Outils pour le diagnostic et le suivi des Infections ... · Outils pour le diagnostic et le suivi des Infections Fongiques Invasives chez les patients immunodéprimés : Patients

Outils pour le diagnostic et le suivi des Infections Fongiques Invasives chez les patients

immunodéprimés : Patients d’hématologie et transplantés

22 janvier 2015

Marie-Elisabeth Bougnoux [email protected] Unité de Mycologie-Parasitologie

Hôpital Necker Enfants Malades, Paris Unité Biologie et Pathogénicité Fongiques, Institut Pasteur.

à les infections fongiques à documenter ? Epidémiologie des infections fongiques invasives chez ces patients

à les outils disponibles ?

Valeurs diagnostiques et intérêt dans le suivi des infections chez ces patients

Distribution of invasive fungal pathogens based on the clinical service or the underlying patient condition

From D. Horn et al., CID 2009 ; D. Neofytos et al,,CID 2009

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Total HEME SCT SOT GMED ST SURG NICU

% In

fect

ions

clinical service

Candida spp. Aspergillus spp. other mould

Distribution of invasive fungal pathogens based on the clinical service or the underlying patient condition

From D. Horn et al., CID 2009 ; D. Neofytos et al,,CID 2009

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Total HEME SCT SOT GMED ST SURG NICU

% In

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ions

clinical service

Candida spp. Aspergillus spp. other mould

Les plus fréquents pathogènes fongiques responsables IFI chez les patients d’hématologie

et de transplantation •  Levures

–  Candida spp., Cryptococcus neoformans

•  Champignons filamenteux : moisissures –  Aspergillus spp. –  Zygomycètes

•  Mucor, Rhizopus, Lichtheimia

– Autres moisissures : •  CH noires (Alternaria etc), Fusarium spp., Scedosporium spp.

•  Pneumocystis jirovecii

Les moyens diagnostiques, Les outils…

– directs : •  Mise en évidence du champignon : prélèvements respiratoires,

biopsies, sang … : à cytologie, examen direct et culture –  indirects :

•  Détection antigène spécifique –  antigène galactomannane : LBA, LCR, sérumà Aspergillose –  antigène GXM de Cryptococcus neoformans à Cryptococcose –  Antigène mannane à Candidose

•  Détection antigène « panfongique « béta (1-3) D glucane : sérum àIFI

•  Détection d’ADN fongique : LBA, sérum • à PCR spécifiques • à PCR « panfongique »



biopsies, sang … : à cytologie, examen direct et culture –  indirects : Marqueurs des IFI




Antigène Galactomannane (GM) •  GM : Polysaccharide (mannane et

galactofurane) libéré par les champignons du genre Aspergillus au cours de leur croissance

•  Détectable dans le sérum, LBA et LCR

Antigène Galactomannane (GM) •  GM : Polysaccharide (mannane et

galactofurane) libéré par les champignons du genre Aspergillus au cours de sa croissance

•  Détectable dans le sérum, LBA et LCR

•  Méthode de détection standardisée: ELISA à1 seul test (Platelia® Aspergillus, Bio-Rad) :

seuil de détection ∼1 ng GM •  Critères de positivité : modifiés en 2008

–  Cut off de positivité : selon échantillon biologique

Platelia® Aspergillus

Galactomannane sérique est un marqueur d’aspergillose Invasive

•  27 études entre 1996 -2005. Méta-analyse •  Performances globales: Se : 71 % et Sp : 89% •  variations importantes par population de patients

Population Sensitivité Spécificité

onco-hématologie adulte 70 % 92 %

GMO adulte 82 % 86 %

onco-hématologie et GMO enfant 89 % 85 %

transplantation organe 22 % 84 %

Pfeiffer C et coll. CID 2006 Critères de positivité : Index≥ 1,5; 2 tests +

Galactomannane sérique est un marqueur d’aspergillose Invasive

validé que chez les patients d’onco-hématologie ! •  27 études entre 1996 -2005. Méta-analyse •  Performances globales: Se : 71 % et Sp : 89% •  variations importantes par population de patients

Population Sensitivité Spécificité

onco-hématologie adulte 70 % 92 %

GMO adulte 82 % 86 %

onco-hématologie et GMO enfant 89 % 85 %

transplantation organe 22 % 84 %

Pfeiffer C et coll. CID 2006 Critères de positivité : Index≥ 1,5; 2 tests +

Protocole de détection du GM chez les patients d’onco-hématologie !

•  Approche diagnostique active àpatients à haut risque

-  prévalence AI élevée -  traitement ATF (prophylactique, préemptif ou empirique (neutropénie

fébrile) à Screening du GM (2x /semaine) •  Critères actuels de positivité ds le sérum :

–  cut off : index ≥ 0,5 –  Nbre sérums positifs : dès le 1er sérum à index ≥ 0,7

ou 2 sérums à index 0,5 -0,7

Maertens, J. A., CID 2007, De Paw, CID 2008, Marchetti O, ECIL 2012

Chez les enfants : une réelle difficulté d’interprétation

•  Peu d’études à disparité des résultats •  Plus haute incidence de faux positifs chez les enfants que chez

les adultes ? Auteurs N°

patients

Age moyen

Cut off

Faux positifs (% de

patients) Rohrlich P 37 8,5 ans 0,9 5,7

Sulahian A 347 17,5 ans 1,5 10,1

Herbrecht R 48 - 1,5 44

Chachati E 36 7,1 ans 1,5 27,3

Hayen R 56 3 m-18 ans 0,5 12,8

Steinbach W 64

8 ans 0,5

12,7

à Adultes : 0,9 – 5%

à Enfants : 5,7 – 44%

Steinbach W et coll. Ped Inf Dis 2007 Ostrosky-Zeichner L. Am J Med 2012

GM : Problème de spécificité 3 principales causes de fausses positivités

à Réactivité croisée avec des substances d’origine iatrogène

à Réactivité croisée avec d’autres champignons

à Facteurs d’hôte

GM : Problème de faux positifs •  Réactivité croisée avec des substances d’origine iatrogène àSolutions IV :

–  Antibiotiques semi- synthétiques : •  Pipéracilline- tazobactam •  Amoxicilline et Amoxicilline-acide clavulanique

–  IgIV (Tégéline®) –  Solution de nutrition parentérale NP 2 (gluconate de calcium) –  solutions de nutrition préparées à l’hôpital (gluconate de calcium) –  Plasma-lyte (gluconate de calcium)

à Alimentaire –  Lait et produits lactés

•  Réactivité croisée avec d’autres champignons •  Facteurs d’hôte

Gangneux JP et coll., Lancet 2002 Aubry A et coll., JCM 2006 Ribaud P et coll., ICAAC 2007 Hayden R et coll. Pediatr Infect Dis J 2008 Asano-Mori, Y. et coll., JAC 2008 Bougnoux M.E et coll., ECCMID 2010 Pétraitienne R et coll., JCM 2011

Rôle de certaines IgIV : Tégéline

Bougnoux M.E et coll., ECCMID 2010

Cinétique des antigénémies galactomannane chez des adultes et des enfants sans infection aspergillaire

Tégéline

Positivité du GM dans les échantillons des différentes IgIV

•  Tégéline (LFB biomédicaments) : + •  Clairyg : + •  Privigen : - •  Octogam : - •  Gammagard : - •  Kiovig : -

Bougnoux M.E et coll., ECCMID 2010

GM : Problème de faux positifs •  Réactivité croisée avec des substances d’origine iatrogène àSolutions IV :

–  Antibiotiques semi- synthétiques : •  Pipéracilline- tazobactam •  Amoxicilline et Amoxicilline-acide clavulanique

–  IgIV (Tégéline®) –  Solution de nutrition parentérale NP 2 (gluconate de calcium) –  solutions de nutrition préparées à l’hôpital (gluconate de calcium) –  Plasma-lyte (gluconate de calcium)

à Alimentaire –  Lait, produits lactés, Thé ?

•  Réactivité croisée avec d’autres champignons •  Facteurs d’hôte

Gangneux JP et coll., Lancet 2002 Aubry A et coll., JCM 2006 Ribaud P et coll., ICAAC 2007 Hayden R et coll. Pediatr Infect Dis J 2008 Asano-Mori, Y. et coll., JAC 2008 Bougnoux M.E et coll., ECCMID 2010 Pétraitienne R et coll., JCM 2011

GM : Problème de faux positifs •  Réactivité croisée avec des substances d’origine iatrogène àSolutions IV : à Alimentaire

•  Réactivité croisée avec d’autres champignons pathogènes opportunistes –  Cryptococcus neoformans, Geotrichum capitatum, Histoplasma

capsulatum, Fusarium spp. et même Prototheca spp. (algues achlorophyles)

•  Facteurs d’hôte

Dalle F. et coll, JCM 2005; Giacchino et coll. JCM 2006; Riviere V. et coll, Am J Trop Med 2012; Tortorano AM. et coll, JCM 2012; Van den Bossche D et coll. JCM 2012

GM : Problème de faux positifs •  Réactivité croisée avec des substances d’origine iatrogène àSolutions IV : à Alimentaire

•  Réactivité croisée avec d’autres champignons pathogènes opportunistes

•  Facteurs d’hôte

–  Post allo greffe de MO au cours des GVH digestives –  Pédiatrie, rôle de la microflore ??(Bifidobacterium sp.)

Hamaki T. ety coll. Bone Marrow Transplant. 2001

Translocation intestinale de GM ?

•  Taille et structure des GM présents et détectés dans le sang : inconnues

•  GM peut être relargué sous forme de molécules de PM : 21 KDa à 100KDa

•  Molécules de ~ 45 KDa peuvent « transloquer» chez les patients ayant un muqueuse intestinale immature ou une diminution de l’intégrité de la barrière intestinale

•  Charge fongique : valeurs plus élevées –  Aspergillose angio-invasive –  Patients neutropéniques

•  données autopsiques : lésions histologiques plus extensives et plus angio-invasives chez les patients neutropéniques que chez les non-neutropéniques

•  Suivi thérapeutique : marqueur pronostique –  diminution et disparition du GM : bon pronostic –  Persistance associée à un échec thérapeutique - Cordonnier C et col., CMI 2009 - Chamilos G et coll., Haematologica 2006 - Hidalgo A et coll., Eur J Radiol (2009) - Woods G et coll., Cancer 2007 - Miceli MH et coll., CID 2008

GM indicateur de la charge fongique et du pronostic ?

GM et LBA - intérêt diagnostique : chez quels patients ? - utilisation : seuil à retenir ?

Mingxiang Zou et al.

-  30 études : à Fev 2012

-  Problème du cut off à 1

GM et LBA : intérêt diagnostique AI démontré chez les patients d’hématologie adultes

•  2 principales études : GM/LBA

•  Etude J. Maertens : –  LBA : Se GM > ED et culture ( 91, 3% vs 53,3 et 50%) –  LBA GM : VPP = 76% et VPN = 96% –  Performances GM : pts neutropéniques = non-neutropéniques

•  Etude A. Bergeron :

– Performances GM : pts neutropéniques ≠ non-neutropéniques

Bergeron A. et al., Chest 2010 Maertens J et al., CID 2009

Auteurs N° patients

Prévalence AI

Cut off ≥

Se. Sp.

A. Bergeron et al. 101 33 % 0,5 57,6 % 95,6 %

J. Maertens et al. 99 30 % 1 91,3 % 87,8 %

Le seuil de pos dans le LBA n’est pas encore validé !

Maertens J. CID 2009

Chez les patients d’hématologie à cut off ≥ 1

Le seuil de pos dans le LBA n’est pas encore validé !

Maertens J. CID 2009

Chez les patients d’hématologie à cut off ≥ 1

Limites de la détection de GM •  Sérum :

–  validée comme marqueur des AI chez les patients d’oncohématologie dans le contexte d’un suivi bihebdomadaire de patients à très haut risque AI (probabilité pré test élevée)

•  Critère de pos : I ≥ 0,5 •  àProblème de spécificité (notamment chez les enfants)

–  Faible sensibilité chez les patients de transplantation (à tester que si la probabilité pré test est élevée chez le pt)

•  LBA : –  Indispensable sur les LBA de patients d’hémato –  Seuil ?

Béta 1-3 D glucane

Béta 1-3 D glucane (BDG)

•  Origine ? •  Quelles infections ? •  Élimination ? •  Comment l’utiliser, quand le prescrire ?

Longues chaînes de résidus glucose liées en β1-3 et en β1-6

BDG : composant pariétal majeur d’un grand nombre d’espèces fongiques

Paroi fongique

à Détection : β 1-3-D-glucanes à Infections dues à : Candida sp., Aspergillus sp., Pneumocystis jirovecii (kystes), Fusarium spp. , Paecilomyces spp., Scedosporium sp., Histoplasma capsulatum, Trichosporon spp. à Non détectables dans les infections dues à Cryptococcus neoformans et à des zygomycètes Miyazaki T et al. J Clin Microbiol 1995 - Obayashi T et al. Lancet 1995 - Pazos C et al. J Clin Microbiol 2005 -  Mitsutake KT et al. J Clin Microbiol 1996 - Marty H. & Koo S, Med Myco 2009 - Nakase K. et coll. Int J Inf Dis 2012 - Rivière S et coll. AM J Trop Med 2012

BDG : composant pariétal majeur d’un grand nombre d’espèces fongiques

Paroi fongique à  sauf zygomycètes • Test Fungitell® : à Détection : β 1-3-D-glucanes à Infections dues à Candida sp., Aspergillus sp., Pneumocystis jirovecii (kystes), Fusarium sp. , Paecilomyces sp., Scedosporium sp., Histoplasma capsulatum, Trichosporon sp. à Non détectables dans les infections dues à Cryptococcus neoformans et à des zygomycètes Miyazaki T et al. J Clin Microbiol 1995 - Obayashi T et al. Lancet 1995 - Pazos C et al. J Clin Microbiol 2005 -  Mitsutake KT et al. J Clin Microbiol 1996 - Marty H. & Koo S, Med Myco 2009 - Nakase K. et coll. Int J Inf Dis 2012 - Rivière S et coll. AM J Trop Med 2012

Détection β 1-3-D-glucane 4 Tests commercialisés Fungitec G-test

β glucane test Walko

B-G star Fungitell

Développé Japon Japon Japon USA

Approuvé 1995 1995 2001 2004

Valeur du Cutoff pg/ml

20 11 11 60-80

Patients tout venant Performance diagnostique du glucane (BG)

•  Prospective monocentrique 2004-2006 •  871 patients et 1308 prélèvements obtenus au moment de l’épisode •  Infections fongiques : n=116

–  Prouvées n= 80 ( 44 candidoses, 14 AI, 22 autres) –  Probables n = 36 ( 1 candidose, 18 AI, 1 PCP, 4 autres) –  Possibles n = 93

Nb patient Sensitivité Spécificité RV + RV- IFI vs non IFI 871 71 % 81% 3,71 0,36 Pts hématologie 497 62 % 84 % 4,55 0,44 Greffe de moelle 251 64 % 91% 7,26 0,39 Neutropénie fébrile 212 50 % 90 % 4,86 0,56 Pneumopathie 304 77 % 81 % 4 0,29

Koo S et coll. CID 2009

Performance diagnostique (BG) •  Prospective monocentrique 2004-2006 •  871 patients et 1308 prélèvements obtenus au moment de l’épisode •  Infections fongiques : n=116

–  Prouvées n= 80 ( 44 candidoses, 14 AI, 22 autres) –  Probables n = 36 ( 1 candidose, 18 AI, 1 PCP, 4 autres) –  Possibles n = 93

Nb patient Sensitivité Spécificité RV + RV- IFI vs non IFI 871 71 % 81% 3,71 0,36 Pts hématologie 497 62 % 84 % 4,55 0,44 Greffe de moelle 251 64 % 91% 7,26 0,39 Neutropénie fébrile 212 50 % 90 % 4,86 0,56 Pneumopathie 304 77 % 81 % 4 0,29

Koo S et coll. CID 2009 Evaluation du test en fonction du contexte

Aucune évaluation clinique en pédiatrie

•  Etude chez des contrôles : –  120 enfants ( 7 mois-18 ans), âge moy : 9,2 ans

àC° moy. BG dans le sang : 68 ± 128 pg/ml àversus chez les contrôles adultes : C° moy.BG : 48 pg/ml

–  18% des enfants : taux ≥ 80 pg/ml (seuil de positivité)

•  Cas ponctuels rapportés d’IFI: –  Prématurés, des enfants ID –  Candidémie à C. parapsilosis et Aspergillose

Smith P et coll., Clin Vaccine Immunol 2007 Mularoni A et coll., Clin Vaccine Immunol 2010

BDG : Problème de spécificité hypothèses faux positifs à +/- confirmées

•  Réactivités croisées avec des substances d’origine iatrogène –  membrane de cellulose : hémodialyse –  compresses : chirurgie –  Immunoglobulines IV, ABT (amoxicillin-clavulanic) –  Albumine

•  Réactivités croisées avec d’autres microorganismes : ?? -  Bactéries : patients bactériémiques ou inf bactériennes

(Pseudomonas aeruginosa) -  colonisation multiple à Candida sp.

Miyazaki T et al. J Clin Microbiol 1995; Obayashi T et al. Lancet 1995; Mitsutake KT et al. J Clin Microbiol 1996 ; Pazos C et al. J Clin Microbiol 2005 ; Vlieger G et al; JCM 2011

Réactions croisées Bactériémies et BDG ? Etude prospective Hôpital Necker •  Inclusion :

–  enfants & adultes Hc positives à Gram+ et Gram-

–  BG prélevé dès résultats HC + (délai < 4 jours)

•  Exclusion : IFI et IgIV •  Résultats : 27 pts, 30

épisodes •  Tous les BDG négatifs (< 80

pg/ml)

Episodes de bactériemies étudiés

0

1

2

3

4

5

6

N b

acté

riém

ie

Desjardins A. et coll., Med Mycology 2014

BDG : Problème de spécificité dans le LCR

•  Faux positif : Nocardiose cérébrale (Koncan R. et coll, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2014)

Facteurs influençant la présence et la concentration sérique de BDG

•  Type d’infection et espèce en cause •  Structure et poids moléculaire des BDG relargués pendant l’IFI à  Meilleure performance au cours des Pneumocystoses avec des taux

très élevés +++ à  Mauvaise performance au cours des candidémies

•  Facteurs de l’hôte : –  Degré de neutropénie et d’immunosuppression, charge fongique, organe

infecté –  Fonction hépatique et rénale ??

–  la clairance des BG chez l’homme mal connue –  l’homme ne possède pas de B glucanases –  BG de faible PM : dépend de la filtration glomérulaire. –  BG de haut PM apparaissent retenus dans le foie et dégradés par les

cellules de Küpffer

Brown G et coll. Immunology 2003 Marty M et coll. Med Myc 2009

CMI, 2012

Facteurs influençant la présence et la concentration sérique de BDG

•  Type d’infection et espèce en cause •  Structure et poids moléculaire des BDG relargués pendant l’IFI à  Meilleure performance au cours des Pneumocystoses avec des taux

très élevés +++ à  Mauvaise performance au cours des candidémies

•  Facteurs de l’hôte : –  Degré de neutropénie et d’immunosuppression, charge fongique, organe

infecté –  Fonction hépatique et rénale ??

–  la clairance des BG chez l’homme mal connue –  l’homme ne possède pas de B glucanases –  BG de faible PM : dépend de la filtration glomérulaire. –  BG de haut PM apparaissent retenus dans le foie et dégradés par les

cellules de Küpffer

Brown G et coll. Immunology 2003 Marty M et coll. Med Myc 2009

Influence de l’espèce sur les performances de la détection de (1-3) beta-glucane chez les patients candidémiques

Espèce Nombre épisodes de candidémie

sensibilité

Candida sp 92 78,3 %

Candida albicans 36 80,6 %

Candida parapsilosis 18 61,1 %

Candida tropicalis 11 81,8 %

Candida glabrata 26 80,8 %

Candida krusei 3 100 %

Ostrosky-Zeichner L et coll. CID 2005

Données Necker

Positivité des BG lors d’une candidémie ? questions :

–  Les BG sont-ils positifs au moment de la candidémie ? –  rôle du KT (biofilm ?), neutropénie, prophylaxie ATF, espèces de

Candida, candidose profonde associée, évolution ? –  Quel est le délai d’apparition des BG ? –  Quelles sont les valeurs de BG en cas de candidémie ? –  La cinétique des BG est-elle interprétable lors du suivi d’une

candidémie Patients éligibles : absence de causes de faux positifs

* Données personnelles MEB

BDG : causes de faux positifs

•  --> Réactivités croisées avec des substances d’origine iatrogène –  membrane de cellulose : hémodialyse –  compresses : chirurgie –  Immunoglobulines IV (Clairyg, Privigen +++) –  Albumine

Miyazaki T et al. J Clin Microbiol 1995; Obayashi T et al. Lancet 1995; Mitsutake KT et al. J Clin Microbiol 1996 ; Pazos C et al. J Clin Microbiol 2005 ; Vlieger G et al; JCM 2011

Méthodologie

34 épisodes de candidémies

Adultes* N=22

Enfants N=12

Hématologie N=19

TransplantaJon Rénale N=3

RéanimaJon Pédiatrique

N=12

N=16 N=2 N=5

1 BG / épisode de candidémie Au moment du prélèvement d’hémoculture ⊕ : [J-‐3 ; J+10]

Suivi des BG : 2 à 16 sérums, [22-‐686 jrs] post-‐candidémie

Dosage de BG : ‒ Test Fungitell, Cape Cod ‒ Passage en duplicate (CV<20%) ‒ InterprétaJon des résultats :

•  <80 pg/ml : négaJf •  80 – 500 pg/ml •  >500 pg/ml ( pas de diluJon)

* 1 adulte avec 2 épisodes de candidémie Données personnelles MEB

PosiJvité des BG et candidémie ? -‐ Ensemble des pa,ents : à 41% (14/34) à BG négaJfs au moment de la

candidémie -‐ 11 espèces différentes de Candida dt 9 pts C. albicans -‐ Pa,ents d'Hématologie adulte à36% (7/19) à BG négaJfs au moment de la candidémie à4/ 7 (suivis 15 jrs) : BG négaJfs -‐ Comparaison des pa,ents avec des BG +/-‐ au moment de la candidémie :

à  pas de différence en fonction de : 1)présence d'un KT vascu, 2) la durée de la candidémie, 3) administration d'antifongique en prophylaxie, la neutropénie, l'existence d'une mucite

à  différence selon les espèces de Candida en cause : toutes les candidémies à C. albicans étaient positives

Données personnelles MEB

La cinétique des BG est-elle interprétable lors du suivi d’une candidémie ?

Cas 1 : 1 paJent adulte d’Hématologie Suivi : 16 sérums, [J-‐31; J+321] après la candidémie

Candidémie C. albicans + C. kefyr, 26 et 28/06/2011

Données Necker. C. Angebault & ME Bougnoux



J-‐3: 23/06/2011




M-‐1: 26/05/2011



Candidémie C. kefyr M+2,5 : 09/09/2011

M+7: 13/04/2012



3 PCR A. fumigatus sériques + 20, 23, 26/01/12

Ag GM + le 20/01/12




InterprétaJon difficile lors du suivi du paJent ‒ 1 candidémie mixte suivie d’une 2ème candidémie 3 mois après puis d’une API encore 3 mois après ‒ BG >500 pg/ml dès J-‐3 avant la 1ère candidémie ‒ Pas de décroissance des BG ‒ Rôle des différentes IFI dans la cinéJque des BG

‒  Nécessité d’interpréter les BG en lien avec les autre marqueurs d’IFI


Cas 2 : 1 paJent adulte d’Hématologie Suivi : 16 sérums, [J-‐16; J+159] après la candidémie AMO 07/05/13

Candidémie C. albicans 18/05/2013


AMO 07/05/13

J+2: 20/05/2013




AMO 07/05/13



J-‐2

J-‐8 J-‐16


AMO 07/05/13



M+5 : 24/10/2013


AMO 07/05/13



Ag GM <0,5 et PCR A. fumigatus sériques négaJves


AMO 07/05/13 30/05/13 : PN>500 Fièvre persistante +

douleurs abdominales




AMO 07/05/13 Scan + IRM 04/06/13 :

Micro-‐abcès HS spléniques



30/05/13 : PN>500 Fièvre persistante +



AMO 07/05/13 PN>500 0/05

Candidose hépato-‐splénique

Scan + IRM 04/06/13:

Micro-‐abcès HS spléniques


Candidose hépato-‐splénique


30/05/13 : PN>500 Fièvre persistante +


InterprétaJon difficile lors du suivi du paJent… ‒ 1 candidémie à J10 d’une AMO pour une adrénoleucodystrophie ‒ BG >500 pg/ml dès J-‐2 ‒ SorJe d’aplasie à J23 de l’AMO ◊ fièvre persistante, douleurs abdominales ‒ Scan + IRM : diagnosJc de CHS ‒ Pas de décroissance des BG à 5 mois de la candidémie + CHS, sous traitement ‒ Autre infecJon fongique en cours ?


BDG : comment le prescrire ? Surveillance des patients à haut risque ? : screening 1 ou 2 fois par semaine ? à Patients d’hématologie ?

àPatients de réanimation ?

BG et IFI

BG Fortement positifs : •  Pneumocystose •  Candidoses ( 44% négatifs au moment de la

candidémie) et CHS +++ •  Aspergillose I (52% négatifs au moment du diagnostic) •  Histoplasmose •  Alternarioses •  Infection disséminée à Exophiala spp. •  Mycétomes

Données personnelles MEB

BG et IFI BG modérément ou faiblement positifs : •  Hémoculture à Rhodotorula et à Scedosporium BG négatifs •  Fusarioses •  Mucor •  Cryptocoques (encore que certains cas

faiblement +) Hémocultures à Malassezia •  Microsporidiose intestinale •  Coccidoidiomycose Données personnelles MEB

BG : conclusions

•  à test diagnostique pan-fongique : VPN et VPP ?

•  Ne permet pas de différencier le type d’IFI : levures/ champignons filamenteux !!

•  Données nouvelles à confirmer à études indispensables à analyser la cinétique en fonction/ stratifiant

–  facteurs de l’hôte (fonction rénale et hépatique) –  type d’infection PCP et de pathogène fongique –  Marqueur diagnostique fongique très intéressant dans les

atteintes du CNS



biopsies, sang … : à cytologie, examen direct et culture –  indirects : Marqueurs des IFI




Les PCRs fongiques ciblent ADN ribosomiques

unités répétées

Sous unités (18S; 5,8S; 28S) régions conservées et régions variables

spécifiques d’espèce

Unité

18S 5,8S 28S

Plusieurs options •  PCR panfongique : PCR standard + séquençage •  PCR plusieurs espèces. - PCR quantitative + séquençage - PCR multiplex •  PCR spécifique d’espèce : - PCR quantitative

àamorces consensus : régions conservées présentes chez tous les champignons PCR ITS et 28S à amorces judicieusement choisies régions conservées entre plusieurs espèces fongiques à amorces specifiques : régions spécifiques d’une espèce

PCR panfongique

18S 5,8S 28S

PCR spécifique

Performances de la PCR pour le diagnostic des Aspergilloses Invasives

•  Résultats d’une méta-analyse 16 études : 2000 – 07/2008

•  screening ADN sérique de Aspergillus chez les patients d’hématologie

•  Grande disparité des stratégies de PCR

Sensitivité Spécificité RV + RV -

1 PCR + 88% 75% 3,53 0,15

2 PCR + 75% 87% 6,04 0,28

Mengoli C. et coll. Lancet Inf Dis 209

Variable nombre Type d’échantillon 3 Volume testé 100 µl – 3ml Procédure d’extraction 8 Cible amplifiée 4 Type de PCR 5

Performances de la PCR pour le diagnostic des Aspergilloses Invasives

•  Résultats d’une méta-analyse 16 études : 2000 – 07/2008

•  screening ADN sérique de Aspergillus chez les patients d’hématologie

•  Grande disparité des stratégies de PCR

Sensitivité Spécificité RV + RV -

1 PCR + 88% 75% 3,53 0,15

2 PCR + 75% 87% 6,04 0,28

Mengoli C. et coll. Lancet Inf Dis 209

Variable nombre Type d’échantillon 3 Volume testé 100 µl – 3ml Procédure d’extraction 8 Cible amplifiée 4 Type de PCR 5

Chez les patients d’hématologie adulte àla détection d’ADN d’A. fumigatus est un marqueur précoce et spécifique d’AI

•  Prospective, Hématologie adulte Necker 2006-2007 •  125 patients inclus (137 épisodes évalués)

–  17 cas AI (1 prouvé, 14 probables et 2 possibles) à8 patients allogreffés –  Incidence AI : 11,3%

•  Screening : GM : 2/ sem •  q-PCR A. fumigatus (28S): 1/sem /Sérum (1mL et 100 µL)

AI qPCR large volume faible volume

GM

Sensitivité 100% 76,5 88,2 Spécificité 96,7 96,7 95,8 VPP 81 81,3 75 VPN 100 95,6 98,3

Suarez F et coll. JCM 2008

Chez les patients d’hématologie adulte àla détection d’ADN d’A. fumigatus est un marqueur précoce et spécifique d’AI

•  Prospective, Hématologie adulte Necker 2006- 2007 •  125 patients inclus (137 épisodes évalués)

–  17 cas AI (1 prouvé, 14 probables et 2 possibles) à8 patients allogreffés –  Incidence AI : 11,3%

•  Screening : GM : 2/ sem •  q-PCR A. fumigatus (28S): 1/sem /Sérum (1mL et 100 µL)

AI qPCR large volume faible volume

GM

Sensitivité 100% 76,5 88,2 Spécificité 96,7 96,7 95,8 VPP 81 81,3 75 VPN 100 95,6 98,3


Délai de positivité de la q-PCR et du GM en fonction de

la date du diagnostic d’AI chez les 17 patients


PCR + : à Précède le diagnostic clinique : 13/ 17 cas AI à Précède la détection GM: 5 cas concomitant : 6 cas àseul marqueur sérique + AI : 2 cas

Standardisation des méthodes PCR pour le diagnostic d’AI

Echantillon sanguin à utiliser ? –  sang total, sérum, plasma

Méthode d’extraction - volume sanguin ad’hoc ? –  Automate et Kit d’extraction - Large volume

Cible d’amplification : ADN ribosomique Type de PCR : PCR quantitative

Plusieurs protocoles et Kits disponibles

Aspergillose Invasive : stratégies diagnostiques basées sur les

biomarqueurs ? •  Intérêt d’associer plusieurs marqueurs : à GM + PCR + BG ? •  Etudes cliniques ?

Plusieurs essais : stratégie diagnostique basée sur les biomarqueurs ??

PCR-GM vs GM •  Surveillance active AI chez patients d’hématologie à haut

risque d'AI (marqueurs mesurés 2 X/semaine) •  Etude prospective (20 mois, 2011-2012), multicentrique (13

centres –Espagne), randomisée ( 2 bras : PCR-GM vs GM) •  rtPCR : A fumigatus, A terreus, A. flavus ?? •  Patients :

–  LAM et SMD tt induction, surveillance à PN 500/mm3 –  Allogreffe CS, surveillance 10-18 semaines –  Aucun des pts sous prophylaxie ATF anti CH filamenteux +++ (fluco OK)

•  Critères d’évaluation : 1) incidence des AI ; 2) intervalle de tps entre diagnostic AI et utilisation traitement ATF empirique et survie des patients sans AI

Aguado J et coll., CID 2014

Aguado J et coll., CID 2014

Résultats et conclusions : stratégie diagnostique basée sur détection GM + PCR

Bras PCR-GM : 1) diminution incidence des IA prouvées et probables (4,2% vs 13,1%) 2) diminution intervalle de tps entre diagnostic AI (13 j vs 20 jrs) et diminution de l'utilisation traitement ATF empirique (16,7 vs 29%) et survie des patients sans AI (P=0,027) •  nbre > traitement ATF précoce •  attention protocole particulier : pas de traitement

prophylactique anti "CH filamenteux" quid 2015 ? •  "the end of the road for empirical antifungal

treatment ?? !!" plusieurs essais en cours ...

59,2

24,8

7,2

6,8

14

Aspergillose 59,2%

Candidose 24,8%

14% Zygomycose 7.2%

Autres mycoses à CH filamenteux 6.8%

Mycoses à champignons filamenteux en dehors de l’aspergilloses

Répartition des étiologies

Neofytos D. et coll., CID 2009

mycoses filamenteux en dh Aspergillose •  100 % documentées par ED/culture à Zygomycose : 50 %

à Rhizopus, Mucor, Absidia à Autres champignons filamenteux : 50% à Fusarium sp., à Scedosporium sp., Geosmithia sp..

Moyens diagnostiques rapportés : ED /histologie /cultures

Quid d’autres méthodes ? ECIL-3 : 2012

!Diagnostic des mycoses à champignons filamenteux autres que les Aspergilloses : 1) ) Béta glucane : - Zygomycoses : non valables

- autres mycoses : peu de données 2) PCR : pas de vraie PCR panfongiqe, manque de sensibilité (ECIL-3) -à Million L et coll CID 2013 qPCR serum patient +++ PHRC 2014 en France

Marchetti et coll

Diagnostic des Mucormycoses

•  Diagnostic extrêmement difficile •  Pas de marqueurs sériques disponibles

•  Etude rétrospective •  10 patients atteints de différentes formes cliniques

de mucormycoses (cutanée, rhinocérébrale ou disséminée)

•  qPCR : cibles 18S –  3 qPCRs à Mucor/Rhizopus, Lichtheimia et Rhizomucor

•  Intérêt diagnostique : Pos ds le serum 9/10 pts •  Suivi thérapeutique •  Evaluation clinique : PHRC ModiMucor début 2015

Millon L et coll, CID 2013

Détection d’ADN circulant dans le sérum de patients atteints de Mucormycoses ?



biopsies, sang … : à cytologie, examen direct et culture –  indirects :




Examens directs des prélèvements (ECBC, LBA) ou

histologie des biopsies pulmonaires Préparation

État frais Potasse Colorations non spécifiques

Apposition /frottis

usuelles GIEMSA -Gram

fluorescentes Calcofluore -Uvitex 2B

Cytologie/ histolologie

PAS Grocott

ED et histologie •  Coloration non spécifique des champignons •  aspects morphologiques des filaments CH ++++ à filaments septés de 2 à 5 µm de diamètre avec

branchements à 45° (Type Aspergillus) –  Ne permet pas de différencier les différentes espèces de

Aspergillus –  Ne permet pas de séparer d'autres champignons filamenteux

septés (Scedosporium sp., Fusarium sp., Scedosporium sp.)

à filaments non septés (type Mucorale) à filaments pigmentés (Alternaria sp. Ch noires) à Pseudo filaments : levures

Etat Frais

FROTTIS LBA BIOPSIE PULMONAIRE

Aspect des filaments à type Aspergillus à type Mucorale (Zygomycète) à  type Fusarium, Scedosporium ou autres à Type champignons levuriformes

GIEMSA GROCOTT PAS

Valeur de la culture

Champignons filamenteux

Levures

Durée d’incubation

3 semaines 8 jours

Milieu Tube et milieu de Sabouraud + antibiotiques

Boites de pétri Milieux chromogènes

Température 30°C 30°-37°C

OPTIMISER LA MISE EN CULTUE

Prélèvements respiratoires non invasifs

ECBC crachat induit 1) ED et culture (Se de l’ordre de 30%) Sp ?

Prélèvements respiratoires semi invasifs

LBA 1) ED + culture (Se de l’ordre de 50% sp ?) Intérêt des tests indirects ! -  Ag GM (Galactomannane) -  PCR ?

Biopsies poumon

- aiguille trans-thoracique - trans bronchique - chirurgicale

1) ED+culture ?? 2) Histologie vs Hybridation in situ Intérêt des tests indirects ?

Biopsies Sinus ED (Se ?) ED + : culture se : 50%

Valeurs diagnostiques ?

Prélèvements sanguins

plasma sang total sérum

hémoculture 1) Ag GM 2) b 1-3 glucane 3) PCR

3 règles pour améliorer la prise en charge des IFI en hématologie ..

•  Documenter les IFI : isolement de la souche –  Infections dues à des moisissures : histologie –  ( Aspergillus, Fusarium, Scedosporium, Geosmithia sp.,

Mucorales, Alternaria sp. et autres champignons noires •  Diagnostic d’espèce précis

–  Au sein des complexes d’espèces : spectre de sensibilité aux antifongiques spécifiques

–  Résistance intrinsèque de certaines espèces •  Tester les sensibilités des souches

–  d’Aspergillus sp. (A. fumigatus) :

A votre avis ?

Aspergillus

Fusarium

Zygomycètes

Penicillium

Candida

Biopsie Culture







Spectre de sensibilité des principaux pathogènes fongiques aux ATF

Arendrup MC et coll.







Hong et al., 2008

Aspergillus

Aspergilli : Taxonomie

Genre Section Complexe d’espèces

Fumigati

Flavi

Nigri

Terrei

Nidulantes A. lentulus

N. pseudofischeri

N. udagawae

A. viridinutans

A. fumigatiaffinis

A. fumigatus

35 espèces

AmB ITC VCZ POS CAS MIC

d’après Alcazar-Fuoli L. et coll., AAC, 2008

Profils de sensibilité aux AF des Aspergillus de la section Fumigati







Aspergillus fumigatus et résistance aux antifongiques de la classe des azolés

•  1ere description souches A. fumigatus : Itraconazole R à1997, USA

•  2000 : Itra + posaconazole/ Itra + voriconazole

•  Multi azole R (Itra+Vorico+Posa)

Pourcentage de patients porteurs de souche de A. fumigatus Triazolés-R, UK vs Hollande

Denning D, AAC. 1997; Verweij P. NEJM 2007, Snelders E et col, Plos Med 2008

Chez qui ? à Pts avec une exposition à long terme aux ATF àPts exposition à court terme et pts naifs

P. Verweij et coll.,Lancet Infect Dis, 2009

Définition de seuils de sensibilité Aspergillus fumigatus1 (µg/ml)

Proposed interpretative breakpoints (MIC, mg/L) for A. fumigatus and clinically licensed, active azoles

1. Verweij, P. E., et al. 2009. Drug Resist Updat 12:141-7.

Antifongique Sensible Interm Résistant

Itraconazole < 2 2 > 2

Voriconazole < 2 2 > 2

Posaconazole < 0.5 0.5 > 0.5

Mécanismes de résistance étudiés : Mutations Cyp51A, cible des azolés

àNouveau mécanisme de résistance Mutation Facteur transcription HapE de Cyp51A GOF Camps S et col, Plos One 2012 à Nouvelles mutation dans Cyp51A

En France la mutation la plus fréquente observée chez les souches R est : TR34/L98H

Phénotype particulier : TR46/Y121F/T289A CMI vorico >16 mg/l MIC vorico> MIC Itra

Pneumocystose de l’ID: outils diagnostiques

•  Prélèvements respiratoires – Mycologique traditionnelle : Crachat induit/ LBA

•  Examen direct •  Pas de culture ++++

– PCR Pneumocystis jirovecii : (Rinçage rhino pharyngé, Crachat induit, ECBC, aspiration, PDP, LBA) Se et Sp ??? Évaluation compliquée

•  Sang : marqueur sérique non spécifique : BG

Examen direct Méthodes –  Colorations du LBA :

•  Giemsa, Gram-Weigert : mise en évidence des formes trophiques •  Gomori-Grocott, bleu de toluidine, Calcofluor white : mise en évidence

des Kystes –  IF Ac monoclonaux : Crachat induit et LBA

•  Plus sensible, différents kits •  Méthode de référence

Sensibilité –  Crachat induit IF

•  HIV sensibilité 55-66% •  Non HIV moins sensible

–  LBA++ chez non HIV •  Sensibilité 89-98% colos et IF

Thomas NEJM 2004

Gomori: paroi des kystes (Ø 4-5µm)

Giemsa: kystes � formes trophiques u

LBA : Gomori-Grocott LBA : Giemsa

PCR P. jirovecii

•  Divers prélèvements non invasifs ou semi invasifs : Rinçage rhino pharyngé, crachat induit, ECBC, aspiration bronchique, LBA

•  Sensibilité plus importante que l’IF

•  Multiples PCR maisons publiées,

–  diverses cibles (gènes multicopie ou non)

–  diverses techniques (conventionnelles, nichées, quantitative)

•  Limites: différencier colonisation et infection. Pas de généralisation possible des résultats.

F. Gangneux-Robert, JCM 2014

•  PCP avérée : charge fongique plus élevée chez les pts VIH + que chez les autres pts ID

•  Charge fongique plus élevée en cas de PCP avec ED positif en comparaison aux PCP avec ED négatif

•  La valeur du Ct ne permet pas de différencier PCP avérée et une colonisation

Interprétation PCR Pneumocystis positive dans le LBA ? N =160 patients

Diagnostic par PCR quantitative

•  PCR maison mtLSU •  238 patients ID (HIV+ = 69)

–  LBA n=163 –  Expectoration induite (EI) n=115

•  N=16 PCP « très probable »: 100% PCR+. 1 négatif IF sur EI

•  N=222 PCP « peu probable »: 13% PCR+ (30 patients, 9 VIH), tous IF-, non traités, diagnostic alternatif

•  Détermination d’un cut-off sup et inf

Alanio A. et coll Clin Microb Infect 2011

Diagnostic par PCR quantitative

Cut-off haut: -  Sensibilité 85%, spécificité 100%, -  VPP 100%, VPN 98,9% Cut-off bas : -  Sensibilité 100%, spécificité 96%, -  VPP 72%, VPN 100% Pvt en zones grise: 11/278 pvt (3,9%); 20% des PCR +

équivalents formes trophiques/ml

Alanio A. et coll Clin Microb Infect 2011

Diagnostic PCP : béta-glucane

•  Abondant dans la paroi de Pneumocystis jirovecii •  Intérêt:

–  prélèvement non invasif. Détectable dans le sang à titre élevé au cours de la pneumocystose

•  Limites: –  Egalement détecté dans les autres infections fongiques

invasives (aspergillose, histoplasmose, candidose disséminée…)

–  Faux positifs

Diagnostic PCP: béta-glucane

•  Méta-analyse : •  14 études de méthodologie diverses (statut HIV, critères

diagnostiques de pneumocystose). 2 prospectives •  exclusion des autres diagnostics fongiques •  4 méthodes de dosage commercialisées, cut off

manufactureur différent •  357 cas, 1723 contrôles

Karageorgopoulos Clin Microb Infect 2011

Karageorgopoulos Clin Microb Infect 2011

Diagnostic PCP, résumé

•  Référence: IF, sur LBA si non VIH •  Intérêt de la PCR quantitative (2 seuils ?) : standardisation

nécessaire

•  Beta-glucane: non spécifique PCP.

àIndications : prélèvement invasif impossible

•  Intérêt de l’association BG/PCR

Documents

Outils pour le diagnostic et le suivi des Infections ... · Outils pour le diagnostic et le suivi des Infections Fongiques Invasives chez les patients immunodéprimés : Patients