzophénone va alors rapidement retourner à son état initial. L’activation par

irradiation de la benzophénone ne conduit donc pas à un composé inactivé si

celui-ci ne réagit pas immédiatement contrairement aux dérivés arylazotures ou

diazirine. L’irradiation de la benzophénone est donc réversible alors que pour les

autres groupements photoactivables elle est irréversible, il s’agit là d’un des

avantages majeurs de ce groupement. Le groupement benzophénone peut ainsi

enchaîner les cycles excitation-relaxation jusqu’à avoir la bonne géométrie pour

interagir avec un donneur d’hydrogène. Grâce à ce phénomène, le rendement de

photomarquage avec la benzophénone est plus élevé qu’avec les autres

groupements photoactivables.

Les liaisons C-H, donneurs d’hydrogène favorables à l’interaction

protéine/benzophénone, sont abondantes dans les protéines et plus encore dans

les acides aminés membranaires mais absentes dans les solvants les plus

utilisés et particulièrement dans l’eau, milieu prépondérant aux expériences

biologiques. Le diradical généré par l’irradiation ne va pas réagir avec la plupart

des solvants nucléophiles et protiques à l’inverse des nitrènes et carbènes très

réactifs. L’espèce formée n’a pas non plus la possibilité d’effectuer un

60 G. Dorman and G. D. Prestwich (1994). Benzophenone Photophores in Biochemistry. Biochemistry, 19, 5661-5673


- 55 -

réarrangement intramoléculaire. Elle n’a donc que deux possibilités : soit se

coupler avec son plus proche voisin ayant une liaison C-H convenablement

orientée, soit retourner à l’état initial d’où elle peut être réactivée par un nouveau

photon. C’est pour ces raisons que les benzophénones sont des groupements

photoactivables plus efficaces que les systèmes basés sur des groupements

azotures.

Ainsi la réaction d’insertion sur une liaison C-H de la benzophénone produit

principalement un adduit covalent chimiquement stable et stable aussi vis-à-vis

des clivages enzymatiques, ce qui est intéressant pour une utilisation ultérieure

(analyses chimiques, expériences biologiques : digestion) de l’adduit formé.

Le taux de liaison du groupement benzophénone peut atteindre 40%61. Ce

rendement de marquage est atteint lorsqu’un phospholipide contenant un

groupement benzophénone inséré dans un liposome préparé avec 1,2-

dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine (DML) est photoactivé et donc réagit

avec le DML. Les rendements de photomarquage de la benzophénone sont

corrects quant celle-ci est insérée dans un système organisé (liposome ou

particule lipidique) mais le rendement de marquage peut tomber à moins de 0,1

%62 dans certains systèmes hétérogènes.

A Strasbourg, l’équipe du Pr. Ourisson a mené une étude sur la réactivité

de la benzophénone sur des acides aminés par photoactivation63. Il en ressort

que la photoalkylation d’un acide aminé par la benzophénone en milieu

organique forme principalement le produit de couplage sur le carbone de

l’acide aminé pour la glycine, l’alanine et la phénylalanine. Par contre, dans le

cas de la méthionine, la benzophénone réagit plutôt sur le carbone (carbone

adjacent au sulfure) ou sur le groupement méthyle porté par la fonction sulfure.

61 B. John, E. R. Kumar, A. K. Lala (2000). Depth-dependent analysis of membranes using benzophenone-based phospholipids. Biophysical Chemistry, 87, 37-42 62 C. Montecucco, G. Schiavo (1986). 1-Pamitoyl-2-(p-benzoyl)benzoyl phosphatidylcholine, a photoactive phospholipid for the labeling of membrane components. Biochem. J., 237, 309-312 63 E. Deseke, Y. Nakatani, G. Ourisson (1998). Intrinsic Reactivities of Amino Acids towards Photoalkylation with Benzophenone – A Study Preliminary to Photolabelling of the Transmembrane Protein Glycophorin A. Eur. J. Org. Chem., 243-251


- 56 -

L’avantage de la méthionine démontré par cette étude est qu’elle a une bonne

réactivité mais aussi une bonne stabilité de l’adduit de photomarquage formé.

Dans tous les cas testés, la réaction de couplage est réalisée après

photoactivation entre la forme radicalaire de la benzophénone et le radical acide

aminé le plus stable.

Cette étude sur la réactivité de la benzophénone avec les acides aminés a

été réalisée en solution et a aussi prouvé que les rendements dépendent du

système utilisé : en solution (haut degré de liberté) les rendements sont plus

faibles comparés aux rendements de cette réaction effectuée dans une

membrane (système organisé, moins libre).

7.5. Bilan

Voici résumés les différents groupements photoréactifs existant depuis les

années 1970 (tab. I.1). Il est à savoir que dans chaque catégorie, une multitude

de molécules et d’analogues a été développée en fonction de la problématique

posée. Les rendements de couplage de la réaction de photomarquage de ces

composés varient fortement en fonction de l’environnement étudié et du type de

molécules utilisées.

longeur d'onde d'activation

(en nm) Stabilité

Les nitrènes azoture d'aryle non substitué <300 Expansion de cycle46 substitué ~300 azoture d'acyle <300 Réarrangement de Curtius51

azoture d'alkyle ~285 Migration d'hydrogène51 Les carbènes Diazo ~340 Réarrangement de Wolff51 Diazirine 350-380 Les benzophénones 350-360

Tableau I.1 : Les différents groupements photoréactifs, leur longueur d’onde d’activation et leur stabilité


- 57 -

La réussite d’un couplage de deux entités par une réaction de

photomarquage d’affinité n’implique pas seulement le choix du groupement

photoréactif mais aussi le réglage de plusieurs autres paramètres. Ces

paramètres sont le substrat à marquer, l’environnement de la réaction, la

spécificité voulue du marquage ou encore le temps d’irradiation en fonction

desquels sera choisie la bonne molécule de photomarquage avec le bon

groupement photoréactif pour conduire au rendement de marquage maximal.

Dans un premier temps, la conception et la synthèse d’une sonde lipidique

de référence (SLR) est détaillée dans une première partie, suivie par la synthèse

d’analogues de la sonde lipidique de référence : ces analogues sont le résultat

de la variation de la position du groupement photoactivable, du changement de

traceur et de la modification de la plateforme trifonctionnelle.

Une seconde partie est consacrée d’abord à la caractérisation de l’activité

des sondes fluorescentes, à l’optimisation du protocole de photomarquage et à

leur capacité de photomarquage de protéines membranaires modèles. Ce

premier point est suivi de l’application de cette méthode à la caractérisation et à

l’identification plus précise de la zone marquée des protéines utilisées en

spectrométrie de masse. Pour terminer cette partie, des solutions sont mises en

place pour améliorer le protocole d’identification de zones marquées en utilisant

d’autres analogues et en augmentant le rendement de photomarquage. Des

expériences préliminaires sont menées sur le VHB et VHCpp.

Une troisième partie est développée sur des projets annexes effectués

durant cette thèse sur la synthèse de composés lipidiques bicaténaires

polyfonctionnels.

II. Conception et synthèse des sondes lipidiques

- 59 -

II. Conception et synthèse des

sondes lipidiques


- 61 -

Traceur

Figure II.1 : Structure générale de la sonde lipidique

PFL : plateforme de liaison

Fonction photo-réactive

Figure II.2 : Sondes lipidiques soit en micelle de détergent à gauche, soit dans un liposome à droite

1. Conception générale d’une famille de sondes lipidiques

Pour pouvoir étudier les interactions protéines/lipides, une nouvelle famille

de composés multifonctionnels lipidiques ayant la capacité de réaliser du

photomarquage d’affinité hydrophobe a été développée. La démarche de

conception de cette famille est ici résumée. La molécule-cible doit posséder trois

fonctionnalités : i) avoir la structure d’un lipide bicaténaire, ii) posséder un

groupement photoréactif, et iii) porter un traceur. Ces trois fonctionnalités sont

connectées ensemble par une plateforme de liaison multifonctionnelle (PFL)

comme par exemple un tri-acide, une tri-amine, un dérivé du glycérol ou encore

un acide aminé possédant au moins trois groupements réactifs (fig. II.1).

La structure lipidique des sondes est indispensable pour permettre leur

insertion, de façon stable et non réversible, au sein d’un système hydrophobe :

micelle de détergent ou bicouche lipidique64 (fig. II.2).

T

T

T

T

T

TT

TT

TT

TT

TT

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

Ce type d’organisation supramoléculaire est nécessaire pour ‘’solubiliser’’

les sondes lipidiques dans un milieu aqueux et pour qu’elles puissent interagir

64 R. M. Epand (1997). Biophysical Studies of Lipopeptide-Membrane Interactions. Biopolymers, 43, 15-24

P F L


- 62 -

avec le matériel biologique hydrophobe étudié, principalement des protéines

transmembranaires enchâssées dans des micelles de détergent. La structure

lipidique choisie est composée d’une chaîne grasse saturée de 16 carbones et

d’une deuxième chaîne grasse contenant un groupement photoréactif (fig. II.3).

Cette deuxième chaîne grasse intégrant le groupement photoréactif doit

répondre à deux fonctionnalités : i) être assez longue pour s’insérer dans un

système lipidique, ii) être photoactivable et ainsi réagir avec des acides aminés

hydrophobes présents dans son voisinage.

L’intégration du groupement photoréactif dans une chaîne grasse permet

aussi sa bonne orientation au sein de la couche lipidique et surtout permet

d’éviter un retournement de celui-ci vers l’extérieur du système lipidique65.

Enfin le traceur intégré aux sondes lipidiques doit permettre la détection

et/ou la purification des produits résultant de la réaction de photomarquage pour

pouvoir les identifier et les analyser. A ce stade de la conception, il peut être un

élément radioactif, un chromophore ou une molécule d’intérêt reconnue par un

substrat comme la biotine.

2. Conception et synthèse de la sonde lipidique de référence

Le groupement photoréactif choisi pour la première sonde lipidique conçue

est la benzophénone positionnée au milieu d’un acide gras. Ce choix repose sur

les arguments avancés chapitre I.7.4. Le traceur intégré à cette sonde est un

fluorophore. Les trois fonctionnalités indispensables à notre sonde sont

connectées ensembles via une plateforme de liaison trifonctionnelle (fig. II.4).

65 A.K. Lala (2002). Fluorescent and photoactivable probes in depth dependent analysis of membrane. Chemistry and Physics of Lipids, 116, 177-188

Figure II.3 : Structure de l’acide gras intégrant le groupement photoréactif


- 63 -

Fluorophore

2.1. La plateforme liaison (PFL)

La plateforme de liaison trifonctionnelle choisie est un acide aminé

commercial, l’acide N-t-Butyloxycarbonyl-L-2,3-diaminopropionique (Boc-L-Dpr-

OH, fig. II.5 A).

OHN

OOH

O

NH2

Cet acide aminé présente l’avantage de posséder trois groupements

fonctionnels différents : une amine libre, un acide carboxylique et une amine

protégée. L’utilisation de ce squelette nous évite plusieurs étapes de protection-

déprotection lors de la synthèse de la sonde a contrario d’un squelette

multifonctionnel dont les fonctions ne sont pas ou peu différenciées comme par

exemple le glycérol (fig. II.5 B).

La connexion des différentes fonctionnalités sur notre plateforme Boc-L-

Dpr-OH est effectuée par couplage peptidique, en formant des liaisons amides.

La liaison amide a l’avantage d’être stable et résistante aux conditions

expérimentales envisagées66 : tant lors de la synthèse que du photomarquage.

Pour que la réaction de formation d’une liaison amide entre une amine libre et un

acide carboxylique fonctionne, il est nécessaire d’activer le groupement

carboxyle mis en jeu avec un agent de couplage (fig. II.6). 66 L. Bourel-Bonnet, E. I. Pécheur, C. Grandjean, A. Blanpain, T. Baust, O. Melnyk, B. Hoflack, H. Grass-Masse (2005). Anchorage of Synthetic Peptides onto Liposomes via Hydrazone and a-Oxo Hydrazone Bonds. Preliminary Functional Investigation. Bioconj.Chem., 16, 450-457

Figure II.5 : A. Structure de Boc-L-Dpr-OH, B. Structure du glycérol

A B

Figure II.4 : Structure générale de la sonde lipidique de référence

P F L

O


- 64 -

Les premiers agents de couplage activateurs des groupements carboxyles

développés ont été les carbodiimides comme le dicyclohexylcarbodiimide (DCC)

permettant la formation d’urées O-acylées hautement réactives (fig. II.7 A).

Malheureusement les intermédiares formés sont très réactifs, ce qui peut

provoquer la racémisation des acides aminés67. Pour pallier ce problème, de

nouvelles molécules telles que le 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) et le 1-hydroxy-

7-azabenzotriazole (HOAt), son analogue azoté, ont été développées. Ces

agents de couplage réagissent avec les urées O-acylées obtenues grâce aux

carbodiimides pour former des esters activés moins réactifs donc plus stables, ce

qui diminue la possibilité de racémisation3 (fig. II.7 B).

BocHN

R

O

O

N

NH

67 L. A. Carpino (1993). 1-Hydroxy-7-azabenzotriazole. An Efficient Peptide Coupling Additive. Journal of the American Chemical Society 115, 4397-4398

A B

Figure II.6 : Formation d’une liaison peptidique.

Figure II.7 : (A) Urée O-acylée formée par la réaction du DCC avec un acide aminé. (B) Ester activé d’un acide aminé formé par la réaction de l’urée O-acylée A avec HOBt ou formé directement par réaction avec PyBOP.


- 65 -

Mais ce type d’activation du groupement carboxyle donne, dans certains cas,

des rendements de réaction insuffisants pour ce type de réaction68 et les agents

de couplage cités, notamment le monohydrate d’HOBt, ont été récemment

classifiés comme explosifs69.

D’autres agents de couplage ne nécessitant plus l’utilisation des

carbodiimides ont été développés. L’ester activé est obtenu directement en

solution sous la forme d’un sel d’uronium ou de phosphonium d’un anion

«spectateur» non nucléophile comme le tétrafluoroborate ou

l’hexafluorophosphate. Ces agents de couplages sont par exemple l’HBTU

(hexafluorophosphate de 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium), le

BOP (hexafluorophosphate de benzotriazolyloxy)-tris(diméthylamino)-

phosphonium) ou le PyBOP (hexafluorophosphate de benzotriazolyloxy-

tris[pyrrolidino]-phosphonium)70 (fig. II.8).

O N

N

NN

N+

PF6-

O-

OP

N

NN

NN

N

PF6-

Malheureusement l’utilisation du BOP ou de son analogue l’HBTU génère des

résidus toxiques comme l’hexaméthylphosphoramide71 (HMPA) et la

tétraméthylurée respectivement (fig. II.9), connus pour être des agents alkylants

carcinogènes. C’est pour cela que nous avons préféré utiliser le PyBOP comme

agent de couplage.

68 E. Frérot, J. Coste, A. Pantaloni, M. Dufour, P. Jouin (1991). PyBOP and PyBroP : two reagents for the difficult coupling of the -dialkyl amino acid. Tetrahedron 47, 259-270 69 K. D. Wehrstedt, P. A. Wandrey, D. Heitkamp (2005). Explosive properties of 1-hydroxybenzotriazoles. Journal of Hazardous Materials 126, 1-7 70 Coste, J., Le-Nguyen, D. and Castro, B (1990). PyBOP(R): A new peptide coupling reagent devoid of toxic by-product. Tetrahedron Letters 31, 205-208 71 IARC monographs (1999) vol 71, 1465-1481

Figure II.8 : Structures de l’HBTU, du BOP, du PyBOP


- 66 -

OP

N

NN

O N

N

Les réactions de couplage peptidique réalisées avec le PyBOP donnent

d’aussi bons rendements qu’avec le BOP ou l’HBTU. Cependant cet agent a

l’avantage d’être dépourvu de toxicité du fait du remplacement des groupements

diméthylamine par des groupements pyrroles. Bien sûr d’autres agents de

couplage existent et sont utilisés en fonction de la réaction mise en jeu. Ce sont

soit des agents de couplage plus réactifs pour réaliser des réactions de

couplages peptidiques difficiles, soit des agents de couplage permettant une

baisse de la racémisation lors de la réaction72.

2.2. Le fluorophore

Historiquement, la détection de l’adduit de photomarquage entre un réactif

de photomarquage et une protéine ou une molécule d’intérêt est assurée par un

élément radioactif : [125I], [131I], [3H], [14C] principalement73. Cet élément est

attaché de manière covalente au réactif de photomarquage et nécessite donc

une étape de synthèse délicate et la manipulation d’un radioélément tout au long

des expérimentations. Même si cette méthode est efficace et parfaitement

décrite, elle engendre un certain nombre de désavantages : une faible activité

spécifique de certains analogues radioactifs, une durée de demi-vie courte (8,02

jours pour 131I)73, la toxicité des éléments manipulés (rayonnement pour 125I),

une réglementation en vigueur complexe pour la manipulation d’éléments

radioactifs (demande de licence à l’IRSN, installation spécifique) et le coût élevé

de traitement des déchets. C’est pour cela qu’un fluorophore a été choisi en lieu

72 Merck, Novabiochem (2008/2009). Peptide Synthesis, Coupling reagents and additives. 265-270 73 J. Brunner (1989). Photochemical Labeling of Apolar Phase of Membranes. Methods in Enzymology, 172, 628-687

Figure II.9 : Structure de l’HMPA et de la tétraméthylurée


- 67 -

et place, pour nous permettre de suivre et de valider notre stratégie de marquage

par détection de fluorescence, sans utiliser de radioéléments. Le fluorophore

choisi est la 5,6-carboxy-tétraméthyl-rhodamine (5,6-CTMR) (fig. II.10) pour sa

stabilité dans les conditions de synthèse et d’utilisation envisagées :

le cœur rhodol de la rhodamine est photostable et est relativement insensible

aux changements de pH. Cette rhodamine est disponible commercialement sous

la forme d’un mélange de régioisomères. Il a été montré précédemment que la

présence de ces deux isomères n’a pas d’influence sur les résultats des

expériences effectuées avec les sondes lipidiques dont il est question dans ce

manuscrit74.

2.3. Le dérivé photoactivable : synthèse de l’acide 6-(4-(4-n-hexyl

benzoyl)phényl) hexanoique, C6-BP-C5-COOH (1)

Il n’existe pas d’acide gras contenant une benzophénone répondant aux

critères de longueur exposés plus haut disponibles dans le commerce. Un

premier composé ayant la benzophénone au milieu de la chaine aliphatique de

l’acide gras décrit par l’équipe de E. R. Kumar75 a été choisi. La position de la

benzophénone par rapport à la fonction acide carboxylique a été choisie pour

minimiser la gène stérique entre les deux chaines grasses et pour assurer la

meilleure stabilité possible et la bonne orientation de ce dérivé benzophénone

74 P. Jolimaitre, A. Roux, A Blanpain, C. Leduc, P. Bassereau, L. Bourel-Bonnet (2005). Synthesis and preliminary physical applications of a rhodamin-biotin phosphatidylethanolamine, an easy attainable lipid double probe. Chemistry and Physics of Lipids, 133, 215-223 75 A. K. Lala, E. R. Kumar (1993). Orientation of the benzophenone group at various dephts in bilayers. J. Am. Chem. Soc., 115, 3982-3988

Figure II.10 : Structure de la 5,6-carboxy-tétraméthyl-rhodamine


- 68 -

une fois inséré dans une bicouche lipidique. La synthèse de ce dérivé a été

réalisée suivant la méthode de A. K. Lala52 sans optimisation à partir de l’acide 6-

phénylhexanoique et du chlorure de 4-hexylbenzoyle commercialement

disponibles en trois étapes (fig. II.11).

La première étape consiste en la protection de l’acide 6-phénylhexanoïque

en son ester méthylique correspondant. Ensuite le 6-phénylhexanoate de

méthyle est couplé au chlorure de 4-hexylbenzoyle via une réaction de

substitution électrophile. Cette réaction d’acylation de Friedel-Crafts est effectuée

en présence du trichlorure d’aluminium comme acide de Lewis. La dernière

étape consiste en la déprotection de l’ester méthylique obtenu par une

saponification à l’aide d’une solution de potasse dans le méthanol pour conduire

au produit 1 sous la forme d’un solide gras légèrement jaune. Le rendement

global de ces trois étapes est de 45 %.

2.4. Ordre d’introduction des fonctionnalités de la sonde sur la

plateforme

Le premier groupement fonctionnel inséré sur la plateforme de liaison

trifonctionnelle est l’acide gras contenant le groupement photoactivable (a) (fig.

II.12). Son insertion au début de la synthèse nous permet d’avoir un suivi facile

de l’avancement de nos différentes étapes de réaction grâce aux propriétés

Fig. II.11 : Schéma général de la synthèse de C6-BP-C5-COOH 1


- 69 -

Fluorophore

spectrales du groupement photoactivable, la benzophénone. Celle-ci est visible

en UV à 254 nm ce qui permet de suivre nos réactions par CCM. Ensuite, la

deuxième étape consiste en l’insertion de la deuxième chaîne aliphatique :

l’hexadécylamine (b). L’étape suivante est la déprotection de la deuxième amine

de notre plateforme pour l’avoir sous sa forme libre nécessaire à la suite de la

synthèse. La dernière étape est la fixation du fluorophore 5,6-CTMR sur la

plateforme (c). La rhodamine est fixée à la fin du processus à cause des

difficultés de purification engendrées par l’entité formée (mélange de deux

régioisomères) et pour limiter les quantités de réactif engagées.

2.5. Synthèse de la sonde lipidique de référence Rhod-Dpr(CO-C5-BP

C6)-NH-C16H33 (5)

Il faut donc 4 étapes à partir de l’acide gras (C6-BP-C5-COOH 1) et de

l’acide aminé Boc-L-Dpr-OH pour conduire à une sonde lipidique bicaténaire

polyfonctionnelle (fig. II.13).

Figure II.12 : Ordre d’introduction des fonctionnalités sur la plateforme

P F L

c

Figure II.13 : Schéma de la synthèse de la sonde lipidique de référence 5

PFL : plateforme de liaison

b

aO


- 70 -

Cette synthèse commence par l’activation de l’acide 1 par le PyBOP en

présence de DIEA. Celui-ci réagit ensuite sur l’amine libre du Boc-L-Dpr-OH, en

milieu basique (DIEA) pour garder l’amine sous la forme non protonée, via une

addition nucléophile. 12h de réaction sont nécessaires pour avoir une conversion

optimale. Le produit 2 est obtenu sous la forme d’un solide blanc avec un

rendement de 83 %. Il est à remarquer que l’acide aminé Boc-L-Dpr-OH n’est

pas très soluble dans le mélange de solvants CH2Cl2/MeOH, mais qu’une fois

que l’acide activé a été ajouté à notre milieu, le produit de la réaction 2 formé se

solubilise parfaitement dans le milieu réactionnel.

L’hexadécylamine est ensuite greffée à 2. Pour ce faire, la fonction acide

libre de 2 est préalablement activée avec du PyBOP en présence de DIEA. La

fonction amine de l’hexadécylamine réagit ensuite via une addition nucléophile

sur le groupement carboxyle activé de 2 (ester d’HOBt) en milieu basique (DIEA)

pour conduire à un composé contenant deux chaînes grasses. Cette nouvelle

molécule 3 est obtenue sous la forme d’un solide gras jaune avec un rendement

de 78%.

La fonction amine du produit 3 est ensuite déprotégée par acidolyse du

groupement protecteur Boc en milieu acide (TFA) dans CH2Cl2 pour conduire au

produit 4. Le rendement de cette étape est quasi quantitatif. Cette réaction ne

nécessite pas de purification.

L’amine primaire libre de la molécule 4 est ensuite couplée avec du 5,6-

CTMR. La fonction acide du 5,6-CTMR est préalablement activée par le PyBOP

en présence de DIEA avant de réagir avec l’amine libre de 4 via une réaction

d’addition nucléophile pour conduire au produit final 5 sous la forme d’un solide

violet avec un rendement de 74 %. Le rendement isolé global de ces quatre

étapes est de 36%.


- 71 -

3. Synthèse d’analogues

Différents analogues ont été synthétisés, soit ayant le groupement

benzophénone à distance variable sur l’acide gras, soit avec un traceur différent

ou encore en faisant varier le squelette. L’assemblage des différentes

fonctionnalités de ces nouvelles sondes lipidiques a été effectué selon le même

schéma de synthèse en 4 étapes que pour la sonde lipidique de référence

(même stratégie de synthèse, fig. II.13 p. 69).

3.1. Synthèse de sondes lipidiques fluorescentes avec un

groupement photoactivable à distance variable

La spécificité du marquage de protéines avec notre sonde lipidique n’est

pas du seul fait du groupement photoactivable choisi mais aussi de

l’environnement dans lequel il est placé. C’est pour cela que la position de la

benzophénone sur l’acide gras a une grande importance pour l’identification de

zones hydrophobes plus ou moins proches de la surface du système lipidique

utilisé.

Deux analogues d’acides gras portant le groupement benzophénone plus

ou moins éloigné de la fonction acide carboxylique ont été synthétisés : la

distance d est variable (fig. II.14).

d

Figure II.14 : Structure de l’acide gras portant le groupement photoactivable


- 72 -

Ces synthèses sont inspirées des publications de T. A. Spencer76,77.

3.1.1) Synthèse des acides gras contenant le groupement benzophénone

Deux stratégies ont été utilisées pour synthétiser l’acide gras contenant le

groupement benzophénone : i) l’assemblage de la benzophénone via une

réaction de Friedel-Craft suivi de la mise en place du précurseur du groupement

acide carboxylique terminal porté par une chaîne aliphatique par une réaction de

couplage de Suzuki ou ii) l’assemblage de la benzophénone à partir d’un dérivé

organométallique portant le précurseur du groupement acide carboxylique et

d’un aldéhyde aliphatique d’autre part (fig. II.15).

O

O

OHm n

O

m

Z

O

OHn

X

Y

X

O

OHn

a/ Synthèse de l’acide 11-(4-(4-méthylbenzoyl)phényl)undécanoique : C1-

BP-C10-COOH (9)

La synthèse de ce premier dérivé est réalisée en 5 étapes en partant de

l’acide 10-undécénoïque et du chlorure de 4-bromobenzoyle commerciaux (fig.

II.16).

76 P. Wang, D. H. Blank, T. A. Spencer (2004). Synthesis of Benzophenone-Containing Analogues of Phosphatidylcholine. J. Org. Chem. 69, 2693-270 77 Y. Gan, P. Wang, T. A. Spencer (2006). Synthesis of Benzophenone-Containing Fatty Acids. J. Org. Chem. 71, 9487-9490

Formation de la benzophénone

Création d’une liaison C-C

Figure II.15 : Schéma rétrosynthétique de l’acide gras intégrant la benzophénone


- 73 -

Br

Cl

O O

Br

OH

O

O

O

O

O

OO

OH

O

Toluène

AlCl3

MeOH

H2SO4

KOH95 % EtOH

1. 9-BBN, THF

2. Pd(dppf)Cl2, Cs2CO3, AsPh3

DMF, H2O, THF

(6)

(9)

(8)

(7)

- Formation de la benzophénone

La 4-bromo-4’-méthylbenzophénone est préparée selon la méthode de

Nakatani et al.78, en faisant réagir le chlorure de 4-bromobenzoyle avec du

toluène via une réaction d’acylation de Friedel-Craft (fig. II.17), c’est une réaction

de substitution électrophile aromatique.

Le toluène est à la fois le réactif et le solvant. Cette réaction s’effectue en

présence d’un acide de Lewis, le trichlorure d’aluminium. La molécule 6 est

obtenue sous la forme d’un solide jaune avec un rendement de 75%.

78 K. Nakatani, C. Dohno, T. Nakamura, I. Saito (1998). p-Cyano Substituted Benzophénone as an Excellent Photophore for One-Electron Oxidation of DNA. Tetrahedron Lett. 39, 2779-2782

Figure II.16 : Schéma général de la synthèse de C1-BP-C10-COOH (9)

Figure II.17 : Réaction de Friedel-Craft pour former 6


- 74 -

Afin de protéger la fonction carboxyle de l’acide 10-undécénoïque, celui-ci

est, tout d’abord, estérifié par du méthanol en présence d’acide sulfurique en

quantité catalytique pour donner le produit 7 sous la forme d’une huile jaune

avec un rendement de 93% (fig. II.18).

- Formation de l’acide gras contenant le groupement benzophénone

via un couplage de suzuki

Cette réaction a été décrite pour la première fois en 1981 par Akira

Suzuki79 et c’est l’une des méthodes de couplage les plus utilisées pour former

des liaisons carbone-carbone. C’est une réaction catalysée par du palladium

faisant intervenir des dérivés du bore (fig. II.19). Les dérivés organoborés

comme les acides boroniques ou les boronates sont, aujourd’hui, largement

utilisés car leur réactivité est compatible avec un grand nombre de groupements

fonctionnels. Ils sont aisément accessibles (commercialement disponibles),

particulièrement stables vis-à-vis de l’eau et de l’air et peu toxiques.

Le mécanisme du couplage de Suzuki suit le schéma général des

mécanismes des réactions de couplage catalysées par du palladium, avec

quatre étapes successives : (i) la formation de l’espèce catalytique, (ii) l’addition

oxydante, (iii) la transmétallation, (iv) l’élimination réductrice (fig. II.20).

79N. Miyaura, T. Yanagi, A. Suzuki (1981). The palladium-Catalyzed Cross-Coupling Reaction of Phenylboronic Acid with Haloarenes in the Presence of Bases. Synth. Commun., 11, 513-519

Fig. II.18 : Protection de l’acide 10-undécénoique

Pd(0) base

R-R’ + X-B(OH)2 R-X + R’-B(OH)2

R = vinyl, aryl R’ = vinyl, aryl, alkyl X = I, OTf, Br, Cl

Figure II.19 : Equation de la réaction de couplage de Suzuki


- 75 -

Pd(0) ou Pd(II)

i) transformation de l’espèce catalytique

R-Pd(II)L2-R’R-Pd(II)L2-X

Pd(0)L2

ii) addition oxydante

iii) transmétallation

iv) élimination réductrice

R’-B(OH)2

X-B(OH)2

R-R’

Figure II.20 : Cycle catalytique de la réaction de couplage de Suzuki

R-X

La première étape consiste à former in situ l’espèce catalytique Pd(0)L2,

très réactive et instable (le Pd est électroniquement riche, nucléophile et possède

des sites de coordination vacants), à partir de sels stables de Pd(0) ou de Pd(II)

(pré-catalyseur). L’efficacité du catalyseur diffère selon la nature des ligands

portés par celui-ci.

Cette espèce Pd(0)L2 va donc facilement réagir avec des électrophiles de

type R-X via une étape d’addition oxydante (étape(ii)) pour former l’espèce R-

Pd(II)L2-X. L’addition oxydante correspond à une insertion du Pd(0) dans une

liaison C-X avec une oxydation du métal vers le degré d’oxydation (II). La nature

du groupement X de la molécule R-X influence la vitesse de réaction de cette

étape car la réactivité des halogénures et triflates pour le couplage de Suzuki

décroit comme suit : I > Br > OTf >> Cl80.

L’étape suivante (étape (iii)) est une réaction de transmétallation et

correspond à un échange de métal pour conduire à une espèce palladiée,

80 A. Suzuki (1991). Synthetic studies via the cross-coupling reaction of organoboron derivatives with organic halides. Pure and Appl. Chem., 63, 419-422


- 76 -

toujours au degré d’oxydation II, comportant les deux fragments carbonés R et R’

à coupler.

La dernière étape du cycle catalytique consiste à régénérer l’espèce

catalytique Pd(0)L2 et à former le produit de couplage R-R’ : c’est l’élimination

réductrice.

Ce couplage consiste donc en la réaction de l’alkylboronique 7’ formé par

réaction de l’alkylalcène 7 avec du 9-Borabicyclo[3.3.1]nonane (9-BBN) avec

l’halogénure d’aryle 6 en présence d’une base et de palladium comme catalyseur

pour former le cétoester 8 sous la forme d’un solide blanc (fig. II.21).

La dernière étape de cette synthèse consiste en la déprotection de la

fonction acide carboxylique du composé 8 en effectuant une saponification par la

potasse pour conduire au produit 9 sous la forme d’un solide blanc avec un

rendement de 96% (fig. II.22).

Le rendement global isolé pour la synthèse du composé 9 est de 46 % pour les 5

étapes.

Figure II.22 : Déprotection de la fonction acide carboxylique pour conduire au produit 9

Figure II.21 : Réaction de Suzuki pour la synthèse de 8


- 77 -

b/ Synthèse de l’acide 2-(4-((4-décylphényl)(hydroxy)méthyl)phényl)

acétique : C10-BP-C1-COOH (18)

La synthèse de ce dérivé est réalisée en 7 étapes à partir du chlorure de

décylbenzoyle et du 2-(4-bromophényl)éthanol commerciaux (fig. II.23).

- Conversion du chlorure de décylbenzoyle en décylbenzaldéhyde

Différentes stratégies peuvent être envisagées pour obtenir un aldéhyde à

partir de son chlorure d’acyle correspondant (fig. II.24). La première stratégie (a)

passe par une synthèse en une étape par réduction de Rosemund81 : c’est une

hydrogénation catalytique des chlorures d’acyle. La seconde stratégie (b) passe

par une synthèse en deux étapes via un ester méthylique, l’aldéhyde est alors

obtenu par réduction de cet ester par l’hydrure de diisobutylaluminium (DIBAL).

La dernière stratégie (c) envisagée comporte trois étapes et l’aldéhyde est

obtenu par la réduction totale de l’ester en alcool puis par oxydation de celui-ci.

81 D. Winkler, K. Burger (1996). Synthesis of enantiomerically pure D- and L- armentomycin and its difluoro analogues from aspartic acid. Synthesis, 1419-1421

Figure II.23 : Schéma général de la synthèse de 18


- 78 -

R

O

Cl H2, Pd/BaSO4R

O

H

Rdt. 64 %(a)

R

O

O

R

O

HDIBAL, toluène

- 78°C

R

O

Cl DMAP, MeOH

Rdt. 99 %

ROHLiAlH4, Et2O

Rdt. 90 %R

O

HSwern

Rdt. 87%

(b)

(c)

C’est la stratégie (c) qui a été adoptée au laboratoire pour convertir le chlorure

d’acyle en aldéhyde de par sa facilité d’exécution et le bon rendement global

obtenu sur ces trois étapes (77%).

Le chlorure de décylbenzoyle est donc transformé en son aldéhyde

correspondant 12 en passant par l’alcool 11 en 3 étapes (fig. II.25).

Pour améliorer le rendement de conversion du chlorure d’acyle en alcool

11, celui-ci est tout d’abord converti en ester méthylique 10 dans du méthanol,

jouant le rôle de solvant et de réactif, en présence d’une quantité catalytique de

DMAP. L’ester 10 formé n’a pas besoin d’être purifié : aucun produit secondaire

n’est formé lors de cette étape. Ensuite l’ester 10 est réduit en alcool avec du

tétrahydruroaluminate de lithium (LiAlH4). L’alcool 11 peut être obtenu

directement à partir du chlorure d’acyle par réduction avec LiAlH482

mais avec un

82 R. F. Nystrom, W. G. Brown (1947). Reduction of Organic Compounds by Lithium Aluminium Hydride. I. Aldehydes, Ketones, Esters, Acid Chlorides and Acid Anhydrides. J. Am. Chem. Soc., 65, 1197-1199

Figure II.24 : Stratégies de conversion d’un chlorure d’acyle en aldéhyde

Figure II.25 : Schéma de synthèse de l’aldéhyde 12


- 79 -

rendement non satisfaisant dans notre cas (inférieur à 30 %). L’alcool 11 est

ensuite oxydé en son aldéhyde correspondant 12 par une réaction de Swern83. Il

est également possible d’obtenir directement l’aldéhyde 12 à partir de l’ester 10

en utilisant le réducteur DIBAL84 (b). Cette étape a été expérimentée au

laboratoire sans le succès escompté : la réaction n’est pas totale et engendre

des problèmes de purification du produit formé 12 et donc un mauvais

rendement. L’alcool 11 est aussi directement formé par réduction totale de l’ester

méthylique 10 si la température n’est pas drastiquement contrôlée : elle ne doit

pas dépasser – 65 °C.

La conversion du chlorure d’acyle en aldéhyde 12 est nécessaire pour

diminuer la réactivité de celui-ci afin d’éviter la di-substitution du chlorure d’acyle

par un organométallique lors de l’étape suivante. Le produit 12 est obtenu sous

la forme d’une huile incolore avec un rendement global pour ces 3 étapes de

77%.

- Protection de la fonction hydroxyle du 2-(4-bromophényl)éthanol

Deux types de groupements protecteurs ont été testés : le 3,4-dihydro-2H-

pyrane pour former un éther de tétrahydropyranyle (THP-OR) 13 et le chlorure

de triisopropylsilyle pour former un éther de triisopropylsilyle (TIPS-OR) 14 (fig.

II.26).

83 K. Omura and D. Swern (1978). Oxidation of Alcohols by “Activated” Dimethylsulfoxide. A Preparative, Steric and Mechanistic Study. Tetrahedron, 34, 1651-1660 84 P. Garner and J. M. Park (1987). The synthesis and configural stability of differentially protected -hydroxy--amino aldehydes. J. Org. Chem., 52, 2361-2364


- 80 -

Le groupement protecteur tétrahydropyranne est largement utilisé pour

protéger les alcools en synthèse organique du fait de son coût modeste, de sa

bonne stabilité vis-à-vis de la plupart des réactifs non acides et de sa facilité à

être retiré.

Les éthers de silyle sont les groupements protecteurs les plus

fréquemment utilisés pour protéger une fonction alcool. La taille du groupement

TIPS le rend stable vis-à-vis des hydrolyses acides et basiques et surtout

empêche la chélation par un réactif de Grignard lors de l’addition de celui-ci à un

carbonyle85. La réaction de protection de l’alcool est quasi quantitative pour ces

deux types de protection.

- Couplage des alcools protégés 13 et 14 avec l’aldéhyde 12 via un

composé organométallique

Les travaux de Victor Grignard au début de XXème siècle ont été le début

de l’utilisation des réactifs organométalliques en synthèse organique. L’utilisation

de composés organométalliques comme les organomagnésiens appelés aussi

réactifs de Grignard (fig. II.27 (a)) ou les organolithiens (fig. II.27(b)) en synthèse

organique est l’une des méthodes les plus utilisées, de nos jours, pour la

formation de liaisons carbone-carbone. Les dérivés bromés sont très souvent

utilisés comme précurseur des réactifs organométalliques (fig. II.27).

85 S. V. Frye and E.L. Eliel (1986). Prevention of chelation by an oxygen function through protection with a triisopropyl silyl group. Tetrahedron Lett., 27, 3223-3226

Figure II.26 : Protection de la fonction hydroxyle du 2-(4-bromophényl)éthanol


- 81 -

Ces composés sont des sources de carbone nucléophile facilement

exploitables en chimie organique via une réaction de substitution nucléophile

pour former une nouvelle liaison carbone-carbone.

Les dérivés organométalliques sont donc de puissants nucléophiles dont

l’ordre de nucléophilie décroit comme suit : organolithiens > organomagnésiens >

organocuprates.

Nous avons d’abord mis en place une stratégie de synthèse avec un

réactif de Grignard pour former le composé 15 (fig. II.28) sans succès du fait des

réactifs utilisés ou du fait du groupement protecteur choisi sur la fonction

hydroxyle du précurseur bromé 13. Vraisemblablement le magnésium peut se

chélater aux deux oxygènes de la fonction alcool protégée et ne plus être

disponible pour former le réactif de Grignard.

Du fait de sa plus grande réactivité vis-à-vis des aldéhydes, nous avons

utilisé par la suite et avec succès, un organolithien pour former le composé 18.

Cette réaction s’effectue en deux étapes : tout d’abord un échange halogène –

métal entre le brome et le lithium est réalisé. Ensuite une réaction d’addition

nucléophile de l’entité formée (un organolithien) sur l’aldéhyde 12 conduit aux

produits 15 ou 16 en fonction de l’alcool protégé choisi (fig. II.29). Ainsi, le

rendement de ce couplage a-t-il été fortement amélioré en changeant le

Figure II.28 : synthèse de 15 à partir d’un organomagnésien

Figure II.27 : Préparation et réaction des organométalliques en synthèse organique


- 82 -

groupement protecteur du groupement hydroxyle de notre précurseur bromé (13

ou 14).

Le produit 15 obtenu à partir de l’alcool protégé 13 a d’abord été

synthétisé. Le rendement de cette réaction n’est que de 19% vraisemblablement

à cause de la chélation du lithium par les deux atomes d’oxygène présents au

niveau du groupement protecteur de 13. Le produit 16 réalisé à partir de l’alcool

protégé 14 (avec TIPS) est obtenu avec un meilleur rendement (70%)

certainement parce que le phénomène de chélation n’est plus possible avec ce

nouveau groupement protecteur encombré.

Les composés 15 et 16 sont ensuite déprotégés respectivement en milieu

acide ou avec le fluorure de tétra-n-butylammonium (TBAF) pour conduire au

produit 17. Ce produit subit, pour terminer, une double oxydation par une solution

aqueuse de trioxide de chrome dans l’acide sulfurique (réactif de Jones) pour

conduire à l’acide 18 sous la forme d’un solide blanc avec un rendement de 91%

(fig. II.30).

Figure II.29 : Schéma de synthèse des produits 15 et 16


- 83 -

Cette synthèse en 7 étapes a un rendement global isolé de 36% pour la

voie avec TIPS et de 12% avec THP. Sur cette synthèse nous avons réussi à

augmenter le rendement global (de 22 % à 36 %) et à diminuer le nombre

d’étapes (de 5 à 4) par rapport à ce qu’il était reporté dans la littérature en

partant de l’aldéhyde 12 et du bromo-alcool86.

86 Y. Gan, P. Wang, T. A. Spencer (2006). Synthesis of Benzophenone-Containing Fatty Acids. J. Org. Chem. 71, 9487-9490

Fig. II.30 : Schéma de synthèse de 18


- 84 -

3.1.2) Synthèse de deux nouvelles sondes lipidiques

La synthèse des sondes lipidiques bicaténaires avec ces deux nouveaux

acides gras contenant le groupement benzophénone suit le même schéma

réactionnel en quatre étapes que la synthèse de la sonde lipidique de référence

(chap. II.2.5 p. 69) avec des rendements sensiblement différents (tab. II.1).

Les rendements de synthèse de la première et de la deuxième étape pour

la synthèse de la sonde lipidique avec l’acide gras proximal 18 sont moins bons

certainement du fait de la proximité entre le groupement benzophénone et le

groupement carboxyle : les fonctions réactives sont vraisemblablement moins

accessibles. Pour la synthèse de l’analogue avec l’acide gras distal 9 les

rendements sont du même ordre que ceux de la synthèse de la sonde lipidique

de référence 1 : le rendement global isolé de ces quatre étapes est de 37 % avec

l’acide gras 9 contre 36 % pour la synthèse de la sonde lipidique de référence.

Du fait des deux premières étapes, le rendement global isolé n’est que de 17 %

pour l’analogue contenant l’acide gras 18. Ces deux nouveaux analogues sont

aussi obtenus sous la forme d’un solide violet.

Tableau II.1 : Rendements (en %) de chaque étape et rendement global isolé de chaque analogue

Boc-L-Dpr-OH 2 3 4 5 R

C1-BP-C10-COOH (9)

C6-BP-C5-COOH (1) (réf)

C10-BP-C1-COOH (18)

90 64 86 74

83 78 84 67

50 54 95 66

Rdt. global

37

36

17


- 85 -

3.2. Bilan

Trois analogues photoactivables d’acides gras contenant un groupement

benzophénone à distance variable de la fonction carboxylique ont ainsi été

synthétisés (tab. II.2).

Nom Formule d (Å) Nombre d’étapes de

synthèse

Rendement global

isolé

C1-BP-C10-COOH

(9)

O

OH

O

18,7 5 46 %

C6-BP-C5-COOH

(1)

12,7 3 45 %

C10-BP-C1-COOH

(18)

7,9 7 36 %

La distance d entre l’oxygène du groupement hydroxyle et le carbone de la

fonction carbonyle de la benzophénone (fig. II.14) est estimée en extrapolant les

valeurs décrites par Spencer et al.

A partir de ces trois acides gras, trois analogues de sonde lipidique

photoactivable ont été obtenus :

Tableau II.2 : Structure des acides gras contenant le groupement benzophénone

9 étapes Rendement global isolé : 17 %

Rhod-Dpr(CO-C10-BP-C1)-NH-C16H33 : sonde lipidique distale (9.4)


- 86 -

Le rendement global isolé de ces trois synthèses totales est acceptable

compte tenu du nombre d’étapes (de 7 à 12) et du type de molécule synthétisé :

il s’agit de molécules lipidiques réputées difficiles à purifier.



Rhod-Dpr(CO-C5-BP-C6)-NH-C16H33 : sonde lipidique médiane (5)

Rhod-Dpr(CO-C1-BP-C10)-NH-C16H33 : sonde lipidique proximale (18.4)


- 87 -

3.3. Synthèse d’une sonde lipidique photoactivable biotinylée

Après avoir fait la preuve du concept de marquage hydrophobe d’affinité

avec les sondes lipidiques fluorescente (chap. III p. 114) par détection de

fluorescence, une deuxième famille de molécules a été synthétisée en

remplaçant le traceur fluorescent par une autre molécule d’intérêt : la biotine.

Celle-ci nous permet, grâce à sa forte interaction avec son substrat la

streptavidine (constante de dissociation Kd = 4.10-14 M)87, de pouvoir immobiliser

et purifier (chap. III.3.2.) les produits résultant de la réaction de photomarquage

afin de les identifier et les analyser. Un pont disulfure clivable est intégré à cette

molécule pour pouvoir libérer, en conditions réductrices, le complexe

biotine/streptavidine formé.

La synthèse de cette sonde lipidique est réalisée en une étape à partir de

l’acide 3-[2-N-(biotinyl)aminoéthyldithio]propanoïque (Biotine-SS-COOH)

commercial et de l’intermédiaire 4 (synthétisé en trois étapes fig. II.13 p. 69) via

une réaction de couplage peptidique (fig. II.31).

87 A. Holmberg, A. Blomstergren, O. Nord, M. Lukacs, J. Lundeberg, M. Uhlen (2005). The biotin-streptavidin interaction can be reversibly broken using water at elevated temperatures. Electrophoresis, 26, 501-510

Figure II.31 : Schéma de synthèse de 19


- 88 -

Le groupement acide de la molécule biotine-SS-COOH est activé par

l’agent de couplage PyBOP en présence de DIEA dans un mélange de solvant

DMF/CH2Cl2 2/1. Le DMF est nécessaire pour solubiliser la molécule biotine-SS-

COOH. Cet acide activé réagit ensuite sur l’amine libre de l’intermédiaire 4, en

milieu basique (DIEA) par addition nucléophile. Les réactifs réagissent pendant

12h pour obtenir une conversion optimale. Vu les quantités de matière engagées

dans cette synthèse (entre 20 et 30 mg) et les difficultés de purification

rencontrées avec les méthodes classiques, le brut réactionnel a été purifié par

HPLC sur une colonne C4 préparative. Malgré une optimisation du gradient

d’élution utilisé, le produit 19 n’a pas pu être obtenu avec une excellente pureté

du fait de la forte hydrophobicité de celui-ci. Le produit 19 est obtenu sous la

forme d’un solide blanc avec de faibles rendements (inférieurs à 20 %).

3.4. Synthèse de sondes lipidiques fluorescentes avec différentes

plateformes de liaison

Trois autres analogues ont été synthétisés au laboratoire par C. Erhet durant son

stage de master. La plateforme de liaison est différente de celle de la sonde

lipidique de référence (fig. II.32) mais toujours d’origine commerciale.

OHN

OOH

O

NH2

OHN

OOH

O

NH2

O

OHH2N

NH

O

O

OHN

OOH

O

NH2

Deux des analogues synthétisés ont leurs deux chaînes lipidiques plus

distantes de 1 et de 3 carbones par rapport à la sonde lipidique de référence : la

Figure II.32 : Structures des plateformes de liaison utilisées : A Boc-L-Dpr-OH (référence), B Boc-L-Dab-OH, C Boc-L-Lys-OH, D H-Lys(Boc)-OH

A B C D


- 89 -

chaîne latérale des acides aminés choisis comme plateforme de liaison est

allongée (fig. II.32 B et C).

Le troisième analogue a sa tête polaire, la rhodamine, plus éloignée des

chaînes lipidiques. L’acide gras portant le groupement benzophénone est greffé

sur le groupement amine en du groupement carboxyle et la rhodamine sur le

groupement amine de la chaîne latérale de l’acide aminé (fig. II.32 D). La

synthèse de ces analogues a été réalisée suivant le même schéma de synthèse

en 4 étapes que celui de la sonde lipidique de référence (chap II.2.5, p. 69, fig.

II.13) avec un rendement global de 4% pour la synthèse à partir de la plateforme

B, de 12% pour la synthèse à partir de la plateforme C et de 3% pour la synthèse

à partir de la plateforme D (fig. II.33 pour la structure des sondes lipidiques

correspondantes). Ces analogues ont été synthétisés pour permettre d’analyser

si l’écart entre les deux chaînes grasses a une incidence sur l’insertion et la

stabilité de ces composés dans un système lipidique. Les résultats de ces

analyses sont discutés dans un chapitre suivant.

HN

O

O

HN

O

O

NH

O

O

NN

O

HN

O

O

HN

O

O

NN

O

O

O

NH

OHN

HN

O

NH

O

O

N

NO

O

O

B C

D

Figure II.33 : Structures des sondes lipidiques B, C, D correspondantes aux plateformes B, C, D respectivement.


- 90 -

4. Partie expérimentale chimique

4.1. Indications générales

4.1.1) Solvants et réactifs

Les solvants utilisés pour les synthèses ont été utilisés au grade analytique.

Dans le cas de réactions effectuées en conditions anhydres, les solvants ont été

préparés par distillation sous argon en présence de l’agent déshydratant

couramment employé: THF anhydre sur Na/benzophénone et CH2Cl2 sur CaH2

respectivement.

Les produits commerciaux ont été achetés auprès des fournisseurs Aldrich,

Acros, Alfa Aesar, Iris et ont été utilisés sans aucune purification

complémentaire.

4.1.2) Matériels et méthodes

a/ Chromatographie

- Chromatographie sur couche mince

L’avancement des réactions a été suivi par chromatographie sur

couche mince (CCM) en utilisant des plaques de silice (MERCK 0,25 mm,

Kieselgel 60 F254). La révélation des plaques a été effectuée par rayonnement

UV ( = 254 nm) ou par trempage dans un révélateur (acide

phosphomolybdique, vaniline ou ninhydrine) suivie d’un chauffage à 200°C ou

par exposition de la plaque à la vapeur d’iode. Le système d’élution et le rapport

frontal sont précisés pour chaque molécule.

- Chromatographie sur colonne

Les chromatographies sur colonne de silice ont été réalisées avec de la

silice MERCK (Kieselgel 60, 40 – 63 m). La silice a été utilisée environ 50 à 100

fois en excès par rapport à la masse du produit brut à purifier. Le diamètre des

colonnes a été choisi de manière à ce que la hauteur du gel de silice dans la


- 91 -

colonne soit d’environ 20 cm. Le système d’élution est précisé pour chaque

purification.

- Chromatographie liquide à haute performance

Les analyses HPLC sont réalisées sur un appareil Shimadzu équipé

d’une colonne Jupiter 5µm C4 300Å (150 x 4,6 mm, C4) fournie par Phenomenex.

Les analyses sont effectuées, pour les sondes lipidiques fluorescentes, avec un

gradient linéaire durant 10 min, de 0 % CH3CN dans l’eau (avec 0,1 % TFA) à

100 % CH3CN (avec 0,1 % TFA) suivies d’un plateau durant 5 min à 100 %

CH3CN (avec 0,1 % TFA) avec un débit de 1 mL.min-1. Pour la sonde biotinylée,

un gradient linéaire durant 25 min, de 0 % CH3CN dans l’eau (avec 0,1 % TFA) à

100 % CH3CN (avec 0,1 % TFA) suivies d’un plateau durant 10 min à 100 %

CH3CN (avec 0,1 % TFA) avec un débit de 1 mL.min-1 a été utilisé. La longueur

d’onde de détection est à 254 nm. Les temps de rétention sont donnés en

minute.

b/ Spectroscopie Infrarouge

Les spectres d’absorption infrarouge (IR) ont été enregistrés à l’aide d’un

spectromètre à transformée de Fourier Perkin-Elmer (FT-IR Spectrum 2000). Les

échantillons ont été examinés en solution dans un solvant approprié. Les

nombres d’onde sont exprimés en cm-1.

c/ Spectroscopie de masse

Les spectres de masse ont été enregistrés sur un appareil ESI/TOF

Mariner par la technique de l’électrospray. Les produits de masses moléculaires

élevées ont été analysés par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF. Les

spectres de masse haute résolution (HRMS) ont été enregistrés sur un appareil

GC/TOF Agilent ou LC/TOF Agilent. Les pics mentionnés (m/z) sont ceux

observés et interprétables sans équivoque. Les mesures de m/z observées sur le

spectre sont comparées à une masse exacte calculée, la masse indiquée pour

chaque molécule représente son poids moléculaire.


- 92 -

d/ Point de fusion

Les points de fusion ont été enregistrés sur un appareil de type Büchi B-

450 et sont donnés en degrés Celsius.

e/ Résonance Magnétique Nucléaire

Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) ont été

enregistrés sur des appareils Brücker DPX 300 (300 MHz), équipé d’une sonde 13C/1H 5 mm (Dual) pour le proton (fréquence d’irradiation : 300 MHz) et pour le

carbone 13 (fréquence d’irradiation : 75 MHz) et Brüker Advance 400 (400 MHz

pour le proton et 100 MHz pour le carbone 13). Les spectres 13C ont été

découplés du proton pendant l’acquisition. Les déplacements chimiques () sont

exprimés en parties par million (ppm) par rapport à la référence standard pour le

noyau considéré (proton et carbone 13 : TMS à 0,00 ppm). Dans tous les cas

une référence secondaire dont le déplacement chimique est connu est utilisée à

la place de la référence standard :

Noyau Solvant Référence Déplacement chimique (ppm)

1H CDCl3 CHCl3 7,27 CD3OD CD2HOD 3,31

13C CDCl3 CDCl3 77,7

CD3OD CD3OD 49

Les constantes de couplage (J) sont exprimées en Hertz. La description des

spectres utilise, pour caractériser la multiplicité du couplage, les abréviations

suivantes : s (singulet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet), dd (doublet

dédoublé), dt (triplet dédoublé), m (multiplet).


- 93 -

4.2. Synthèse de la sonde lipidique de référence

Synthèse de l’acide (S)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-(6-(4-(4-hexyl

benzoyl)phényl)hexanamido) propanoïque (2)

L’acide 6-(4-(4-n-hexylbenzoyl)phényl)-hexanoïque 1 (190,1 mg – 0,5 mmol) est

dissous dans 3 mL de CH2Cl2. La DIEA (194 mg – 1,5 mmol) et le PyBOP (260

mg – 0,5 mmol) sont ajoutés à la solution. Après 10 min d’agitation à

température ambiante, le Boc-L-Dpr-OH (100 mg- 0,5 mmol) préalablement

dissous dans 4 mL de CH2Cl2 et 3 mL de MeOH est ajouté au milieu réactionnel.

La solution est agitée à température ambiante et sous argon pendant 12 h. La

phase organique est ensuite lavée avec de l’eau distillée (2 fois 10 ml) puis la

phase aqueuse est extraite avec CH2Cl2 (1 fois 20 ml). Les deux phases

organiques collectées sont séchées sur Na2SO4 et le solvant est évaporé sous

pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient

d’élution CH2Cl2/MeOH 98/2 à 93/7 v/v) pour conduire au produit 2 obtenu sous

la forme d’un solide blanc (235 mg – Rdt : 83 %).

CCM : Rf = 0,3 (CH2Cl2/MeOH 9/1).

RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,67 (m, 4H2,6,10,12), 7,24 (m, 4H3,5,7,9), 4,14 (m,

1Hk), 3,73 (q, J = 7 Hz, 1Hj), 3,14 (q, J = 7 Hz, 1Hj), 2,65 (m, 4Hd+e), 2,17 (m,

2Hh), 1,62 – 1,21 (m, 23Hb,c,f,g,n), 0,87 (m, 3Ha).

Masse : m/z = 567,4 [M+H]+, masse calculée = 566,3 g.mol-1.

C33H46N2O6 ; PM : 566,7 g.mol-1


- 94 -

Synthèse du (S)-tert-butyl-1-(hexadécylamino)-3-(6-(4-(4-hexylbenzoyl)

phényl)hexanamido)-1-oxopropan-2-ylcarbamate (3)

2 (225 mg – 0,4 mmol) est dissous dans 3,5 mL de CH2Cl2. La DIEA (155 mg –

1,2 mmol) et le PyBOP (250 mg – 0,4 mmol) sont ajoutés à la solution. Après 10

min d’agitation à température ambiante, de l’hexadécylamine (96,5 mg- 0,4

mmol) est ajoutée au milieu réactionnel. La solution est agitée à température

ambiante et sous argon pendant 6 h. La phase organique est ensuite lavée avec

de l’eau distillée (2 fois 15 ml) puis la phase aqueuse est extraite avec 15 mL de

CH2Cl2. Les deux phases organiques collectées sont séchées sur Na2SO4,

filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est

purifié sur colonne de silice (éluant CH2Cl2/MeOH 25/1 v/v) pour conduire au

produit 3 obtenu sous la forme d’un solide blanc et gras (246 mg – Rdt : 78 %).

CCM : Rf = 0,6 (CH2Cl2/MeOH 9/1).

RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,73 (m, 4H2,6,10,12), 7,27 (m, 4H3,5,7,9), 6,86 (s,

1HNH), 6,35 (s, 1HNH), 5,98 (d, J = 6 Hz ,1HNH), 4,16 (m, 1Hk), 3,71 (m, 1Hj), 3,51

(m, 1Hj), 3,23 (m, 2Hp), 2,69 (t, 4Hd+e, J = 7,5), 2,20 (t, 2Hh, J = 7,5), 1,70 – 1,25

(m, 51Hb,c,f,g,n,q,r), 0,88 (m, 6Ha+s).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 196,9 (Ct), 175,5 (Ci), 171,1 (Cl), 148,6, 148,0

(C1+11 pour les deux pics), 136,3, 136,0 (C4+8 pour les deux pics), 130,9

(C2,6,10,12), 128,9 (C3,5,7,8), 81,0 (Co), 42,7 (Cj), 40,2 (Cp), 37,0 , 36,7, 36,4, (Cd,e,h

pour les trois pics), 32,6, 32,4, 31,8, 31,5, 30,4-29,5, 29,0, 27,5, 26,1, 23,3 (Cb),

14,7 (Ca+s).


C49H79N3O5 ; PM : 790,2 g.mol-1


- 95 -

Synthèse du (S)-N-(2-amino-3-(hexadécylamino)-3-oxopropyl)-6-(4-(4-hexyl

benzoyl)phényl) hexanamide (4)

3 (146 mg – 0,18 mmol) est dissous dans 3 mL d’une solution de CH2Cl2/TFA 1/1

v/v. La solution est agitée à température ambiante et sous argon pendant 1 h. La

phase organique est ensuite diluée avec 75 mL de CH2Cl2 puis lavée avec une

solution de NaHCO3 saturée (3 fois 75 ml) et la phase aqueuse est extraite avec

CH2Cl2 (2 fois 50 mL). Les phases organiques récupérées sont séchées sur

Na2SO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite pour conduire au

produit 4 obtenu sous la forme d’un solide blanc gras (104,3 mg – Rdt : 84 %).

CCM : Rf = 0,4 (CH2Cl2/MeOH 9/1).

RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,73 (m, 4H2,6,10,12), 7,50 (m, 1HNH), 7,27 (m,

4H3,5,7,9), 6,29 (m, 1HNH), 3,65 (m, 1Hk), 3,47 – 3,37 (m, 2Hj), 3,23 (m, 2Hp), 2,69

(t, 4Hd+e, J = 7,5 Hz), 2,20 (t, 2Hh, J = 7,5), 1,66 – 1,25 (m, 42Hb,c,f,g,q,r), 0,88 (m,

6Ha+s).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 196,9 (Ct), 174,8 (Ci), 173,9 (Cl), 148,6, 148,0

C1+11 pour les deux pics), 136,2, 136,0 (C4+8 pour les deux pics), 130,8 (C2,6,10,12),

128,9 (C3,5,7,8), 55,9 (Ck), 44,3 (Cj), 39,8 (Cp), 37,2, 36,6, 36,4 (Cd,e,h pour les trois

pics), 32,6, 32,3, 31,8, 31,4, 30,3-29,5, 27,6, 26,1, 23,3 (Cb), 14,7 (Ca+s).


C44H71N3O3 ; PM : 690,1 g.mol-1


- 96 -

Synthèse de Rhod-Dpr(CO-C5-BP-C6)-NH-C16H33 (5)

43 mg de 5,6 tetraméthyl-carboxy-rhodamine (TMCR) (0,099 mmol) sont dissous

dans 3 mL de CH2Cl2. La DIEA (30 mg – 0,230 mmol) et le PyBOP (52 mg –

0,099 mmol) sont ajoutés à la solution. Après 20 min d’agitation à température

ambiante, 4 (53 mg – 0,077 mmol) préalablement dissous dans 3 mL de CH2Cl2

est ajouté au milieu réactionnel. La solution est agitée à température ambiante et

sous argon pendant 24 h. Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le

résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d’élution CH2Cl2/MeOH

100/0 à 100/15 v/v) pour conduire au produit 5 obtenu sous la forme d’un solide

violet (57 mg – Rdt : 67 %).

CCM : Rf = [0,7 ; 0,5] (CH2Cl2/MeOH 9/2) (2 isomères).

RMN 1H (500 MHz ; CDCl3) = 11,05 (s, 1H), 8,90 (m, 1H), 8,15 (m, 2H), 7,69

(m, 4H), 7,23 (m, 4H), 6,86 (m, 2H), 6,57 (m, 4H), 3,75 (m, 1H), 4,72 – 4,62 (m,

2H), 3,18 (m, 2H), 3,10 (m,12H), 2,68 (m, 4H), 2,17 (m, 2H), 1,64 – 1,22 (m,

42H), 0,88 (m, 6H).

RMN 13C (125 MHz ; CDCl3) = 196,9, 176,0, 175,9, 170,7, 170,5, 169,0, 167,5,

167,3, 156,0, 155,6, 148,6, 148,0, 136,2, 136,0, 130,8, 128,9, 126,2, 125,3,

118,5, 112,5, 111,8, 97,8, 56,3, 54,3, 51,5, 44,3, 39,8, 37,2, 36,6, 36,4, 32,6,

32,3, 31,8, 31,4, 30,3-29,5, 27,6, 26,1, 23,3, 14,7.

C69H91N5O7 ; PM : 1102,5 g.mol-1


- 97 -

Masse : m/z = 1102,9 [M+H]+, masse calculée = 1101,7 g.mol-1, HRMS m/z =

1102,6961 [M+H]+, masse calculée = 1101,6918 g.mol-1

HPLC : Tr = 13,6 min.

4.3. Synthèse des acides gras contenant un groupement

benzophénone

Synthèse de la 4-Bromo-4’-méthylbenzophénone (6)

Du chlorure de 4-bromobenzoyle (500 mg – 2,28 mmol) est dissous dans 5 mL

de toluène sous agitation et à température ambiante. AlCl3 (456 mg - 3,42 mmol)

est ajouté à la solution en une seule fois, le milieu réactionnel est ensuite porté à

reflux pendant 2h. La solution est refroidie à température ambiante puis versée

dans une solution d’HCl37% glacé. Puis le mélange est extrait avec 15 mL

d’acétate d’éthyle. La phase organique collectée est lavée par 15 mL d’HCl 1N

aqueux, 15 mL d’eau puis 15 mL de saumure. La phase organique est séchée

sur MgSO4, filtrée et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu

obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d’élution cyclohexane/AcOEt

38/2 à 37/3 v/v) pour enlever les produits inorganiques (colonne de filtration)

pour conduire après recristallisation dans le n-hexane au produit 6 obtenu sous

la forme d’un solide blanc (470 mg – Rdt : 75 %).

CCM : Rf = 0,4 (Cyclohexane/AcOEt 9/1 v/v).

RMN 1H (300 MHz; CDCl3) = 7,70-7,60 (m, 6H), 7,30-7,27 (m, 2H), 2,44 (s,

3Ha).

C14H11BrO ; PM : 275,1 g.mol-1


- 98 -

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 195,9 (Cb), 144,2 (C1), 137,3, 135,0, 132,1,

132,0, 130,9, 129,7, 127,8 (C11), 22,3 (Ca).

Masse : m/z = 274,0 [M]+, masse calculée = 274,0 g.mol-1.

Synthèse du 10-undécénoate de méthyle (7)

De l’acide 10-undécénoïque (5,00 g – 27,1 mmol) est dissous dans 100 mL de

méthanol sous agitation et à température ambiante. 1 mL d’acide sulfurique

concentré est ajouté à la solution et le milieu réactionnel est porté à reflux

pendant une nuit. La solution est refroidie à température ambiante puis le

méthanol est évaporé sous pression réduite et la solution et reprise dans 200 mL

d’éther. Le mélange obtenu est lavé avec une solution d’NaHCO3 saturée et

avec de la saumure. La phase organique récupérée est séchée sur MgSO4,

filtrée et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit est séché à la

pompe à palettes pendant une nuit pour obtenir le composé 7 sous la forme

d’une huile jaune (5,00 g – Rdt : 93 %).


RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 5,83-5,77 (m, 1Hd), 5,01-4,91 (m, 2Hc), 3,66 (s,

3Hj), 2,29 (t, 2Hh , J=7,6), 2,04 (m, 2He), 1,61 (m, 2Hg), 1,38-1,29 (m, 10Hf).

RMN 1H (400 MHz ; CDCl3) =5,83-5,77 (ddt, 1Hd, J = 17,1;10,1;6,8), 5,01-4,91

(m, 2Hc), 3,66 (s, 3Hj), 2,29 (t, 2Hh, J = 7,6), 2,04 (q, 2He, J = 7,0), 1,61 (quint,

2Hg, J = 7,3), 1,38-1,29 (m, 10Hf).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 174,9 (Ci), 139,8 (Cd), 114,8 (Cc), 52,0 (Cj), 34,8

(Ch, 34,4 (Ce), 29,8 (Cf), 25,6 (Cg).

Masse : ESI m/z = 199,2 [M+H]+, masse calculée = 198,2 g.mol-1.

C12H22O2 ; PM : 198,3 g.mol-1


- 99 -

Synthèse du 11-(4-(4-méthylbenzoyl)phényl)undécanoate de méthyle (8)

D’une part 7 (181 mg – 0,91 mmol) est dissous dans 5 mL de THF sous agitation

et à 0°C. Sous argon, 4 mL d’une solution de 0,5 M de 9-BBN dans du THF est

ajouté à la solution et le milieu réactionnel est agité pendant 4 h à température

ambiante. D’autre part, du carbonate de césium (890 mg – 2,73 mmol) est

dissous dans une solution de 2 mL de DMF, 3 mL de THF et 0,6 mL d’eau puis

du triphénylarsine (55 mg – 0,18 mmol), du Pd(dppf)Cl2 (131,7 mg – 0,18 mmol)

et 6 (250 mg – 0,91 mmol) y sont ajoutés sous argon et sous agitation. La

première solution est ajoutée à la seconde via une canule. Le milieu réactionnel

résultant est agité pendant 22 h. La solution obtenue est diluée dans 15 mL

d’eau et 15 mL d’AcOEt puis lavée avec de l’eau, avec une solution de NaHCO3

saturée et avec de la saumure. La solution est filtrée sur célite et celle-ci est

rincée avec de l’acétate d’éthyle. La phase organique récupérée est séchée sur

Na2SO4, filtrée et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu

est purifié sur colonne de silice (gradient d’élution cyclohexane/AcOEt 100/0 à

100/10 v/v) puis trituré dans le n-hexane pour conduire au produit 8 obtenu sous

la forme d’une huile jaune (247 mg – Rdt : 69 %).


RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,73-7,71 (m, 4Har), 7,37-7,29 (d, 4Har, J = 7,4),

3,67 (s, 3Hj), 2,69 (t, 2Hh, J = 7,7), 2,45 (s, 3Ha), 2,31 (t, 2Hc, J = 7,5), 1,67-1,60

(m, 4Hg+d), 1,36-1,24 (m, 12He+f).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 196,3 (Cb), 174,3 (Ci), 147,9 (C11), 142,9 (C1),

135,4, 135,3 (C4+8 pour les 2 pics), 130,2, 128,9, 128,3, 51,4 (Cj), 36,0 (Cc), 34,1

C26H34O3 ; PM : 394,5 g.mol-1


- 100 -

(Ch), 31,2 (Cd), 29,7, 29,5, 29,4, 29,3, 29,2, 29,2 (Ce+f pour les 6 pics), 24,9 (Cg),

21,6 (Ca).


Synthèse de l’acide 11-(4-(4-méthylbenzoyl)phényl)undécanoïque (9)

Le composé 8 (200 mg – 0,51 mmol) est dissous dans 10 mL d’EtOH 95% (v/v)

sous agitation puis de l’hydroxyde de sodium (85 mg – 1,52 mmol) y est ajouté.

Le milieu réactionnel résultant est agité pendant 12 h à température ambiante.

La solution obtenue est rectifiée jusqu’à pH = 1 avec une solution aqueuse d’HCl

1N puis extraite avec AcOEt et enfin lavée avec de la saumure. La phase

organique récupérée est ensuite séchée avec MgSO4, filtrée et le solvant est

évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par recristallisation

dans l’éther pour conduire au produit 9 obtenu sous la forme d’un solide blanc

(180 mg – Rdt : 93 %).

CCM : Rf = 0,8 (CH2Cl2/MeOH 9/1 v/v).

RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,74-7,71 (dd, 4H2,6,10,12, J = 8,1, 2,7), 7,29-7,27

(d, 4H3,5,7,9, J = 7,4), 2,69 (t, 2Hh, J = 7,7), 2,45 (s, 3Ha), 2,36 (t, 2Hc, J = 7,5),

1,65-1,61 (m, 4Hg+d), 1,41-1,22 (m, 12He+f).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 196,3 (Cb), 179,1 (Ci), 147,9 (C11), 142,9 (C1),

135,4, 135,2 (C4+8 pour les 2 pics), 130,2, 128,9, 128,3, 36,0 (Cc), 33,9 (Ch), 31,2

(Cd), 29,5, 29,4, 29,4, 29,3, 29,2, 29,0(Ce+f pour les 6 pics), 24,7 (Cg), 21,6 (Ca).


C25H32O3 ; PM : 380,5 g.mol-1


- 101 -

Synthèse du 4-décylbenzoate de méthyle (10)

.

Du chlorure de 4-décylbenzoyle (1,00 g – 3,56 mmol) est dissous dans 10 mL de

méthanol sous agitation et à température ambiante. Puis de la

diméthylaminopyridine (43 mg – 0,36 mmol) est ajoutée à la solution et le milieu

réactionnel est laissé sous agitation pendant 1 h. Le méthanol est ensuite

évaporé sous pression réduite puis la solution est redissoute dans 20 mL de

CH2Cl2. Le mélange obtenu est lavé avec de l’eau (2 fois 20 mL). La phase

aqueuse est extraite avec CH2Cl2 et les phases organiques récupérées sont

séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le

produit est séché sous la pompe à palettes pendant une nuit pour conduire au

produit 10 sous la forme d’une huile incolore (973 mg – Rdt : 99%).

CCM : Rf = 0,7 (cyclohexane/AcOEt 8/2 v/v).

RMN 1H (400 MHz ; CDCl3) = 7,96 (d, 2H8+12, J = 8,2), 7,24 (d, 2H9+11, J = 8,2),

3,90 (s, 3Hh), 2,66 (t, 2Hj, J = 7,8), 1,63 (m, 2Hk), 1,32-1,27 (m, 14Hl+m), 0,89 (t,

3Hn, J = 6,7).

RMN 13C (100 MHz ; CDCl3) = 167,8 (Ci), 149,1 (C10), 130,3 (C8+12), 129,0

(C9+11), 128,3 (C7), 52,5 (Ch), 36,7 (Cj), 32,6, 31,8, 30,2, 30,2, 30,1, 30,0, 29,9

(Cl+k pour les sept pics), 23,3 (Cm), 14,7 (Cn).


C18H28O2 ; PM : 276,4 g.mol-1


- 102 -

Synthèse du (4-décylphényl)méthanol (11)

Du tétrahydruroaluminate de lithium (40 mg – 1,03 mmol) est dissous dans 15

mL d’éther diéthylique sous agitation, sous argon et à température ambiante

dans un ballon sec muni d’un condenseur. Puis 10 (950 mg – 3,43 mmol) est

ajouté goutte à goutte à la solution et le milieu réactionnel est laissé sous

agitation pendant 1 h. 20 mL d’eau sont ensuite ajoutées avec précaution à la

solution puis celle-ci est versée dans de l’eau glacée et une solution aqueuse à

10 % H2SO4 (v/v) est ensuite ajoutée. La phase aqueuse est extraite avec de

l’éther diéthylique et les phases organiques récupérées sont séchées sur

MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu

est purifié sur colonne de silice (gradient d’élution Cyclohexane/AcOEt 95/5 à

80/20 v/v) pour conduire au produit 11 obtenu sous la forme d’un solide blanc

(768 mg – Rdt : 90%).


RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,29 (d, 2H8+12, J = 7,9), 7,19 (d, 2H9+11, J = 7,9),

4,65 (s, 2Hi), 2,63 (t, 2Hj, J = 7,8), 1,63 (m, 2Hk), 1,29 (m, 14Hl+m), 0,91 (t, 3Hn, J

= 6,8).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 143,1 (C7), 138,8 (C10), 129,2 (C9+11), 127,8

(C8+12), 65,9 (Ci), 36,3 (Cj), 32,6, 32,2, 30,3, 30,2, 30,0 (Cl+k pour les 5 pics), 23,3

(Cm), 14,7 (Cn).

Masse (GCMS) : m/z = 246,2 , masse calculée = 248,2 g.mol-1.

C17H28O ; PM : 248,4 g.mol-1


- 103 -

Synthèse du 4-décylbenzaldéhyde (12)

A du chlorure d’oxalyle (390 µL – 4,63 mmol) à -78 °C est ajouté, avec

précaution, du diméthylsulfoxyde (460 µL – 6,49 mmol) en solution dans 10 mL

de CH2Cl2 à –78 °C, sous argon et sous agitation pendant 10 min. Puis l’alcool

11 (768 mg – 3,09 mmol) dissous dans 10 mL de CH2Cl2 est ajouté prudemment

à -78 °C. La solution résultante est agitée pendant 20 min. De la triéthylamine

(1,73 mL – 12,4 mmol) est ensuite ajoutée puis la solution est laissée revenir à

température ambiante. 20 mL d’une solution de NaHCO3 saturée sont ensuite

ajoutés au milieu réactionnel. La phase aqueuse est extraite avec du diéthyl

éther (1 fois 50 mL). Les phases organiques réunies sont lavées avec une

solution de KHSO4 saturée, avec une solution de NaHCO3 saturée et avec de la

saumure puis séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous

pression réduite pour conduire au produit 12 obtenu sous la forme d’une huile

incolore (662 mg – Rdt : 87%).


RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 9,98 (s, 1Hi), 7,80 (d, 2H8+12, J = 8,0), 7,34 (d,

2H9+11, J = 8,1), 2,69 (t, 2Hj, J = 7,8), 1,65 (m, 2Hk), 1,27 (m, 14Hl+m), 0,89 (t,

3Hn, J = 6,6).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 192,5 (Ci), 151,1 (C10), 135,1 (C7), 130,5 (C8+12),

129,7 (C9+11), 36,9 (Cj), 32,6, 31,7, 30,2, 30,1, 30,0 (Cl+k pour les 5 pics),

23,3(Cm), 14,7 (Cn).

Masse : ESI m/z = 247,2 [M+H]+, masse calculée = 246,2 g.mol-1

HRMS m/z = 246,2004, masse calculée = 246,1984 g.mol-1.

C17H26O ; PM : 246,4 g.mol-1


- 104 -

Synthèse du 2-(4-bromophénéthoxy)-tétrahydro-2H-pyrane (13)

L’alcool 4-bromophénéthylique (1,5 g – 7,44 mmol) est dissous dans 30 mL

CH2Cl2 puis du 3,4-dihydro-2H-pyrane (3,13 g – 0,04 mol) et de l’acide toluène-4-

sulfonique (14,1 mg – 0,074 mmol) sont ajoutés. La solution est agitée à

température ambiante pendant 6 h. La phase organique est ensuite diluée avec

50 mL de CH2Cl2 puis lavée avec une solution de NaHCO3 saturée (2 fois 30

mL), avec de l’eau (1 fois 30 mL) et avec de la saumure (1 fois 30 mL). La phase

aqueuse est extraite avec du CH2Cl2 (2 fois 75 mL). Les deux phases organiques

collectées sont séchées sur Na2SO4, filtrées et le solvant est évaporé sous


d’élution cyclohexane/AcOEt 100/0 à 100/3 v/v) pour conduire au produit 13

obtenu sous la forme d’une huile incolore (1,95 g – Rdt : 92 %).


RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,40 (m, 2H3+5), 7,12 (m, 2H2+6), 4,58 (t,1Hc, J =

3,7), 3,93 (dt, 1Hb, J = 9,8, 7,0), 3,74 (m, 1Hg), 3,59 (dt, 1Hb, J = 9,8, 6,9), 3,46

(m, 1Hg), 2,86 (t, 2Ha, J = 7,0), 1,85-1,45 (m, 6Hd,e,f).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 138,9 (C1), 131,9 (C3+5), 131,4 (C2+6), 120,6 (C4),

99,4 (Cc), 68,5 (Cb), 62,8 (Cg), 36,4(Ca), 31,3 (Cd), 26,1 (Cf), 20,1 (Ce).

Masse : m/z = 293,0 [M+Li]+, masse calculée = 285,2 g.mol-1.

C13H17BrO2 ; PM : 285,2 g.mol-1


- 105 -

Synthèse du (4-bromophénéthoxy)triisopropylsilane (14)

De l’alcool 4-bromophénéthyle (500 mg – 2,48 mmol) est dissous dans 10 mL

CH2Cl2 puis du chlorure de triisopropylsilyle (720 mg – 3,73 mmol) et de

l’imidazole (506 mg – 7,44 mmol) sont ajoutés. La solution est agitée à

température ambiante pendant 2 h. La phase organique est lavée avec une

solution de NaHCO3 saturée (2 fois 10 mL), avec de l’eau (1 fois 10 mL) et avec

de la saumure (1 fois 10 mL). La phase aqueuse est extraite avec du CH2Cl2 (2

fois 30 mL). Les deux phases organiques collectées sont séchées sur MgSO4,


purifié sur colonne de silice (gradient d’élution cyclohexane/AcOEt 100/0 à

100/10 v/v) pour conduire au produit 14 obtenu sous la forme d’une huile incolore

(880 mg – Rdt : 99 %).


RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,40 (m, 2H3+5), 7,11 (m, 2H2+6), 3,87 (t, 1Hb, J =

6,9), 2,81 (t, 1Ha, J = 6,9), 1,05 (m, 21Hc+d).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 139,0 (C1), 131,9 (C3+5), 131,6 (C2+6), 120,6 (C4),

65,1 (Cb), 39,8 (Ca), 18,6 (Cd), 12,7 (Cc).

Masse : ESI m/z = 357,1 [M+H]+, masse calculée = 356,1 g.mol-1

HRMS m/z (avec 79Br et un isobutyl en moins) = 313,0638,

masse calculée (avec 79Br et un isobutyl en moins) = 313,0623 g.mol-1.

C17H29OBrSi ; PM : 357,4 g.mol-1


- 106 -

Synthèse du (4-décylphényl)(4-(2-(tétrahydro-2H-pyran-2-yloxy)éthyl)

phényl) méthanol (15)

13 (667 mg – 2,35 mmol) est dissous dans 10 mL de THF sous agitation, sous

argon et à –78 °C dans un ballon sec. Puis du n-butyl lithium (1,76 mL – 2,82

mmol) est ajouté à la solution et celle-ci est laissée sous agitation pendant 1 h.

12 (290 mg – 1,18 mmol) dissous dans 10 mL de THF est ensuite ajouté à la

solution maintenue à –78°C. Le milieu réactionnel revient à température

ambiante et la solution est agitée pendant 12 h. 20 mL d’une solution de

NaHCO3 saturée sont ajoutés à la solution et celle-ci est ensuite extraite avec

AcOEt. Les phases organiques récupérées sont lavées avec une solution de

NaHCO3 saturée et de la saumure puis séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant

est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de

silice (gradient d’élution Cyclohexane/AcOEt 100/0 à 85/15 v/v) pour conduire au

produit 15 obtenu sous la forme d’une huile incolore (101 mg - Rdt : 19%)


RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,32 – 7,13 (m, 8H2,3,5,6,8,9,11,12), 5,80 (s, 1Hi),

4,59 (t, 1Hc, J = 3,4), 3,93 (dt, 1Hb, J = 9,8, 7,2), 3,74 (m, 1Hg), 3,61 (dt, 1Hb, J =

9,6, 7,2), 3,45 (m, 1Hg), 2,90 (t, 2Ha, J = 7,3), 2,59 (t, 2Hj, J = 7,5), 1,84-1,27 (m,

22Hd,e,f,k,l,m), 0,90 (t, 3Hn, J = 6,6).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 142,9, 142,6 (C7+4 pour les 2 pics), 141,9 (C10),

139,0 (C1), 129,7, 129,1, 127,1 (C2,3,5,6,8,9,11,12 pour les 3 pics), 99,3 (Cc), 76,6

(Ci), 68,8 (Cb), 62,8 (Cg), 36,7 (Cj), 36,3 (Ca), 32,6, 32,2, 31,3, 30,3, 30,0 (Cd,k,l

pour les 5 pics), 26,1 (Cf), 23,4 (Cm), 20,1 (Ce), 14,8 (Cn).

Masse : m/z = 459,4 [M+Li]+, masse calculée = 452,3 g.mol-1.

C30H44O3 ; PM : 452,7 g.mol-1


- 107 -

Synthèse du (4-décylphényl)(4-(2-(triisopropylsilyloxy)éthyl)phényl)

méthanol (16)

L’alcool protégé 14 (957 mg – 2,67 mmol) est dissous dans 10 mL de THF sous

agitation, sous argon et à –78 °C dans un bicol sec. Puis du n-butyl lithium (1,8

mL – 2,92 mmol) est ajouté goutte à goutte à la solution et celle-ci est laissée

sous agitation à –78 °C pendant 1 h. L’aldéhyde 12 (600 mg – 2,43 mmol)

dissous dans 10 mL de THF est ensuite ajouté, goutte à goutte, à la solution

maintenue à –78°C puis on laisse le milieu réactionnel revenir à température

ambiante et la solution est agitée pendant 12 h. 20 mL d’une solution de



NaHCO3 saturée et de la saumure puis séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant

est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de

silice (gradient d’élution Cyclohexane/AcOEt 100/0 à 100/7 v/v) pour conduire au

produit 16 obtenu sous la forme d’une huile incolore (892 mg- Rdt : 70%)



3,89 (dt, 2Hb, J = 10,6, 7,2), 2,86 (dt, 2Ha, J = 10,6, 7,2), 2,59 (t, 2Hj, J = 7,8),

1,59 (m, 2Hk), 1,30 (m, 14Hl+m), 1,05 (m, 21Hc+d), 0,89 (t, 3Hn, J = 6,7).

RMN 13C (100 MHz ; CDCl3) = 142,9, 142,5 (C7+4 pour les 2 pics), 141,9 (C10),

139,2 (C1), 129,9, 129,1, 127,1 (C2,3,5,6,8,9,11,12 pour les 3 pics), 76,7 (Ci), 65,5(Cb),

40,1 (Ca), 36,3 (Cj), 32,6, 32,2, 30,3, 30,2, 30,0 (Ck,l pour les 5 pics), 23,4 (Cm),

18,6 (Cd), 14,8 (Cn), 12,7 (Cc).

Masse : ESI m/z = 547,4 [M+Na]+, masse calculée = 524,4 g.mol-1.

C34H56O2Si ; PM : 524,9 g.mol-1


- 108 -

HRMS m/z (avec un isopropyle en moins) = 481,3496,

masse calculée (avec un isopropyle en moins) = 481,3502 g.mol-1

Synthèse du 2-(4-((4-décylphényl)(hydroxy)méthyl)phényl)éthanol (17)

15 (100 mg – 0,22 mmol) est dissous dans une solution de AcOH/THF/H2O 4/2/1

v/v/v sous agitation à température ambiante pendant 30 h. 10 mL d’une solution

de NaHCO3 saturée est ajouté à la solution puis celle-ci est extraite avec CH2Cl2

(2 fois 20 mL). Les phases organiques récupérées sont lavées avec une solution

de NaHCO3 saturée et de la saumure puis séchées sur MgSO4, filtrées et le

solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit obtenu est utilisé sans

purification supplémentaire pour l’étape suivante (synthèse de 18).

Synthèse du 2-(4-((4-décylphényl)(hydroxy)méthyl)phényl)éthanol (17)

16 (842 mg – 1,60 mmol) est dissous dans 10 mL de THF sous agitation et du

fluorure de tetra-n-butylammonium (3 mL – 3 mmol) est ajouté à la solution.

Celle-ci est laissée sous agitation pendant 1,5 h. 10 mL d’une solution de



NaHCO3 saturée puis séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous


C25H36O2 ; PM : 368,5 g.mol-1

C25H36O2 ; PM : 368,5 g.mol-1


- 109 -

d’élution CH2Cl2/MeOH 100/0 à 98/2 v/v) pour conduire au produit 17 obtenu

sous la forme d’un solide blanc (427 mg- Rdt : 73%).



3,85 (m, 2Hb), 2,86 (t, 2Ha, J = 6,5), 2,58 (t, 2Hj, J = 7,8), 1,59 (m, 2Hk), 1,26 (m,

14Hl+m), 0,89 (t, 3Hn, J = 6,7).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 143,0 (C7), 142,9 (C4), 141,8 (C10), 138,3 (C1),

129,7 (C9,11), 129,2 (C2,6), 127,4 (C8,12), 127,1 (C3,5), 76,6 (Ci), 64,2 (Cb), 39,5

(Ca), 36,3 (Cj), 32,6, 32,1, 30,3, 30,2, 30,0 (Ck+l pour les 5 pics), 23,4 (Cm), 14,8

(Cn).

Masse : ESI m/z = 351,2 [M+H-H2O]+, masse calculée = 368,3 g.mol-1,

HRMS m/z = 368,2738, masse calculée 368,2715 g.mol-1.

Synthèse de l’acide (4-(4-décylbenzoyl)phényl)éthanoique (18)

17 (410 mg – 1,11 mmol) est dissous dans 10 mL d’acétone puis 1 mL de réactif

de Jones 2,67 M (26,72 g de trioxyde de chrome, 23 mL d’acide sulfurique

concentré, 77 mL d’eau) est ajouté goutte à goutte à la solution. Celle-ci est

agitée à température ambiante pendant 2 h. L’excès de réactif est réduit par

quelques gouttes d’isopropanol. 20 mL d’eau sont ensuite ajoutés au milieu

réactionnel pour dissoudre le précipité de sel de chrome. L’acétone est évaporée

sous pression réduite. La phase aqueuse est alors extraite avec du CH2Cl2 (4

fois 20 mL). Les phases organiques récupérées sont séchées sur MgSO4, filtrées

et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur

colonne de silice (gradient d’élution Cyclohexane/AcOEt 95/5 à 85/15 v/v) pour

C25H32O3 ; PM : 380,5 g.mol-1


- 110 -

conduire au produit 18 obtenu sous la forme d’un solide blanc (384 mg - Rdt :

91%).


Point de fusion : 71,0 – 72,5 °C.

RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,77 (dd, 4H3,5,8,12, J = 12,8, 8,2), 7,35 (dd,

4H2,6,9,11, J = 38,7, 8,1), 3,76 (s, 2Ha), 2,69 (t, 2Hj, J = 7,7), 1,64 (m, 2Hk), 1,28

(m, 14Hl+m), 0,89 (t, 3Hn, J = 6,4).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 196,8 (Ci), 177,4 (Cb), 149,0 (C10), 138,3, 137,6,

135,6 (C1,4,7 pour les 3 pics), 131,0, 130,0, 129,0 (C2,3,5,6,8,9,11,12 pour les 3 pics),

41,6 (Ca), 36,7 (Cj), 32,6, 31,8, 30,2, 30,0 (Ck+l pour les 4 pics), 23,3 (Cm), 14,8

(Cn).


4.4. Synthèse des sondes lipidiques à partir des acides gras 9 et 18

Synthèse de l’acide (S)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-(11-(4-(4-méthyl

benzoyl)phényl)undécanamido)propanoïque (9.1)

9 (190 mg – 0,5 mmol) est dissous dans 3 mL de CH2Cl2. La DIEA (194 mg – 1,5

mmol) et le PyBOP (260 mg – 0,5 mmol) sont ajoutés à la solution. Après 10 min

d’agitation à température ambiante, le Boc-L-Dpr-OH (100 mg - 0,5 mmol)

préalablement dissous dans 4 mL de CH2Cl2 et 3 mL de MeOH est ajouté au

milieu réactionnel. La solution est agitée à température ambiante et sous argon

pendant 2,5 h. La phase organique est ensuite lavée avec de l’eau distillée (2

fois 15 ml) puis la phase aqueuse est extraite avec CH2Cl2 (2 fois 20 ml). Les

C33H46N2O6 ; PM : 566,3 g.mol-1


- 111 -

deux phases organiques collectées sont séchées sur Na2SO4 et le solvant est

évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice

(gradient d’élution CH2Cl2/MeOH 100/0 à 100/10 v/v) pour conduire au produit

9.1 obtenu sous la forme d’un solide blanc (258 mg – Rdt : 90 %).


RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,69 (m, 4H), 7,27 (m, 4H), 4,14 (m, 1H), 3,74 (q,

J = 7 Hz, 1H), 2,65 (m, 2H), 2,42 (s, 3H), 2,17 (m, 2H), 1,62 – 1,21 (m, 25H).


Synthèse du (S)-tert-butyl 1-(hexadécylamino)-3-(11-(4-(4-méthylbenzoyl)

phényl)undécanamido)-1-oxopropan-2-ylcarbamate (9.2)

9.1 (150 mg – 0,26 mmol) est dissous dans 4,5 mL de CH2Cl2. La DIEA (102 mg

– 0,79 mmol) et le PyBOP (138 mg – 0,26 mmol) sont ajoutés à la solution.

Après 10 min d’agitation à température ambiante, de l’hexadécylamine (63 mg-

0,265 mmol) est ajoutée au milieu réactionnel. La solution est agitée à

température ambiante et sous argon pendant 5 h. La phase organique est

ensuite lavée avec 20 mL d’eau distillée puis la phase aqueuse est extraite avec

du CH2Cl2 (2 fois 20 mL). Les deux phases organiques collectées sont séchées

sur Na2SO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu

obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d’élution CH2Cl2/MeOH 100/2 à

100/4 v/v) pour conduire au produit 9.2 obtenu sous la forme d’un solide blanc et

gras (134 mg – Rdt : 64 %).

C49H79N3O5 ; PM : 790,2 g.mol-1


- 112 -


RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,73 (dd, 4H2,6,10,12, J = 8,1, 2,7), 7,29 (d,

4H3,5,7,9, J = 7,4), 6,82 (s, 1HNH), 6,27 (s, 1HNH), 5,99 (s, 1HNH), 4,16 (m, 1Hk),

3,74 (m, 1Hj), 3,51 (m, 1Hj), 3,23 (m, 2Hp), 2,69 (t, 2Hh, J = 7,6), 2,45 (s, 3Ha),

2,19 (t, 2Hc, J = 7,7), 1,67 – 1,25 (m, 53Hd,e,f,q,r), 0,89 (m, 3Hs).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 196,9 (Cb), 148,5 (C11), 143,6 (C1), 136,1, 135,9

(C4+8 pour les 2 pics), 130,8, 129,6, 128,9, 81,0 (Co), 55,9 (Ck), 42,7 (Cj), 40,2

(Cp), 37,3 (Ch), 36,7 (Cc), 32,6 (Cr), 31,8 (Cd), 30,4, 30,2, 30,2, 30,1, 30,0, 29,9

(Ce+f+r pour les 6 pics), 29,0 (Cn), 27,5 (Cq), 26,4 (Cg), 23,4 (Cr), 22,3 (Ca), 14,8

(Cs).


Synthèse du (S)-N-(2-amino-3-(hexadécylamino)-3-oxopropyl)-11-(4-(4-

méthyl benzoyl)phényl)undécanamide (9.3)

9.2 (130 mg – 0,16 mmol) est dissous dans un mélange CH2Cl2/TFA 50/50 v/v.

La solution est agitée à température ambiante pendant 2 h. La phase organique

est ensuite diluée avec 75 mL de CH2Cl2 puis lavée avec une solution de

NaHCO3 2M (3 fois 25 ml). La phase aqueuse est extraite avec du CH2Cl2 (2

fois 50 mL) et les deux phases organiques collectées sont séchées sur Na2SO4,

filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite pour conduire au produit

9.3 obtenu sous la forme d’un solide blanc (95 mg – Rdt : 86 %) sans purification

supplémentaire.

C41H71N3O3 ; PM : 690,1 g.mol-1


- 113 -


RMN 1H (400 MHz ; CDCl3) = 7,72 (dd, 4H2,6,10,12, J = 8,1, 2,7), 7,53 (t, J = 5,6

Hz, 1HNH), 7,29 (d, 4H3,5,7,9, J = 7,4), 6,31 (m, 1HNH), 3,65 (m, 1Hk), 3,47 (m, 2Hj),

3,24 (q, 2Hp, J = 6,7), 2,68 (t, 2Hh, J = 7,7), 2,45 (s, 3Ha), 2,18 (t, 2Hc, J = 7,6),

1,63 (m, 4H), 1,51 (m, 2HNH2), 1,28 (m, 40Hd,e,f,q,r), 0,89 (t, 3Hs, J = 6,8).

RMN 13C (100 MHz ; CDCl3) = 196,9 (Cb), 175,0 (Ci), 173,9 (Cl), 148,5 (C11),

143,6 (C1), 136,1, 135,9 (C4+8 pour les 2 pics), 130,9, 129,6, 128,9, 55,9 (Ck),

44,3 (Cj), 39,9 (Cp), 37,5 (Ch), 36,7 (Cc), 32,6 (Cr), 31,8 (Cd), 30,4, 30,3, 30,2,

30,1, 30,0, 29,9 (Ce+f+r pour les 6 pics), 27,7 (Cq), 26,4 (Cg), 23,4 (Cr), 22,3 (Ca),

14,8 (Cs).

Masse : m/z = 690, 5 [M+H]+, masse calculée = 689,5 g.mol-1.

Synthèse de Rhod-Dpr(CO-C10-BP-C1)-NH-C16H33 (9.4)

43 mg 5,6 tétraméthyl-carboxy-rhodamine (5,6-CTMR) (0,099 mmol) sont

dissous dans 3 mL de CH2Cl2. De la DIEA (30 mg – 0,230 mmol) et le PyBOP

(52 mg – 0,099 mmol) sont ajoutés à la solution. Après 20 min d’agitation à

température ambiante, 9.3 (53 mg – 0,077 mmol) préalablement dissous dans 3

mL de CH2Cl2 et deux gouttes de méthanol sont ajoutées au milieu réactionnel.

La solution est agitée à température ambiante et sous argon pendant 24 h. Le

solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur

colonne de silice (gradient d’élution CH2Cl2/MeOH 100/0 à 100/12 v/v) pour

C69H91N5O7 ; PM : 1102,5 g.mol-1


- 114 -

conduire au produit 9.4 obtenu sous la forme d’un solide violet (63 mg – Rdt : 74

%).

CCM : Rf = [0,8 ; 0,7] (CH2Cl2/MeOH 8,5/1,5 v/v).

RMN 1H (500 MHz ; CDCl3) = 8,79 (m,1H), 8,65 (m,1H), 8,09 (m,1H), 7,75 (m,

2H), 7,72 (d, 4H, J = 8,1), 7,56 (m, 2H), 7,26 (m, 4H), 6,91 (m, 1H), 6,56 (m, 2H),

4,11 (m, 1H), 3,90 (m, 2H), 3,25-3,13 (m, 14H), 2,65 (m, 2H), 2,44 (s, 3H), 2,19

(m, 2H), 1,61 (m, 4H), 1,28 (m, 40H), 0,87 (m, 3H).

RMN 13C (125 MHz ; CDCl3) = 197,0, 176,4, 170,7, 167,8, 156,5, 156,0, 148,6,

143,6, 142,9, 136,0, 135,8, 130,9, 129,6, 128,9, 126,2, 125,3, 118,7, 111,6, 97,6,

64,7, 54,4, 44,2, 42,7, 41,3, 40,5, 37,5, 36,7, 32,6, 31,8, 30,4, 30,3, 30,2, 30,1,

30,0, 29,9, 27,7, 26,4, 23,4, 22,3, 14,8.

Masse : HRMS : m/z = 1102,6951 [M+H]+, masse calculée = 1101,6918 g.mol-1.

HPLC : Tr = 13,6 min.

Synthèse de l’acide (S)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-(2-(4-(4-décyl

benzoyl)phényl)acétamido)propanoïque (18.1)

18 (190 mg – 0,5 mmol) est dissous dans 3 mL de CH2Cl2. De la DIEA (250 µL –

2,5 mmol) et le PyBOP (260 mg – 0,5 mmol) sont ajoutés à la solution. Après 10

min d’agitation à température ambiante, le Boc-L-Dap-OH (100 mg- 0,5 mmol)

préalablement dissous dans 4 mL de CH2Cl2 et 3 mL de MeOH est ajouté au


pendant 12 h. La phase organique est ensuite lavée avec une solution de

NaHCO3sat (2 fois 15 ml) puis la phase aqueuse est extraite avec CH2Cl2 (2 fois

C33H46N2O6 ; PM : 566,7 g.mol-1


- 115 -

20 ml). Les deux phases organiques collectées sont séchées sur MgSO4 et le

solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur

colonne de silice (gradient d’élution CH2Cl2/MeOH 100/0 à 100/15 v/v) pour

conduire au produit 18.1 obtenu sous la forme d’un solide blanc (138 mg – Rdt :

50%).


Masse : m/z = 467,2 [M+H-Boc]+, 565,2 [M-H]-, masse calculée = 566,3 g.mol-1.

Synthèse du (S)-tert-butyl 3-(2-(4-(4-décylbenzoyl)phényl)acétamido)-1-

(hexadécylamino)-1-oxopropan-2-ylcarbamate (18.2)

18.1 (138 mg – 0,24 mmol) est dissous dans 5 mL de CH2Cl2. La DIEA (200 µL –

1,21 mmol) et le PyBOP (164 mg – 0,32 mmol) sont ajoutés à la solution. Après

10 min d’agitation à température ambiante, de l’hexadécylamine (59 mg- 0,24

mmol) est ajoutée au milieu réactionnel. La solution est agitée à température

ambiante et sous argon pendant 12 h. La phase organique est ensuite lavée

avec 20 mL d’eau distillée puis la phase aqueuse est extraite avec du CH2Cl2 (2

fois 20 mL). Les deux phases organiques collectées sont séchées sur MgSO4,


purifié sur colonne de silice (gradient d’éluantion CH2Cl2/MeOH 100/0 à 100/4

v/v) pour conduire au produit 18.2 obtenu sous la forme d’un solide blanc et gras

(104 mg – Rdt : 54 %).

C49H79N3O5 ; PM : 790,2 g.mol-1


- 116 -


RMN 1H (400 MHz ; CDCl3) = 7,77 (dd, 4H2,6,10,12, J = 17,5, 8,1), 7,33 (m,

4H3,5,7,9), 6,68 (s, 1HNH), 6,37 (s, 1HNH), 5,83 (d, 1HNH J = 6,5), 4,17 (m, 1Hd),

3,72 (m, 1Hc), 3,64 (s, 2Ha), 3,50 (m, 1Hc), 3,21 (q, 2Hp, J = 6,5), 2,69 (t, 2Hj, J =

7,6), 1,67 – 1,25 (m, 53Hh,k,l,m,q,r), 0,89 (t, 6Hs,n, J = 6,6).

RMN 13C (100 MHz ; CDCl3) = 196,5 (Ci), 172,6 (Cb), 170,9 (Cf), 149,0 (C10),

139,5 (Cf), 137,8 (C1), 135,6 (C4,7), 131,3, 130,9, 129,8, 129,1 (C2,3,5,6,8,9,11,12 pour

les 4 pics), 81,2 (Cg), 44,2 (Cc), 40,3 (Ca), 36,7 (Cp), 31,9, 30,4, 30,3, 30,2, 30,1,

30,0 (Cj,k,l,r pour les 6 pics), 29,0 (Ch), 27,5 (Cq,r), 23,4 (Cm,r), 14,8 (Cn,s).

Masse : m/z = 690,4 [M+H-Boc]+, masse calculée = 789,6 g.mol-1.

Synthèse du (S)-2-amino-3-(2-(4-(4-décylbenzoyl)phényl)acétamido)-N-hexa

décylpropanamide (18.3)

18.2 (100 mg – 0,16 mmol) est dissous dans un mélange CH2Cl2/TFA 50/50 v/v.

La solution est agitée à température ambiante pendant 5 h. La phase organique

est ensuite diluée avec 50 mL de CH2Cl2 puis lavée avec une solution de

NaHCO3sat (3 fois 50 ml). La phase aqueuse est extraite avec du CH2Cl2 (2 fois

50 mL) et les deux phases organiques collectées sont séchées sur MgSO4,

filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite pour conduire au produit

18.3 obtenu sous la forme d’un solide blanc (83 mg – Rdt : 95 %) sans

purification supplémentaire.

C49H79N3O5 ; PM : 690,1 g.mol-1


- 117 -


RMN 1H (400 MHz ; CDCl3) = 7,75 (dd, 4H2,6,10,12, J = 17,5, 8,1), 7,44 (s, 1HNH),

7,34 (m, 4H3,5,7,9), 6,52 (s, 1HNH), 3,63 (s, 2Ha), 3,45 (m, 2Hc), 3,21 (m, 2Hp), 2,69

(t, 2Hj, J = 7,6), 1,65 (m, 2Hq), 1,48 (m,2HNH2), 1,25 (m, 42Hk,l,m,r), 0,88 (t, 6Hs,n, J

= 6,6).

RMN 13C (100 MHz ; CDCl3) = 196,5 (Ci), 172,6 (Cb), 149,0 (C10), 139,5 (C4),

137,8 (C1), 135,6 (C7), 131,3, 130,9, 129,8, 129,1 (C2,3,5,6,8,9,11,12 pour les 4 pics),

55,7 (Cd), 44,2 (Cc), 40,3 (Ca), 36,7 (Cp), 31,9, 30,4, 30,3, 30,2, 30,1, 30,0 (Cj,k,l,r

pour les 6 pics), 27,5 (Cq,r), 23,4 (Cm,r), 14,8 (Cn,s).

Masse : m/z = 690, 5 [M+H]+, masse calculée = 689,5 g.mol-1.

Synthèse de Rhod-Dpr(CO-C5-BP-C6)-NH-C16H33 (18.4)

57 mg de 5,6 tétraméthyl-carboxy-rhodamine (5,6-CTMR) (0,131 mmol) sont

dissous dans 3 mL de CH2Cl2. De la DIEA (80 µL – 0,50 mmol) et le PyBOP (68

mg – 0,131 mmol) sont ajoutés à la solution. Après 20 min d’agitation à

température ambiante, 18.3 (70 mg – 0,101 mmol) préalablement dissous dans 3

mL de CH2Cl2 est ajouté au milieu réactionnel. La solution est agitée à

température ambiante et sous argon pendant 24 h. Le solvant est évaporé sous


d’élution CH2Cl2/MeOH 100/0 à 100/12 v/v) pour conduire au produit 18.4 obtenu

sous la forme d’un solide violet (74 mg – Rdt : 66 %).

C69H91N5O7 ; PM : 1102,5 g.mol-1


- 118 -

CCM : Rf = [0,5 ; 0,6] (CH2Cl2/MeOH 8,5/1,5 v/v).

RMN 1H (500 MHz ; CDCl3) = 11,01 (s, 1H), 8,78 (m, 1H), 8,12 (m, 1H), 7,78

(m, 2H), 7,61 (m, 4H), 7,27 (m, 4H), 7,10 (m, 2H), 6,66 (m, 1H), 6,52 (m, 2H),

3,63 (s, 2H), 4,75 (m, 2H), 3,18-3,07 (m, 14H), 2,69 (m, 2H), 1,60-1;18 (m, 44H),

0,87 (t, 6H, J = 6,5).

RMN 13C (125 MHz ; CDCl3) = 196,8, 170,6, 157,1, 156,6, 149,3, 148,8, 142,7,

137,8, 135,6, 131,3, 130,9, 129,8, 129,1, 126,4, 125,4, 118,7, 111,6, 97,2, 54,3,

44,2, 42,6, 40,3, 36,7, 31,9, 30,4, 30,3, 30,2, 30,1, 30,0, 27,5, 23,4, 14,8.

Masse : m/z = 1102,6 [M+H]+, masse calculée = 1101,7 g.mol-1,

HRMS m/z = 1102,6946 [M+H]+, masse calculée = 1101,6918 g.mol-1.

HPLC : Tr = 14,1 ; 14,3 min (2 isomères).


- 119 -

Synthèse du N-((S)-3-(hexadecylamino)-3-oxo-2-(3-((2-(5-((3aR,4R,6aS)-2-

oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)ethyl)disulfanyl)

propanamido)propyl)-6-(4-(4-hexylbenzoyl)phenyl)hexanamide (19)

L’acide 3-[2-N-(biotinyl)aminoéthyldithio]propanoïque (23 mg - 0,05 mmol) est

dissous dans 1 mL de DMF et 0,500 mL de CH2Cl2. De la DIEA (56 mg – 0,4

mmol) et le PyBOP (30 mg –0,06 mmol) sont ajoutés à la solution. Après 20 min

d’agitation à température ambiante, 4 (30 mg – 0,04 mmol) préalablement

dissous dans 1 mL de CH2Cl2 et 0,5 mL de DMF. La solution est agitée à


pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par HPLC (colonne C4), pour

conduire au produit 19 obtenu sous la forme d’un solide blanc (7 mg – Rdt : 16

%).

Masse : m/z = 1080,4 [M+H]+, masse calculée = 1079,6 g.mol-1,

HRMS m/z = 1079,6483 [M+H]+, masse calculée = 1078,6397 g.mol-1

HPLC : Tr = 30,0 min

C59H94N6O6S3 ; PM : 1079,61 g.mol-1

III. Caractérisation, développement et optimisation

- 121 -

III. Caractérisation, développement et

optimisation


- 123 -

1. Caractérisation de l’activité des sondes lipidiques

Après la synthèse des 6 sondes lipidiques fluorescentes (3 analogues avec

le groupement benzophénone à distance variable et 3 autres analogues avec

des PFL différentes, chap. II), les propriétés attendues de celles-ci ont été

étudiées, à savoir, leur fluorescence (pour les 6) et leur capacité de

photomarquage (pour les 3 premières) dans les conditions expérimentales

choisies.

1.1. Etude de la fluorescence

Tout d’abord, les propriétés spectrales des sondes lipidiques ont été

vérifiées par spectroscopie de fluorescence. Des spectres d’excitation et

d’émission des sondes lipidiques insérées dans des liposomes ont été mesurés

à deux pH différents et à plusieurs temps d’irradiation. Les deux pH choisis (pH =

7,4 et pH = 5,0) sont ceux optimaux pour induire le processus de fusion virale

soit d’un virus pH-dépendant (induction de la fusion virale à pH acide), soit d’un

virus pH-indépendant (induction de la fusion virale à pH neutre chap. I.1.). Les

temps d’irradiation (0 s, 20 s, 45 s et 90 s) ont été choisis pour trouver un

compromis entre une irradiation efficace et une irradiation destructrice pour le

matériel biologique testé par la suite : on veut le meilleur rendement de

photomarquage possible pour une dégradation minimale du matériel biologique

utilisé.

Les maxima des spectres d’excitation et d’émission des sondes lipidiques

testées sont 560 ± 2 nm et 585 ± 2 nm respectivement aux deux pH (fig. III.1 A

et B) et aux différents temps d’irradiation testés (fig. III.1 C et D). Ces maxima

sont typiques des dérivés de la rhodamine. La tête rhodamine fluorescente des

sondes lipidiques n’est donc pas affectée dans les différentes conditions

expérimentales. L’intensité de la fluorescence des sondes lipidiques diminue

faiblement en fonction du temps croissant d’irradiation, une faible perte de la

fluorescence est observée mais aucune destruction totale n’est à déplorer. La


- 124 -

partie rhodamine des molécules étudiées est donc stable vis-à-vis de l’irradiation

UV à 365 nm correspondant à la photoactivation des sondes lipidiques et aux

deux pH testés. Ces résultats sont en accord avec ceux de la littérature

concernant la stabilité des dérivés du rhodol vis-à-vis des variations de pH88. Au

final, ces deux paramètres expérimentaux n’ont qu’une faible influence sur les

caractéristiques de fluorescences des 6 sondes lipidiques synthétisées. Pour

vérifier que la stabilité de la tête rhodamine des sondes lipidiques ne soit pas

spécifique de la structure de ceux-ci, nous avons reproduit ces expériences sur

des liposomes PC/chol 60/35 (mole/mole) contenant 5% (mole/mole) d’une

molécule fluorescente : le chlorure d’octadécyl Rhodamine B (R18) commercial.

Les propriétés spectrales de fluorescence de ce lipide sont bien connues

notamment lors de son utilisation pour des tests de fusion virale89. La

fluorescence des liposomes contenant R18 varie de la même manière par rapport

aux conditions expérimentales, pH et irradiation, que celle des sondes lipidiques

étudiées (fig. III.1 E et F). On peut en conclure que la stabilité de la fluorescence

de la rhodamine observée dans nos conditions expérimentales est une propriété

intrinsèque de la rhodamine et est indépendante du squelette qui lui est attaché.

88 J.E. Whitaker, R.P. Haugland, D. Ryan, P. C. Hewitt, F. G. Prendergast (1992). Fluorescent rhodol derivatives: versatile, photostable labels and tracers. Anal. Biochem. 207, 267-279. 89 D. Hoekstra, T. de Boer, K. Klappe, J. Wilschut (1984). Fluorescence method for measuring the kinetics of fusion between biological membranes. Biochemistry 23, 5675-5681.


- 125 -

Figure III.1 : Caractéristiques fluorescentes des sondes lipidiques : médiane (en noir), distale (en rouge) et proximale (en bleu) A, spectre d’excitation à pH = 7,4 (lignes pleines) ou à pH = 5,0 (lignes en pointillé). B, spectre d’émission. C et D spectre d’émission de la sonde lipidique (medium) de référence à pH = 7,4 (C) et pH = 5,0 (D), après 0, 20, 45, 90 s d’irradiation. E et F spectre d’émission de R18 à pH = 7,4 (E) et pH = 5,0 (F), après 0, 20, 45, 90 s d’irradiation.


- 126 -

1.2. Capacité de photomarquage des sondes lipidiques

Dans un premier temps, la capacité de photomarquage a été étudiée puis le

protocole de photomarquage des sondes lipidiques a été optimisé avec la sonde

lipidique de référence (SLR) médiane 5 (chap. II.2). Dans un second temps le

protocole de photomarquage optimisé est appliqué avec les sondes lipidiques

fluorescentes proximale 18.4 et distale 9.4 (chap. II.3.2.) sur différentes protéines

membranaires.

1.2.1) Conditions d’irradiation

Le photomarquage par les sondes lipidiques est réalisé en irradiant en

continu le complexe protéine ou hexane/sonde lipidique à 365 nm avec une

lampe au mercure de 400 W (Source « Flood » Dymax, Equipements

Scientifiques SA) à une distance de 10 cm environ sans système de

refroidissement dans une enceinte fermée. Le temps d’irradiation est précisé

pour chaque expérience.

1.2.2) Etude du photomarquage de la sonde lipidique de référence

a/ en solution organique

Dans un premier temps, pour tester la capacité de réaction du

groupement benzophénone des sondes lipidiques sur une liaison C-H dans un

système hydrophobe (chap. I.5.4.), la SLR est solubilisée dans un mélange de

CHCl3/n-hexane 1/2 v/v et est irradiée pendant 45 s. L’hexane est en très large

excès par rapport à la SLR. Le ratio molaire hexane/sonde lipidique est

largement plus élevé >500/1 par rapport au ratio protéine/sonde lipidique testé

par la suite du fait que le système hexane/sonde lipidique en solution organique

est moins organisé qu’un système en micelles de détergent ou en liposome

utilisé par la suite.


- 127 -

Après irradiation puis analyse de l’échantillon en spectrométrie de masse,

un adduit à m/z = 1170,4 [M+H+] est observé (fig. III.2). Celui-ci correspond à

l’addition du n-hexane sur le groupement benzophénone de la sonde lipidique

testée et à l’élimination d’une molécule d’eau (fig III.2 structure b). La structure a

n’est pas observée en spectrométrie de masse (LC-ESI) du fait que l’analyse est

effectuée en milieu acide. La sonde lipidique est donc capable de réagir de

manière covalente en solution, avec un environnement hydrophobe, ici avec

l’hexane dans le CHCl3.

b/ sur les protéines membranaires

Dans un second temps, la capacité de photomarquage de la SLR est

testée sur un système modèle de protéines membranaires en détergent. Deux

protéines ont été testées : la BmrA et la bactériorhodopsine (bR) (chap. I.4). La

BmrA est solubilisée avec 0,3 % de dodécylphosphocholine (FC 12) comme

détergent dans un tampon Tris HCl à pH = 8,0 et la bR est solubilisée dans l’eau

quand elle nous est fournie par Sigma-Aldrich. La BmrA en détergent et la bR

sont donc mises en contact avec la SLR préalablement solubilisée en micelles

de détergent (FC12) à pH = 8,0. Le ratio molaire protéine/sonde lipidique est de

1 pour 15. Cet excès permet d’éviter les problèmes d’accessibilité de la sonde

Figure III.2 : Photoréaction de la sonde lipidique de référence avec du n-hexane : exemples de structures possibles. Spectre de masse de l’échantillon.

a b


- 128 -

lipidique à la protéine, en effet il n’existe pas d’affinité particulière entre la sonde

lipidique et les protéines testées qui aurait permis un rapprochement spécifique.

L’incubation se fait pendant une heure à 4 °C à l’obscurité suivie d’une

irradiation de 45 secondes. L’échantillon est ensuite déposé sur un gel

d’électrophorèse. Après migration, le résultat est analysé à l’aide d’un

FluorImager Typhoon 8600 pour détecter la fluorescence de la rhodamine sur le

gel, puis celui-ci est coloré au bleu de Coomassie pour détecter la protéine (fig.

III.3).

L’analyse au FluorImager (fig. III.3 B) permet de révéler des bandes

fluorescentes. Il n’y a pas de fluorescence sur le gel quand la solution micellaire

protéine/sonde lipidique n’est pas irradiée et ni BmrA, ni bR ne donnent un signal

Figure III.3 : Protocole de photomarquage et photomarquage de BmrA et de bR avec la sonde lipidique de référence. A, coloration au bleu de Coomassie. B, analyse au fluorimager. M. marqueur, a. BmrA + SLR irradiée, b. bR + SLR irradiée.

Visualisation au Fluorimager

BmrA (66 kDa)

bR (27 kDa)

a b M

R

R

R

RR

RR

RR

RR

RRRR

P

P P

Incubation à 4ºC

Sonde lipidique en détergent

Protéine en détergent

RR

P

RR

RR

Irradiation à 365 nm Gel SDS-PAGE

Coloration au bleu de Coomassie

a b A B

Dénaturation


- 129 -

fluorescent sur le gel. Après coloration du gel au bleu de Coomassie (fig. III.3 A),

les bandes fluorescentes sont corrélées avec les protéines BmrA et bR,

suggérant que la sonde lipidique est bien capable de réagir avec son

environnement et de se fixer de manière covalente à la protéine.

Les conditions opératoires c’est-à-dire le rapport protéine/sonde lipidique,

les temps d’incubation et d’irradiation sont ensuite optimisées. Une étude sur

l’influence du ratio, du temps d’incubation et du temps d’irradiation sur l’efficacité

du photomarquage de la protéine par la SLR est ainsi effectuée avec BmrA (66

KDa).

1.3. Optimisation des conditions opératoires

Une évaluation semi-quantitative de photomarquage peut être effectuée en

fonction de l’intensité de la bande sur le gel analysée au fluorimager (image de

droite) : la dégradation de la protéine s’observe en fonction de l’intensité de la

bande sur le gel coloré en bleu de Coomassie (image de gauche) sachant que

la quantité de protéine déposée sur le gel est identique pour toutes les

expériences et pour chaque puits (10 µg de protéine). Pour pouvoir visualiser

correctement sur gel d’électrophorèse le marquage de la protéine par la sonde

lipidique en fluorescence au fluorimager sans que le signal ne sature, l’excédant

de sonde lipidique n’ayant pas réagi est découpé en bas de gel et éliminé avant

d’effectuer l’analyse.

1.3.1) Influence du rapport protéine/sonde lipidique

La SLR est mise en contact avec la protéine à différents ratio

protéine/sonde lipidique allant de 1/1 à 1/45 pendant une heure à 4°C puis

irradiée pendant 45s. Les différents échantillons sont déposés sur gel

d’électrophorèse.


- 130 -

Si la solution micellaire BmrA/sonde lipidique n’est pas irradiée, il n’y a pas

de marquage de la protéine par la sonde lipidique, celle-ci ne se fixe pas sur la

protéine. Il n’y a pas de bande visible au fluorimager à 66 kD et la sonde lipidique

se retrouve en totalité en bas de gel (fig. III.4, puits 2). Par contre, une fois la

solution micellaire BmrA/sonde lipidique irradiée, le rendement de

photomarquage augmente quand le ratio protéine/sonde lipidique augmente de

1/1 à 1/15 (fig. III.4, puits 3 et 4) puis celui-ci stagne (fig. III.4, puits 4 à 6) quand

le ratio augmente de 1/15 à 1/45. La quantité de sonde lipidique en excès

n’ayant pas réagi avec la protéine, visible en bas de gel, augmente quand le ratio

protéine/sonde lipidique augmente tandis que le rendement de photomarquage

n’augmente plus (fig. III.4, puits 4, 5, 6). Au vu de ces résultats, le ratio 1/15

protéine/sonde lipidique semble le plus adapté et sera utilisé dans la suite de

l’optimisation du protocole.

Néanmoins, en prévision des expériences futures consommant une plus

grande quantité de protéine et toujours dans un but d’optimiser ce protocole, un

ratio protéine/sonde lipidique intermédiaire de 1/5 est testé. Ces conditions

donnent les mêmes résultats qu’avec un ratio 1/15. C’est donc le ratio

protéine/sonde lipidique 1/5 qui semble le plus efficace pour conduire au meilleur

37

75 50

M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6

M Marqueur standard all blue 1 BmrA sans irradiation 2 BmrA + SLR, 1/15 sans irrad 3 BmrA + SLR, 1/1 45 s UV

5 BmrA + SLR, 1/15 45 s UV 6 BmrA + SLR, 1/30 45 s UV 7 BmrA + SLR, 1/45 45 s UV

Figure III.4 : Photomarquage de BmrA avec la SLR à différents ratio BmrA/SLR, coloration au bleu de coomassie, analyse au fluorimager.

15

25

250

BmrA (66 kDa)

Sonde lipidique excédentaire


- 131 -

rendement de photomarquage en consommant le minimum de sonde lipidique.

Ce ratio sera donc appliqué pour la suite des manipulations hors optimisation.

1.3.2) Influence du temps d’incubation entre la BmrA et la sonde lipidique

Deux temps d’incubation entre la protéine et la sonde lipidique ont été

testés à savoir 1 heure et 1 nuit à deux temps d’irradiation différents (45 s et 1

min).

Le temps d’incubation entre 1h ou une nuit, n’a pas d’influence sur le

rendement de photomarquage de la protéine comme on l’observe sur la figure

III.5 (puits 4 et 5), l’intensité de fluorescence visualisée au fluorimager est

identique pour les deux temps d’incubation testés. On remarque aussi qu’il n’y a

pas de marquage de la protéine s’il n’y a pas d’irradiation (fig. III.5 puits 2 et 3)

même avec un temps d’incubation d’une nuit. Il n’y a donc pas d’interaction non

spécifique entre la sonde lipidique et la protéine. Au vu de ces résultats, la

quantité de protéine photomarquée n’est pas influencée par le temps

d’incubation. Le temps d’incubation de 1 h est largement suffisant et efficace

pour avoir un rendement de photomarquage optimum et sera donc appliqué par

la suite.

M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 7

M marqueur standard all blue 1 BmrA sans irradiation 2 BmrA + SLR (1/15) sans irrad (1 nuit) 3 BmrA + SLR (1/15) sans irrad (1 h)

4 BmrA + SLR (1/15) 45 s UV (1 nuit) 5 BmrA + SLR (1/15) 45 s UV (1 h) 6 BmrA + SLR (1/15) 1 min UV (1 nuit) 7 BmrA + SLR (1/15) 1 min UV (1 h)

Figure III.5 : Photomarquage de BmrA avec la SLR à deux temps d’incubation différents, coloration au bleu de coomassie, analyse au fluorimager.

10

15

25

75 50 37

BmrA (66 kDa)


- 132 -

M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 7

1.3.3) Influence du temps d’irradiation entre la BmrA et la sonde lipidique

Après incubation, la solution micellaire protéine/sonde lipidique est soumise

à des temps d’irradiation allant de 30 secondes à 2 minutes selon les conditions

exposées en 1.3.1). Les différents échantillons sont déposés sur gel

d’électrophorèse.

Plus le temps d’irradiation de la solution micellaire protéine/sonde lipidique

augmente, plus l’intensité de la bande de gel colorée en bleu de Coomassie

correspondant à la BmrA diminue. L’irradiation provoque une dégradation de la

protéine du fait de la chaleur que dégage la lampe mais aussi du fait des autres

longueurs d’ondes inférieures à 300 nm émises par cette même lampe (fig. III.7).

< 300 nm, destructrices pour

75 50 37

4 BmrA + SLR (1/15) 45 s UV 5 BmrA + SLR (1/15) 1 min UV 6 BmrA + SLR (1/15) 1 min 30 s UV 7 BmrA + SLR (1/15) 2 min UV

M marqueur standard all blue 1 BmrA seule sans irradiation 2 BmrA + SLR (1/15) sans irrad 3 BmrA + SLR (1/15) 30 s UV

Figure III.6 : Photomarquage de BmrA avec la SLR à des temps d’irradiation différents, coloration au bleu de coomassie, analyse au fluorimager.

Figure III.7 : Spectre d’émission du mercure

= 365 nm

la protéine

15

25

BmrA (66 kDa)


- 133 -

La dégradation de la protéine est limitée jusqu’à un temps d’irradiation

continu de 45 s (fig. III.6 puits 3 et 4) par rapport à la protéine non irradiée (fig.

III.6 puits 1 et 2). A partir d’une minute d’irradiation la protéine se dégrade plus

fortement (fig. III.6 puits 5, 6 et 7) jusqu’à être totalement détruite à 2 min

d’irradiation (fig. III.6 puits 7 : la bande de gel colorée en bleu de Coomassie est

quasi inexistante au niveau de la masse correspondant à la BmrA).

L’intensité de fluorescence de la bande de gel correspondant à la BmrA

marquée par la sonde lipidique visualisée au fluorimager augmente entre 30 s et

1 min d’irradiation (fig. III.6 puits 3, 4 et 5) puis diminue entre 1 min 30 s et 2 min

d’irradiation (fig. III.6 puits 6 et 7). La quantité de protéine marquée augmente

donc entre 30 s et 1 min d’irradiation.

Si on fait la corrélation entre le rendement de photomarquage visualisé au

fluorimager et la dégradation de la protéine visualisé en bleu de Coomassie, le

temps d’irradiation de la solution micellaire protéine/sonde lipidique optimal est

de 45 s pour la BmrA (fig. III.6 puits 4). C’est le meilleur compromis entre un

rendement de photomarquage maximal et une dégradation minimale de la

protéine.

En conclusion les conditions optimales de photomarquage des protéines

par la SLR qui seront transposées aux autres sondes lipidiques sont une

incubation de la protéine en présence de la sonde lipidique pendant une heure à

4 °C, un ratio protéine/sonde lipidique de 1/5 et une irradiation de 45 s avec cette

lampe.

1.4. Etude du photomarquage des sondes lipidiques fluorescentes

sur différentes protéines

La capacité de photomarquage des trois sondes lipidiques (SL)

fluorescentes (médiane, distale et proximale) est testée sur les trois protéines

membranaires modèles : BmrA, bR et NS2 (chap. I.4). La solution micellaire

protéine/sonde lipidique 1/5 est irradiée 45 s puis l’échantillon est déposé sur gel


- 134 -

d’électrophorèse puis celui-ci est d’abord visualisé en fluorescence avec le

FluorImager (image de droite) pour identifier le marquage et ensuite coloré au

bleu de Coomassie (image de gauche) pour identifier la protéine. La protéine

seule non irradiée est aussi déposée sur le gel comme contrôle sauf pour BmrA

(contrôle effectué ci-dessus). La même quantité de protéines (15 µg) est

déposée dans chaque puits sauf indication contraire.

4 bR + SL distale irradiée 5 bR + SL proximale non irradiée 6 bR + SL proximale irradiée 7 bR seule non irradiée

M marqueur standard all blue 1 bR + SL médiane non irradiée 2 bR + SL médiane irradiée 3 bR + SL distale non irradiée

Figure III.9 : Photomarquage de bR avec les sondes lipidiques (SL) fluorescente, coloration au bleu de coomassie, analyse au fluorimager.

M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 7

4 BmrA + SL distale irradiée 5 BmrA + SL proximale non irradiée 6 BmrA + SL proximale irradiée

M marqueur standard all blue 1 BmrA + SL médiane non irradiée 2 BmrA + SL médiane irradiée 3 BmrA + SL distale non irradiée

Figure III.8 : Photomarquage de BmrA avec les sondes lipidiques (SL) fluorescente, coloration au bleu de coomassie, analyse au fluorimager.

37

M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6

75 50

15

25

250

10

BmrA (66 kDa)

37

75 50

15

25

10

bR (27 kDa)


- 135 -

Une fois les gels colorés en bleu de Coomassie, chaque série de bandes

visibles est corrélée avec la protéine analysée : BmrA à 66 kDa, bR à 27 kDa et

NS2 à 39 KDa. Aucune des trois protéines seules non irradiées ne génère un

signal fluorescent (figs. III.6 puits 1, III.9 puits 7 et fig. III.10 puits 1 ou 2). La

solution micellaire protéine/sonde lipidique ne génère pas non plus de

fluorescence si elle n’est pas irradiée (cf. les puits impairs sur les trois figures).

Seules les solutions micellaires protéine/sonde lipidique irradiées génèrent de la

fluorescence visible au fluorimager quelle que soit la protéine étudiée (cf. les

puits pairs sur les trois figures). Toutes les solutions micellaires protéine/sonde

lipidique irradiées sont fluorescentes : les trois sondes lipidiques fluorescentes

synthétisées (médiane, distale et proximale) ont donc une capacité à

photomarquer ces trois protéines membranaires. Aucune interaction non

spécifique protéine/sonde lipidique influençant la réaction photochimique n’est

observable. Ces trois sondes ont donc la capacité de se lier de manière

covalente aux protéines membranaires hydrophobes.

En fonction de la position de la benzophénone sur la chaine grasse de la

sonde lipidique et de la protéine utilisée, une variation de la quantité de protéine

photomarquée est observée (figs. III.8, 9, 10). L’efficacité du marquage est donc

4 NS2 + SL médiane irradiée 5 NS2 + SL distale non irradiée 6 NS2 + SL distale irradiée 7 NS2 + SL proximale non irradiée 8 NS2 + SL proximale irradiée

M marqueur standard all blue 1 NS2 seule non irradiée 10 µg 2 NS2 seule non irradiée 20 µg 3 NS2 + SL médiane non irradiée

Figure III.10 : Photomarquage de NS2 avec les sondes lipidiques (SL) fluorescente, coloration au bleu de coomassie, analyse au fluorimager.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8

37

75 50

15

25

250

10

NS2 (39 kDa)


- 136 -

influencée par la profondeur du groupement benzophénone sur les sondes

lipidiques et dépend de chaque protéine.

Ainsi une nouvelle génération de sondes lipidiques permettant de réaliser

du photomarquage d’affinité de matériels biologiques hydrophobes a été

synthétisée. Elle est basée sur l’utilisation de molécules lipidiques contenant un

groupement photoréactif et un groupement fluorescent pour la détection des

adduits formés lors de la réaction de photomarquage.

Cette nouvelle génération de sondes lipidiques offre plusieurs avantages :

sa synthèse est relativement simple, les sondes lipidiques sont stables dans une

membrane du fait de leur deux chaînes grasses, la photoactivation est réalisée à

une longueur d’onde non destructrice pour le matériel biologique. Après

photoactivation, le groupement benzophénone réagit de façon covalente avec

son environnement immédiat dans la membrane : soit un lipide, soit une région

hydrophobe de protéine membranaire. La tête rhodamine permet la détection et

le suivi du produit de la réaction de photomarquage.

Ces sondes lipidiques sont un nouvel outil robuste et efficace pour l’étude et

l’identification de zones hydrophobes de protéines. Cette partie du travail fait

actuellement l’objet d’un brevet CNRS90 et d’une publication91.

90 L. Bourel-Bonnet, B. Hilbold, E. I. Pécheur (25/03/2011). Composés à groupements chromophore et photoréactif. Brevet n° 11/52498 91 B. Hilbold, M. Perrault, C. Ehret, S. L. Nui,E. I. Pécheur,L. Bourel-Bonnet. Benzophenone-containing Fatty Acids and their related Photosensitive Fluorescent New Probes: Design, physico-chemical properties and Preliminary Functional Investigation. Bioorg. Med. Chem., publication soumise BMC-D-11-01103


- 137 -

2. Développement d’une méthode d’étude et d’identification de

protéines

2.1. Introduction

Le développement des techniques et des appareils en spectrométrie de

masse a révolutionné la biologie et plus particulièrement celui de la protéomique.

L’utilisation de la spectrométrie de masse pour l’étude de la structure et du rôle

des protéines a conduit à un grand nombre de découvertes durant ces vingt

dernières années allant de l’identification de protéines92 à l’analyse des voies de

transduction du signal93 en passant par l’identification de biomarqueurs94. Trois

stratégies ont été développées pour préparer et analyser des échantillons

biologiques par spectrométrie de masse : l’approche ‘’bottom-up’’ (1), l’approche

‘’middle-down’’ (2) et l’approche ‘’top-down’’ (3) (fig. III.11).

92 D. S. Chu, H. Liu, P. Nix, T. F. Wu, E. J. Ralston, J. R. Yates, B. J. Meyer (2006). Sperm Chromatin Proteomics Identifies Evolutionarily Conserved Fertility Factors. Nature, 443, 101-105. 93 J. M. Koomen, E. B. Haura, G. Bepler, R. Sutphen, E. R. Remily-Wood, K. Benson, M. Hussein, L. A. Hazlehurst, T. J. Yeatman, L. T. Hildreth, T. A. Sellers, P. B. Jacobsen, D. A. Fenstermacher, W. S. Dalton (2008). Proteomic Contributions to Personalized Cancer Care. Mol. Cell. Proteom., 7, 1780-1794. 94 L.M. de Godoy, J. V. Olsen, J. Cox, M. L. Nielsen, N. C. Hubner, F. Frohlich, T. C. Walther, M. Mann (2008). Comprehensive Mass-Spectrometry-Based Proteome Quantification of Haploid Versus Diploid Yeast. Nature, 455, 1251-1254.


- 138 -

L’approche ‘’bottom-up’’

Cette stratégie mise en œuvre pour l’analyse d’un mélange plus ou moins

complexe de protéines en solution est la stratégie classique et la plus répandue.

Elle consiste à découper une ou un mélange de protéine(s) à analyser en petits

peptides (< 3 kDa) par digestion enzymatique ou chimique. La digestion

enzymatique s’effectue, dans la plupart des cas par la trypsine. Les fragments

peptidiques obtenus doivent être suffisamment petits mais assez significatifs

pour permettre l’identification d’une protéine.

Figure III.11 : schéma des différentes approches d’analyse par spectroscopie de masse pour la protéomique : 1 approche bottom-up, 2 approche middle-down, 3 approche top-down

Extrait protéique : Solution complexe de protéines

1 2 3

digestion

solution très complexe de peptides

Purification : GE ou LC

solution complexe de peptides

LC-MS/MS

Protéine(s)

digestion limitée

quelques peptides en solution

LC-MS/MSLC-MS

Purification

Protéine

Purification

MS et MS/MS

Analyse à l’aide d’une base de données

Séquence d’acides aminés

Analyse manuelle des données

Séquence d’acides aminés

Analyse manuelle des données

Masse caractéristique d’un peptide

Masse caractéristique d’une protéine

Analyse à l’aide d’une base de données

1


- 139 -

Dans certains cas l’échantillon est purifié grossièrement pour diminuer sa

complexité soit avant la digestion (sur gel d’électrophorèse ou par

chromatographie), soit après digestion. Dans d’autres cas de figure, l’échantillon

peut être directement purifié par LC-ESI-MS.

Cette technique permet d’identifier une protéine dont la séquence primaire

est préalablement connue parmi un mélange de protéines, soit par une

empreinte massique d’un peptide d’une protéine donnée, soit par fragmentation

(tandem MS : MS/MS). Dans le premier cas, l’identification de la protéine

s’effectue par comparaison de masse grâce à une base de données contenant

un ensemble de masses chacune correspondant à un fragment peptidique

unique caractéristique d’une protéine. Dans le second cas, l’identification de la

protéine est basée sur les informations produites par la fragmentation d’un

précurseur polypeptidique chargé de la protéine pour former des fragments

peptidiques chargés. La séquence du précurseur polypeptidique chargé est

déduite par la masse des fragments ioniques générés.

Généralement cette stratégie ne donne pas d’information complète sur la

séquence entière de la protéine : il y a un risque de perte d’information. Elle ne

permet pas non plus d’avoir des informations sur les éventuelles modifications de

séquence obtenues lors de mutations ou sur la structure de la protéine car dans

ce cas la séquence du peptide modifié ne sera pas répertoriée dans la base de

données.

L’approche ‘’bottom-up’’, avec le développement d’appareils performants

(LC-ESI-MS/MS) et de solutions informatiques, est une technique largement

utilisée pour l’analyse et l’identification automatisée à haut débit de protéines et

d’échantillon complexe de mélanges protéiques.

L’approche ‘’middle-down’’

Cette stratégie consiste à analyser une protéine ou un mélange simple de

protéines après une digestion limitée, soit enzymatique avec des protéases

spécifiques choisies (comme par exemple l’endoprotéinase GluC ou AspN), soit

2


- 140 -

chimique avec le bromure de cyanogène (CNBr). Les peptides obtenus ont une

masse plus élevée que ceux produits par l’approche ‘’bottom up’’ (entre 3 et 20

kDa).

Cette technique combine les avantages des deux autres techniques : il est

possible d’avoir accès à la séquence complète de la protéine, la caractérisation

de modifications de la séquence peptidique est possible et enfin l’identification

automatisée des peptides est envisageable grâce à une base de données.

L’approche ‘’top-down’’

Cette stratégie consiste à analyser directement la protéine intacte sans

digestion protéolytique préalable. Cette approche est rendue possible grâce au

haut pouvoir de résolution massique et à la précision des spectromètres de

masse à transformée de Fourier développés ces dernières années95. Cette

approche a été mise au point récemment, avec le développement des

techniques de spectrométrie de masse comme le MALDI-TOF et l’ESI. Elle

convient pour l’analyse des protéines de bas poids moléculaire allant jusqu’à 60

kDa mais certaines équipes ont pu analyser des protéines allant jusqu’à 100

kDa96.

Cette méthode a permis l’analyse d’interactions protéine/protéine non

covalentes97, de sonder la structure secondaire et même tertiaire de certaines

protéines d’intérêt98,99. L’analyse de protéines par cette approche commence par

une étape de purification permettant de disposer de la protéine seule en solution,

95 K. Breuker, M. Jin, X. Han, H. Jiang, F. W. McLafferty (2008). Top-Down Identification and Characterization of Biomolecules by Mass Spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom, 19, 1045-1053. 96 N. Siuti and N. L. Kelleher (2007). Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry. Nat Methods, 4, 817-821. 97 N. L. Kelleher, S. V. Taylor, D. Grannis, C. Kinsmand, H. J. Chiu, T. P. Begley, F. W. McLafferty (1998). Efficient sequence analysis of the six gene products (7-74 kDa) from the Escherichia coli thiamin biosynthetic operon by tandem high-resolution mass spectrometry. Protein Sci., 7, 1796-1801. 98 J. A. Loo, C. G. Edmonds, R. D. Smith (1990). Primary Sequence Information from Intact Proteins by Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Science, 248, 201-204. 99 A. Miranker, C. V. Robinson, S. E. Radford, R. T. Aplin, C. M. Dobson (1993). Detection of Transient Protein Folding Populations by Mass Spectrometry. Science, 262, 896-900.

3


- 141 -

ou au moins de réduire l’hétérogénéité de l’échantillon à analyser. Ensuite

l’échantillon protéique est soit analysé directement par ESI soit purifié en direct

par RP – HPLC puis analysé par ESI. Une analyse de masse à haute résolution

est obtenue. Les avantages de cette méthode sont l’accès à la séquence

complète de la protéine étudiée et sa capacité à localiser et caractériser des

modifications survenues sur la protéine analysée.

Deux de ces trois approches, ’’middle-down’’ et ‘’top-down’’, ont été utilisées

en vue de l’identification et la caractérisation des zones photomarquées des trois

protéines modèles (BmrA, bR et NS2) par la sonde lipidique de référence (SLR,

fig. III.12).

Ainsi un gel d’électrophorèse de contrôle est réalisé à chaque étape des

analyses développées ci-dessous. Celui-ci nous permet de vérifier l’état de la

protéine étudiée par coloration du gel au bleu de Coomassie et la qualité de

marquage de la protéine avec la sonde lipidique par fluorescence à l’aide du

FluorImager.

Après photoactivation, la protéine peut potentiellement être plusieurs fois

marquée par la sonde lipidique. L’adduit de photomarquage formé (protéine +

sonde lipidique) a alors une masse de m = Mp + (n x 1102,5) en g.mol-1 où Mp est

la masse de la protéine non marquée et n le nombre de sondes lipidiques ayant

réagi avec la protéine (fig. III.12 A).

Figure III.12 : masses et structures possible des adduits de photomarquage formés entre une protéine et la sonde lipidique de référence


- 142 -

En milieu acide, l’adduit de photomarquage a tendance à se dégrader et à

perdre une molécule d’eau (fig. III.12 B) : le produit de couplage a alors une

masse m = Mp + (n x 1084,5).

2.2. Approche middle-down

Cette stratégie nous permet d’identifier, après digestion limitée d’une

protéine, la séquence peptidique marquée par la sonde lipidique. A une bande

de gel photomarquée visualisée en fluorescence par le fluorimager (cf. ci-

dessous : bandes encadrées en rouge) pourra être attribuée une séquence

peptidique caractérisée en LC-MS/MS ou en MALDI-TOF après purification de

l’échantillon. Cette attribution doit permettre d’identifier la région membranaire

marquée de la protéine analysée.

2.2.1) Digestion enzymatique limitée des protéines

Les solutions de protéines ou de protéines marquées sont digérées par une

enzyme spécifique pour limiter leur fragmentation. L’enzyme utilisée ici est la

protéase Glu-C V8. Il s’agit d’une sérine endopeptidase nommée Glutamyl

endopeptidase (EC 3.4.21.19). Cette enzyme a été choisie du fait de sa forte

spécificité de coupure après un résidu glutamate ou aspartate en fonction du

tampon (phosphate ou acétate) et du pH (7,8 ou 4,0) utilisés100. Cette protéase

est produite par la souche V8 de Staphylococcus aureus. L’enzyme nous est

fournie sous forme lyophilisée.

Les solutions micellaires de protéines ou de protéines marquées à étudier

ont été mises en contact avec l’enzyme à 37°C, dans un tampon spécifique et

pendant une durée déterminée. Pour limiter le nombre de fragments produits par

la digestion enzymatique, le temps de digestion a été optimisé en fonction de

chaque protéine utilisée.

100 J. Houmard and G. R. Drapeau (1972). Staphylococcal Protease: A Proteolitic Enzyme Specific for Glutamoyl Bonds. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 3506-3509


- 143 -

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

BmrA (66 kDa) BmrA (66 kDa)

Fragment de BmrA après digestion (~15 kDa)

a/ Cas n° 1 : la BmrA

Les premiers tests de digestion enzymatique avec la Glu-C V8 ont été

effectués sur la BmrA. L’enzyme a été solubilisée dans l’eau. Le gel

d’électrophorèse de la digestion de BmrA est présenté ci-dessous.

Différents temps de digestion ont été testés allant de 1 à 45 min (fig.

III.13), le temps optimum de digestion de la BmrA est de 5 min à 37 °C dans un

tampon tris HCl 20 mM à pH = 7,8 (puits 4). Un peptide majoritaire à ~15 kDa est

obtenu. Il est à remarquer que ce peptide est marqué par la sonde lipidique : la

bande fluorescente est visible au fluorimager.

b/ Cas n° 2 : la bactériorhodopsine (bR)

Un premier essai de digestion de cette protéine a été effectué dans un

tampon tris HCl 20 mM à pH = 7,8 (condition identique au cas n° 1 avec

l’enzyme solubilisée dans l’eau milliQ) à des temps de digestion allant de 5 min à

5h : aucune digestion n’a été observée.

50

M marqueur standard All blue 1 BmrA seule sans irradiation 2 BmrA + SLR, 45 s, pas de digestion 3 BmrA + SLR, 45 s UV, digestion 1 min 4 BmrA + SLR, 45 s UV, digestion 5 min

5 BmrA + SLR, 45 s UV, digestion 10 min 6 BmrA + SLR, 45 s UV, digestion 15 min 7 BmrA + SLR, 45 s UV, digestion 20 min 8 BmrA + SLR, 45 s UV, digestion 30 min 9 BmrA + SLR, 45 s UV, digestion 45 min

Figure III.13 : Photomarquage de BmrA avec la sonde lipidique de référence (SLR) à différents temps de digestion, coloration au bleu de Coomassie, analyse au fluorimager

37

75

15

25

250

10


- 144 -

M

bR (27 kDa)

bR digérée

bR (27 kDa)

BA

Non irradiée Irradiée

Non irradiée digérée

Irradiée digérée



Irradiée digérée

Temps de digestion

Tampon d'incubation

Tampon de solubilsation de Glu-C V8

< 5 h Tris HCl 20mM

pH = 7,8 H2O

pas de digestion

< 5 h AcNH4 100 mM

pH = 4,0 H2O

pas de digestion

> 12 h Tris HCl 20mM

pH = 7,8 H2O

pas de digestion

> 12 h Tris HCl 20mM

pH = 7,8 AcNH4 100 mM

pH = 4,0

digestion

> 12 h AcNH4 20 mM

pH = 8,0 AcNH4 100 mM

pH = 4,0

digestion

Après ajustement des différents paramètres : condition de solubilisation

de l’enzyme, tampon et durée de la digestion (tab. III.1), on obtient une digestion

partielle de la bR par l’enzyme solubilisée dans un tampon acétate d’ammonium

100 mM à pH = 4,0 et dans un tampon acétate d’ammonium 20 mM à pH = 8,0

pendant 15 h à 37 °C (fig. III.14).

Un fragment peptidique majoritaire à ~15 kDa (encadré en rouge sur la fig.

III.14) issu de la digestion de la bR est marqué par la sonde lipidique. D’autres

fragments issus de la digestion sont visibles mais en quantité fortement

minoritaire.

Figure III.14 : Photomarquage de bR avec la sonde lipidique de référence (SLR), digestion avec Glu-C V8, coloration au bleu de Coomassie, analyse au fluorimager. M, marqueur All Blue standard.

Tableau III.1 : paramètres testés pour la digestion de la bactériorhodopsine.

50 37

75

15

25

250

10


- 145 -

A B

NS2 (39 kDa) NS2 (39 kDa) NS2 digérée : plusieurs

fragments



Irradiée digérée



Irradiée digérée M

c/ Cas n° 3 : NS2, une protéine de VHC

La digestion de NS2 est effectuée avec les conditions

expérimentales suivantes : l’enzyme est solubilisée dans un tampon acétate

d’ammonium 100 mM à pH = 4,0 ; la mise en contact de la protéine et de

l’enzyme puis la digestion se font dans un tampon Tris HCl 20 mM à pH = 8,0, le

temps de digestion optimal est de 4 min.

La digestion enzymatique de cette protéine produit deux fragments

peptidiques majoritaires entre 15 et 20 kDa. Seul un de ces deux fragments est

marqué par la sonde lipidique (encadré en rouge sur la figure III.15).

Pour les trois protéines étudiées le temps de digestion avec la protéase

Glu-C V8 a été optimisé. Il varie de 4 min à plus de 12 heures en fonction de

l’accessibilité des résidus acides glutamiques au sein de la protéine et de la

compacité de celle-ci en micelles de détergent. Ces temps de digestion ne

permettent pas une digestion totale de la protéine, malheureusement si la

digestion est trop longue, un grand nombre de petits fragments est obtenu

rendant impossible leur purification et, au final, leur identification en

spectrométrie de masse. La digestion de chaque protéine produit au moins un

fragment marqué par la sonde lipidique visible en fluorescence. C’est ce

fragment que l’on va essayer d’identifier plus précisément grâce à diverses

techniques.

37

Figure III.15 : Photomarquage de NS2 avec la sonde lipidique de référence (SLR), digestion avec Glu-C V8, coloration au bleu de Coomassie, analyse au fluorimager. M, marqueur All Blue standard.

50 75

15

25

10

250


- 146 -

2.2.2) Purification et identification

Avant de pouvoir effectuer une analyse par spectrométrie de masse,

l’échantillon digéré est purifié afin de diminuer la complexité de la solution à

analyser. Plusieurs techniques de purification ont été testées, soit sur gel

d’électrophorèse soit en solution.

a/ Purification et identification par SDS-PAGE : digestion trypsique ‘in-gel’

Les différents fragments peptidiques produits par la digestion sont

séparés sur un gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en fonction de la taille

apparente du fragment. La bande correspondant au fragment peptidique d’intérêt

est découpée et est extraite du gel par une digestion à la trypsine (fig. III.16). Les

avantages de cette technique sont l’utilisation de faible quantité de protéine (< 15

µg, néanmoins suffisante pour pouvoir visualiser la protéine en bleu de

Coomassie sur le gel) et la robustesse de la méthode. C'est une technique

optimisée et utilisée en routine pour l'identification de protéines, elle est facile à

mettre en place et c'est l'une des méthodes les plus utilisées pour purifier des

protéines.

Malheureusement cette technique souffre de plusieurs désavantages.

D’abord dans le cas qui nous intéresse, avec des protéines hydrophobes, un

mauvais rendement d’extraction de la protéine du gel est à déplorer. Ensuite il

est généralement difficile de réaliser ces différentes manipulations sans avoir de

Séparation des fragments

de l’échantillon sur

SDS-PAGE

Excision de la bande

d’intérêt

Extraction de la protéine du

gel (digestion à la trypsine)

Identification par

spectrométrie de

masse

Figure III.16 : Schéma général de la méthode de digestion et d’identification dite ‘in-gel’


- 147 -

M

contaminant qui vont biaiser les analyses. Enfin l’analyse par LC-MS/MS donne,

en théorie, accès à la séquence du peptide à analyser, c’est une analyse

qualitative et non quantitative : on ne peut pas savoir si le peptide identifié est

majoritaire ou minoritaire dans le morceau de protéine purifié par SDS-PAGE.

Cette méthode a tout de même été appliquée à la bR et à NS2 avec des

quantités de protéine de l’ordre de 30 µg pour pallier le faible rendement

d’extraction de celles-ci hors du gel. Les bandes d’intérêts excisées du gel sont

celles encadrées en rouge (cf. ci-dessous). Après extraction des fragments de

protéines du gel par la trypsine, celles-ci ont été analysées par LC-MS/MS afin

de déterminer la séquence de ces fragments protéiques.

- La bactériorhodopsine (bR)

Voici le résultat des analyses en LC-MS/MS de la bR (a), de la bR digérée

(b) et de la bR digérée et marquée avec la SLR (c) : les bandes encadrées en

rouge sur le gel ont été analysées (fig. III.17). Toutes les bandes à analyser ont

subi le même traitement (excision, digestion à la trypsine, analyse).

Chaque séquence (à droite) correspond à sa bande de gel respective (à

gauche) analysée en LC-MS/MS. Les fragments peptidiques caractérisés et



Irradiée digérée

a b c

a

b

c

Fragments peptidiques correspondant aux bandes excisées du gel (encadrées en rouge), les peptides en rouge ont été caractérisés

Figure III.17 : Résultats des analyses de la bR en LC-MS/MS après digestion ‘in gel’, M : marqueur All Blue standard

37 50 75

15

25

10

250


- 148 -

identifiés par LC-MS/MS via la base de données Uniprot KB 2010 sont en rouge

sur la figure III.17 à droite.

Il n’y a pas de différences significatives entre les fragments peptidiques

caractérisés pour la bR seule (a) et ceux caractérisés pour la bR digérée (b). Les

séquences des fragments peptidiques caractérisés en spectrométrie de masse

sont dispersées sur toute la longueur de la séquence de la protéine. On a un

recouvrement de 33 % de la séquence de la bR pour l’analyse de la bR non

digérée (a) et de 30 % pour l’analyse du segment peptidique digéré (b). On ne

peut donc pas déterminer, avec précision, à quel(s) segment(s)

transmembranaire(s) correspond le fragment digéré (b) de bR encadré en rouge

sur le gel.

La seule différence expérimentale entres les fragments peptidiques (b) et

(c) est l’irradiation de la protéine induisant le marquage de celle-ci. Cette

modification est visible par fluorescence sur le fragment peptidique (c), la bande

de gel analysée est visible en fluorescence au fluorimager. Ces deux fragments

peptidiques correspondent donc à un même fragment de la protéine l’un marqué

(c) l’autre non (b). Les peptides caractérisés en LC-MS/MS pour le fragment (c)

sont aussi dispersés sur toute la séquence de la protéine. On ne peut donc pas

localiser quel(s) segment(s) transmembranaire(s) sont marqués par la sonde

lipidique en faisant la comparaison des fragments peptidiques caractérisés pour

la protéine entière (a) et ceux de la protéine digérée et marquée (c).

Une autre analyse de ces séquences peptidiques (a), (b) ou (c)

caractérisées en LC-MS/MS peut être menée. Le photomarquage de la protéine

par la sonde lipidique induit une modification de la séquence de la protéine au

niveau du marquage. Cette modification n’est ni visible ni identifiable par LC-

MS/MS : le fragment peptidique marqué ne peut pas être caractérisé car il n’est

plus reconnu par la base de données du fait de sa modification. Dans ce cas, les

peptides entourés sur la figure III.17 (b) (à droite) ne sont plus reconnus lorsque

la protéine est marquée (c). Le recouvrement de la séquence primaire de la bR

n’est alors plus que de 22 %. Ces fragments peptidiques sont des zones de la


- 149 -

M

bR potentiellement marquées par la sonde lipidique. Ils correspondent aux

hélices transmembranaires 4 et 6 de la bactériorhodopsine.

La non caractérisation de ces peptides en LC-MS/MS peut aussi venir de

la manière de préparer l'échantillon à analyser. Le rendement d'extraction

(digestion à la trypsine non complète) de la protéine du gel peut être plus faible

est donc certains peptides ne sont pas extraits de la bande de gel et donc ne

sont pas présents dans la solution à analyser. Mais il est à remarquer que ces

analyses ont été réalisées plusieurs fois par un même opérateur et donnent les

mêmes résultats. C'est-à-dire qu’il y a un même recouvrement de séquence

entre la protéine seule et la protéine digérée non marquée et un recouvrement

plus faible entre la protéine marquée et digérée avec les mêmes fragments

peptidiques non caractérisés. Cette deuxième hypothèse est donc peu probable

quant à la non caractérisation des ces peptides.

- NS2

Voici le résultat des analyses en LC-MS/MS de NS2 (a) (fig. III.18), de

NS2 digérée (b) et de NS2 digérée et marquée avec la SLR (c). Toutes les

bandes à analyser ont subi le même traitement (excision, digestion à la trypsine,

analyse).

MSYYHHHHHHGMSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGSDLSGGGGGLVPRGSDPWSGEDSATLGAGILVLFGFFTLSPWYKHWISRLMWWNQYTICRCEATLQVWVPPLLARGSRDGVILLTSLLYPSLIFDITKLLIAILGPLYLIQAAITTTPYFVRAHVLVRLCMLVRSVMGGKYFQMAILSVGRWFNTYLYDHLAPMQHWAAAGLKDLAVATEPIIFSPMEIKVITWGADTAACGDILCGLPVSARLGREVLLGPADDYREMGWRLL





Irradiée digérée

a

b c

a

b

c

Fragments peptidiques correspondant aux bandes excisées du gel (encadrées en rouge), les peptides en vert ont été caractérisés

37 50 75

15

25

10

250

Figure III.18 : Résultats des analyses de NS2 en LC-MS/MS après digestion ‘in gel’, M : marqueur All Blue standard


- 150 -

La stratégie d'identification précédemment utilisée a été appliquée à une

deuxième protéine, NS2. Les fragments peptidiques en vert ont été caractérisés

(fig. III.18 à droite). Chaque séquence correspond à sa bande de gel respective

analysée en LC-MS/MS. La bande du gel analysée est celle qui est visible en

fluorescence au fluorimager (fig. III.18, bande encadrée en rouge).

Les conclusions de ces analyses pour caractériser le fragment peptidique

marqué par la sonde lipidique sont sensiblement les mêmes qu’avec bR. Il n'y a

pas de différence entre les fragments peptidiques identifiés en LC-MS/MS de la

protéine seule (a) et de ceux de la protéine digérée (b). On a un recouvrement

de la séquence primaire de NS2 identique entre les séquences (a) et (b). La

seule différence, en jaune sur la figure III.18 (côté droit) peut être attribuée à un

site probable de clivage de la protéase Glu-C V8 utilisée pour la digestion

partielle de la protéine car ce site de clivage ne peut pas être attribué à la

trypsine. Pour les mêmes raisons que pour la bR, le fragment peptidique entouré

sur la séquence (b) (et qui n'est plus caractérisé en LC-MS/MS sur la séquence

de NS2 digérée et marquée (c)) peut être une zone de NS2 marquée par la

sonde lipidique. Cette zone correspond au 2ème segment transmembranaire de la

protéine.

L'utilisation de cette méthode nous permet d'émettre un faisceau

d’hypothèses sur la localisation précise de zones marquées sur ces deux

protéines. Pour lever toutes les ambiguïtés liées à cette méthode plusieurs

autres solutions ont été mises en place.

b/ Purification et identification ‘en solution’

Ces méthodes de purification et d’identification nécessitent une plus

grande quantité de protéine, entre 150 et 200 µg du fait d’un nombre plus

important d’étapes avant l’analyse. Garder les échantillons en solution nous

permet d’effectuer une analyse directe de masse en MALDI-TOF et donc de

disposer d’une information quantitative sur le rendement de photomarquage des

protéines par la sonde lipidique.


- 151 -

- Purification par RP-HPLC

L'avantage de cette technique est que l'échantillon purifié est solubilisé

dans un solvant organique : la phase mobile de la colonne de chromatographie,

dans notre cas de l'acétonitrile en présence de 0,1 % de TFA (nos produits

hydrophobes sont élués à 80% d'acétonitrile sur une colonne C8). Les problèmes

de détergents et de sels contenus dans le tampon sont donc résolus. L'analyse

en spectrométrie de masse est alors effectuée dans de meilleures conditions.

L'échantillon, en sortie de colonne est trop dilué pour une analyse directe en

spectrométrie de masse : celui-ci est lyophilisé puis resolubilisé dans un

minimum d'acétonitrile. L’absorbance à deux longueurs d’onde est enregistrée en

sortie de colonne HPLC : 220 nm correspondant à la longueur d’onde

d’absorption des liaisons peptidiques et 550 nm longueur d’onde d’absorption de

la rhodamine. Les fragments de protéines marquées absorbent, en HPLC, aux

deux longueurs d’onde choisies. Des résultats cohérents en spectrométrie de

masse sont obtenus sur les échantillons contrôles. Après purification de la BmrA

seule par HPLC, un spectre de masse des fractions HPLC correspondant à la

protéine est obtenu avec une valeur de m/z caractéristique de celle-ci (fig. III.19

A).

Après digestion à la Glu-C V8 et purification de la BmrA, un spectre de

masse des fractions HPLC majoritaires (fig. III.19 B’ encadré en rouge) confirme

que la digestion de la BmrA produit un fragment majoritaire à ~15 kDa (fig. III.19

C). Le spectre de masse de la BmrA mise en contact avec la sonde lipidique

(sans irradiation) indique que la séparation HPLC de ces deux entités n’est pas

efficace (fig. III.19 C et C’). Le fragment majoritaire produit par la digestion de la

protéine ne peut pas être séparé de la sonde lipidique avec les gradients et la

colonne utilisés en HPLC.


- 152 -

La séparation des fragments non marqués des fragments marqués de

l'échantillon semble être efficace par HPLC (fig. III.20 A et A’). Malheureusement

le rendement de photomarquage et le rendement de purification (expérience

complète comprenant la séparation, la concentration et le resolubilisation) avec

des protéines hydrophobes telles que la BmrA, ne sont pas suffisants. Certains

fragments marqués ne sont pas séparables des fragments non marqués du fait

de la faible différence d’hydrophobicité entre ces deux entités. On a donc un

mélange de fragments de protéine non marquée et de fragments de protéine

marquée. En fait, seuls les petits fragments moins hydrophobes comme la queue

cytosolique en position C-terminale de la BmrA sont séparés des autres

fragments. Cette expérience ne produit pas assez de matériel marqué pour avoir

des résultats exploitables en spectrométrie de masse malgré une quantité de

Figure III.19 : A spectre de masse de la BmrA en MALDI-TOF après purification par HPLC, B chromatogramme HPLC de la BmrA digérée à 220 nm, B’ chromatogramme HPLC de la BmrA digérée à 550 nm, C spectre de masse de la BmrA en MALDI-TOF digérée après purification par HPLC (fraction encadrée en rouge), C’ spectre de masse de la sonde lipidique présente dans l’échantillon (fraction encadrée en rouge).

A B

C

C’

m/z : 65531

m/z : 37014

m/z : 32760

m/z : 14483

m/z : 1102,5

m/z : 7242,7

B’


- 153 -

protéine importante au départ. Les spectres de masse obtenus (fig. III.20 B et B’)

correspondant à la fraction majoritaire marquée en HPLC (fig. III.20 A et A’

encadrée en rouge) sont similaires à ceux de la même expérience où la protéine

est non marquée (ci-dessus). On retrouve un fragment de la BmrA digérée non

marquée à ~15 kDa, d’autres pics non interprétables (fig. III.20 B) et la sonde

lipidique en excès (fig. III.20 B’). La multiplication des étapes avec cette méthode

de purification n'est pas favorable à un bon rendement : l'échantillon digéré peut

former des agrégats non séparables lors de la séparation HPLC, les fragments

de protéines hydrophobes traînent sur tout le gradient HPLC : la séparation n’est

finalement pas si efficace et l'échantillon lyophilisé est difficilement resolubilisable

(l'échantillon reste adsorbé aux parois du tube en plastique utilisé).

A

A’

B B’

Fragments de BmrA non marqués (pas de signal à 550 nm)

Fragments de BmrA marqués et sonde lipidique en excès (signal à 220 nm et à 550 nm)

Figure III.20 : A chromatogramme HPLC de la BmrA digérée et marquée à 220 nm, A’ spectre HPLC de la BmrA digérée et marquée à 550 nm, B spectre de masse de la BmrA en MALDI-TOF digérée et marquée après purification par HPLC, B’ spectre de masse de la sonde lipidique présente dans l’échantillon.

m/z : 14489

m/z : 1102,9

m/z : 4820


- 154 -

Cette méthode a été testée sur la BmrA sans donner de résultats

exploitables en spectrométrie de masse (MALDI-TOF) en comparant les spectres

de masse de la protéine marquée (fig. III.20) de celle où elle n’est pas marquée

(cf. fig. III.19). Malgré une étape de purification par HPLC, l’échantillon à

analyser reste trop hétérogène pour déterminer avec précision les zones

marquées de la protéine par la sonde lipidique.

- Purification par chromatographie d’exclusion stérique (CES) :

application à la BmrA

Cette technique permet de séparer chaque fragment protéique issu de la

digestion en fonction de leur taille apparente. A la différence de la méthode dite

‘in-gel’ (vue précedemment) les fragments protéiques sont séparés en solution

dans un tampon salin contenant un détergent. Ces conditions sont nécessaires

pour solubiliser la protéine et de la sonde lipidique dans un milieu aqueux. Après

digestion de la BmrA par le Glu-C V8 (cf. ci-dessus) un peptide majoritaire à ~15

kDa est obtenu. Cette solution est éluée sur une colonne de chromatographie

d’exclusion stérique (CES) et après concentration et dessalage de l’échantillon

celui-ci est analysé en spectrométrie de masse par MALDI-TOF. Trois analyses

sont effectuées (fig. III.21) : la BmrA seul irradiée (a), la BmrA digérée en

présence de la sonde lipidique (b) et la BmrA en présence de la sonde lipidique

ayant subi une irradiation puis digérée (c).


- 155 -

Profils chromatographiques Spectres de masse MALDI

BmrA Irradiée (a)

BmrA digérée en présence de la sonde lipidique (b)

BmrA irradiée en présence de la sonde lipidique et digérée (c)

BmrA

Fragments de BmrA

m/z : 65660

m/z : 33033

BmrA

Fragments de BmrA provenant de la digestion

Présence de la sonde lipidique

m/z : 8413 8053 6334 4816 3351

BmrA

Fragments de BmrA provenant de la digestion

Présence de la sonde lipidique

m/z : 4819

Figure III.21 : Analyses effectuées sur la BmrA, sur les profils chromatographiques le chromatogramme bleue est obtenue à = 220 nm et le chromatogramme rouge à = 550 nm.


- 156 -

La détection des fractions en sortie de colonne est effectuée à deux

longueurs d’onde différentes : à 220 nm pour détecter la liaison amide et à 550

nm pour détecter la rhodamine.

L’irradiation de la BmrA par notre lampe au mercure conduit à une légère

dégradation de celle-ci (fig. III.21 a côté gauche) principalement en fragments de

petite taille. Le pic majoritaire correspond à la BmrA non dégradée de m/z

observé égale à ~66 kDa (fig. III.21 a côté droit).

Après digestion de la BmrA, le fragment majoritaire obtenu en CES (fig. III.21 b

côté gauche) correspond à des fragments de protéine allant de 3000 à 8000 Da

en MALDI-TOF (fig. III.21 b côté droit). Ces résultats ne sont pas en adéquation

avec les observations effectuées sur Gel SDS-PAGE ou en HPLC. Ceci est dû

au fait que les fragments de protéine forment des agrégats après la digestion et

ont donc une taille apparente plus grande que la masse de chaque fragment

respectif. On observe ce même phénomène avec la sonde lipidique. Celle-ci est

éluée en même temps que tous ces fragments de protéines alors qu’elle n’a

qu’une masse moléculaire de 1102,5 Da et qu’elle n’est pas attachée de manière

covalente à la protéine (échantillon non irradié). Elle reste sous forme de

micelles de détergent lors de cette séparation (fig. III.21 b côté gauche courbe

rouge). Après vérification sur gel SDS-PAGE de la fraction purifiée par CES, on a

bien un fragment de protéine non marquée et la sonde lipidique (fig. III.22), les

différents m/z obtenus sur le spectre de masse MALDI-TOF proviennent alors

soit du fragment visible sur gel soit de contaminants ou de fragments non visibles

sur gel (fragments trop petits ou non visibles en bleu de Coomassie). Après

irradiation de l’échantillon, un fragment de BmrA est obtenu (fig. III.21 c côté

gauche), celui-ci est marqué par la sonde lipidique comme le montre la figure

III.22 où le fragment marqué est visible en fluorescence (encadré en rouge).

Malheureusement après concentration et dessalage de l’échantillon, celui-ci ne

contient pas assez de protéine marquée pour pouvoir interpréter correctement

l’analyse en spectrométrie de masse.


- 157 -

Cette méthode a été utilisée pour son bon rendement de purification

contrairement à une purification par HPLC. Malheureusement l’avantage majeur

de cette méthode, c’est-à-dire la séparation par taille apparente des protéines en

tampon, devient dans notre cas un désavantage puisque l’échantillon purifié en

fin de colonne est solubilisé en présence de sel et de détergent pour garder la

protéine soluble : deux éléments ne permettant pas de réaliser des analyses

correctes en spectrométrie de masse. Une étape de dessalage supplémentaire

serait nécessaire ce qui ferait baisser le rendement de purification de la protéine.

Cette méthode, tout comme celle utilisant l’HPLC comme moyen de purification,

ne donne pas de résultats exploitables quant à l’identification précise d’une zone

marquée de la protéine en spectrométrie de masse. Un fragment de protéine

marqué en solution est tout de même isolé après purification de l’échantillon : la

purification de fragments de protéine par CES est efficace.

Fragment de BmrA (b)

Fragment de BmrA (b)

Fragment marqué de BmrA (c)

Fragment marqué de BmrA (c)

Fragment BmrA après CES

Sonde lipidique

Figure III.22 : Vérification du contenu des échantillons b (non marqué) et c (marqué) reconcentrés et dessalés sur gel SDS-PAGE après CES


- 158 -

Une dernière approche, utilisant la méthode ‘’middle-down’’ en MALDI-

TOF, a été mise en place pour identifier plus directement des zones marquée de

la BmrA par comparaison des spectres de masse de la protéine digérée (fig.

III.23 A) avec ceux de la protéine digérée et marquée (fig. III.23 B) sans

purification.

Après vérification par SDS-PAGE, un fragment de BmrA est marqué (fig.

III.22) à ~15 kDa. En outre la digestion de BmrA produit bien un fragment de

protéine non marquée ayant une masse de ~12 kDa (spectre A). En comparant

les spectres A et B, aucune différence notable n’est visible au niveau du nombre

de massifs. Le massif correspondant à la protéine marquée (spectre B) par la

sonde lipidique doit être décalé vers une masse supérieure de n x 1102,5 g.mol-1

ou n x 1084,5 g.mol-1 (chap. III.2.1.) à celui de la protéine non marquée (spectre

A). Aucun pic du spectre B, non présent sur le spectre A, ne peut être attribué à

une masse d’un fragment de protéine marquée. Aucune conclusion ne se

dégage quant à l’identification de zones marquées de BmrA avec cette méthode.

B

A

Figure III.23 : Spectre de masse en MALDI-TOF de BmrA digérée A et de la BmrA digérée et marquée B.


- 159 -

Les méthodes de purification et d’identifications des zones marquées des

protéines en solution n’apportent pas de nouvelles informations quant à la

localisation précise de ces zones marquées certainement du fait d’un rendement

de photomarquage faible avec la méthode d’irradiation utilisée et d’une étape

supplémentaire de purification de l’échantillon ou encore à cause d’une

mauvaise sensibilité des spectromètres de masse pour l’analyse de protéines

hydrophobes.


- 160 -

2.3. Approche ‘’top-down’’ LC-ESI et MALDI-TOF

Le but de l’utilisation de cette méthode avec une analyse en LC-ESI ou en

MALDI-TOF est de déterminer le rendement de photomarquage sur la protéine

c’est-à-dire connaître la quantité de sondes lipidiques qui s’est fixée sur la

protéine. L’excédent de sondes lipidiques ne perturbe pas le résultat de l’analyse

du fait que sa masse moléculaire est de 1102,5 Da, masse inférieure à celle des

protéines étudiées. Les protéines utilisées sont purifiées en fin de production par

chromatographie d’exclusion stérique. Elles nous sont fournies avec une bonne

pureté et aucune purification supplémentaire n’est nécessaire. Les solutions de

protéines et de protéines marquées sont donc analysées directement. Cette

méthode nécessite de 30 à 70 µg de protéine en fonction de la concentration de

l’échantillon.

L’analyse en LC-ESI nous permet de purifier ‘’en direct’’ notre échantillon

avant l’analyse en spectrométrie de masse sans rajouter d’étapes. Moins un

échantillon est manipulé avant l’analyse, plus il est concentré en protéine

marquée.

2.3.1) Analyse de la bR en LC-ESI et MALDI-TOF

Comme on peut le voir sur ce spectre de masse (fig. III.24 A), le signal

correspondant à bR est pratiquement dans le bruit de font de l’analyse : un très

mauvais rapport signal sur bruit est à déplorer. La bR non marquée est

Figure III.24 : Spectre de la bR en LC-ESI A et en MALDI B

A B


- 161 -

difficilement identifiable avec cette méthode même avec une concentration

élevée de protéine en solution. Cette difficulté vient du fait que la bR est une

protéine très hydrophobe et difficilement ionisable (sur le spectre elle est 9 à 16

fois chargée). Le rendement de photomarquage n’étant pas suffisant, le spectre

de masse de la protéine marquée n’est pas exploitable puisqu’on aurait encore

moins de signal correspondant à la protéine marquée. Le spectre de la bR

obtenu en MALDI-TOF (fig. III.24 B) n’a pas non plus une résolution suffisante

(massif trop large) pour être exploité du fait de la présence de sels et de

détergents dans l’échantillon à analyser.

2.3.2) Analyse de NS2 en LC-ESI et MALDI-TOF

De meilleurs résultats sont obtenus avec NS2 en LC-ESI du fait que cette

protéine est moins hydrophobe et plus facilement ionisable que bR (sur le

spectre, fig. III.25 A, elle est 15 à 32 fois chargée).

Malgré une séparation en direct par chromatographie liquide, l’échantillon

de protéines marquées reste trop hétérogène, on a un mélange de protéines

marquées par une ou plusieurs sondes lipidiques et de protéines non marquées.

La variation d’hydrophobicité des ces différentes entités n’est pas suffisante pour

pouvoir les séparer. Les colonnes et les méthodes utilisées en LC-ESI n’ont pas

un pouvoir de séparation assez grand pour discriminer toutes les entités de

l’échantillon. On ne peut donc pas affirmer avec certitude que le spectre de

Figure III.25 : Spectre de NS2 marquée A et non marquée A’ en LC-ESI, spectre de NS2 marquée en MALDI-TOF B.

A

A’

B


- 162 -

masse de l’échantillon marqué (fig. III.25 spectre A) correspond à la protéine

marquée seule. Le décalage des pics de masse entre l’échantillon marqué et

l’échantillon non marqué n’est pas clairement identifiable entre ces deux spectres

(fig. III.25 A et A’). Le spectre B sur la figure III.25 en MALDI-TOF de NS2

marquée montre un seul pic à m/z = 39656 Da correspondant à la protéine non

marquée mono chargée, aucun pic n’est visible et attribuable à la protéine

marquée sur le spectre B de la figure III.25. Ce pic devrait avoir un m/z supérieur

à celui de la protéine seule du fait du marquage de la protéine. Ce pic n’est pas

visible à cause du rendement de photomarquage trop faible, de la mauvaise

désorption de la protéine de la matrice ou encore à cause de la présence de

détergent.

Au vu des résultats obtenus avec ces différentes méthodes de purification

et d’identification par spectrométrie de masse, certaines étapes du protocole de

photomarquage doivent être améliorées. Le rendement de photomarquage est

trop faible du fait d’une irradiation trop courte et doit donc être amélioré pour

augmenter la proportion de protéine marquée par rapport à la non marquée. La

complexité de l’échantillon est encore trop grande malgré les étapes de

purification. Ces deux paramètres sont à améliorer par des moyens

complémentaires pour disposer de résultats interprétables en spectrométrie de

masse. Au vu des résultats, la séparation de la protéine marquée de celle non

marquée ne peut pas être menée avec des outils comme la chromatographie ou

le gel d’électrophorèse. Cette séparation doit se faire par d’autres moyens

comme par exemple l’immobilisation des protéines marquées sur des billes

magnétiques pour les séparer des non marquées restées en solution.

Avec l’optimisation du rendement de photomarquage et du rendement de

purification, et le développement de méthodes et d’appareils en spectrométrie de

masse, l’identification de protéines et de fragments de protéines hydrophobes

modifiés ou non sera plus aisée en spectrométrie de masse dans un futur

proche.


- 163 -

3. Optimisation du procédé de photomarquage

Suite aux conclusions apportées au chapitre précédent, différentes stratégies ont

été mises en place pour s’affranchir des problèmes posés.

3.1. Augmentation du rendement de photomarquage

Pour augmenter le rendement de photomarquage, il faut augmenter le

temps d’irradiation de la solution micellaire protéine/sonde lipidique en évitant la

dégradation de la protéine utilisée due à notamment à la chaleur dégagée par la

lampe au mercure utilisée. La solution micellaire protéine/sonde lipidique a donc

été irradiée par pulses P de 30 s d’irradiation suivies d’un temps de

refroidissement de 90 s.

Plusieurs stratégies de refroidissement ont été testées. La première (a) qui

est la plus simple à mettre en place, est le refroidissement par air en ouvrant

l’enceinte après chaque temps d’irradiation. La deuxième (b) est une

amélioration de la première permettant le refroidissement de la cuve en quartz

avec de la glace : le support qui tient la cuve (un bécher) est rempli de glace,

l’enceinte est ouverte entre chaque irradiation. La troisième (c) stratégie mise en

place consiste en la fabrication d’une enceinte ventilée en permanence

permettant le renouvellement de l’air à l’intérieur de celle-ci et avec un système

de refroidissement de la cuve avec un circuit d’eau glacée (photo fig. III.26). Un

contrôle de la température de l’enceinte et de la cuve en quartz est effectué,

celle-ci n’excède pas 32°C dans l’enceinte et 22°C dans la cuve en quartz.


- 164 -

3.1.1) Résultats

Pour chaque stratégie de refroidissement des tests ont été menés avec la

bactériorhodopsine (bR) comme protéine et la sonde lipidique de référence

(SLR) comme sonde lipidique. La solution micellaire protéine/SLR a été soumise

à un nombre croissant de pulses P (P = 30 s d’irradiation + 90 s de

refroidissement) allant de 1 à 40 avec les différents systèmes de refroidissement.

Un gel d’électrophorèse a été effectué pour visualiser la quantité de protéine

marquée par la SLR (visualisation en fluorescence au fluorimager : image de

droite) et pour visualiser la dégradation de la protéine (coloration au bleu de

Coomassie : image de gauche). La quantité de protéine déposée sur le gel est

identique pour toutes les expériences et pour chaque puits : 10 µg. Pour chaque

test, la bR seule et la bR irradiée avec les conditions initiales CI (CI = 45 s

d’irradiation continues) sont déposées sur le gel pour pouvoir suivre la

Figure III.26 : enceinte d’irradiation, A vue globale, B système de ventilation de l’enceinte, C système de refroidissement de la cuve, D intérieur de l’enceinte

Support réfrigéré

Lampe au mercure

Arrivée d’air

A B

C DCuve en quartz

Enceinte

Générateur


- 165 -

M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5

dégradation de la protéine et la variation de la quantité de protéines marquée par

rapport aux résultats obtenus avec les CI.

M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6

M marqueur standard All blue 1 bR seule sans irradiation 2 bR + SLR, CI 3 bR + SLR, 1 P

4 bR + SLR, 5 P 5 bR + SLR, 10 P 6 bR + SLR, 20 P

Figure III.27 : Photomarquage de bR avec la SLR avec le système de refroidissement (a), coloration au bleu de Coomassie, analyse au fluorimager

M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5

M marqueur standard All blue 1 bR seule sans irradiation 2 bR + SLR, CI


Figure III.28 : Photomarquage de bR avec la SLR avec le système de refroidissement (b), coloration au bleu de Coomassie, analyse au fluorimager

M marqueur standard All blue 1 bR seule sans irradiation 2 bR + SLR, CI


Figure III.29 : Photomarquage de bR avec la SLR avec le système de refroidissement (c), coloration au bleu de Coomassie, analyse au fluorimager


- 166 -

M 1 2 3 M 1 2 3

3.1.2) Discussion

La quantité de protéine photomarquée par cette méthode de pulse est

supérieure (au bout de 5 pulses) à la quantité de protéine photomarquée lorsque

l’échantillon est irradié avec les conditions initiales (comparer puits 2 avec le

puits 3 ou 4 des fig. III.27, 28, 29). Cette quantité augmente aussi lorsque le

nombre de pulses augmente comme on peut le visualiser au fluorimager sur les

gels d’électrophorèses des ces trois figures : l’intensité de fluorescence de la

bande correspondant à la protéine marquée augmente quand le nombre de

pulses augmente. Les expériences sont menées de 1 à 40 pulses c’est-à-dire de

30 s à 20 min d’irradiation cumulée sur l’échantillon.

Le système de refroidissement (a) n’est pas assez efficace pour avoir des

temps d’irradiation effectifs élevés car la protéine commence à se dégrader à

partir de 5 min d’irradiation effective (10 P : fig. III.27 puits 5) pour être totalement

dégradée au bout de 10 min d’irradiation effective (20 P : fig. III.27 puits 6) mais

la quantité de protéine marquée augmente significativement entre 45 s

d’irradiation (conditions initiales : fig. III.27 puits 2) et 2 min 30 s d’irradiation (fig.

III.27 puits 4). Pour améliorer ce système de refroidissement, de la glace a été

ajoutée dans le support de la cuve pour disposer d’une enceinte réfrigérée

(système de refroidissement (b)). Les résultats obtenus (fig. III.28) sont

concluants du fait qu’on n’observe plus qu’une légère dégradation de la protéine

quand elle est irradiée 10 min (fig. III.28, puits 5) et que l’intensité de

M marqueur standard All blue 1 bR seule sans irradiation 2 bR + SLR, 20 P 3 bR +SLR, 40 P

Figure III.30 : Photomarquage de bR avec la SLR avec le système de refroidissement (c), coloration au bleu de Coomassie, analyse au fluorimager


- 167 -

fluorescence de la protéine marquée augmente entre les différents puits ayant un

nombre de pulses croissant. Le troisième système de refroidissement (c) mis en

place nous permet d’avoir un contrôle de la température de l’enceinte et de la

cuve pour minimiser la dégradation de la protéine irradiée à des temps allant

jusqu’à 20 min (fig. III.29 et fig. III.30). Ce dernier système de refroidissement est

donc optimal pour irradier des protéines sur des temps longs sans la dégrader et

donc avoir un meilleur rendement de photomarquage.

Une autre source d’irradiation a été testée avec NS2 : une source

d’irradiation par LED à 365 nm (Lumos 43, Atlas photonics). Cette source ne

dégage pas de chaleur et est monochromatique, elle est donc moins destructrice

pour le matériel biologique testé comme on peut le voir sur la figure III.31. Ce

test est effectué sur la protéine NS2 marquée par la SLR en irradiant la solution

micellaire jusqu’à 2 h en continu (fig. III.31 puits 5), aucune dégradation de la

protéine n’est observée. Cette source d’irradiation nous permet donc d’irradier

sur des durées plus longues en continu (pas de temps de refroidissement

nécessaire) les protéines testées pouvant ainsi augmenter le rendement de

photomarquage.

Les protocoles d’irradiation utilisés pour cette source et pour d’autres

sources testées comme le laser sont en cours de développement (optimisation

M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5

Figure III.31 : Photomarquage de NS2 par la SLR, irradiation avec une source LED, coloration au bleu de Coomassie, analyse au fluorimager

M marqueur standard All blue 1 NS2 + SLR irradiée 5 min 2 NS2 + SLR irradiée 10 min

3 NS2 + SLR irradiée 20 min 4 NS2 + SLR irradiée 60 min 5 NS2 + SLR irradiée 120 min


- 168 -

du temps, de la longueur d’onde et de la puissance d’irradiation). Une fois ces

protocoles optimisés, ils seront utilisés en lieu et place du protocole actuel pour

marquer le matériel biologique par la sonde lipidique de manière plus efficace.

3.2. Double purification de l’adduit de photomarquage

Cette méthode est basée sur une double purification de la solution à

analyser après photomarquage grâce à une nouvelle sonde lipidique biotinylée

19 (pour rappel fig. III.32) avec l’utilisation d’abord du His-Tag porté par la

protéine et ensuite de l’interaction forte existante entre la biotine de la sonde

lipidique et la streptavidine.

Cette méthode nous a permis d’enrichir l’échantillon à analyser en protéines

marquées et de baisser la complexité de celui-ci en diminuant les quantités des

entités n’ayant pas réagi : la sonde lipidique biotinylée en excès et la protéine

non marquée (n’ayant pas réagi avec la sonde lipidique).

La streptavidine est une protéine d’origine bactérienne homologue de

l’avidine, isolée de l’actinobacterium Streptomyces avidinii ayant une structure

tétramérique. L’interaction entre la streptavidine et la biotine est la plus forte

interaction non covalente observée à ce jour dans la nature avec une constante

de dissociation de Kd = 4.10-14 M101. La structure du complexe

biotine/streptavidine a été résolue pour la première fois en 1989 par Hendrickson

101 N. M. Green (1990). Avidin and Streptavidin. Methods Enzymol., 184, 51-67

Figure III.32 : sonde lipidique photoactivable et biotinylée 19


- 169 -

et son équipe102, montrant une structure en tonneau pour chacun des quatre

monomères permettant une interaction forte entre ces poches et la biotine via

des liaisons hydrogène et des interactions de Van der Waals. La streptavidine

est très utilisée en biologie moléculaire à cause de la résistance du complexe

biotine/streptavidine formé aux solvants organiques, aux dénaturants, aux

détergents, à la digestion protéolytique et aux températures et pH extrêmes.

La purification se déroule en deux étapes (fig. III.33). La première étape de

cette purification consiste à enlever l’excédant de sonde lipidique biotinylée

n’ayant pas réagi avec la protéine. Pour ce faire, la protéine est immobilisée sur

des billes magnétiques Ni-NTA-Agarose via son His-Tag (fig. III.33, 1ère

purification). Ces billes magnétiques sont constituées d’agarose fonctionnalisé

102 W. A. Hendrickson, A.Pahler, J. L. Smith, Y. Satow, E. A. Merritt, R. P. Phizackerley (1989). Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 2190-2194

Figure III.33 : Double purification d’une protéine His-Tag marquée par la sonde lipidique biotinylée


- 170 -

M 1 2 3 4 5

NS2 (39 kDa) NS2 (39 kDa)

avec de l’acide nitrilotriacétique complexant du nickel. Les résidus histidine du

tag sont immobilisés sur les billes en complexant le nickel. Une fois l’excédant de

sonde lipidique enlevé par lavage successif, la protéine est décrochée des billes

grâce à de l’imidazole.

La deuxième étape consiste à enlever la protéine n’ayant pas réagi avec la

sonde lipidique biotinylée. Pour ce faire, la protéine marquée est immobilisée sur

des billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine via le résidu

biotine de la sonde accrochée à la protéine (fig. III.33, 2ème purification).

Comme l’interaction biotine/streptavidine est trop forte pour être cassée et pour

ne pas être gêné par le complexe billes magnétiques/biotine/streptavidine lors

des analyses, la séparation de la protéine marquée du complexe billes

magnétiques/biotine/streptavidine est effectuée en milieu réducteur permettant la

coupure du pont disulfure situé entre le groupement photoréactif et la biotine de

la sonde lipidique 19 (fig. III.32).

Malgré l’optimisation de la méthode d’irradiation, la protéine après

irradiation est tout de même dégradée par rapport à la protéine non irradiée (fig.

III.34 puits 1 et 2). Le surnageant prélevé avant le décrochage de la protéine des

billes d’agarose après la première purification ne contient pas de protéine, (fig.

III.34 puits 4) ce qui veut dire que toute la quantité de protéines (marquées et

non marquées) contenue dans l’échantillon est immobilisée par les billes

M marqueur standard All blue 1 NS2 seule sans irradiation 2 NS2 + 19, irradiée

Figure III.34 : Photomarquage et double purification de l’échantillon marqué, essai avec NS2, coloration au bleu de Coomassie

3 surnageant après la 2ème purification 4 surnageant après la 1ère purification 5 surnageant après la dénaturation

37

75

15

25

10

250


- 171 -

d’agarose. Par contre le surnageant prélevé avant la dénaturation lors de la

deuxième purification avec les billes magnétiques streptavidine contient de la

protéine (fig. III.34 puits 3) : c’est de la protéine non marquée ne pouvant pas

interagir avec les billes streptavidine. Finalement après dénaturation de

l’échantillon en milieu réducteur, le surnageant contient bien de la protéine (fig.

III.34 puits 5, bande encadrée en rouge). De plus, des résidus thiols sont

retrouvés sur les billes magnétiques streptavidine après dénaturation prouvant

bien la présence du complexe sonde lipidique/protéine sur celles-ci.

L’identification de ces résidus a été effectuée par un dosage d’Ellman103.

Malheureusement au final, la quantité de protéine marquée purifiée n’est pas

suffisante pour effectuer diverses analyses pour identifier la ou les zone(s)

marquée(s) ou pour quantifier le rendement de photomarquage.

Cette méthode de double purification et donc d’enrichissement de notre

échantillon en protéine marquée est en cours de développement. Elle nous

permet de diminuer la complexité de l’échantillon et donc permettra une analyse

plus simple de celui-ci. L’optimisation de cette méthode s’effectue au niveau du

choix de la protéine, de la quantité de protéine utilisée, de l’irradiation de

l’échantillon et des étapes de purification mises en œuvre, mais elle a déjà

donné des résultats encourageants.

103 G. L. Ellman (1959). Tissue sulfhydryl groups. Biochemistry and Biophysics, 82, 70-77


- 172 -

4. Partie expérimentale biochimique

4.1. Molécules utilisées

Le n-dodécyl--D-maltoside (DDM), le dodécylphosphocholine (FC 12), la L-

-phosphatidylcholine (PC) de jaune d’œuf, le cholestérol (chol, pureté 99%,

recristallisé dans du méthanol) et la bactériorhodopsine (bR) lyophilisée de

Halobacterium salinarum utilisés proviennent de chez Sigma-Aldrich. Le chlorure

d’octadécylrhodamine B (R18) utilisée pour les tests de fluorescence provient de

chez Molecular Probes.

4.2. Formation des liposomes

A partir des lipides solubilisés dans du chloroforme (PC, chol et sonde

lipidique), un mélange est réalisé en fonction de la composition lipidique choisie.

Dans notre étude cette composition est PC/chol/sonde lipidique 65/30/5 (ratio

molaire) et pour avoir une concentration finale en lipide de 5 mM dans un volume

donné (au minimum 300 L). Le solvant est évaporé sur une plaque chauffante à

37 °C ou sous flux d’azote pour former un film lipidique. Celui-ci est ensuite

repris dans un volume donné de tampon PBS (Phosphate Buffer Saline, 58 mM

Na2HPO4, 2H2O, 17 mM NaHPO4, H2O, 68 mM NaCl, pH = 7,4). Le film lipidique

est détaché grâce à un passage au vortex, ce qui conduit à la formation de

liposomes de taille et d’épaisseurs irrégulières. Cette solution subit ensuite au

moins 5 cycles de congélation/décongélation dans l’azote liquide (-196°C) et au

bain marie à 37°C. La calibration des liposomes s’effectue par filtration à un

diamètre de 100 nm grâce à un filtre de polycarbonate (Avestin) à l’aide d’un

extrudeur (Hamilton), pour obtenir des liposomes unilamellaires et de taille

uniforme. Ces échantillons sont conservés à 4°C au maximum une semaine.


- 173 -

4.3. Fluorimètre

Le fluorimètre utilisé pour les mesures de fluorescence est un Tecan infinite

M1000. Cet appareil permet de réaliser des mesures de spectres d’émission et

d’excitation des sondes lipidiques fluorescentes en liposome. Les mesures sont

réalisées dans une plaque Chimney-Greiner 96 puits noires à fond plats. Les

données brutes sont ensuite traitées par informatique (courbe générée par

Excel).

4.4. Mesure de la fluorescence

La mesure s’effectue sur des échantillons de 100 L par puits : 2L de

solution de liposome PC/chol/sonde lipidique + 98 L de tampon PBS. Les

spectres d’émission sont mesurés à une longueur d’onde d’excitation de 560 nm

et à une longueur d’onde d’émission comprise entre 570 et 650 nm, les spectres

d’excitation sont mesurés à une longueur d’onde d’émission de 580 nm et à une

longueur d’onde d’excitation comprise entre 450 et 570 nm. Tous les spectres

sont mesurés à 32 °C. La fluorescence résiduelle de liposomes blancs (PC/chol)

est soustraite de la fluorescence enregistrée avec les sondes lipidiques

fluorescentes.

4.5. Formation des micelles de détergents contenant les lipides outils

A 50 L (45,4 nmol) d’une solution à 1 mg/mL (0,9 mM) de sonde lipidique

dans CHCl3 sont ajoutée 25 L de MeOH (1/2 MeOH/CHCl3 v/v) et 3,98 L (2,27

mol – 1/50 ancre/détergent n/n) d’une solution de FC 12 à 570 mM (rq : le

volume de détergent ne doit pas dépasser 5% du volume total de l’échantillon).

Le solvant est évaporer sur une plaque chauffante à 37 °C et séché au

lyophilisateur pendant 2 h. Ce film lipidique est resolubilisé dans 50 L d’eau

milliQ et 50 L d’une solution tampon. Le tampon est choisi en fonction de


- 174 -

l’expérience à mener et est précisé pour chaque expérience. Cette solution peut

être conservée pendant une semaine à 4°C.

4.6. Irradiation

L’irradiation est réalisée avec une lampe UV au mercure de 400 W (Source

« Flood » Dymax, Equipements Scientifiques SA) à différent temps et sur un

échantillon placé dans une cuve en quartz à une distance de 10 cm. L’irradiation

est effectuée sur une gamme de longueurs d’onde située autour de 365 nm,

maximum d’excitation de la benzophénone. Le volume d’échantillon (au

minimum 10 µL) est défini en fonction des expériences effectuées par la suite.

L’irradiation avec le système à LED Lumos 43 d’Atlas photonics

(http://www.atlas-photonics.com) est aussi effectuée en continu dans une cuve

en quartz sans système de refroidissement à une longueur d’onde

monochromatique de 365 nm.

4.7. Digestion protéolytique des protéines membranaires

photomarquées

La digestion protéolytique a été effectuée avec l’endoprotéinase Glu-C.

Dans le tampon approprié cette enzyme coupe spécifiquement la protéine au

niveau d’un résidu glutamate. Les protéines membranaires photomarquées sont

incubées avec l’enzyme de digestion V8 dans les proportions 1/20

enzyme/protéine p/p à 0°C dans un tampon Tris 20 mM à pH = 8,0 puis la

digestion est effectuée à 37 °C pendant un temps voulu (pour BmrA : 5 min). La

digestion est stoppée soit en ajoutant du tampon Läemmli 2X (1/1

échantillon/Läemmli v/v) pour déposer sur gel soit en ajoutant quelques L d’une

solution de TFA à 1 % dans l’eau pour arriver à pH = 2 pour faire une purification

en HPLC et/ou une mesure de masse ou soit par 2% (v/v) de SDS.


- 175 -

4.8. Analyse des gels

Tous les gels de polyacrylamide (SDS-PAGE) sont fabriqués avec 15 %

d’acrylamide et 20 % de glycérol. La migration a été effectuée dans une solution

de SDS 1X, à 80 V durant la migration dans le stacking puis à 125 V durant la

migration dans le gel de migration.

Après migration de l’échantillon sur gel de polyacrylamide, le résultat obtenu

a été tout d’abord scanné à l’aide d’un fluorimager Typhoon 8600 (disponible au

CERVI de Lyon) pour détecter la fluorescence de la rhodamine grâce à un laser

à 580 nm. Le gel est directement déposé dans la scanner après avoir découpé,

au scalpel, la bande de gel comportant l’excédant de sonde lipidique. Ensuite le

gel est coloré en bleu de Coomassie (Bleu de Coomassie R250, méthanol 1%,

isopropanol 25 %, acide acétique 10 %).

4.9. Analyse HPLC

Les analyses HPLC sont réalisées sur un appareil Waters équipé d’une

colonne C8 Polymeric Reversed-Phase VYDAC 208TP (250 x 10 mm, 10 µm,

300 Å). Les analyses ont été effectuées avec un gradient linéaire durant 45 min

de 0 % à 70 % de B puis 30 min pour passer de 70 % à 100 % de B suivies d’un

plateau durant 10 min à 100 % de B avec un débit de 1 mL.min-1. Les temps de

rétention sont donnés en minute. La détection s’effectue à deux longueurs

d’onde 220 et 550 nm. Solvant A : H2O/ACN 80/20 v/v, 0,1 % TFA, solvent B :

H2O/ACN 20/80 v/v, 0,1 % TFA.

4.10. Purification de la protéine membranaire photomarquée dans un

tampon

L’échantillon est purifié par SEC/FPLC (AKTÄpurifier, GE Healthcare)

équipé d’une colonne Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). Après

conditionnement (un volume de colonne : 23 mL (VC)) et équilibrage (1VC) de la


- 176 -

colonne avec un tampon [20 mM tris-HCl (pH 8), 0.5 % FC 12 (p/v), 0.2 ou 0.05

M NaCl], l’échantillon (50 µL) est injecté à un debit de 0,5 mL/min. Les fractions

(150 µL) sont collectées et celles d’intérêt sont choisies en fonction du profil

FPLC, concentrées et dessalées jusqu’à 50 µL par centrifugation (3 passages à

9500 g pendant 25 min) avec une unité de filtration (Amicon Ultra – 0.5 mL 3K

Millipore) pour les analyses futures. La détection en sortie de colonne est

effectuée à trois longueurs d’onde différentes : 220 nm (liaison amide), 280 nm

(fonction aromatiques) et 550 nm (rhodamine).

4.11. Spectrométrie de masse

4.11.1) Spectrométrie de masse MALDI-TOF

Les mesures de masse enregistrées ont été effectuées sur un spectromètre

UltraflexTM Maldi-TOF/TOF (Bruker Daltonics GmbH, Bremen, Germany). Cet

appareil a été utilisé à un potentiel d’accélération maximum de 25 kV en mode

positif avec un laser à azote (337 nm) pulsé. La préparation de l’échantillon est

effectuée selon la méthode de la gouttelette séchée. Cette gouttelette est

composée de 0,5 µL d’échantillon à analyser et 0,5 µL de matrice (acide -

cyano-4-hydroxycinnamique), déposée sur la cible puis séchée à température

ambiante.

4.11.2) Spectrométrie de masse LC-MS/MS

Avant analyse en LC-MS/MS, le peptide à analyser est extrait du gel. Tout

d'abord la bande du gel d'intérêt est excisée puis cette bande de gel est décoloré

à 37 °C pendant 15 min dans un tampon bicarbonate d'ammonium (tampon

ABC) 50 mM/CH3CN (50/50 v/v). La mixture résultante subit une réduction au

DTT dans un tampon ABC 10 mM à 50 °C pendant 15 min. La solution est

ensuite alkylée avec de l'iodoacétamide 100 mM pendant 15 min à température

ambiante. Pour finir l'extraction du peptide du gel, la solution est digérée à la

trypsine pendant 45 min à 50°C avant d'être analysée en LC-MS/MS.


- 177 -

La séparation en LC est effectuée sur un Ultimate 3000 (Dionex) équipé

d’une colonne Acclaim PepMap C18 (150 mm, 75 µm, 3µm, 100 Å). Les analyses

sont effectuées avec un gradient linéaire de 60 min de 100 % de A (95 % H2O, 5

% ACN, 0,1 % d’acide formique) à 100 % de B (20 % H2O, 80 % ACN, 0,1 %

d’acide formique). Les mesures de masse enregistrées ont été effectuées sur un

spectromètre LTQ Velos (Thermo Scientific) en mode de fragmentation CID.

4.11.3) Spectrométrie de masse LC-MS

La séparation en LC est effectuée sur un Alliance 2695 (Waters, Milford,

MA) équipé d'une colonne XBridge BEH300 C4 (250 mm x 2,1 mm, 3,5 µm). Les

analyses sont effectuées avec un gradient linéaire de 25 min de 20 à 60 % de B

(100 % ACN, 0,1 % TFA) à 50 °C suivi par un plateau de 5 min à 85 % de B à un

débit de 250 µL/min. Le solvant A est 100 % H2O et 0,1 % TFA. Les mesures de

masse enregistrées ont été effectuées sur un spectromètre LCT-TOF (Waters,

Milford, MA) en mode positive.

4.12. Double purification

100 µg de NS2 sont incubés avec la sonde lipidique biotinylée (rapport 1/8

NS2/biotine) à 4°C durant une nuit puis cette solution est irradiée 20 min

effectives avec la lampe à mercure utilisant la méthode d’irradiation (c) (chap.

III., p. 156).

Pour la première purification 100 µL de billes magnétiques d’agarose sont

lavées avec 3 mL d’eau, puis elles sont équilibrées avec un tampon

d’équilibration (Tris-HCl 10 mM pH = 8,0, imidazole 10 mM, NaCl 300 mM, DPC

0,5 %). La solution de protéines marquées est déposée sur les billes est incubée

à température ambiante pendant 10 min. Le surnageant est enlevé en

immobilisant les billes magnétiques avec un aimant, puis les billes sont lavées

avec un tampon (3 fois 500 µL, Tris-HCl 10 mM pH = 8,0, imidazole 30 mM,

NaCl 300 mM, DPC 0,5 %). La protéine immobilisée sur les billes est décrochée

avec un tampon d’élution (3 fois 100 µL, Tris-HCl 10 mM pH = 8,0, imidazole 500


- 178 -

mM, DPC 0,5 %). Le surnageant est ensuite mis de côté à 4°C le temps de

conditionner les billes magnétiques streptavidine.

80 µL d’une solution à 5 mg/mL de billes magnétique streptavidine pouvant

immobiliser 1947 pmol de biotine par mg sont prélevés et déposés dans un

Eppendorf. Le surnageant de cette solution est enlevé puis les billes sont lavées

avec un tampon AcNH4 20 mM pH = 8,0 (2 fois 100 µL). Le surnageant de la

première purification est déposé et incubé sur ces billes magnétiques

streptavidine pendant 30 min à température ambiante pour immobiliser la

protéine marquée avec la biotine. Le surnageant est ensuite enlevé et les billes

restantes sont lavées trois fois avec 200 µL d’un tampon AcNH4 20 mM pH = 8,0

pour enlever la protéine non marquée. Au final la protéine marquée est

décrochée des billes magnétiques en milieu réducteur avec du Laemmli 5X

pendant une nuit à 4°C. Le surnagenant est déposé sur gel d’électrophorèse.

Un dosage d’Ellman avec de l’acide 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoique (DTNB)

est effectué sur les billes magnétiques stéptavidine en fin de purification pour

observer la présence de résidus thiols sur les billes en mesurant une absorbance

à 412 nm.

IV. Projets annexes

- 179 -

IV Projets annexes

IV. Projets annexes

- 181 -

1. ‘’Click Chemistry’’ sans cuivre sur liposome : un couplage pH-

indépendant

La fonctionnalisation en surface des liposomes par des peptides, des

protéines ou par des sucres est, de nos jours, largement étudiée104,105. Par

exemple pour fonctionnaliser un liposome par un peptide, l’insertion stable de

celui-ci dans la bicouche phospholipidique requiert l’extension du peptide par une

queue lipidique composée d’une à deux chaînes grasses106. Malheureusement

l’entité amphiphile formée est difficilement manipulable du fait de ses difficultés à

être solubilisé. Pour contourner ces difficultés, des stratégies alternatives ont été

développées où le composé que l’on veut associer au liposome est lié via une

liaison covalente à une ancre lipidique fonctionnalisée qui est déjà insérée dans

la membrane du liposome107. Pour cette stratégie et depuis le milieu des années

2000, la liaison chimique entre l’ancre et le peptide (par exemple) est choisie

parmi les liaisons amide, thioether, imine, le pond disulfure ou encore la liaison

hydrazone. Malheureusement la formation de ces liaisons chimiques présente

certains désavantages et ont souvent besoin de conditions opératoires

spécifiques : pH spécifique, besoin d’un agent activateur ou d’un catalyseur,

production de produits secondaires et certaines ne sont pas spécifiques.

Pour pallier ces désavantages, une nouvelle réaction de chimie de

bioconjugaison à la surface des liposomes a été développée. Cette réaction

chimique est bioorthogonale c’est-à-dire inerte vis-à-vis du milieu biologique, non

toxique, ne nécessite pas de catalyseur et ne génère pas de produits dérivés.

Elle est basée sur la réaction de ‘’Click Chemistry’’ bien connue et développée

104 H. Hojo, T. Kojima, K. Yamauchi, M. Kinoshita (1996). Synthesis and liposome-formation of a thermostable lipid bearing cell adhesion peptide sequence. Tetrahedron Lett. 37, 7391-7394 105 P. Schelré, C. Boeckler, B. Frisch, F. Schuber (2000). Differential reactivity of maleimide and bromoacetyl functions with thiols: Application to the preparation of liposomal diepitope constructs. Bioconj. Chem., 11, 118-123 106 S. Shahinian, J. R. Silvius (1995). Doubly-Lipid-Modified Protein Sequence Motifs Exhibit Long-Lived Anchorage to Lipid Bilayer Membranes. Biochemistry, 34, 3813-3822 107 M. Fleiner, P. Benzinger, T. Fichert, U. Massing (2001). Studies on protein-liposome coupling using novel thiol-reactive coupling lipids: influence of spacer length and polarity. Bioconj. Chem., 12, 470-475

IV. Projets annexes

- 182 -

par Sharpless et son équipe108 depuis les années 2000 comme étant une

cycloaddition de Huisgen catalysée par le cuivre. De récents développements

apportés par Bertozzi et al.109 nous permettent maintenant de réaliser cette

réaction de ‘’Click Chemistry’’ sans cuivre entre un alcyne cyclique et un azoture.

Cette étude va montrer la faisabilité de cette réaction de couplage en milieu

aqueux et à différents pH comme nouveau mode de bioconjugaison à la surface

des liposomes.

Tout d’abord deux composés ont été conçus et synthétisés pour pouvoir

réagir sélectivement et exclusivement l’un avec l’autre : une ancre lipidique, du

dioléylglycéro-éthoxy-éthoxy-éthanamide cyclooct-1-yn-3-glycole (Ancre

DOGPEG4Cyclooctyne) et un azoture soluble dans l’eau et fluorescent, du 2-(2-

(2-azidoéthoxy)éthoxy)éthanamidecarboxytétraméthylrhodamine (sonde

N3PEG3CTMR). L’ancre lipidique est composée de deux chaînes grasses et

d’une fonction alcyne cyclique. Cette fonctionnalité connue pour être

chimiquement inerte in vivo106 lui permet de réagir spécifiquement avec n’importe

quel azoture présent dans son environnement. Le caractère amphiphile de cette

molécule lui permet de s’insérer de manière stable et irréversible dans la

bicouche lipidique des liposomes. Ensuite ce composé est quantitativement

incorporé aux liposomes durant leurs formations grâce à ces deux chaînes

grasses. Enfin, dans notre étude cette ancre lipidique a réagi avec une sonde

fluorescente via une réaction de ‘’Click’’ en formant un triazole entre l’azoture

porté par la sonde fluorescente et l’alcyne cyclique de l’ancre (fig. IV.1). La

fluorescence de la sonde couplée nous a permis de suivre et de quantifier la

réaction de couplage à la surface des liposomes.

108 H. C. Kolb, M. G. Finn, K. B. Sharpless (2001). Click Chemistry: Diverse Chemical Function a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed., 40, 2004-2021 109 N. J. Agard, J. A. Prescher, C. R. Bertozzi (2004). A Strain-Promoted [3+2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc., 126, 15046-15047

IV. Projets annexes

- 183 -

1.1. Synthèse de l’ancre DOGPEG4Cyclooctyne

La synthèse de l’ancre alcyne DOGPEG4Cyclooctyne commence par la

production d’un dérivé lipidique de type dyoléylglycérol DOGPEG4NH2. Cette

molécule est synthétisée en 6 étapes à partir du glycérol, du tétraéthylène glycol

Figure IV.2 : synthèse de l’ancre DOGPEG4Cyclooctyne

Ancre lipidique DOGPEG4Cyclooctyne incorporée dans un liposome

SUV

SUV

Tampon

Sonde fluorescente N3PEG3CTMR

Produit de couplage entre l’ancre et la sonde

Figure IV.1 : réaction de couplage entre une sonde fluorescente et une ancre lipidique incorporée dans un liposome via une réaction de ‘’Click chemistry’’

IV. Projets annexes

- 184 -

et de l’alcool oléique110. L’amine libre de ce dérivé réagit ensuite avec l’acide

cyclooc-1-yn glycolique111 préalablement activé par du PyBOP en présence de

DIEA solubilisé dans CH2Cl2 pour donner l’ancre alcyne DOGPEG4Cyclooctyne

avec un rendement isolé satisfaisant de 55% (fig. IV.2).

1.2. Synthèse de la sonde N3PEG3CTMR

La sonde N3PEG3CTMR est synthétisé en une étape à partir du 2-(2-(2-

azidoéthoxy)éthoxy)éthanamine (N3PEG3NH2) et de la 5,6-CTMR via un

couplage peptidique. Le N3PEG3NH2 est synthétisé en 3 étapes à partir du

triéthylène glycol112. La fonction acide de la 5,6-CTMR est d’abord activée avec

du PyBOP en milieu basique (DIEA) dans du CH2Cl2 puis cette acide activé

réagit avec l’amine libre du N3PEG3NH2 pour former le composé N3PEG3CTMR

avec un bon rendement de 56% (fig. IV.3).

110 S. Espuelas, P. Haller, F. Schuber, B. Frisch (2003). Synthesis of an amphiphilic tetraantennary mannosyl conjugate and incorporation into liposome carriers. Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 2557-2560 111 A. Bernardin, A. Cazet, L. Guyon, P. Delannoy, F. Vinet, D. Bonnaffé, I. Texier (2010). Copper-Free Click Chemistry for Highly Luminescent Quantum Dot Conjugates : Application to in Vivo Metabolic Imaging. Bioconjugate Chem., 21, 583-588 112 G. Budin, M. Moune Dimala, V. Lamour, P. Oudet, C. Mioskowski, S. Meunier, L. Brino, A. Wagner (2010). A Chemical Labeling Strategy for Proteomics under Nondenaturing Condition. ChemBioChem, 11, 79-82

Figure IV.3 : synthèse de la sonde N3PEG3CTMR

IV. Projets annexes

- 185 -

1.3. Couplage de la sonde fluorescente à la surface des liposomes

Après incorporation de l’ancre lipidique dans des liposomes, le couplage par

‘’click chemistry’’ sans cuivre de la sonde fluorescente à la surface des

liposomes contenant l’ancre lipidique a été réalisé à trois pH différents en

fonction des tampons utilisés (tampon Hepes (10 mM, 100 mM NaCl, pH = 7,4),

tampon acétate d’ammonium AcNH4 (10 mM, 100 mM, pH = 4,0), tampon Borax

(10 mM, 100 mM, pH = 9,0)) et à des temps de réaction allant de 1 h à 24 h.

Pour stopper la réaction de couplage entre la sonde fluorescente portant la

fonction azoture et l’ancre lipidique portant la fonction alcyne à un temps donné,

l’excédant de sonde fluorescent qui n’a pas réagi est enlevée de la solution de

liposomes par chromatographie d’exclusion stérique.

Pour calculer le rendement de couplage de la réaction une mesure

d’absorbance est enregistrée pour déterminer la quantité de sonde fluorescente

immobilisée à la surface des liposomes.

Le contrôle négatif est déterminé dans les mêmes conditions avec des

liposomes ne contenant pas d’ancre lipidique. Ces liposomes blancs, après

séparation de la sonde fluorescente, ne donnent qu’un faible signal d’absorbance

résiduel compris entre 0,02 et 0,06.

1.3.1) Quantification de la quantité de sonde fluorescente ayant réagi avec

l’ancre

La loi de Beer-Lambert a été utilisée pour quantifier la quantité de sonde

fluorescente couplée à la surface du liposome. Cette loi est une relation linéaire

entre l’absorbance A et la concentration C corrigée par un coefficient d’extinction

molaire si le trajet optique est de 1 cm de long.

D’abord, la longueur d’onde max où l’absorbance de la sonde fluorescente

est maximale a été déterminée : max = 551 nm. Toutes les mesures

d’absorbance ont été enregistrées dans la suite de l’étude à cette longueur

d’onde. Ensuite le coefficient d’extinction molaire a été déterminé pour chaque

tampon utilisé (aux différents pH) : l’absorbance de solution de sonde

IV. Projets annexes

- 186 -

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.00E+00

5.00E-06

1.00E-05

1.50E-05

2.00E-05

2.50E-05

3.00E-05

3.50E-05

Concentration (M)

Ab

so

rba

nc

e

fluorescente à des concentrations connues pour chaque tampon a été mesurée,

le coefficient directeur de la droite formée nous donne le coefficient d’extinction

molaire (fig. IV.4). Pas de différence significative entre les trois correspondant

aux trois différents tampons utilisés n’a été trouvée. La sonde fluorescente

synthétisée n’est pas sensible aux changements de pH.

Finalement la concentration de sonde greffée aux liposomes en solution est

déterminée en utilisant la loi de Beer-Lambert avec le approprié en mesurant

l’absorbance de chaque échantillon à = 551 nm. Cette concentration calculée

est comparée à la concentration mesurée d’ancre lipidique incorporée dans les

liposomes pour déterminer le rendement de couplage de la réaction. La

concentration réelle mesurée d’ancre lipidique présente dans la solution de

liposomes est déterminée par un dosage PC. La quantité réelle d’ancre lipidique

est déduite de la quantité totale de PC dans un échantillon mesurée par un

dosage PC en fonction des proportions des différents lipides composant les

liposomes.

Tampon (L.mol-1.cm-1)

NH4Ac 20323 Hepes 20342 Borax 20274

Figure IV.4 : détermination du coefficient d’extinction molaire de la sonde fluorescente, mesure de l’absorbance en fonction de la concentration avec les différents tampons : en vert tampon Hepes, en rouge tampon Borax, en bleu tampon AcNH4. Les coefficients de droite correspondant à sont résumés dans le tableau en fonction des tampons.

IV. Projets annexes

- 187 -

1.3.2) Influence de la concentration de l’ancre lipidique dans les liposomes

après 24 h de couplage

Les liposomes SUV composés de phospholipides et de cholestérol

(PC/PG/Chol 70/30/50 ratio molaire) et contenant de 2,5 à 15 mol % d’ancre

lipidique sont préparés dans un tampon Hepes, leur diamètre moyen varie de 45

à 70 nm. La réaction de couplage est stoppée après 24 h de réaction. Une

mesure d’absorbance est enregistrée pour déterminer le rendement de couplage

de la réaction c’est-à-dire la quantité de sonde fluorescente immobilisée à la

surface des liposomes (tab. IV.1). Le rendement de cette réaction de couplage à

24 h est d’environ 100 % pour toutes les concentrations d’ancres lipidiques

incorporées dans les liposomes (allant de 2,5 à 15 mol %).

Liposome (% d’ancre)

Absorbance Ancre lipidique

(nmol) Sonde (nmol)

Rdt. (%)

2.50% 0.385 47.5 48.7 >100 5.00% 0.815 97.6 111.4 >100 7.50% 1.140 148.1 157.7 >100

10.00% 1.503 223 204 91

15.00% 2.201 309 296 96

Ces résultats prouvent qu’au bout de 24 h la totalité des fonctions alcynes

des ancres lipidiques incorporées dans les liposomes PC/PG/Chol sont

disponibles et réagissent avec la sonde fluorescente quelle que soit la quantité

allant de 2,5 à 15 % d’ancre lipidique incorporée dans ces liposomes. Soit l’ancre

est orientée à l’extérieur du liposome lors de sa formation, soit un phénomène

dynamique au niveau de la membrane du liposome permet le transfert de l’ancre

lipidique de la membrane intérieur du liposome à la membrane extérieur.

Tableau IV.1 : rendement de couplage de la réaction entre l’ancre lipidique et la sonde fluorescente

IV. Projets annexes

- 188 -

1.3.3) Influence du pH sur la vitesse de réaction de couplage

La réaction de couplage entre l’ancre lipidique et la sonde fluorescente est

effectuée à 25 °C protégée de la lumière et sous argon. La réaction est stoppée

à différents temps (1, 2, 4, 8 et 24 h) en séparant l’excédant de sonde

fluorescente des liposomes par chromatographie d’exclusion stérique.

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25

Temps (h)

Rd

t. d

e c

ou

pla

ge

(%

)

Les liposomes formés à ces différents pH ont une taille homogène comprise

entre 35 et 50 nm de diamètre.

Le rendement maximal et la vitesse de la réaction de couplage varient en

fonction du tampon et donc du pH utilisé (fig. IV.5). Le rendement de couplage

est déterminé entre la quantité totale mesurée d’ancre lipidique incorporée dans

le liposome et la quantité de sonde greffée à ce liposome déterminée par une

mesure d’absorbance. Environ huit heures de réaction sont nécessaires pour

atteindre un maximum de conversion à pH = 7,4 et à pH = 4,0. Le rendement

maximum atteint est de 100 % à pH = 7,4 mais seulement de 40 % à pH = 4,0.

En tampon Borax à pH = 9,0, la réaction de couplage est plus lente, le maximum

Figure IV.5 : Courbe de la réaction de couplage entre l’ancre lipidique et la sonde fluorescente à différents pH sur 24 h. En vert tampon Hepes à pH = 7,4, en rouge tampon Borax à pH = 9,0 et en bleu tampon AcNH4 à pH= 4,0.

IV. Projets annexes

- 189 -

de conversion n’est pas atteint au bout de 24 h de réaction mais le rendement de

couplage est de 94 % tout de même.

Nous avons donc développé une méthode pH-indépendante pour post-

fonctionnaliser les liposomes via une réaction de ‘’Click Chemistry’’ sans cuivre.

Le pH et le tampon optimal de cette réaction de couplage en termes de

rendement et de vitesse de réaction est le tampon Hepes pH = 7,4, mais la

réaction de couplage est aussi possible à différents pH comme pH = 9,0 et pH =

4,0. La baisse de rendement observé de la réaction de couplage n’est pas

forcement due uniquement à la réaction de ‘’Click’’ en elle-même mais peut aussi

provenir de la structure et de la dynamique des liposomes formés à ces

différents pH.

Ce nouveau mode de fonctionnalisation des liposomes apporte plusieurs

avantages à la communauté scientifique : il est spécifique (les fonctionnalités

alcyne et azoture sont inexistantes dans le monde du vivant), non toxique (pas

besoin de catalyseur, pas de résidu de réaction et le produit de couplage est

aussi non toxique) et robuste (non sensible aux variations de pH et stabilité

chimique des réactifs ainsi que du produit de couplage). Cette nouvelle méthode

de bioconjugaison n’as donc pas besoin d’un environnement spécifique pour être

réalisée. Ces travaux font l’objet d’un manuscrit en cours de rédaction113.

113 B. Hilbold, L. Bourel-Bonnet, B. Frisch. Copper-free click Chemistry on Liposomes: a pH-independent Way of Coupling. Manuscript in progress.

IV. Projets annexes

- 190 -

1.4. Partie expérimentale

Les indications générales sur les solvants et réactifs ainsi que sur le

matériel et méthode utilisés sont les mêmes que précédemment (chap. II.4 pour

la chimie et chap. III.4 pour la biologie) sauf précisions apportées ci-dessous.

Synthèse du dioléylglycéro-éthoxy-éthoxy-éthanamide cyclooct-1-yn-3-

glycole (Ancre DOGPEG4Cyclooctyne)

A une solution d’acide cyclooct-1-yn-3-glycolique (20 mg – 0,109 mmol) dans 2

mL de CH2Cl2 anhydre est ajoutée de la DIEA (68 mg – 0,540 mmol) et du

PyBOP (68 mg – 0,130 mmol). La solution résultante est agitée pendant 10 min

à température ambiante pour l’activation de l’acide. Puis du DOGPEG4NH2 (100

mg – 0,130 mmol) solubilisé dans 2 mL de CH2Cl2 anhydre y est ajouté. La

solution est agitée à température ambiante pendant 12h. Le solvant est évaporé

sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient

d’élution CH2Cl2/MeOH 100/0 à 100/5 v/v) pour conduire au produit

DOGPEG4Cyclooctyne obtenu sous la forme d’une huile jaune (55 mg – Rdt :

55 %).

CCM : Rf = 0,8 (CH2Cl2/MeOH 9,5/0,5).

RMN 1H (400 MHz ; CDCl3) = 5,34 (m, 4H), 4,23 (m, 1H), 4,05 (d, 1H, J = 15,3

Hz), 3,86 (d, 1H, J = 15,3 Hz), 3,65-3,40 (m, 23H), 2,72-1,25 (10H + 56 H), 0,87

(t, 6H, J = 7,0 Hz).

C57H105NO8 ; PM : 932,4 g.mol-1

IV. Projets annexes

- 191 -

RMN 13C (50 MHz ; CDCl3) = 170,3, 130,9, 130,5, 102,2, 91,9, 78,5, 73,7, 72,3,

72,0, 71,5, 71,2, 70,9, 69,0, 42,8, 39,2, 34,9, 33,3, 32,6, 30,7, 30,4, 30,3, 30,2,

29,9, 27,9, 26,9, 26,8, 23,3, 21,3, 14,8.

Masse : m/z = 954,7738 [M+Na]+, masse calculée = 931,7840 g.mol-1.

Synthèse du 2-(2-(2-azidoéthoxy)éthoxy)éthanamide carboxytétraméthyl

rhodamine (N3PEG3CTMR)

A une solution de 5,6-CTMR (30 mg – 0,070 mmol) dans 3 mL de CH2Cl2

anhydre est ajoutée de la DIEA (44 mg – 0,348 mmol) et du PyBOP (44 mg –

0,084 mmol). La solution résultante est agitée pendant 10 min à température

ambiante pour l’activation de l’acide. Puis du N3PEG3NH2 (13 mg – 0,077 mmol)

solubilisé dans 3 mL de CH2Cl2 anhydre y est ajouté. La solution est agitée à

température ambiante pendant 12h protégée de la lumière. Le solvant est

évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice

(gradient d’élution CH2Cl2/MeOH 100/0 à 100/20 v/v) pour conduire au produit

N3PEG3CTMR obtenu sous la forme d’un solide violet (23 mg – Rdt : 56 %).

CCM : Rf = 0,3 (CH2Cl2/MeOH 9/1).


Préparation des liposomes

Les liposomes sont préparés en mélangeant les phospholipides (PC, PG) et le

cholestérol (70/30/50 ratio molaire) solubilisé dans du chloroforme avec la

C31H34N6O6 ; PM : 586,6 g.mol-1

IV. Projets annexes

- 192 -

quantité appropriée d’ancre DOGPEG4Cyclooctyne (de 0 à 15 mol %). Après

avoir évaporé le solvant sous pression réduite pendant 45 min, le film lipidique

résultant est hydraté par 1 mL de tampon. Le film lipidique est décollé grâce à un

passage au vortex (minimum 5 min). Cette solution formée est soniquée à 25 °C

pendant 45 min sous argon avec une sonde à ultra-sons de 3 mm (Vibra Cell,

Sonics and Material Inc., Danbury, CT, USA) à 300 W. La suspension de SUV

(Small Unilamellar Vesicles) est centrifugée pendant 10 min pour enlever les

particules de titane originaires de la sonde. Les liposomes blancs sont

uniquement composés de PC/PG/Chol (70/30/50 ratio molaire) en absence

d’ancre DOGPEG4Cyclooctyne.

Mesure des tailles des SUV

La distribution des tailles des particules est mesurée par la méthode de diffusion

dynamique de la lumière, utilisant un Nano ZS (Malvern Instrumentation, Inc.

Orsay, France) avec un angle de détection de 173°. La mesure est effectuée à

25 °C et en intensité. Chaque échantillon pour la mesure est dilué dans le

tampon approprié : 20 µL d’une solution de liposomes à 10 mM dans 980 µL de

tampon.

Dosage PC

La quantité exacte de PC dans les liposomes est vérifiée par un dosage

enzymatique en utilisant un kit de dosage commercial (AssayTM Phospholipid,

Wako Chemicals GmbH, Neuss, Germany). 5 ou 10 µL de solution de liposomes

sont distribués en triplicat dans une microplaque de 96 puits avant d’ajouter 250

µL de la solution de phospholipide B préparée comme décrit par le fabriquant. La

plaque est incubée à 37 °C pendant 10 min. Une couleur bleue apparait en

présence de choline, à cause de la formation du complexe de phénol-4-

aminoantipyridine. Une solution de chlorure de choline est utilisée pour effectuer

la courbe d’étalonnage. L’absorbance de chaque puits est mesurée à = 595 nm

IV. Projets annexes

- 193 -

par un lecteur de microplaques (Bio-Rad, model 550, Marnes-La-Coquette,

France).

Mesure d’absorbance

Les mesures d’absorbance sont effectuées sur un spectromètre de type

UVIKONXL (BIO-TEK instruments) à = 551 nm dans une cuve en quartz.

L’absorbance résiduelle des liposomes blancs est soustraite des absorbances

enregistrées des solutions de liposomes contenant l’ancre

DOGPEG4Cyclooctyne et la sonde fluorescente.

Couplage de la sonde Azoture-CTMR aux liposomes par ‘’Click Chemistry’’

sans cuivre

A une suspension de liposomes fonctionnalisés par l’ancre

DOGPEG4Cyclooctyne dans le tampon approprié est ajoutée la sonde Azoture-

CTMR solubilisée dans l’eau. (1/2 ancre alcyne/sonde Azoture-CTMR ratio

molaire). La solution résultante est agitée sous argon à 25 °C et protégée de la

lumière. Après l’étape de couplage, la sonde Azoture-CTMR n’ayant pas réagi

est enlevée par chromatographie d’exclusion stérique sur une colonne Sephadex

G-100 de 1 x 20 cm. La colonne est équilibrée (2 x 25 mL) par le même tampon

utilisé lors de l’étape de couplage.

IV. Projets annexes

- 194 -

2. Synthèse de dérivés fluorescents de type diacylglycérole

2.1. Introduction

La conception et la synthèse de deux dérivés fluorescents de type

diacylglycérol (DAG) (fig. IV.6 A et B) ont été réalisées pour le développement

d’une nouvelle approche in vitro consistant à l’étude des mécanismes de fission

membranaire des vésicules couvertes par le manteau COPI.

O

OO

OO

O

HN

O

O

N N

OO

Ces vésicules sont responsables du transport rétrograde de l’appareil de

Golgi vers le réticulum endoplasmique (RE) et du transport intra-Golgi. Ces

vésicules sont formées à partir de la membrane de l’appareil de Golgi et

contiennent des lipides et des protéines.

La fission de ces vésicules à partir des membranes de l’appareil de Golgi

est encore mal comprise mais il semble que les lipides et notamment les DAGs

jouent un rôle important lors de cette fission. Le manteau COPI, permettant le

bourgeonnement de ces vésicules, se lie à la membrane de l’appareil de Golgi

par activation d’une petite protéine G Arf1 (fig. IV.7 1 et 2). Puis une autre

protéine ArfGAP1 inactive Arf1 lors du bourgeonnement dans la zone de

Figure IV.6 : A oléate de 2-((6-rhodamineamidohexanoyl)oxy)-3-hydroxypropyl, B dioléylglycéro-éthoxy-éthoxy-éthanamide carboxytétraméthylrhodamine

A

B

IV. Projets annexes

- 195 -

courbure positive en s’insérant dans la membrane via son domaine ALPS

(Amphipatic Lipid Packing Sensing). Celui-ci se replie en hélice amphipatique en

présence d'une densité élevée en défauts de 'packing' des lipides, induite par

exemple par une forte courbure membranaire114 (fig. IV.7 3) pour s’insérer dans

la membrane. Après fission membranaire, ArfGAP1 provoque la

dépolymérisation du manteau (fig. IV.7 4). Il a été également montré que les

DAGs (lipides de courbure spontanée fortement négative) augmentent l’activité

d’ArfGAP1 et participent à la fission des vésicules COPI in vivo115.

L’équipe de Dr. J. B. Manneville du CNRS-Institut Curie (UMR 144) à Paris

a commencé à étudier la liaison des protéines du manteau COPI (notamment

ArfGAP1) à la membrane de vésicules géantes contenant des DAGs et sur des 114 J. Bigay, J. F. Casella, G. Drin, B. Mesmin, B. Antonny (2005). ArfGAP1 respond to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal, 24, 2244-2253 115 I. Fernández-Ulibarri, M. Vilella, F. Lázaro-Diéguez, E. Sarri, S. E. Martinez, N. Jiménez, E. Claro, I. Mérida, K. N. J. Burger, G. Egea.(2007). Diacylglycerol Is Required for the Formation of COPI Vesicles in the Golgi-to-ER Transport Pathway. Molecular Biology of the Cell, 18, 3250-3263

Figure IV.7 : bourgeonnement d’une vésicule couverte du manteau COPI et désassemblage du manteau d’après Bigay et al114.

IV. Projets annexes

- 196 -

nanotubes lipidiques tirés à partir de ces vésicules à l’aide de moteurs

moléculaires kinésine116. La présence de 1,2-dioléyleglycérol (DOG) augmente

fortement la liaison d’ArfGAP1. C’est la forme conique des DOGs, le volume de

la tête hydrophile étant largement inférieur à celui du volume des chaînes

aliphatiques hydrophobes situées dans la partie interne de la membrane, créant

des défauts de ‘’packing’’ c’est-à-dire un espacement entre les têtes hydrophiles

et favorisant l’insertion des domaines ALPS d’ArfGAP1 dans les membranes (fig.

IV.7, vignette).

2.2. Résultats et discussion

La synthèse de dioléylglycéro-éthoxy-éthoxy-éthanamide carboxytétra

méthylrhodamine (DOGPEG4Rho) a été effectuée en une étape à partir de la

5,6-CTMR et du DOGPEG4NH2 synthétisé au laboratoire via un couplage

peptidique (fig. IV.8).

Dans un premier temps l’acide 5,6-CTMR est activé par du PyBOP en

présence de DIEA puis celui-ci réagit sur l’amine du DOGPEG4NH2 via une

addition nucléophile. Le DAG est obtenu sous la forme d’un solide violet avec un

rendement isolé de 50 %.

116 M. Pinot, B. Goud, J. B. Manneville (2010). Physical aspects of COPI vesicle formation. Molecular Membrane Biology, 27, 428-442

Figure IV.8 : schéma de la synthèse du DAG fluorescent

IV. Projets annexes

- 197 -

La synthèse de l’ester 2-((6-rhodamineamidohexanoyl)oxy)-3-hydroxypropyl

oléate 6 a été réalisée en 6 étapes à partir du Solketal® et de l’acide oléique

commerciaux (fig. IV.9).

Cette synthèse a commencé par l’estérification du groupement hydroxyle

libre par de l’acide oléique pour conduire au produit 1 sous la forme d’une huile

incolore avec un rendement de 83%. Cette estérification a été suivie d’une

déprotection de l’acétal par acidolyse en milieu acide (TFA) dans du toluène pour

libérer les deux fonctions hydroxyles du glycérol conduisant au produit 2. Cette

réaction est quasi quantitative et le produit obtenu n’a pas nécessité de

purification pour son utilisation à l’étape suivante.

L’alcool primaire libre du glycérol a ensuite été protégé sélectivement par du

chlorure de triphénylméthyle pour conduire au produit 3 sous la forme d’une huile

incolore avec un bon rendement (89 %). Puis la fonction hydroxyle secondaire

restante a été estérifiée par de l’acide 6-((tert-butoxycarbonyl)amino)hexanoique

pour former le produit 4.

Figure IV.9 : schéma de la synthèse du DAG fluorescent (6)

IV. Projets annexes

- 198 -

Pour finir la molécule 4 a été complètement déprotégée en milieu acide

(TFA). Le rendement de cette étape est quasi quantitatif. La dernière étape a été

le couplage de la 5,6-CTMR sur l’amine primaire libre de la molécule 5 par une

liaison amide. Pour ce faire, le groupement acide carboxylique de la 5,6-CTMR a

été préalablement activée par le PyBOP en milieu basique (DIEA) avant de

réagir sur l’amine libre via une réaction d’addition nucléophile pour conduire au

produit final 6 sous la forme d’un solide violet.

La synthèse de ce DAG fluorescent 6 a nécessité 6 étapes pour un

rendement global isolé de 22 %.

Les deux molécules synthétisées ont été conçues pour quantifier et localiser

précisément le DOG incorporé dans des GUVs (Giant Unilamellar Vesicles) par

fluorescence. La contrainte majeure pour le développement de ces molécules est

qu’elle doit conserver au maximum la forme géométrique conique et les

propriétés hydrophobes du DOG pour qu’elle se comporte comme telle. C’est

pour cela que deux molécules ont été synthétisées : l’une avec le fluorophore au

niveau de la tête polaire du DOG (fig. IV.6 B) pour ne pas modifier la géométrie

de la partie hydrophobe de celui-ci, et l’autre où le fluorophore est intégré à une

des chaînes grasses du DOG (fig. IV.6 A) pour ne pas géner les interactions

possibles avec la tête polaire du DOG. Seule la molécule A a été utilisée et

incorporée aux GUVs avec succès comme on peut l’observer sur la figure IV.10.

Figure IV.10 : Vésicule géante contenant 5% de DOG fluorescent (composé A), résultat apporté par Mathieu Pinot et Katharina Henneberg dans l’équipe du Dr. J. B. Manneville.

IV. Projets annexes

- 199 -

2.3. Partie expérimentale

Les indications générales sur les solvants et réactifs ainsi que sur le

matériel et méthode utilisés sont les mêmes que précédemment (chap. II.4).

Synthèse du dioléylglycéro-éthoxy-éthoxy-éthanamide carboxytétraméthyl

rhodamine (DOGPEG4Rho)

De la 5,6-CTMR (22 mg- 0,051 mmol) est dissous dans 2 mL de CH2Cl2. De la

DIEA (24,4 mg – 0,195 mmol) et le PyBOP (31 mg – 0,058 mmol) sont ajoutés à

la solution. Après 10 min d’agitation à température ambiante, DOGPEGNH2 (30

mg – 0,039 mmol) préalablement dissous dans 2 mL de CH2Cl2 est ajouté au


pendant 12 h. Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est

purifié sur colonne de silice (gradient d’élution CH2Cl2/MeOH 100/0 à 100/5 v/v)

pour conduire au produit DOGPEG4Rho obtenu sous la forme d’un solide violet

(23 mg – Rdt : 50 %).

Synthèse de l’ester (2,2-diméthyl-1,3-dioxolan-4-yl)méthyl oléate (1)

O

O O

Ono

k

l

m

cdgccji

p

ccfcch

b

ac

c

e

De l’acide oléique (1,5 g – 5,31 mmol) est dissous dans 10 mL de CH2Cl2

anhydre et du dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (1,2 g – 5,84 mmol) y est ajouté.

Le milieu réactionnel résultant est agité sous argon pendant 10 min à

C24H44O4 ; PM : 396,6 g.mol-1

C72H113N3O10 ; PM : 1180,7 g.mol-1

IV. Projets annexes

- 200 -

température ambiante. Du Solketal (912 mg – 6,90 mmol) dissous dans 10 mL

de CH2Cl2 et de la DMAP (64 mg – 0,53 mmol) sont ensuite ajoutés à la

solution. La réaction se poursuit sous agitation et à température ambiante

pendant 6H. La phase organique est ensuite lavée avec une solution de NaHCO3

saturée (2 fois 30 ml) et avec de la saumure (1 fois 30 mL) puis la phase

aqueuse est extraite avec CH2Cl2 (1 fois 50 ml). Les deux phases organiques

collectées sont séchées sur MgSO4 et le solvant est évaporé sous pression

réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d’élution

CH2Cl2/MeOH 100/0 à 100/10 v/v) pour conduire au produit 1 obtenu sous la

forme d’une huile incolore (1,75 g – Rdt : 83 %).


RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 5,33 (m, 2He+f), 4,30 (m, 1Hm), 4,15 (m, 1Hm),

4,07 (m, 2Hk), 3,72 (m, 1Hl), 2,33 (t, 2Hi, J = 7,5), 2,00 (m, 4Hg+d), 1,62 (m, 2Hh),

1,42 (s, 3Hn), 1,36 (s, 3Hp), 1,32-1,25 (m, 20Hb+c), 0,87 (t, 3Ha, J = 6,9).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 174,2 (Cj), 130,6 (Cf), 130,4 (Ce), 110,4 (Co), 74,3

(Cl), 67,0 (Cm), 65,2 (Ck), 34,7 (Ci), 32,6 (Cc), 30 (m, 5 pics, Cc), 27,8(Cg), 27,3

(Cd), 26,0 (Cn+p), 25,5 (Ch), 23,3 (Cb), 14,7 (Ca).

Synthèse de l’ester 2,3-dihydroxypropyl oléate (2)

1 (500 mg – 1,26 mmol) est dissous dans 10 mL de THF et de l’acide

trifluoroacétique (2 mL) et de l’eau (200 µL) y sont ajoutés. Le milieu réactionnel

résultant est chauffé à 60 °C (ballon ouvert : évacuation de l’acétone formée) et

agité pendant 3 h. La solution est ensuite neutralisée avec de l’hydroxyde

d’ammonium (solution à 30%) puis la phase organique est lavée avec une

solution de NaHCO3 saturée (2 fois 10 ml) et avec de la saumure (1 fois 15 mL).

C21H40O4 ; PM : 356,5 g.mol-1

IV. Projets annexes

- 201 -

La phase aqueuse est extraite avec CH2Cl2 (1 fois 50 ml). Les deux phases

organiques collectées sont séchées sur MgSO4 et le solvant est évaporé sous

pression réduite. Le résidu 2 obtenu est obtenu sous la forme d’une huile

incolore et est utilisé sans purification supplémentaire (442 mg – Rdt : 98 %).


RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 5,33 (m, 2He+f), 4,14 (m, 2Hm), 3,91 (m, 1Hl),

3,68 (dd, 1Hk, J = 11,4, 3,9), 3,57 (dd, 1Hk, J = 11,4, 6,0), 2,33 (t, 2Hi, J = 7,5),

2,00 (m, 4Hg+d), 1,61 (m, 2Hh), 1,32-1,25 (m, 20Hc+b), 0,87 (t, 3Ha, J = 6,9).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 174,9 (Cj), 130,6 (Cf), 130,3 (Ce), 70,8 (Cl), 65,7

(Ck), 64,0 (Cm), 34,8 (Ci), 32,5 (Cc), 30 (m, 5 pics, Cc), 27,8 (Cg+d), 25,5 (Ch), 23,3

(Cb), 14,7 (Ca).

Synthèse de l’ester 2-hydroxy-3-(trityloxy)propyl oléate (3)

2 (400 mg – 1,12 mmol) est dissous dans 10 mL de CH2Cl2 anhydre et de la

pyridine (195 mg – 2,46 mmol) et du triphénylchloromethane (625 mg – 2,24

mmol) y sont ajoutés. Le milieu réactionnel résultant est agité pendant 24 h sous

argon. Le précipité blanc formé est filtré et la phase organique est lavée avec

une solution de NaHCO3 saturée (2 fois 10 ml) et avec de la saumure (1 fois 15

mL). La phase aqueuse est extraite avec CH2Cl2 (1 fois 50 ml). Les deux phases

organiques collectées sont séchées sur MgSO4 et le solvant est évaporé sous



sous la forme d’une huile incolore (597 mg – Rdt : 89 %).

C40H54O4 ; PM : 598,8 g.mol-1

IV. Projets annexes

- 202 -

RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,43 (m, 6Har), 7,30 (m, 9Har), 5,36 (m, 2He+f),

4,19 (m, 2Hk), 4,00 (m, 1Hl), 3,22 (m, 2Hm), 2,87 (t, 2Hi, J = 7,5), 2,01 (m, 4Hg+d),

1,59 (m, 2Hh), 1,32-1,25 (m, 20Hb+c), 0,89 (t, 3Ha, J = 6,9).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 174,6 (Cj), 144,3 (Car), 130,7 (Cf), 130,4 (Ce),

129,3 (Car), 128,6 (Car), 127,9 (Car), 87,5 (Cq), 70,0 (Cl), 66,3 (Cm), 64,9 (Ck), 34,8

(Ci), 32,6 (Cc), 30 (m, 5 pics, Cc), 27,9 (Cg+d), 25,5 (Ch), 23,4 (Cb), 14,7 (Ca).

Synthèse du diester de 2-((6-((tert-butoxycarbonyl)amino)hexanoyl)oxy)-3-

(trityloxy) propyl oléate (4)

3 (300 mg – 0,50 mmol) est dissous dans 7 mL de CH2Cl2 anhydre et du DCC

(165 mg – 0,80 mmol) y est ajouté. Le milieu réactionnel résultant est agité sous

argon pendant 10 min à température ambiante. De l’acide Boc-6-

aminohexanoique (173 mg – 0,75 mmol) dissous dans 7 mL de CH2Cl2 et de la

DMAP (12,2 mg – 0,10 mmol) sont ensuite ajoutés à la solution. La réaction se

poursuit sous agitation et à température ambiante pendant 12 h. Le DCU formé

est filtré. La phase organique est ensuite lavée avec une solution de NaHCO3

saturée (2 fois 30 ml) et avec de la saumure (1 fois 30 mL) puis la phase

aqueuse est extraite avec CH2Cl2 (1 fois 50 ml). Les deux phases organiques

collectées sont séchées sur MgSO4 et le solvant est évaporé sous pression

réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (CH2Cl2/MeOH 100/1

v/v) pour conduire au produit 4 obtenu sous la forme d’une huile incolore (298

mg – Rdt : 73 %).

C51H73NO7 ; PM : 812,1 g.mol-1

IV. Projets annexes

- 203 -

RMN 1H (300 MHz ; CDCl3) = 7,43 (m, 6Har), 7,30 (m, 9Har), 5,36 (m, 2He+f),

5,26 (m, 1Hl), 4,37 (dd, 1Hk, J = 11,8, 3,7), 4,54 (s, 1HNH), 4,24 (dd, 1Hk, J =

11,8, 6,6), 3,24 (m, 2Hm), 3,10 (m, 2H), 2,35 (t, 2H, J = 7,5), 2,24 (t, 2H, J = 7,5),

2,02 (m, 4Hg+d), 1,67 (m, 4H), 1,56 (m, 2H), 1,49 (m, 2H), 1,45 (s, 9Htbu), 1,32-

1,25 (m, 24Hb+c), 0,89 (t, 3Ha, J = 6,9).

RMN 13C (75 MHz ; CDCl3) = 174,0 (Cj), 173,4 (Cr), 156,6 (Cv), 144,2 (Car),

130,7 (Cf), 130,4 (Ce), 129,3 (Car), 128,5 (Car), 127,8 (Car), 87,3 (Cq), 79,7 (Cw),

71,2 (Cl), 63,4 (Cm), 62,8 (Ck), 41,0 (Cu), 34,8 (Ci), 34,7 (Cs), 32,6 (Cc), 30 (m, 5

pics, Cc), 29,1 (Ctbu), 27,9 (Cg+d), 25,5 (Ch), 25,2 (Ct), 23,4 (Cb), 14,7 (Ca).

Synthèse du diester de 2-((6-aminohexanoyl)oxy)-3-hydroxypropyl oléate

(5)

4 (200 mg – 0,25 mmol) est dissous dans 6 mL d’une solution de CH2Cl2/TFA

50/50 v/v. La solution est agitée à température ambiante pendant 2 h. Du toluène

(10 mL) y est ajouté et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu

obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d’élution CH2Cl2/MeOH/Et3N

100/2/1 à 100/14/1 v/v) pour conduire au produit 5 obtenu sous la forme d’une

huile légèrement jaune (112 mg – Rdt : 95 %).


RMN 1H (400 MHz ; CDCl3) = 5,33 (m, 2He+f), 4,35-4,04 (m, 4H), 3,70 (m, 1Hl),

2,80 (s, 3HOH+NH2), 2,73 (m, 2H), 2,35 (m, 4H), 2,01 (m, 4H), 1,64 (m, 4H), 1,49

(m, 2H), 1,42-1,25 (m, 22Hc), 0,87 (t, 3Ha, J = 6,9).

C27H51NO5 ; PM : 469,7 g.mol-1

IV. Projets annexes

- 204 -

RMN 13C (100 MHz ; CDCl3) = 174,5 (Cj), 174,3 (Cr), 130,7 (Cf), 130,4 (Ce),

68,5 (Cl), 66,0 (Cm), 65,7 (Ck), 42,0 (Cu), 34,8 (Ci), 34,6 (Cs), 32,6 (Cc), 30 (m, 5

pics, Cc), 27,9 (Cg+d), 25,5 (Ch), 25,2 (Ct), 23,4 (Cb), 14,8 (Ca).

Masse : m/z = 470,3861 [M+H]+, masse calculée = 470,3845 [M+H]+.

Synthèse de l’ester 2-((6-rhodamineamidohexanoyl)oxy)-3-hydroxypropyl

oléate (6)

36 mg de 5,6 carboxytétraméthylrhodamine (5,6-CTMR) (0,083 mmol) sont

dissous dans 3 mL de CH2Cl2. De la DIEA (40 mg – 0,319 mmol) et le PyBOP

(50 mg – 0,096 mmol) sont ajoutés à la solution. Après 10 min d’agitation à

température ambiante, 5 (30 mg – 0,064 mmol) préalablement dissous dans 3

mL de CH2Cl2 est ajouté au milieu réactionnel. La solution est agitée à




sous la forme d’un solide violet (25 mg – Rdt : 44 %).

Masse : m/z = 896,5457 [M+H]+, masse calculée = 895,5346 g.mol-1

HPLC : Tr = 5,2 min (Colonne C8 1 mm X 3 cm, débit : 300 µL.min-1)

C53H73N3O9 ; PM : 896,2 g.mol-1

V. Conclusion générale et perspectives

- 205 -

V. Conclusion générale et

perspectives


- 206 -


- 207 -

Le but de mon travail de thèse était de concevoir et de mettre en place une

nouvelle méthodologie pour identifier des zones hydrophobes de protéines

membranaires et plus particulièrement pour identifier le peptide de fusion de

virus enveloppés. L’identification de ce peptide de fusion permettrait une

meilleure compréhension d’une étape précoce de l’infection virale : l’étape

d’entrée du virus dans la cellule hôte. La compréhension de ce phénomène est

cruciale pour le développement de nouvelles thérapies pour lutter contre

l’infection virale.

Pour pouvoir étudier les interactions protéines/lipides, une nouvelle famille

de composés multifonctionnels lipidiques ayant la capacité de réaliser du

photomarquage d’affinité hydrophobe a été développée.

Une première partie de ce travail de thèse correspond donc au

développement et à la synthèse de molécules lipidiques bicaténaires

polyfonctionnelles. La synthèse optimisée de différentes sondes lipidiques,

différant par la position du groupement photoactivable intégré à une chaîne

grasse, par leur squelette et par leur traceur a été réalisée avec succès.

Dans une seconde partie, la fluorescence et la capacité de photomarquage

de cette famille de sondes lipidiques ont été vérifiées dans des conditions

drastiques. Les sondes lipidiques synthétisées ont montré leur robustesse dans

les conditions opératoires testées. Ensuite un protocole de photomarquage a été

mis en place et optimisé sur différentes protéines membranaires hydrophobes.

Les résultats obtenus sont à la hauteur des objectifs posés puisque cette

nouvelle famille de sondes lipidiques a la capacité de marquer du matériel

biologique hydrophobe. Ces résultats font l’objet d’un brevet et d’une publication.

L’étape suivante après le photomarquage est l’identification précise des

zones marquées comme par exemple dans le cas d’une protéine, connaitre la

séquence peptidique où la sonde lipidique s’est accrochée. Plusieurs méthodes

d’identification de la zone marquée par spectrométrie de masse ont été

développées dans une troisième partie. Malheureusement l’identification et la

caractérisation précise du marquage des protéines par ces sondes lipidique

fluorescente n’a, pour le moment, pas abouti mais différentes améliorations


- 208 -

apportées au protocole d’identification de zones hydrophobe de protéines sont

en cours de développement et ont déjà donné des résultats prometteurs à ce

jour. Ces différentes améliorations sont développées dans une quatrième partie.

Elles consistent en l’augmentation du rendement de photomarquage en modifiant

la source d’irradiation et en augmentant le temps d’irradiation, mais aussi en

l’utilisation d’une nouvelle sonde lipidique biotinylée.

Il serait donc intéressant, dans un futur projet de combiner ces dernières

améliorations aux techniques de purification de protéines et de spectrométrie de

masse développées dans la troisième partie pour identification précisément des

zones protéiques hydrophobes.

Enfin, des expériences préliminaires de fusion virale entre des pseudo-

particules du virus de l’hépatite C ou entre le virus de l’hépatite B et les sondes

lipidiques en liposome pour marquer et caractériser le peptide de fusion de ces

entités ont été effectuées et sont en cours de développement.

D’autres projets, en collaboration avec l’équipe du Dr. Pierre Falson (IBCP,

Lyon), sont en cours de développement. Ils utilisent les sondes lipidiques

fluorescentes comme agent de co-cristallisation pour permettre la cristallisation

de la BmrA et résoudre sa structure tridimensionnelle aux rayons X.

Pour finir, les projets secondaires effectués ont permis de développer et de

valider des nouvelles stratégies applicables à la compréhension et à l’exploration

du monde du vivant. Ces stratégies passent par le développement et la synthèse

totale de nouvelles sondes lipidiques multifonctionnelles innovantes.

Figure V.1 : image d’un cristal de BmrA cristallisé en présence d’une sonde lipidique fluorescente

Résumé

Les pathogènes comme les virus Lassa, Ebola, de l’Hépatite C ou de

l’immunodéficience humaine acquise sont, dans la plupart des cas, mortels et

représentent une menace sérieuse pour la santé humaine dans le monde entier.

Ces virus à enveloppe sont difficiles à étudier parce qu’ils doivent être

manipulés dans des laboratoires de niveau de sécurité 3 ou 4. Malgré ces

difficultés, la compréhension de l’interaction entre les protéines d’enveloppe d’un

virus donné et la membrane cellulaire lors de l’étape d’infection de la cellule-cible

par le virus est essentielle. La compréhension de cette étape-clés permettra de

mieux caractériser ce processus d’infection et permettra d’identifier un procédé

d’inhibition de celui-ci à un stade précoce de l’infection. Certaines de ces

protéines d’enveloppe, les protéines de fusion virale, sont plus particulièrement

impliquées lors de l’étape de fusion virale. Cette étape conduit à la libération du

matériel génétique viral dans le cytoplasme de la cellule cible. Deux éléments

structurels, communs à toutes les protéines de fusion virale connues, jouent un

rôle crucial lors de l’étape de fusion virale : le peptide de fusion virale et le

domaine transmembranaire de la protéine de fusion virale. Le peptide de fusion

virale est une courte séquence d’acides aminés hydrophobes présents en

position N-terminale ou interne à la protéine de fusion virale. La cartographie de

ces régions-clés portées par la protéine de fusion virale est donc cruciale pour la

compréhension des relations structure/fonction au cours du processus de fusion.

Nous proposons donc une stratégie pour identifier les régions hydrophobes

des protéines de fusion virale via un photomarquage covalent d’affinité

hydrophobe. Cette stratégie est basée sur l’utilisation de pseudo-particules

virales non pathogènes ou de virus comme le virus de l’hépatite B (VHB) comme

modèle permettant l’exécution de celle-ci dans un laboratoire de niveau de

sécurité 1 ou 2 moins contraignant.

Cette approche repose sur l’utilisation de nouvelles sondes lipidiques

contenant un groupement photoactivable et un traceur pour la détection des

adduits formés lors de la réaction de marquage.

Documents

Nouveaux lipides bicaténaires polyfonctionnels. Enjeux