Persistance des dommages à l’ADN induits par une ... · 6-4 PP Photoproduit de pyrimidine (6-4) pyrimidone ADN Acide désoxyribonucléique ARN Acide ribonucléique ATM «Ataxia

Persistance des dommages à l’ADN induits par une irradiation chronique aux rayons ultraviolets B et leurs

conséquences dans le génome humain

Mémoire

Roxanne Bérubé

Maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Roxanne Bérubé, 2017

Persistance des dommages à l’ADN induits par une irradiation chronique aux rayons ultraviolets B et leurs

conséquences dans le génome humain

Mémoire

Roxanne Bérubé

Sous la direction de :

Patrick Rochette, directeur de recherche

iii

Résumé

Les rayons ultraviolets (UV) sont les principaux responsables de l’initiation des cancers cutanée, car ils induisent

différents dommages à l’ADN, dont les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPD). Ces dommages sont

principalement induits par les UVB et sont responsables de la formation des mutations trouvées les cancers

cutanés non mélanocytiques. Nos résultats ont démontré qu’une irradiation chronique à de faibles doses de

rayons UVB (CLUV) induit la formation de CPD, qui persistent dans le temps. Ces dommages résiduels

s’accumulent dans le génome et ne semblent pas être réparés. Nous nous sommes donc intéressés à ces

dommages résiduels et à leur impact dans le génome. Premièrement, la distribution post-irradiation des CPD

résiduels a été observée pour des fibroblastes dermiques humains soumis à une irradiation CLUV (75 J/m² aux

12h, durant 7,5 jours). Ces analyses ont démontré que les CPD résiduels sont tolérés et dilués dans le génome

lors des divisions cellulaires. Deuxièmement, la localisation des CPD résiduels a été observée pour les cellules

irradiées avec une CLUV et pour les cellules irradiées avec une dose unique et aigüe (400 J/m²). La

quantification des CPD résiduels a permis d’observer que pour les cellules irradiées avec une CLUV, environ

deux fois plus de CPD résiduels sont présents dans l’hétérochromatine par rapport à l’euchromatine. Pour les

cellules irradiées avec une dose aigüe, les CPD sont répartis également entre les deux fractions de la

chromatine. Ces résultats suggèrent que l’état de compaction de la chromatine a un impact sur l’accumulation

et la réparation des CPD. Troisièmement, la fréquence de chaque type dipyrimidinique de CPD résiduels a été

déterminée par la technique de LC-MS/MS. Une proportion plus faible de CPD contenant des cytosines a été

observée dans les cellules irradiées avec la CLUV par rapport aux cellules irradiées avec la dose aigüe. De

plus, l’analyse a démontré que les photoproduit de pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4 PP) étaient presque

complètement absents des dommages résiduels. Finalement, afin d’observer l’impact des CPD résiduels sur la

stabilité génomique, la quantité d’échanges de chromatides sœurs (SCE) a été comparée pour les cellules

irradiées par la CLUV et les cellules non irradiées. La quantité de SCE observée était plus élevée dans les

cellules irradiées que dans les cellules non irradiées. Globalement, nous avons observés que les CPD résiduels,

majoritairement de type TT, s’accumulent principalement dans l’hétérochromatine, où ils sont tolérés. Ces

dommages sont dilués dans le génome au fil des divisions cellulaires, en causant une augmentation de

l’instabilité génomique. Globalement, mon projet a permis de mieux comprendre l’impact des CPD résiduels

induits par une irradiation chronique dans l’initiation de la cancérogenèse cutanée.

iv

Abstract

Ultraviolet (UV) rays are known to be the main initiator of skin cancer, as they induce different types of DNA

damage, including cyclobutane pyrimidine dimers (CPD). CPD are mostly produced by UVB rays and are the

predominant premutagenic DNA damage responsible for non-melanoma skin cancers. While most CPD are

repaired by the nucleotide excision repair (NER) pathway, some remain unrepaired and persist in the genome.

We recently observed those residual CPD after exposure of human fibroblasts cells to chronic low dose of UVB

(CLUV). Then, we aimed to observe the distribution of residual CPD occurring in dividing cells submitted to

CLUV irradiation. Human dermal fibroblasts were irradiated with CLUV (75 J/m² every 12h for 7.5 days). Our

results showed that residual CPD are tolerated and diluted in the genome by DNA replication. Then, localization

of CLUV-induced residual CPD was observed and compared with residual CPD induced by a single and acute

UVB irradiation (400 J/m2). Euchromatin and heterochromatin fraction were isolated and the amount of CPD

was quantified in each fraction. The quantification showed that residual CPD accumulate mostly in the

heterochromatin fraction of the genome, where the amount of CPD was two times greater than in the

euchromatin. This suggests that DNA compaction has an impact on CPD accumulation and repair. Then, we

measured the frequency of the different types of residual CPD by LC-MS/MS technique. A lower proportion of

cytosine containing CPD was found in CLUV irradiated cells than in acute irradiated cells. The quantification of

the different types of 6-4 photoproducts (6-4 PP) demonstrated that they were almost all absent after a CLUV

irradiation, in the residual damage. Finally, genomic instability was investigated in CLUV irradiated cells by

measuring the amount of SCE induced after the irradiation. A higher number of SCE was observed in CLUV-

irradiated cells than in control cells, suggesting that residual CPD are responsible for an increase of genomic

instability. Overall, we observed that residual CPD, mostly TT-CPD, accumulate in the heterochromatin where

they are tolerated. These CPD are diluted during cellular division but they are causing genomic instability. Finally,

my project aimed to characterise residual CPD induced by chronic irradiation and to gain more knowledge on

their impact in skin carcinogenesis initiation.

v

Table des matières

Résumé .............................................................................................................................................................. iii

Abstract ............................................................................................................................................................... iv

Table des matières .............................................................................................................................................. v

Liste des figures ................................................................................................................................................. vii

Liste des tableaux ............................................................................................................................................... ix

Liste des abbréviations ........................................................................................................................................ x

Remerciements .................................................................................................................................................. xii

1. Introduction ................................................................................................................................................ 1

1.1. Spectre solaire .................................................................................................................................. 2

1.1.1. Rayonnement ultraviolet ........................................................................................................... 3

1.2. La peau ............................................................................................................................................. 4

1.3. Conséquences de l’exposition de la peau aux UV ............................................................................ 7

1.3.1. Mélanogenèse .......................................................................................................................... 7

1.3.2. Érythème cutané....................................................................................................................... 7

1.3.3. Vieillissement cutané ................................................................................................................ 8

1.3.4. Pénétrance des rayons UV dans la peau ................................................................................. 8

1.3.5. Dommages induits par les rayons UV dans la peau ................................................................. 9

1.3.6. Cancers cutanés ..................................................................................................................... 12

1.4. Mécanismes de réparations des dommages à l’ADN ...................................................................... 14

1.4.1. Réparation par excision de nucléotides .................................................................................. 15

1.4.2. Mécanismes de tolérance des dommages ............................................................................. 19

1.5. Pathologies associées à une déficience en NER ............................................................................ 21

1.5.1. Xeroderma pigmentosum ....................................................................................................... 21

1.5.2. Syndrome de Cockayne ......................................................................................................... 23

1.5.3. Trichothiodystrophie ............................................................................................................... 23

1.6. Chromatine ...................................................................................................................................... 24

1.6.1. Chromosomes et échanges de chromatides sœurs ............................................................... 25

1.6.2. Instabilité génomique .............................................................................................................. 28

1.7. Irradiations chroniques .................................................................................................................... 31

2. Objectifs ................................................................................................................................................... 33

3. Matériel et méthodes ................................................................................................................................ 35

3.1. Culture cellulaire et récolte .............................................................................................................. 36

3.2. Irradiation ........................................................................................................................................ 36

3.3. Dilution et persistance des CPD résiduels ...................................................................................... 37

3.4. Slot blot ........................................................................................................................................... 38

vi

3.5. Localisation des CPD résiduels dans le génome ............................................................................ 39

3.6. Fréquence de chaque type de dommages résiduels ....................................................................... 42

3.7. Échanges de chromatides sœurs .................................................................................................... 43

4. Résultats .................................................................................................................................................. 45



4.3. Fréquence de chaque type de dommages résiduels ....................................................................... 53


.......................................................................................................................................................................... 57

5. Discussion ................................................................................................................................................ 58



5.3. Fréquence des photo-dommages sur les différents sites dipyrimidiniques ..................................... 67


6. Conclusion ............................................................................................................................................... 75

Bibliographie ..................................................................................................................................................... 79

vii

Liste des figures

Figure 1. Spectre électromagnétique et ses catégories. .......................................................................................... 2

Figure 2. Irradiance des rayons UV, à l’extérieur de l’atmosphère et au niveau de la mer. ..................................... 4

Figure 3. Schéma de la peau. ................................................................................................................................... 6

Figure 4. Schéma de l’épiderme et du derme. .......................................................................................................... 6

Figure 5. Pénétrance des UVA et des UVB dans la peau. ....................................................................................... 9

Figure 6. Dommages directs induits par les UV. .................................................................................................... 10

Figure 7. Désamination des cytosines et des 5’-méthylcytosines dans l’ADN. ...................................................... 11

Figure 8. Réparation par excision de nucléotides. .................................................................................................. 18

Figure 9. Réparation d’une cassure bicaténaire, formation et résolution d’une jonction de Holliday. .................... 26

Figure 10. Présence d’un dommage sur l’ADN, qui bloque la fourche de réplication et mène à la formation d’une cassure bicaténaire. ...................................................................................................................................... 27

Figure 11. Caryotype d’une cellule SW480 marqué par m-FISH. ........................................................................... 30

Figure 12. Quantité de CPD résiduels induits par les régimes d’irradiation aigüe et CLUV. .................................. 46

Figure 13. Courbe de division cellulaire pour les cellules irradiées contrôles. ....................................................... 47

Figure 14. Immunocytofluorescence montrant les CPD résiduels sur les chromosomes. ...................................... 48

Figure 15. Fréquence des CPD observés sur les chromosomes lors des divisions cellulaires à la suite de l’irradiation CLUV. ................................................................................................................................................... 49

Figure 16. Quantification relative de GAPDH et de Sat2 pour les cellules irradiées avec un régime aigu et un régime CLUV, dans l’hétérochromatine et l’euchromatine. ............................................................................... 51

Figure 17. Quantification relative des CPD résiduels dans l’hétérochromatine et l’euchromatine immédiatement après les irradiations aigüe et chronique (CLUV). ........................................................................ 52

Figure 18. Pourcentage de chaque type de CPD résiduels induits par les irradiations aigüe et chronique. .......... 54

Figure 19. Pourcentage de chaque type de 6-4 PP résiduels induits par les irradiations aigüe et chronique ........ 54

Figure 20. Immunocytofluorescence d’une métaphase de cellule irradiée avec la CLUV et comportant des échanges de chromatides sœurs. .......................................................................................................................... 55

Figure 21. Pourcentage d’échanges de chromatides sœurs lors des divisions cellulaires post-irradiation, chez les cellules irradiées avec une CLUV. ............................................................................................................ 56

Figure 22. Immunocytofluorescence des chromosomes ayant incorporé le BrdU et comportant des échanges de chromatides sœurs. .......................................................................................................................... 57

viii

Figure 23. Quantification des échanges de chromatides sœurs dans les cellules ayant reçues une irradiation chronique et pour les cellules contrôles. ................................................................................................................. 57

Figure 24. Dilution des CPD résiduels dans les chromosomes des réplications post-irradiation. .......................... 62

Figure 25. Hypothèse expliquant l’accumulation des CPD résiduels dans l’hétérochromatine .............................. 66

ix

Liste des tableaux

Tableau 1. Séquences nucléotidiques des amorces forward et reverse utilisées pour les qPCR des gènes GAPDH et Sat2 ....................................................................................................................................................... 41

x

Liste des abbréviations

6-4 PP Photoproduit de pyrimidine (6-4) pyrimidone ADN Acide désoxyribonucléique ARN Acide ribonucléique ATM «Ataxia telangiectasia mutated» ATR «ATM and Rad3-related» BrdU Bromodésoxyuridine CDK2/4/7 Kinase cycline dépendante 2, 4 ou 7 CETN2 Centrin-2 ChIP Immunoprécipitation de la chromatine CLUV «Chronic low-dose of UV» CPD Dimère cyclobutylique de pyrimidine CS Syndrome de Cockayne CSA Syndrome de Cockayne du groupe de complémentation A CSB Syndrome de Cockayne du groupe de complémentation B CUL4A Cullin 4A DA Évitement des dommages DAPI 4',6-diamidino-2-phénylindole DDB1 «DNA damage-binding protein 1» DDB2 «DNA damage-binding protein 2» DDR «DNA damage response» DDT «DNA damage tolerance» DNMT1 ADN méthyltransférase 1 DSB Cassure double brin EDTA Acide éthylène diamine tétra-acétique ELISA «Enzyme-linked immunosorbent assay» ERCC1 «Excision Repair Cross-Complementation Group 1» FBS Sérum fétal bovin FISH Hybridation in situ en fluorescence GAPDH Glycéraldéhyde-3-phosphate déhydrogénase GG-NER Réparation par excision de nucléotides génomique globale H2O2 Péroxyde d’hydrogène H2SO4 Acide sulfurique H3K9ac Histone 3, lysine 9 acétylée H3K9me3 Histone 3, lysine 9 triméthylée HAT Histone acétyltransférase HCl Acide chloridrique HDAC Histone désacétylase hHR23B Homologue humain de Rad23B HLTF «Helicase-like transcripton factor» HMT Histone méthyltransférase HP1 Protéine d’hétérochromatine 1 HR Recombinaison homologue HRP «Horseradish peroxidase» IF Immunocytofluorescence LC-MS/MS Chromatographie liquide couplé à un spectromètre de masse en tandem LINE «Long interspersed elements» LMPCR «Ligation-mediated PCR» Na2PO4 Phosphate de sodium dibasique

xi

NaOH Hydroxyde de sodium NER Réparation par excision de nucléotides NH2 Groupement amine NHEJ Jonction d'extrémités non homologues nm Nanomètre NMSC Cancer cutané non mélanocytique OH Groupement hydroxyl pb paire de base PBS Tampon phosphate salin PBS-T Tampon phosphate salin et Tween-20 PCNA «Proliferating cell nuclear antigen» PCR Réaction de polymérisation en chaîne polη Polymérase eta qPCR Réaction de polymérisation en chaîne quantitative RAD6/18 Enzyme de conjugaison de l'ubiquitine E2 et E3 RPA Protéine de réplication A ROS Espèce réactive de l'oxygène Sat2 Séquence satellite répétée 2 SCE Échanges de chromatides soeurs SDS Dodécylsulfate de sodium SHPRH «SNF2 histone linker PHD RING-helicase» SINE «Short interspersed elements» SUMO «Small ubiquitin modifiers» TBS Tampon «Tris-Buffered saline» TC-NER Réparation par excision de nucléotides couplé à la transcription TFIIH «Transcription factor II H» TLS Synthèse translésionnelle Tris-HCl Tris-Hydrochloride TTD Trichothiodystrophie TTDA «TFIIH basal transcription factor complex TTD-A subunit» TTDN1 «TTD non-photosensitive 1 protein» UV Rayon ultraviolet UVA Rayon ultraviolet A UVB Rayon ultraviolet B UVC Rayon ultraviolet C UV-DDB UV-damaged DNA-binding protein XP Xeroderma pigmentosum XPA Xeroderma pigmentosum groupe de complémentation A XPB Xeroderma pigmentosum groupe de complémentation B XPC Xeroderma pigmentosum groupe de complémentation C XPD Xeroderma pigmentosum groupe de complémentation D XPE Xeroderma pigmentosum groupe de complémentation E XPF Xeroderma pigmentosum groupe de complémentation F XPG Xeroderma pigmentosum groupe de complémentation G

xii

Remerciements

Ceux qui me connaissent savent que mon parcours scolaire est un peu atypique. Après avoir arrêté d’étudier

durant quelques années, recommencer les études n’a pas été facile. Je suis extrêmement fière de l’avoir fait et

de m’être rendue où je suis présentement.

Tout d’abord, je remercie l’équipe de laboratoire du Dr Patrick Rochette. J’ai appris énormément grâce à chacun

et chacune d’entre vous. Marie-Catherine tu m’as confié une partie de ton projet qui te tenait beaucoup à cœur,

j’ai fait mon possible pour le poursuivre comme tu l’aurais souhaité. Malgré nos différences, j’ai apprécié travailler

avec toi. Je te remercie d’avoir partagé ton projet et tes connaissances avec moi.

Je remercie le Dr Thierry Douki pour sa précieuse collaboration dans notre projet.

Marie-Christine et Sébastien, merci tout simplement d’avoir été présents. Je garderai toujours de bons souvenirs

de nos discussions autour d’une bière! Je vous souhaite le meilleur dans vos projets et vos carrières respectives.

Patrick, tu as été plus qu’un directeur de recherche. Tu as été un motivateur, un guide et un mentor. Pour tous

ces rôles que tu as joués, je te remercie. Ton support et ta confiance en moi ont eu une grande part dans ma

réussite. Sans tes encouragements et tes conseils je n’y serais probablement pas arrivé. Merci.

Je tiens à remercier ma famille et mes parents pour leur support. Merci à Suzanne, Céline, Brigitte, Denise et

Alexe. Vous êtes des femmes fortes, brillantes et inspirantes. Merci à Sylvie et Denis mes parents d’avoir

longtemps cru en moi, beaucoup plus que moi-même je ne l’ai fait. Je vous remercie de n’avoir jamais cessé de

m’encourager, surtout dans les moments les plus difficiles. Votre support est inestimable. Je vous aime tous

très fort.

Frédéric. Mon amoureux, mon meilleur ami. Merci de ta patience, ton support, ton écoute. Merci de m’avoir

écouté, conseillé et d’avoir supporté mon horaire lors des irradiations. Merci pour les innombrables cafés au lit

le matin, même si je n’en ai pas toujours eu l’air, je les ai tous appréciés. Ta présence tout au long de mon

parcours a été extrêmement précieuse. Mon cœur, je t’aime.

xiii

1

1. Introduction

2

1.1. Spectre solaire

Le spectre électromagnétique produit par le soleil est composé d’une variété de longueurs d’onde qui se divisent

en plusieurs catégories (Fig 1). Les différents catégories et leurs longueurs d’ondes sont : les rayons gamma

(- de 0,01 nm), les rayons X (10 à 0.01 nm), les ultraviolet (400 à 10nm), la lumière visible (700 à 400 nm), les

infrarouges (1 mm à 700 nm), les micro-ondes (30 à 1 mm) et les ondes radios (+ de 30 mm) (Courdavault et

al. 2004, Chang et al. 2009). La majorité des longueurs d’onde qui atteignent la surface de la Terre se trouvent

dans le spectre de la lumière visible (62.7%) et dans le spectre des infrarouges (31.9%), tandis qu’un faible

pourcentage d’UV atteint la terre (5.4%) (Fig.2). Les longueurs d’onde supérieures à 290 nm atteignent la

surface terrestre, tandis que les longueurs d’onde inférieures à 290 nm sont bloquées par la couche d’ozone

(Brash 2015). Le rayonnement solaire est essentiel au développement et au maintien de la vie sur terre ; les

infrarouges réchauffent l’environnement, tandis que la lumière visible est nécessaire à la photosynthèse. De

plus, chez l’humain, le rayonnement solaire permet la régulation des cycles circadiens et la production de la

vitamine D. Toutefois, les longueurs d’onde énergétiques du rayonnement UV ont aussi des effets néfastes sur

le vivant.

Figure 1. Spectre électromagnétique et ses catégories. Le spectre électromagnétique produit par le soleil est divisé en différents types de rayonnement, selon les longueurs d’onde. En ordre croissant de longueurs d’onde; les rayons gamma (- de 0,01 nm); les rayons X (10 à 0.01 nm); les ultraviolets (400 à 10nm); la lumière visible (700 à 400 nm); les infrarouges (1 mm à 700 nm); les micro-ondes (30 à 1 mm) et les ondes radios (+ de 30 mm). Traduit de NASA's Imagine the Universe ; https://imagine.gsfc.nasa.gov/science/toolbox/emspectrum1.html.

3

1.1.1. Rayonnement ultraviolet

Trois sous-catégories divisent les rayons UV, les UVA (315 à 400 nm), les UVB (280 à 315 nm) et les UVC (100

à 280 nm). Les types de rayons UV, leurs longueurs d’onde et leur pénétrance dans la couche d’ozone sont

décrits dans la figure 2. La longueur d’onde des rayons UV est inversement proportionnelle à leur énergie, donc

plus l’énergie des ondes est grande plus leur pénétrance diminue. Donc, les rayons UVC sont les plus

énergétiques, tandis que les rayons UVA ont la plus grande pénétrance. Les UVC sont les plus dommageables

pour l’ADN, car le maximum d’absorption de l’ADN est de 260 nm et cette valeur se situe dans les longueurs

d’onde des UVC (100 à 280 nm). Avantageusement, comme le montre la figure 2, la couche d’ozone bloque

l’entièreté des rayons UVC qui n’atteignent pas la terre. La couche d’ozone permet aussi de bloquer les UVB

courts, de 280 à 290 nm (Douki et al. 2003, Brash 2015). Les rayons UVA représentent la majorité des UV qui

atteignent la terre, soit 5,1% de la lumière solaire ou 95% des UV totaux. Les UVA sont responsables de la

formation d’espèces réactives de l’oxygène, du photo-vieillissement de la peau et induisent aussi la formation

de CPD (Rochette et al. 2003, MacDonald and Roskams 2009). Les UVB causent les coups de soleil et la

formation de lésions pré-mutagènes sur l’ADN. Ces dommages à l’ADN induits par les rayons UVB seront traités

en détails plus loin dans la section 1.3.3. Toutefois, malgré leur génotoxicité, les rayons UVB sont nécessaires

à la vie humaine pour la synthèse de la vitamine D. De plus, les UVA et les UVB sont utilisés en médecine, afin

de traiter différentes pathologies, par exemple le psoriasis et le kératocône (Almutawa et al. 2013, Parker et al.

2015).

4

Figure 2. Irradiance des rayons UV, à l’extérieur de l’atmosphère et au niveau de la mer. Les rayons ultraviolets sont divisés en trois catégories, les UVA, les UVB et les UVC. Les UVA sont les moins énergétiques et pénètrent la couche d’ozone pour atteindre la terre. Les UVB sont bloqués à 90 % par l’atmosphère et la couche d’ozones, 10 % atteignent la surface de la terre. Les UVC sont les plus énergétiques, ils sont complètement bloqués par la couche d’ozone. Les longueurs d’onde inférieures à 300 nm n’atteignent pas le niveau de la mer. Données tirées de : http://lasp.colorado.edu/lisird/data/sorce_ssi_l3/

1.2. La peau

La peau est l’organe le plus grand du corps humain, elle compose environ 15% de la masse totale de celui-ci

(D'Orazio et al. 2013). Elle permet les échanges avec l’extérieur, le maintien de la température corporelle et la

conservation de l’intégrité physique et chimique de l’organisme. Elle possède un rôle primordial dans la

résistance aux agents externes pathogènes et chimiques (D'Orazio et al. 2013). La peau est composée de deux

couches distinctes, l’épiderme et le derme qui sont soutenus par l’hypoderme, la couche sous-cutanée (Fig 3).

Chacune des trois couches est composée d’un mélange hétérogène de cellules et d’autres composantes par

exemple les glandes et les nerfs (MacKie 1997, Faller et al. 2004).

L’épiderme est la couche externe, elle permet les échanges avec l’environnement et possède un épithélium

stratifié pavimenteux kératinisé. Quatre types de cellules composent l’épiderme : les kératinocytes, les

mélanocytes, les cellules de Merkel et les cellules de Langerhans. Les kératinocytes constituent 90 % des

cellules de l’épiderme, ce sont les cellules les plus abondantes et elles produisent la kératine (Forslind et al.

2004). Dans l’épiderme, les kératinocytes sont organisées en 5 couches distinctes, selon leur stade de

différenciation. Les couches se différencient par la forme et la grosseur des cellules, la présence ou l’absence

de noyau ainsi que la quantité d’expression de kératine (Tortora and Grabowski 1999). La figure 3 montre 4 des

5 couches de l’épiderme; la couche basale (SB) ; la couche épineuse (SS) ; la couche granuleuse (SG) ; la

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

350

360

370

380

390

400

Irra

dia

nce

(W

m2 /

nm

)

Longueur d'onde (nm)

Extra-atmospherique

Niveau de la mer

UVC UVB UVA

5

couche cornée (SC), la couche la plus externe. La couche cornée est composée de kératinocytes morts aussi

appelés cornéocytes. La cinquième couche, la couche claire montrée dans la figure 4 entre la couche cornée et

la couche granuleuse, est présente seulement au bout des doigts et sur les orteils (Forslind et al. 2004). Les

mélanocytes, qui produisent les pigments de mélanine, représentent environ 8 % des cellules de l’épiderme.

Ces cellules se trouvent dans la couche basale de kératinocytes. Les pigments de mélanine sont transférés aux

kératinocytes par les mélanosomes. Ce transfert permet d’obtenir la coloration uniforme de la peau (Riley and

Borovanský 2011). Finalement, les cellules de Merkel, qui sont des cellules sensorielles et les cellules de

Langerhans, qui jouent un rôle immunologique, sont trouvées dans la couche basale de l’épiderme (D'Orazio et

al. 2013). La deuxième couche cutanée, le derme est séparé de l’épiderme par une membrane basale. Le derme

est composé de tissu conjonctif, il contient les vaisseaux sanguins, les nerfs, les glandes et les follicules pileux.

Le derme comprend quelques cellules, dont les fibroblastes et certaines cellules immunitaires. Cette couche

possède un rôle important dans les réponses physiologiques. Les fibroblastes, qui permettent la synthèse du

collagène et de la matrice extracellulaire, jouent un rôle majeur dans la régénération des tissus endommagés

(Moyes and Schulte 2016, Lodish 2004). L’hypoderme, la couche la plus profonde, est composé majoritairement

de tissus adipeux. Cette couche comporte des fonctions de réserves d’énergie et d’isolation contre les pertes

de chaleur. L’hypoderme est aussi intimement lié au derme par le passage des vaisseaux sanguins, des

vaisseaux lymphatiques et des nerfs (Narayan 2009).

6

Figure 3. Schéma de la peau. La peau est constituée de deux couches, l’épiderme la couche externe et le derme, maintenus par l’hypoderme, la couche sous-cutanée profonde. SB : stratum basale/couche basale, SS : stratum spinosum/couche épineuse, SG : stratum granulosum/couche granuleuse et SC : stratum corneum/couche cornée. Traduit de Wong DJ and Chang HY, 2009.

Figure 4. Schéma de l’épiderme et du derme. L’épiderme est divisé en 5 couches, de la plus profonde à la plus en surface : la couche basale, la couche épineuse, la couche granuleuse, la couche claire et la couche cornée. Les cellules de Merkel, les cellules de Langerhans et les mélanocytes sont situés dans le derme. Traduit de http://cnx.org/contents/[email protected]:RxywCGkA@5/Layers-of-the-Skin.

Épiderme

Hypoderme

Derme

Couche granuleuse

Couche épineuse

Couche basale

Mélanocyte

Derme

Couche claire

Couche cornée

Kératinocytes morts

Granules lamellés

Kératinocytes

Cellule de Merkel

Neurone sensitif

7

1.3. Conséquences de l’exposition de la peau aux UV

L’exposition de la peau aux rayons UV induit des réponses physiologiques et des dommages, tant au niveau

tissulaire, cellulaire que moléculaire. Les premières conséquences d’une exposition à la lumière solaire, au

niveau tissulaire, sont l’apparition d’érythème et la production de mélanine (sections 1.3.1 et 1.3.2) (D’Mello et

al. 2016, Fajuyigbe and Young 2016). De plus, en réponse à une exposition solaire prolongée, il peut s’effectuer

une augmentation de la prolifération des kératinocytes, qui amène un épaississement de l’épiderme. Ensuite,

au niveau cellulaire, l’exposition solaire peut déclencher l’apoptose ou un arrêt de progression du cycle cellulaire.

Ces mécanismes servent de protection contre l’initiation des cancers cutanés UV-induits (D'Orazio et al. 2013).

Toutefois, les rayons UV induisent des dommages directs en causant des lésions sur les brins d’ADN et des

dommages indirects par l’excitation de chromophores qui forment des espèces réactives de l’oxygène (ROS).

Les ROS formés par les rayons UV endommagent les lipides, l’ADN et les protéines cellulaires (sections 1.3.4

et 1.3.5) (Fajuyigbe and Young 2016).

1.3.1. Mélanogenèse

Lors d’une exposition solaire, les mélanocytes de la couche basale de l’épiderme synthétisent les pigments de

mélanine. Ce processus se nomme la mélanogenèse. Les pigments de mélanine sont répartis dans les

kératinocytes de l’épiderme (D’Mello et al. 2016). Deux formes de mélanine sont produites, soit la phéomélanine,

un pigment jaune-rouge et l’eumélanine, un pigment brun-noir (D'Orazio et al. 2013). La couleur de la peau est

déterminée par la densité de pigments de mélanine et par le ratio phéomélanine/eumélanine. Plus les pigments

de mélanine sont dense et plus il y a d’eumélanine, plus la peau est foncée (D’Mello et al. 2016). Les différents

types de peau sont classés sur l’échelle de Fitzpatrick, selon la couleur et la réaction de la peau à l’exposition

solaire (Fitzpatrick 1988). Les pigments d’eumélanine confèrent une protection contre les expositions solaires,

car ils absorbent les UV. Les pigments de phéomélanine sont moins efficaces pour bloquer les UV et produisent

plutôt des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Donc, les individus à la peau claire sont plus susceptibles de

subir les dommages et les conséquences associés à une exposition solaire que les individus à la peau foncée

(D'Orazio et al. 2013, D’Mello et al. 2016, Fajuyigbe and Young 2016).

1.3.2. Érythème cutané

Lors d’une exposition solaire la formation d’érythème cutané, mieux connu sous le nom de coups de soleil, est

souvent visible. L’érythème cutané serait initié par la présence de CPD et est associé avec de la douleur, une

sensation de chaleur sur la peau. Quelques heures après l’exposition solaire, il se produit une dilatation des

vaisseaux sanguins et certains kératinocytes entrent en apoptose (Fajuyigbe and Young 2016). Les cellules de

la peau produisent une réponse inflammatoire, qui initie une cascade de cytokines et de neurotransmetteurs

(D'Orazio et al. 2013). Enfin, des études épidémiologiques ont démontré que la fréquence des érythèmes

8

cutanés est corrélée avec le développement de cancers cutanés, principalement des mélanomes (Dennis et al.

2008, Veierød et al. 2010, Hajdarevic et al. 2016).

1.3.3. Vieillissement cutané

Le vieillissement cutané se produit normalement au fil du temps et tous les types de peau y sont soumis. Ce

processus est caractérisé par des modifications histologiques et fonctionnelles de la peau et des cellules

épidermiques. Cependant, le vieillissement cutané est accéléré par l’exposition solaire et il est plus important

chez les individus ayant une peau claire. Le photovieillissement cutané altère les fonctions physiologiques de la

peau (Gilchrest 2013). Les rayons UV accélère le processus de vieillissement cutané par deux mécanismes

principaux. En premier, par la formation des ROS qui altèrent les composantes cellulaires et en second par

l’activation des métalloprotéinases qui dégradent le collagène de la matrice extracellulaire (Fisher et al. 2002,

Gilchrest 2013). Le vieillissement et le photovieillissement de la peau sont deux processus distincts mais qui

mènent vers une finalité similaire. Les mécanismes moléculaires de la peau sont altérés par le temps et

l’exposition solaire, menant à des pertes de fonctions structurelles et physiologiques (Fisher et al. 2002).

1.3.4. Pénétrance des rayons UV dans la peau

Tel que mentionné dans la section 1.1.1, plus l’énergie des ondes est grande plus leur pénétrance diminue. La

figure 5 montre que les UVB, pénètrent jusqu’au derme, moins profondément que les UVA qui pénètrent jusqu’à

l’hypoderme. Les UVB affectent surtout l’épiderme de la peau, en causant les coups de soleil, tandis que les

dommages causés par les UVA sont plus profonds (Maverakis et al. 2010). Les UVA sont responsables de la

formation de dommages indirects et de dommages directs, tandis que les UVB sont surtout responsables de la

formation de dommages directs à l’ADN. Les UVA induisent différents types de dommages indirects par la

formation de ROS (MacDonald and Roskams 2009). Les ROS sont formés lorsque les UVA entrent en contact

avec la peau en causant l’excitation de chromophores, telle que la mélanine et la riboflavine. Ces molécules

dans leur état moléculaire excité réagissent avec d’autres molécules et forment des radicaux libres ou des ROS

(Ryter and Tyrrell 1998, Valencia and Kochevar 2008, Shen et al. 2014). Les différents types de dommages

causés par les ROS dans les cellules sont entre autres, la peroxydation des lipides qui détruit l’intégrité des

membranes cellulaires et la formation de 8 oxo-G, une lésion à l’ADN (Slater 1982, Ryter and Tyrrell 1998,

Aruoma 1998). Les dommages directs à l’ADN causés par les UV sont représentés dans la figure 6 et présentés

dans la section 1.3.5. Lorsque les UV rencontrent un brin d’ADN ayant deux pyrimidines adjacentes, deux types

de dommages peuvent être formés, soit les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPD), et les photoproduits

de pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4 PP) (Mitchell and Nairn 1989, Cadet et al. 2015).

9

Figure 5. Pénétrance des UVA et des UVB dans la peau. Les rayons UVA pénètrent la peau profondément jusqu’à la limite supérieure de l’hypoderme, tandis que les rayons UVB pénètrent jusqu’à la surface du derme. Tiré de : http://www.sante.gouv.qc.ca/conseils-et-prevention/bronzage/.

1.3.5. Dommages induits par les rayons UV dans la peau

Les rayons UVA et UVB endommagent les composantes cellulaires de manière directe ou indirecte. Les

dommages directs sont induits sur les brins d’ADN et peuvent être précurseurs des cancers cutanés. Les

dommages indirects sont plutôt induits par l’excitation de chromophores et la formation de ROS. Les ROS

endommagent les composantes cellulaires, favorisent le vieillissement des cellules et des tissus.

1.3.5.1. Les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPD)

Les CPD sont formés par une double liaison entre les carbones 5 et 6 de deux pyrimidines adjacentes (Fig 6).

Ces liens supplémentaires causent une distorsion d’environ 7 à 9° dans le brin d’ADN. Quatre types de CPD

peuvent être retrouvés dans l’ADN, selon les deux pyrimidines qui les composent, i.e. CC, CT, TC et TT. Les

CPD les plus fréquemment induits par les UV sont composés de deux thymines (TT) (Cadet et al. 2005). Les

quatre types de CPD sont formés du plus fréquent au moins fréquent selon l’ordre suivant : TT˃TC˃CT˃CC

(Douki and Cadet 2001). De plus, les CPD sont formés plus fréquemment que les 6-4 PP dans un ratio d’environ

3 : 1. La formation des différents types de CPD ou des 6-4 PP dépend de plusieurs facteurs, dont la séquence

d’ADN, l’état de compaction de la chromatine et les longueurs d’onde de l’exposition (Zavala et al. 2014). Les

CPD contenant des cytosines sont mutagènes, lorsqu’ils ne sont pas réparés, ils peuvent causer une mutation

de transition C→T ou CC→TT. Les mutations C→T ou CC→TT, sur les sites dipyrimidiniques, sont connues

en tant que mutations signatures des UV et elles sont trouvées dans les cancers de la peau non mélanocytiques,

particulièrement sur le gène p53, un gène suppresseur de tumeur (Brash 2015).

10

Figure 6. Dommages directs induits par les UV. Lorsque les UV rencontrent deux pyrimidines adjacentes sur l’ADN, par exemple deux thymines, il y a formation de dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPD) et de photoproduits de pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4 PP). Adapté de Liu et al., 2015, avec la permission de PCCP Owner Societies. (Liu et al. 2015).

Tel que démontré par la figure 7, lorsqu’une cytosine contenue dans un CPD perd son groupement amine (NH2;

désamination), elle devient un uracile. L’uracile est une base normalement contenue dans l’ARN et qui s’apparie

à l’adénine. Toutefois, l’uracile n’existe pas dans l’ADN et peut être reconnue et excisée par les Uracil DNA

glycosylases, ces enzymes empêchent la formation de mutations signatures des UV (Tu et al. 1998, Sang et al.

2015). Les cytosines de l’ADN peuvent aussi être méthylées, par les méthyltransférases, devenant des 5’-

méthylcytosines. La méthylation de l’ADN est un processus épigénétique impliqué dans le contrôle de la

transcription génique et est une marque à la fois héréditaire et influencée par l’environnement (Sadakierska-

Chudy et al. 2015). Lorsque les 5’-méthylcytosines subissent une désamination spontanée, elles deviennent

alors des thymines. Une fois la cytosine transformée en thymine, il y a un mésappariement de bases, puis la

mutation est formée lors de la réplication cellulaire subséquente.

La désamination des cytosines est un phénomène naturel et spontané dans l’ADN, mais la rapidité de la

transformation peut varier. Normalement, une cytosine contenue dans l’ADN double brin se désamine tous les

30 000 ans, à 37 °C (Frederico et al. 1990, Pfeifer 2000). Le temps de désamination d’une 5’-méthylcytosine se

situe autour de 2000 ans (Shen et al. 1994). Par contre, lorsque les cytosines sont contenues dans un CPD le

temps de désamination se situe plutôt entre 2 et 200 h et pour des 5’-méthylcytosines contenues dans un CPD,

le temps de désamination est de quelques heures (Mitchell 2000, Rochette et al. 2009). De plus, les 5’-

méthylcytosines ont un maximum d’absorption qui est supérieur aux cytosines et qui se rapproche encore plus

des longueurs d’onde des UVB. De ce fait, les 5’-méthylcytosines sont les molécules de l’ADN les plus sensibles

à la formation de CPD et de mutations signatures des UV (Pfeifer et al. 2005, Rochette et al. 2009, Chavez et

al. 2011). Dans les cellules humaines, 3 à 6 % des cytosines peuvent être méthylées, cependant lorsque les

cytosines sont suivies d’une guanine, le pourcentage de probabilité de méthylation des cytosines augmente

11

jusqu’à 70 à 80 % (Pfeifer and Besaratinia 2012, Sassa et al. 2016). La méthylation des cytosines est un

processus épigénétique qui permet la répression de l’expression génique, elle est retrouvée en majorité dans

l’hétérochromatine et résulte de l’activité des ADN méthyltransférases 1 (DNMT1), elles-mêmes activées par la

protéine d’hétérochromatine 1 (HP1) (Sadakierska-Chudy et al. 2015).

Figure 7. Désamination des cytosines et des 5’-méthylcytosines dans l’ADN. Lorsque la cytosine perd son groupement amine, elle devient un uracile, tandis qu’une 5’-méthylcytosine qui perd son groupement amine devient une thymine. Adapté de Chavez et al., 2011.

12

1.3.5.2. Photoproduits de pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4 PP)

La figure 6 présente la conformation des 6-4 PP, ceux-ci sont formés lorsque les UV forment une liaison

covalente entre le carbone 6 d’une pyrimidine et le carbone 4 de la pyrimidine adjacente (Mitchell and Nairn

1989). Cette liaison crée une distorsion dans l’ADN d’environ 44°, qui empêche le passage de la majorité des

ADN polymérases et freine la réplication cellulaire. Le potentiel mutagène des 6-4 PP a été observé chez la

bactérie E. coli. Cependant, peu d’études ont documenté l’impact des 6-4 PP dans le processus de

cancérogenèse cutané dans les cellules humaines, car la réparation de ces dommages est très rapide et les 6-

4 PP arrêtent la réplication cellulaire (Perdiz et al. 2000).

1.3.6. Cancers cutanés

Les cancers cutanés non mélanocytiques sont les plus fréquemment diagnostiqués, au Canada environ 28 %

des nouveaux cancers diagnostiqués (Agence de la santé publique du Canada, 2014). Les personnes les plus

susceptibles de développer un cancer cutané sont les individus ayant une peau claire. Ils sont représentés par

les types de peau 1 et 2 sur l’échelle de Fitzpatrick. Depuis longtemps, il est connu que le rayonnement UV est

le facteur principal dans la cancérogenèse cutanée, plus particulièrement les rayons UVB (Fartasch et al. 2012,

Pfeifer and Besaratinia 2012). La tumorigenèse cutanée est initiée lorsqu’un dommage UV-induit sur l’ADN

cause la formation d’une mutation sur un des gènes régulateurs de la cellule, par exemple un suppresseur de

tumeur ou un oncogène. Une mutation sur ces gènes peut affecter les processus de division cellulaire ou

d’apoptose, en favorisant la survie cellulaire et l’accumulation de mutations subséquentes. La régulation de

plusieurs voies cellulaires peut aussi être modifiée. Les cellules mutantes, n’ayant plus de mécanismes de

régulation de la division cellulaire, se multiplient et se différencient de manière incontrôlée, initiant la progression

tumorale (Seebode et al. 2016). Quatre facteurs déterminent la probabilité d’apparition de mutations UV-induites

et leur capacité à induire la cancérogénèse ; la fréquence des dommages ; la rapidité de la réparation ; le taux

d’erreurs des polymérases ; la sélection des mutations (Hanahan and Weinberg 2011).

1.3.6.1. Mélanome

Les cancers cutanés se divisent en deux catégories les mélanomes et les cancers non mélanocytiques. Les

mélanomes cutanés proviennent de la transformation maligne des mélanocytes de l’épiderme. Ce type de

cancer se développe le moins fréquemment que les autres types de cancers cutanés, mais cause le plus haut

taux de mortalité. Les mélanomes sont responsables de 75 % des cas de décès reliés aux cancers cutanés,

cependant ils comptent pour moins de 1 % des cancers cutanés (Skin cancer foundation, 2017). La plupart du

temps, ces tumeurs sont résistantes aux traitements de radiothérapie et chimiothérapie en plus d’être souvent

propice à la formation de métastases (Volkovova et al. 2012). Quatre types de mélanome peuvent se

développer, dont le plus commun chez les caucasiens est le mélanome superficiel extensif. Il se développe

13

majoritairement sur le haut du dos chez l’homme, sur le haut du dos et les jambes chez la femme. Le second

type est le mélanome nodulaire qui peut se développer n’importe où sur le corps et est de couleur variable,

parfois sans mélanine. Le troisième est le mélanome de type lentigo malin et le quatrième est le mélanome

lentigneux acral. L’épaisseur de la tumeur est généralement lié au pronostique, plus celle-ci est épaisse plus le

pronostique risque d’être défavorable, principalement dû à la possibilité de métastases. Plusieurs facteurs sont

responsables de l’initiation des mélanomes cutanées, par exemple les UV, l’hérédité et l’environnement. Parmi

ces facteurs, les UV ont reçus beaucoup d’attention durant les dernières années. Le lien entre les rayons UV

les cancers mélanocytiques est moins bien définis que pour les cancers non mélanocytiques, toutefois certaines

études épidémiologiques ont démontrées qu’une exposition au rayonnement solaire, ayant causée des coups

de soleil fréquents, chez les individus en bas âge jusqu’à l’adolescence est liée à une augmentation de la

probabilité de développer un mélanome plus tard (Pfeifer and Besaratinia 2012). D’autres études auraient

rapporté un lien entre l’exposition intermittente et l’initiation de mélanomes, tout en rapportant l’inverse pour

l’exposition chronique (Chang et al. 2009). Enfin, plusieurs études ont montrés la présence de mutations

signature des UV sur des gènes suppresseur de tumeurs ou oncogènes dans les cellules de mélanomes cutanés

(Hodis et al. 2012; Krauthammer et al. 2012; Michael et al. 2012; Brash 2015; Premi and Brash 2016, Premi and

Brash 2016).

1.3.6.2. Cancers non mélanocytiques

Les cancers cutanés non mélanocytiques (NMSC) sont divisés en deux catégories, selon le type de cellules

dans lesquelles ils sont initiés. Les carcinomes basocellulaires prennent naissances dans les kératinocytes

basaux de l’épiderme, tandis que les carcinomes spinocellulaires sont initiés dans les cellules squameuses de

l’épiderme. Heureusement, les taux de mortalité et les probabilités de métastase associés à ces types de

cancers sont très bas. La formation des NMSC s’observe sur les régions corporelles fréquemment exposées au

rayonnement solaire, 95 % des carcinomes basocellulaires se forment sur le tronc, la tête et le cou. Ce type de

lésion se présente généralement sous plusieurs formes, dont le carcinome basocellulaire nodulaire qui est

arrondie, rose et perlé, le carcinome basocellulaire superficiel qui est une plaque érythémateuse, semblable à

l’eczéma et le carcinome basocellulaire morphéiforme d’apparence cireuse semblable à une cicatrice

blanchâtre. Peu de carcinomes basocellulaires forment des métastases. Les carcinomes spinocellulaires se

forment aussi sur les régions exposées au rayonnement solaire et sont plutôt sous forme d’ulcères. Ces deux

types de cancers cutanés se traitement aisément par chirurgie et le taux de rémission est élevée (Griffin et al.

2016).

Plusieurs facteurs favorisent le développement des NMSC, dont la peau de couleur pâle, une prédisposition

génétique et une exposition fréquente aux UV (Griffin et al. 2016). Depuis longtemps, les études

épidémiologiques ont reliées l’initiation des NMSC avec l’exposition aux rayons solaires (Urbach 1980, Harris et

14

al. 1987), ensuite différentes études ont confirmées le rôle des UV dans l’initiation de la carcinogenèse cutanée

à l’aide de souris exposées aux rayons UV (de Gruijl and Forbes 1995, Mitchell et al. 1999, van Kranen and de

Gruijl 1999). Finalement, l’initiation des cancers cutanés chez l’humain, à la suite d’une exposition aux UV, a

été observée au niveau moléculaire par D.E. Brash et son équipe. Ils ont observés que les cellules des NMSC

contiennent majoritairement des mutations signatures des UV sur le gène p53, (Brash et al. 1991, Pierceall et

al. 1991, Urbach 1997, Brash 2015, Seebode et al. 2016). De plus, il a été démontré que toutes les séquences

CpG du gène p53 sont méthylés, favorisant la formation de CPD et des mutations associées (Pfeifer 2006).

De nos jours, l’initiation des cancers cutanés non mélanocytiques est attribuée à l’exposition chronique aux

rayons UV, principalement à l’exposition aux UVB. Les travailleurs extérieurs, par exemple les pêcheurs et les

fermiers, sont exposés régulièrement au soleil et subissent les conséquences de cette exposition fréquente et

prolongée. Plusieurs études épidémiologiques ont démontrées qu’il existe une relation positive entre l’exposition

chronique aux rayons UV solaires et la formation de NMSC (Weihrauch et al. 2002, Fartasch et al. 2012).

1.4. Mécanismes de réparations des dommages à l’ADN

Une variété d’agents génotoxiques peuvent endommager l’ADN. Certains des dommages induits peuvent initier

l’apoptose afin de prévenir la transformation cellulaire, lorsque ces dommages ne sont pas réparés. Les cellules

ont acquis une voie globale de réponse aux dommages à l’ADN (DDR), qui module les mécanismes de réponse

cellulaire selon le type de dommage détecté. La DDR est activée par deux protéines principales, les kinases

ATM et ATR. La première protéine, ATM, est principalement activée par la présence de cassures doubles brins

(DSB) sur l’ADN. La seconde protéine, ATR, est généralement activée par la protéine RPA fixée sur l’ADN

simple brin, lors de la réparation des DSB et lors des arrêts de fourche de réplication (Matsuoka et al. 2007).

Les dommages induits par l’exposition aux rayons UV activent les voies de la DDR en stimulant l’activation de

la protéine ATR. Cette dernière est activée par la présence d’arrêts de fourches de réplication et certaines

évidences suggèrent que l’activation d’ATR pourrait être faite directement par la liaison de la protéine avec les

6-4 PP (Costa 2003). Une fois activée la protéine ATR phosphoryle la protéine p53, un suppresseur de tumeur

qui agit en tant que facteur de transcription spécifique. La protéine p53 est activée par une variété d’agents

génotoxiques, en plus des rayons UV, pour maintenir la stabilité génomique. Elle permet, entre autres, le

contrôle du cycle cellulaire par l’inhibition des cyclines CDK2 et CDK4 (Seo and Jung 2004, Jin and Levine

2001). L’arrêt du cycle cellulaire est initié par p53 et est nécessaire pour la réparation des dommages UV-induits.

La réparation de ces dommages est faite par la réparation par excision de nucléotides (NER) (voir section 1.4.1

pour les détails). La protéine p53 permet de retarder la division cellulaire pour permettre la réparation des

dommages par les protéines de la NER. De plus, la protéine p53 est essentielle dans le processus de réparation,

15

car elle agit directement sur la transcription de certaines protéines impliquées dans les premières étapes de la

NER (Adimoolam and Ford 2003).

1.4.1. Réparation par excision de nucléotides

Chez l’humain, les CPD et les 6-4 PP induits par les UV sont réparés par la NER, qui est le principal mécanisme

de réparation des dommages causant une distorsion de l’ADN. La réparation par excision de nucléotides est

divisée en deux voies, qui se différencient par la première étape, la reconnaissance du dommage. La première

voie, est la NER génomique globale (GG-NER) et la seconde voie est la NER couplée à la transcription (TC-

NER). La TC-NER répare les dommages rencontrés lors de la transcription génique seulement, donc sur le brin

transcrit des gènes actifs, alors que la GG-NER répare sur toutes les autres régions d’ADN du génome. Ensuite,

les étapes subséquentes à la reconnaissance du dommage sont les mêmes pour les deux voies (Costa 2003,

de Lima-Bessa et al. 2008).

1.4.1.1. NER couplée à la transcription (TC-NER)

La TC-NER est initiée lorsque l’ARN polymérase II est bloqué par la distorsion des dommages UV-induits sur

l’ADN. L’arrêt de la polymérase permet le recrutement d’un complexe de protéines qui contient les protéines

CSA et CSB. La protéine CSB est un remodeleur de la chromatine de la famille SWI2/SNI2 et elle se fixe au

dommage. La protéine CSB interagit directement avec la polymérase II bloquée pour recruter la protéine CSA

sur le site du dommage. La protéine CSA forme un complexe avec les protéines DDB1 et Cul4A. Ces deux

protéines forment aussi un complexe présent dans la GG-NER, où elles sont associées avec la protéine DDB2

(Costa 2003, Groisman et al. 2003, Reed 2011).

1.4.1.2. NER génomique globale (GG-NER)

La reconnaissance des dommages de la GG-NER débute par le complexe UV-DDB, qui scrute le génome. Ce

complexe comprend les protéines DDB1, DDB2 et Cul4A (Osakabe et al. 2015). Lorsque le complexe UV-DDB

rencontre un dommage UV-induit, il se lie au brin d’ADN et facilite le recrutement d’un second complexe de

protéine. Ce complexe contient les protéines XPC, hHR23B et CETN2 et il se lie au brin d’ADN opposé au

dommage. Ensuite, la protéine XPC recrutement le complexe TFIIH et les protéines hHR23B et CETN2, qui

favorisent l’action de XPC et empêchent sa dégradation (Krasikova et al. 2012). Puis, DDB2 permet le

recrutement de Cul4A pour former le complexe CRL4DDB 2. CUL4 est une ubiquitine ligase activée par sa liaison

avec la protéine DDB2. Une fois activée, cette enzyme permet l’ubiquitination des histones H2A, H3, H4, et des

protéines DDB2 et XPC (Wang et al. 2006). L’ubiquitination des histones facilite l’ouverture de la chromatine en

diminuant l’affinité entre les histones et probablement en les évinçant du site endommagé (Wang et al. 2006,

Reed and Gillette 2007). Puis, l’ubiquitination des protéines DDB2 et XPC, permet leur détachement du brin

16

d’ADN, la dégradation de DDB2 par le protéasome et la relocalisation d’XPC (Sugasawa et al. 2005, Matsumoto

et al. 2015). La poursuite des étapes de la NER est possible lorsque les deux protéines sont détachées, cédant

l’espace pour la liaison des autres protéines de la NER. La protéine p97, une ségrégase ubiquitine-dépendante,

permet la synchronisation entre le retrait de DDB2, d’XPC et l’arrivée des protéines subséquentes (Ruthemann

et al. 2016).

La protéine DDB2 est requise pour la reconnaissance des CPD, par contre DDB2 n’est pas nécessaire pour la

reconnaissance des 6-4 PP (Tang et al. 2000, Itoh et al. 2004). La protéine XPC reconnait tous les dommages

causant une distorsion de l’ADN, mais est le facteur de reconnaissance principal des 6-4 PP. Les CPD causent

une faible distorsion à l’ADN (~7°) et sont plus difficilement reconnu par XPC, d’où l’importance de DDB2, qui

est plus spécifique aux CPD et facilite leur réparation (Moser et al. 2005). L’étape de reconnaissance est

limitante et ralentie la GG-NER en comparaison à la TC-NER (Gillet and Scharer 2006, Hanawalt and Spivak

2008, Scharer 2013).

1.4.1.3. NER : voie commune

La voie commune de la NER débute par le complexe TFIIH, qui est recruté sur le site de la lésion (Compe and

Egly 2016). Ce complexe comprend 10 protéines, dont XPB, XPD et la kinase cycline-dépendante 7 (CDK7)

(Adamczewski et al. 1996). La kinase permet la phosphorylation de plusieurs substrats, particulièrement la

polymérase II, puis les hélicases XPB et XPD permettent l’ouverture des brins d’ADN, soit 3’ → 5’ et 5’ → 3’

respectivement. La protéine XPA est recrutée ensuite, elle sert d’ancrage et de stabilisateur aux deux protéines

subséquentes, soit XPG et XPF (Feltes and Bonatto 2015). Ces deux protéines sont des endonucléases qui

procèdent au clivage du brin endommagé. La protéine XPF forme un complexe avec ERCC1, celui-ci performe

l’incision sur l’extrémité 5’ du brin d’ADN et laisse un groupement hydroxyl (OH) permettant à l’ADN polymérase

de débuter la synthèse du nouveau brin (Fisher et al. 2011). La protéine XPG incise le brin d’ADN sur l’extrémité

3’, environ 15 à 24 nucléotides plus loin. La synthèse du brin d’ADN se fait par une polymérase, Pol δ ou Pol ε,

guidée par PCNA (Wakasugi et al. 1997, Reardon et al. 1997). Finalement, la liaison du brin d’ADN à l’extrémité

5’ est faite par l’ADN ligase I (Costa 2003, Feltes and Bonatto 2015).

1.4.1.4. Efficacité de la NER

La NER ne répare pas les 6-4 PP et les CPD au même rythme. L’équipe de Courdavault et al. (2004) a analysé

la réparation des CPD de type TT et TC et des 6-4 PP de type TT et TC. Ils ont observés que les 6-4 PP étaient

réparés plus rapidement que les CPD. Ils ont aussi observés qu’à la suite d’une irradiation avec une dose aigüe

(500 J/m2 d’UVB), 90 % des 6-4 PP étaient réparés 24 h après l’irradiation, tandis qu’environ 60% des CPD

étaient toujours présents dans les cellules et ce jusqu’à 72 h après l’irradiation. Toutefois, lorsque la dose d’UV

était faible, soit 50 J/m2 d’UVB, la quantité de CPD restante était inférieure à 20 %, 72 h après l’irradiation. Il est

17

possible que la distorsion plus importante des 6-4 PP favorise leur reconnaissance par la NER, accélérant leur

réparation. De plus, il est mentionné dans l’article de Courdavault et al. (2004) que le type de dommage n’a

aucune influence sur la réparation, mais que la dose d’UV a un impact sur la rapidité de réparation des CPD,

mais pas sur les 6-4 PP. La réparation des CPD est plus lente à la suite d’une forte dose d’UV, ce qui pourrait

être dû à la saturation des protéines de la NER. Sachant que la protéine DDB2 est nécessaire à la réparation

des CPD mais ne l’est pas pour la réparation des 6-4 PP, il est probable que ce soit la saturation de cette

protéine qui cause un ralentissement de la réparation des CPD induits par une forte dose d’UVB (Courdavault

et al. 2004).

Une seconde étude plus récente sur la réparation des CPD dans le génome a démontré des résultats un peu

différents de ceux de l’équipe de Courdavault et al. (2004). Ces résultats démontrent une tendance très similaire

mais une réparation plus rapide. L’équipe de Mouret et al. (2008) a analysé la vitesse de réparation des quatre

types de CPD avec la technique de HPLC-MS/MS, dans des fibroblastes exposés à une irradiation aigüe de

200 J/m². Ils ont démontré que les CPD de type TT étaient réparés les plus lentement et que les CPD de type

CT étaient réparés les plus rapidement. La moitié des CPD de type TT étaient réparés en 48 h, tandis qu’environ

90 % de CPD de type CT étaient réparés en 48 h. Il est suggéré que la différence de vitesse de réparation entre

les types de CPD peut être due à la structure des dommages ou à la séquence de base du dommage, soit que

les CPD ayant une cytosine en 5’ se réparent plus rapidement que les CPD ayant une thymine en 5’ (Mouret et

al. 2008).

Enfin, une troisième étude de la réparation des CPD dans le génome, s’est plutôt intéressée à la réparation des

dommages selon la région chromatinienne. L’étude de Rochette et Brash (2010) a démontré que la réparation

des CPD était inexistante dans les régions télomériques de l’ADN. La réparation des CPD sur les télomères a

été comparée à la réparation des CPD sur les gènes p53 et 28S. Le gène p53 est un gène constitutif, il est

continuellement transcrit, donc peut être réparé par la TC-NER et par la GG-NER. Le gène 28S, une séquence

d’ADN ribosomal, est transcrit par l’ARN polymérase I, donc n’est pas réparé par la TC-NER qui est initiée par

l’arrêt de l’ARN polymérase II (Fig. 8). Les résultats de cette étude ont démontrés l’absence de réparation dans

les télomères et l’efficacité de réparation des régions transcrites (Rochette and Brash 2010).

Donc, la réparation des CPD et l’efficacité de la NER dans le génome dépend de plusieurs facteurs, dont le type

de dommages sur l’ADN, la dose d’UV et la région endommagée du génome. Les analyses de réparation des

CPD par la NER doivent tenir compte des types de dommages induits, du type et l’intensité de l’irradiation et de

la région du génome analysée, afin d’être le plus exactes possible.

18

Figure 8. Réparation par excision de nucléotides. Les étapes de la NER sont la reconnaissance du dommage, la vérification, l’excision du brin endommagé et la synthèse du nouveau brin. Seule l’étape de reconnaissance permet la différenciation entre les voies de la GG-NER et de la TC-NER. Tiré de (Lans et al. 2012).

19

1.4.2. Mécanismes de tolérance des dommages

Certaines lésions à l’ADN induites par des agents génotoxiques, comme les UV, ne sont pas réparées et

persistent dans le génome. Ces lésions interfèrent avec plusieurs processus cellulaire, dont la transcription des

gènes et la réplication de l’ADN lors de la phase S du cycle cellulaire (Saugar et al. 2014). Les dommages

interfèrent avec ces processus en bloquant la progression des polymérases réplicatives et transcriptionnelles.

En bloquant la polymérase réplicative, les dommages peuvent causer une régression de la fourche de

réplication. L’instabilité génomique est une des conséquences négatives des régressions et arrêts de la fourche

de réplication (Atkinson and McGlynn 2009). Toutefois, certains mécanismes permettent aux cellules de

contourner les dommages en poursuivant la réplication, ce sont les mécanismes de tolérance des dommages

(DDT) (Branzei and Szakal 2016). Malgré l’avantage réplicatif et la stabilité génomique qu’ils confèrent aux

cellules, ces mécanismes peuvent favoriser la formation de mutations. Deux mécanismes de tolérance des

dommages sont utilisés par les cellules eucaryotes et ils sont contrôlés par les voies RAD6/RAD18, qui sont des

voies homologues de la levure retrouvées chez l’humain (Hoege et al. 2002). La régression de la fourche de

réplication amène la formation d’ADN simple brin, qui est reconnue et enrobée par la protéine RPA. Les

protéines RPA liés à l’ADN permettent le recrutement des ubiquitines ligases RAD18 et RAD6, qui forment un

complexe. Ces protéines ajoutent un groupement ubiquitine sur PCNA, un anneau coulissant qui parcourt l’ADN

avec les polymérases (Hedglin and Benkovic 2015). L’initiation des voies de la tolérance des dommages est

faite lorsque PCNA est modifiée par l’ubiquitine. L’ajout d’une mono ubiquitination sur PCNA, recrute les

protéines de la synthèse translésionnelle, tandis que la polyubiquitination de PCNA recrute la voie de l’évitement

des dommages (Baynton and Fuchs 2000). De plus, le processus d’ubiquitination est réversible, à la suite de la

synthèse de l’ADN autour du dommage les modifications de PCNA sont retirées et les polymérases réplicatives

poursuivent le processus de réplication (Saugar et al. 2014).

1.4.2.1. Synthèse translésionnelle

La synthèse translésionnelle (TLS) est un mécanisme de contournement des dommages effectué par les

polymérases des familles A, B, X et Y. Ces polymérases ont un site actif plus permissif, c’est-à-dire, qu’elles

peuvent poursuivre la synthèse de l’ADN en passant par-dessus le dommage (Gening 2011). Elles ne sont pas

freinées par la présence de CPD sur l’ADN. Toutefois, leur niveau de fidélité peut être moins élevé que les

polymérases réplicatives, certaines sont dites fidèles tandis que d’autres peuvent être mutagènes. De plus, les

polymérases translésionnelles sont recrutées selon les dommages présents (Baynton and Fuchs 2000, Knobel

and Marti 2011). La polη a été la première identifiée, grâce à son rôle dans une pathologie qui rend la peau

extrêmement sensible aux UV et favorise la cancérogénèse. La polη est une polymérase translésionnelle fidèle

et elle permet la synthèse de l’ADN, lorsque cette dernière est endommagée par les CPD (Voir section 1.5.1).

20

Donc, la polη est un mécanisme efficace et précis de tolérance des dommages d’ADN en présence de CPD et

possède un rôle important dans la protection contre les mutations UV-induites (Prakash et al. 2005).

1.4.2.2. Évitement des dommages

La voie de l’évitement des dommages (Damage avoidance; DA) est activés par les protéines de la voie

RAD6/RAD18, qui permet la polyubiquitination de PCNA à l’aide des protéines HLTF et SHPRH. La

polyubiquitination de la lysine 63 recrute les protéines de la DA, à l’instar de la polyubiquitination de la lysine 48

qui stimule la dégradation de PCNA par le protéasome (Hoege et al. 2002). Les voies moléculaires complètes

du fonctionnement de la DA sont encore mal connues, ainsi que les conditions nécessaires à son recrutement.

Il est suggéré que la polyubiquitination de PCNA permet le retrait des polymérases de la TLS et réplicatives du

brin d’ADN, créant l’espace pour les protéines de la DA. De plus, PCNA servirait de plate-forme de recrutement

pour les protéines de la DA. La DA est une voie de tolérance des dommages fidèle, elle ne fait pas d’erreur de

synthèse (Dana et al. 2008). Elle parvient à accomplir la réplication de l’ADN en évitant d’utiliser le brin

endommagé comme modèle. Le brin modèle utilisé pour la synthèse de l’ADN est plutôt le brin nouvellement

synthétisé de la chromatide sœur opposée. Le processus est similaire à la recombinaison homologue et

engendre des jonctions entre les chromatides sœurs, donc une possibilité d’échanges de chromatides sœurs

(Saugar et al. 2014). Étant donné sa capacité à répliquer l’ADN de manière fidèle, il serait logique de croire que

la voie de l’évitement des dommages est la plus fréquemment utilisée par les cellules humaines. Toutefois, une

étude récente a démontré que la voie de la TLS est préférentiellement utilisée pour contourner les dommages

causés par les rayons UV (Izhar et al. 2013, Saugar et al. 2014). Plus d’études sont nécessaires afin de bien

comprendre les voies moléculaires qui déterminent le choix d’une ou l’autre des voies de la tolérance des

dommages. Enfin plusieurs facteurs pourraient être déterminants pour le recrutement de cette voie alternative,

par exemple le type de dommages et le stade du cycle cellulaire (Gonzalez-Huici et al. 2014).

21

1.5. Pathologies associées à une déficience en NER

Il existe une quinzaine de pathologies génétiques associées à des dysfonctionnements des voies de réparation

de l’ADN. Parmi celles-ci, trois sont associées à l’exposition aux UV et à des dysfonctions de la NER. Ces

pathologies sont le Xeroderma pigmentosum (XP), le syndrome de Cockayne (CS) et la trichothiodystrophie

(TTD).

1.5.1. Xeroderma pigmentosum

La pathologie Xeroderma pigmentosum se caractérise par une hypersensibilité à l’exposition aux rayons UV

L’initiation de la pathologie s’observe par une apparition d’éphélides (taches de rousseur), puis un changement

de pigmentation sur les régions exposées à la lumière solaire. Ensuite, la pathologie cause une perte d’élasticité

de la peau et la formation de plusieurs cancers de la peau. Des anomalies des yeux et du système nerveux

peuvent survenir chez les patients les plus sévèrement atteints et touchent environ 20 % de ceux-ci. Toutefois,

il est possible de minimiser les symptômes de la pathologie des personnes atteintes en évitant l’exposition au

rayonnement solaire, particulièrement aux rayons UV, dès le plus jeune âge. La pathologie provient de mutations

génétiques et la sévérité de la maladie dépend de l’impact de la mutation sur l’état de la protéine synthétisée. Il

existe huit variantes de la maladie Xeroderma pigmentosum, chacune caractérisée par des défectuosités dans

une des protéines de la NER (Lehmann 2003).

Tout d’abord, la protéine XPA est comprise dans les deux voies de la NER, soit la TC-NER et la GG-NER. La

protéine XPA est essentielle au fonctionnement adéquat de la NER, elle ne possède pas d’activité enzymatique

propre, mais sert d’échafaudage et stabilise les autres composantes de la NER (Sugitani et al. 2014). Les

mutations du gène de la protéine XPA sont multiples et peuvent mener à la synthèse de protéines tronquées et

non fonctionnelles résultant d’un épissage alternatif. La protéine peut être fonctionnelle, mais présente en plus

petite quantité. Lorsque la protéine XPA n’est pas fonctionnelle, les phénotypes associés sont les plus sévères.

Les patients développent une formation de désordres neurologiques, leur vieillissement est accéléré et la

formation de cancers est plus fréquente. L’incidence des cancers chez les personnes atteintes d’une déficience

à la protéine XPA est environ 1000 fois plus élevée que chez les personnes ayant une protéine XPA

fonctionnelle. Certains patients souffrent d’une diminution de la conduction nerveuse, de trouble de la marche

et parfois de microcéphalie (Lehmann 2003). Ensuite, la protéine de reconnaissance des dommages XPC, une

des premières sur le site de la lésion lors de la GG-NER peut aussi être mutée et induire une hypersensibilité

aux UV. Plusieurs mutations affectent le fonctionnement de cette protéine et la majorité des mutations sont

sévères et ne permettent pas la synthèse d’une protéine fonctionnelle. Il existe tout de même des patients atteint

d’une troncation de la protéine XPC, et ceux-ci présentent les mêmes symptômes que les patients chez qui la

22

protéine est absente. Les patients atteints d’une défectuosité de la protéine XPC sont surtout caractérisés par

des problèmes de peau, ceux-ci ne présentent pas de problèmes neurologiques (Chavanne et al. 2000).

Les deux groupes de patients ayant des mutations sur les gènes des protéines XPE et XPF présentent des

symptômes plus légers. Les symptômes sont une affection de la peau légère aucun problème neurologique et

des probabilités de tumorigenèse plus tardif. Les patients du groupe XPE possèdent des mutations sur le gène

codant pour la protéine DDB2. Les études des patients XPE ont permis d’observer que la réparation des 6-4 PP

était légèrement affectée mais toujours possible, prouvant que DDB2 est nécessaire à la réparation des CPD

mais pas à la réparation des 6-4 PP (Ruthemann et al. 2016). De plus, par l’étude de ces patients, il a été montré

que DDB2 n’est pas présente dans la réparation TC-NER (Lehmann 2003). Ensuite, la protéine XPF forme un

complexe avec la protéine ERCC1, qui est responsable de l’activité endonucléase. La majorité des mutations

associées au phénotype XPF sont des polymorphismes d’un nucléotide et il en résulte d’une diminution de

l’interaction entre les protéines XPF et ERCC1. L’activité endonucléase est réduite ainsi que la réparation par

la NER chez les patients XPF, ceux-ci présentent des symptômes moins importants que les autres patients XP

(Shi et al. 2012). La protéine XPG est aussi une endonucléase, qui est recrutée au même moment que le

complexe ERCC1/XPF, elle est nécessaire à l’activité de ce complexe, en plus de servir de stabilisateur lors de

la transcription par TFIIH. Due aux multiples fonctions de la protéine XPG, qui est autant impliquée dans la

pathologie du syndrome de Cockayne que du XP. Les phénotypes associés à une déficience de cette protéine

sont des retards de développement, du nanisme et des problèmes neurologiques importants (Zotter et al. 2006).

Une protéine supplémentaire, ne faisant pas partie directement de la réparation NER, a été incluse parmi les

protéines causant une déficience XP. Cette protéine est la polymérase η (polη) et la pathologie associée est le

XPV, pour XP variant. Cette polymérase fait partie du groupe de polymérase Y, elle permet la synthèse

translésionnelle. Lorsque cette protéine est déficiente, il survient des problèmes lors de la réplication post-

irradiation, mais aucun problème lors de la réparation des dommages UV-induits (Yuasa et al. 2000). Les

patients atteints de mutations sur le gène de la polymérase η démontrent une propension à développer des

cancers cutanés (Hentosh et al. 2011). Il a été démontré que les mutations dans la polη réduisent l’efficacité de

celle-ci à contourner les dommages, donc favoriserait les mutations menant aux différents cancers cutanés

(Glick et al. 2006).

Enfin, les deux protéines XPB et XPD, comprises dans le complexe TFIIH, peuvent être responsable du

développement de la pathologie XP, lorsqu’elles sont déficientes ou défectueuses. Ces deux protéines sont des

hélicases et sont utilisées à la fois dans la TC-NER et la GG-NER. Des altérations d’une ou l’autre de ces

protéines sont responsables du développement d’un éventail de pathologies, dont le Xeroderma pigmentosum,

en plus du syndrome de Cockayne et de la trichothiodystrophie. Étant donné l’importance du complexe TFIIH

23

dans plusieurs voies cellulaires, des phénotypes pathologiques variés et associés aux différentes pathologies

sont observés lorsque TFIIH est dysfonctionnel (Lehmann 2003).

1.5.2. Syndrome de Cockayne

Le syndrome de Cockayne (CS) est causé par une déficience d’une des deux premières protéines impliquées

dans la TC-NER, soit CSA et CSB, donc un manque de réparation des dommages UV-induits sur les gènes

transcrits. Les défauts génétiques de la protéine CSB représentent environ 75% des patients atteint du

syndrome de Cockayne. Les patients atteints de ce syndrome présentent des retards de développement

mentaux et physiques, des traits faciaux spécifiques, une microcéphalie, des troubles de la marche ainsi qu’une

sensibilité accrue au rayonnement solaire. Le problème majeur avec cette pathologie provient de l’incapacité

des cellules à synthétiser l’ARN à la suite d’une exposition aux UV. Généralement, les patients présentent des

symptômes semblables, qu’ils soient atteints d’une déficience de la protéine CSA ou de la protéine CSB, les

deux étant également nécessaire au fonctionnement normal de la TC-NER (Lehmann 2003). Le développement

des cancers est plus faible chez les patients CS que chez les patients XP, ce qui pourrait être expliqué par la

diminution de la division cellulaire et par l’augmentation de l’apoptose induite par les dommages UV-induits

(Karikkineth et al. 2016). Plusieurs symptômes de la pathologie sont similaires au vieillissement humain, alors il

est de plus en plus suggéré que cette pathologie soit initiée par des dysfonctionnements mitochondriaux. Les

patients présentent des déficiences cognitives, une diminution des capacités auditives et peuvent aussi souffrir

d’hypertension précoce. De plus, des problèmes oculaires surviennent, tel que les rétinopathies pigmentaires,

caractérisés par la perte des photorécepteurs et par le dysfonctionnement de l’épithélium pigmentaire (Stevens

et al. 2001, Karikkineth et al. 2016).

1.5.3. Trichothiodystrophie

Les patients atteints de la TTD ont des cheveux secs, cassants dû à une déficience en soufre et leur peau est

sèche, épaisse, ichtyosique ou écailleuse. Ils ont aussi une petite taille, des retards mentaux, des traits faciaux

distincts et environ la moitié des gens atteints démontrent une sensibilité accrue au rayonnement solaire. Les

patients montrant une sensibilité solaire possèdent une réparation NER défectueuse, tandis que les patients

n’étant pas affectés par l’exposition solaire ont une réparation NER fonctionnelle. Les gènes mutés associés à

cette pathologie sont XPB et XPD, deux gènes permettant la synthèse de protéines de la NER. Toutefois, à

l’encontre des patients XP, les patients TTD ne présentent pas de prédisposition accrue à la cancérogenèse

cutanée (Hashimoto and Egly 2009). Deux gènes supplémentaires ont aussi été mis en cause dans le

développement de la pathologie, soit TTDA et TTDN1, des sous-unités du complexe TFIIH. Les implications de

la TTD sont multiples et varient chez les patients atteints, de plus la pathologie s’observe souvent dès la

naissance ou à un jeune âge. Cet éventail de symptômes et caractéristiques a été relié à l’importance du

24

complexe TFIIH et a ses implications dans plusieurs autres processus cellulaires, tel que la NER, la transcription

génique de base et sa régulation (Lehmann 2003, Faghri et al. 2008, Arseni et al. 2015).

1.6. Chromatine

Dans la cellule interphasique l’ADN se présente sous forme de chromatine. La chromatine permet à la cellule

de compacter l’ADN, afin de le contenir entièrement dans le noyau. La compaction de l’ADN est faite par les

histones, qui s’assemblent pour former les nucléosomes. Un nucléosome est formé d’un tétramère contenant

deux histones H3 et deux histones H4 et de deux dimères formés des histones H2A et H2B. L’ADN est enroulé

autour des nucléosomes, puis ces derniers sont reliés entre eux par l’histone H1 (Ye et al. 2017). La présence

des nucléosomes permet de diviser la chromatine en deux régions distinctes : l’hétérochromatine et

l’euchromatine. De façon générale, l’hétérochromatine est condensée et contient les gènes inactifs, qui ne sont

pas transcrits. L’euchromatine est moins dense et contient les gènes actifs, ceux qui sont transcrits pour

permettre la synthèse des protéines (Lodish 2004). Le niveau de compaction de la chromatine est régulé de

multiples façons. Principalement, la régulation de l’état de la chromatine est faite par des modifications post-

traductionnelles sur les histones. Les histones sont des protéines globulaires qui possèdent des extensions

terminales et ces extensions peuvent être modifiées par différentes enzymes (Johnstone and Baylin 2010). Ces

modifications sont généralement observées sur les résidus lysines et arginines, mais peuvent aussi être faites

sur d’autres acides aminés, par exemple la phosphorylation des sérines, les ubiquityl-lysines ou l’acide

aspartique (Alam et al. 2015). Les modifications principales des histones sont l’ajout ou le retrait de l’acétylation

et de la méthylation. Ces modifications sont effectuées par les histones acétyl-tranférases (HAT), les histones

désacétylases (HDAC) ou les histones méthyl-transférases (HMT). Les différentes modifications et leurs

combinaisons permettent l’activation ou la répression de la transcription. Ce sont des marques signalétiques

lues par des complexes enzymatiques de décompaction ou de compaction de la chromatine (Johnstone and

Baylin 2010). De plus, la quantité d’histone H1 a une influence sur la transcription génique et sur la compaction

de la chromatine, une quantité élevée d’histone H1 inhibe la transcription, tandis qu’une quantité plus faible

favorise la transcription (Kowalski 2016). Généralement, l’euchromatine est formée lorsque les histones sont

acétylés, tandis que l’hétérochromatine est formée par la méthylation des histones. La méthylation des lysines

9 et 20 de l’histone H3 empêche l’activation des gènes, par contre la méthylation des lysines 4, 36 et 79 de

l’histone 3 permet l’activation des gènes. Donc, en plus des modifications post-traductionnelles des histones, la

compaction de la chromatine est déterminé par la combinaison de ces marques et de leur localisation (Lodish

2004, Johnstone and Baylin 2010, Alam et al. 2015).

25

1.6.1. Chromosomes et échanges de chromatides sœurs

Dans le noyau de la cellule, l’ADN est disposé selon différents territoires, contenant des séquences génomiques

et des gènes spécifiques. L’ADN actif se trouve à la surface des territoires dans le noyau et chaque territoire

forme un chromosome lors de la division cellulaire. Les deux brins d’ADN sont répliqués, pour former les

chromosomes, composés de deux chromatides sœurs doubles brins. Le génome humain comprend 22 paires

de chromosomes autosomes et deux chromosomes sexuels (Lodish 2004). Les chromosomes sont composés

de deux chromatides sœurs reliés par le centromère et ils permettent la ségrégation de l’ADN entre les deux

cellules filles (Tkacz et al. 2016, Kulashreshtha et al. 2016). Cependant, il peut y avoir un échange de matériel

génétique entre les chromatides sœurs d’un même chromosome, il en résulte d’un échange entre les

chromatides sœurs (SCE). Ces derniers sont formés lorsque la réparation de l’ADN engendre la formation de

jonctions de Holliday (Fig. 9). Deux mécanismes forment des jonctions de Holliday, soit la recombinaison

homologue et la réparation des régressions de fourches de réplication (Fig. 10). Plusieurs agents mutagènes

exogènes et endogènes, tel les UV et certains polluants, causent des dommages à l’ADN et nécessitent l’une

ou l’autre de ces voies de réparation (Prakash et al. 2005). Suite à l’arrêt de la fourche de réplication, le

mécanisme de réparation utilisé est similaire à la recombinaison homologue et permet de poursuivre la synthèse

de l’ADN de manière fidèle. Une invasion du brin opposé est faite servant de brin modèle pour la synthèse de

l’ADN, engendrant la formation d’une jonction de Holliday. La formation d’un SCE sera observée si le clivage de

l’ADN de la résolution de la jonction de Holliday est fait dans un sens précis (Ma et al. 2013). Les SCE

s’observent dans la majorité des cellules en réplication, selon une fréquence d’environ 3 à 4 par cellule par

cycle, toutefois il a été observé que plusieurs facteurs augmentent cette fréquence. L’observation des SCE dans

les cellules est donc un indicateur d’instabilité génomique, qui serait causée par un agent génotoxique (Wilson

and Thompson 2007, Mourelatos 2016).

La présence de CPD sur l’ADN empêche la fourche de réplication de poursuivre, si la TLS n’intervient pas, la

fourche régresse après un arrêt prolongé et il se forme une cassure bicaténaire sur l’ADN (Fig 10) (Watson and

Berry 2009). Les cassures bicaténaires sont létales pour les cellules doivent être réparées. Lors de la réparation

de ces cassures, il se forme une jonction de Holliday, qui lors de sa résolution peut entrainer un SCE (Fig 9).

26

Figure 9. Réparation d’une cassure bicaténaire, formation et résolution d’une jonction de Holliday. Cette cassure est réparée, cependant lors de la réparation il se forme des jonctions de Holliday (HJ). Lors de la résolution de ces jonctions, il peut y avoir un échange de matériel génétique entre les chromatides d’un même chromosome, un échange de chromatide sœurs (SCE). Tiré de Watson and Berry 2009.

27

Figure 10. Présence d’un dommage sur l’ADN, qui bloque la fourche de réplication et mène à la formation d’une cassure bicaténaire. Lorsqu’un dommage, par exemple un CPD, est rencontré lors de la réplication, celui-ci bloque la fourche de réplication et cause une cassure bicaténaire sur l’ADN. Tiré de Watson and Berry 2009.

28

1.6.2. Instabilité génomique

Plusieurs mécanismes et processus cellulaires permettent la préservation de l’intégrité du génome lors des

divisions cellulaires. L’instabilité génomique survient lorsqu’un de ces mécanismes faillit et empêche une

transmission fiable du matériel génétique de la cellule mère à la cellule fille. L’instabilité génomique affecte l’ADN

sur de multiples niveaux, allant d’un changement de nucléotides, jusqu’aux modifications d’un chromosome

entier. Le maintien de la stabilité génomique débute par une réplication fiable et sans erreur de l’ADN, donc

nécessite la coordination des voies de réparation et de réplication. Plusieurs composants et voies cellulaires

peuvent initier l’instabilité génomique, qui est divisée en catégories selon les changements observés (Aguilera

and Gomez-Gonzalez 2008, Coschi and Dick 2012). Les mutations simples, telles les modifications de

nucléotides, les micro-insertions ou micro-délétions, sont regroupées dans une catégorie et sont habituellement

causées par des erreurs lors de la réplication. Ces mutations peuvent aussi être causées par des erreurs durant

la réparation par excision de bases, la réparation des mésappariements et par la synthèse translésionnelle

infidèle. La seconde catégorie contient les réarrangements de l’ADN causés par la liaison entre deux fragments.

Généralement, ils comprennent des translocations, des duplications, des inversions ou des délétions géniques,

qui sont causés par la recombinaison homologue ou la jonction d’extrémités non homologues. La troisième

catégorie d’instabilité génique comprend les défauts de réplication des séquences microsatellites et

minisatellites. Des défauts de lecture et de synthèse des séquences, lors des mécanismes de réparation de

mésappariement et de recombinaison homologue, causent des élongations ou raccourcissements des

structures répétées. Enfin, la dernière catégorie d’instabilité génomique, affecte les chromosomes, soit en entier

ou par segments (Aguilera and Gomez-Gonzalez 2008). L’aneuploïdie est formée lorsqu’une cellule subie la

perte ou le gain d’un chromosome. L’instabilité chromosomique est aussi observée lorsqu’un segment

chromosomique est ajouté ou perdu, alors les changements observés sont structurels (Coschi and Dick 2012).

Plusieurs mécanismes et voies cellulaires sont responsables du maintien de la stabilité chromosomique,

toutefois des évènements perturbateurs favorisent une augmentation de l’instabilité génomique (Ferguson et al.

2015). Premièrement, la stabilité chromosomique est maintenue, entre autres, grâce aux télomères, une

structure complexe d’ADN et de protéines, qui protègent l’extrémité de l’ADN contre les mécanismes de

réparation des cassures bicaténaires. Les télomères protègent les extrémités libres des brins d’ADN, qui sinon

seraient reconnues en tant que cassures doubles brins. Les mécanismes de recombinaison homologue et de

réparation par jonction d’extrémités non homologues seraient recrutés sur l’extrémité des chromosomes pour

former des réarrangements et des fusions chromosomiques, menant à l’instabilité chromosomique (Lu et al.

2013, Murnane 2012). Deuxièmement, lors de la division cellulaire, les centrosomes permettent le maintien de

l’intégrité génomique en contrôlant la ségrégation de l’ADN entre les deux cellules filles. Le centrosome est

responsable de l’attachement des microtubules, ces derniers guident les chromatides sœurs dans chacune des

29

cellules filles. L’instabilité génomique causée par les centrosomes provient de leur amplification ou d’une

aberration dans leur structure. Un défaut lors de la formation des centrosomes peut être causé par différents

facteurs, dont une mutation sur un des gènes régulateurs des centrosomes. Une ségrégation inégale des

chromosomes, de l’aneuploïdie et la perte de gènes suppresseurs de tumeurs résultent d’un centrosome

dysfonctionnel et mènent à une instabilité génomique (Nam et al. 2015, Lingle et al. 2005, Nigg 2006).

Troisièmement, le maintien de la stabilité et de l’intégrité génomique est maintenu par les modifications post-

traductionnelles de l’ADN et des histones, soit les mécanismes épigénétiques. Ces mécanismes sont acquis

durant la réplication et la différenciation cellulaire et contrôlent la transcription génique et la réparation de l’ADN.

Cependant, des altérations des mécanismes épigénétiques peuvent affecter les processus cellulaires qu’elles

régulent, soit la stabilité et l’intégrité génétique (Ferguson et al. 2015). De plus, les modifications des histones

et de l’ADN sont héritables, elles sont transmises entre les divisions cellulaires et les modifications indésirables

peuvent s’accumuler dans les cellules (Hanahan and Weinberg 2011, Ferguson et al. 2015).

1.6.2.1. Instabilité génomique et cancer

L’instabilité chromosomique a longtemps été perçue comme un phénotype causée par la tumorigenèse.

Cependant, selon une variété d’études récentes, l’instabilité chromosomique aurait un rôle dans l’initiation de la

tumorigenèse plutôt que d’en être une conséquence (Bond et al. 2004, Schvartzman et al. 2010, Hanahan and

Weinberg 2011, Coschi and Dick 2012). L’instabilité génomique est observée dans la majorité dans cellules

cancéreuses, où les anomalies chromosomiques sont omniprésentes. L’instabilité chromosomique peut être

observée sur un chromosome entier, causant l’aneuploïdie ou sur une séquence particulière, causant une

anomalie structurelle. Un exemple de modifications chromosomiques pouvant être trouvées dans une cellule

cancéreuse est présenté dans la figure 11. Une cellule métaphasique provenant d’un adénocarcinome du colon

(SW480), a été marquée avec la technique m-FISH. Cette cellule comprends 56 chromosomes, au lieu de 46 et

comprends des échanges de segments entre chromosomes (Rochette et al. 2005). De l’instabilité génomique

et des réarrangements chromosomiques aléatoires sont observés avant la transformation tumorale des cellules.

Ces derniers causent la formation de mutations génétiques pour certaines cellules, qui obtiennent un avantage

sélectif. Il se produit alors une expansion clonale de cellules qui accumulent une variété de mutations (Hanahan

and Weinberg 2011). Éventuellement, parmi ces mutations certaines peuvent initier la transformation tumorale

des cellules, ce sont les mutations conductrices. Différentes combinaisons de 2 à 3 mutations conductrices ont

été observées dans des cellules de peau, sans que la transformation des cellules ait été initiée. De plus, l’impact

des protéines de régulation de la chromatine aurait un rôle dans l’initiation des cancers en combinaison avec

les mutations conductrices (Shen and Laird 2013, Morgan and Shilatifard 2015). Donc, des combinaisons

spécifiques de mutations conductrices sont nécessaires pour initier la mutagenèse. Toutefois, les étapes initiales

30

du développement de la carcinogenèse sont encore mal connues dû à la variété de mutations et de facteurs

environnementaux (Martincorena et al. 2015).

Figure 11. Caryotype d’une cellule SW480 marqué par m-FISH. Caryotype d’une cellule SW480, marqué par m-FISH. La métaphase est composée de chromosomes surnuméraires (2, 3, 9 à 11, 13, 19, 20 et 21) et présente des réarrangements chromosomiques. Adapté de Rochette et al. 2005.

31

1.7. Irradiations chroniques

Depuis longtemps, il a été reconnu que le rayonnement UV de la lumière solaire est la cause principale de la

cancérogenèse cutanée chez l’humain. La souris glabre est le modèle de prédilection pour les études de

carcinogenèse induite par les irradiations chroniques aux UV (Ananthaswamy and Pierceall 1990). Ces études

ont permis de comprendre les mécanismes de vieillissement et de lier la carcinogenèse de la peau à l’exposition

répétée aux rayons solaires (Black et al. 1994, Mitchell et al. 1999). Toutefois, peu d’études se sont penchées

sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la carcinogenèse cutanée initiée par des irradiations

chroniques. L’accumulation et la persistance des dommages induits par une irradiation chronique aux UVB dans

les cellules de peau humaine sont peu étudiées. La majorité des études sur l’initiation de la carcinogenèse

utilisent des irradiations uniques et aigües, qui ne reflètent pas bien l’exposition solaire humaine. L’exposition

solaire humaine est surtout composée de plusieurs doses faibles et non létales pour les cellules. Depuis

quelques années, différentes équipes de recherche utilisent des irradiations chroniques, qui représentent mieux

la réalité de l’exposition solaire humaine (Mitchell et al. 1999, Bosset et al. 2003, Hishida et al. 2009, Hishida et

al. 2010, Roshan and Jones 2012, Parkinson et al. 2015). Tout d’abord, l’utilisation des irradiations chroniques

à faible dose d’UV (CLUV) ont été introduites par David L. Mitchell et son équipe en 1999, qui utilisaient la souris

glabre comme modèle. Depuis, Hishida (2009 et 2010), Haruta (2010 et 2012) et leurs équipes ont soumis des

cellules de levures à des irradiations chroniques, tandis que Kambayashi et al. (2001) et Parkinson et al. (2015)

ont aussi utilisés la souris comme modèle. Enfin, plusieurs analyses ont été faites sur des échantillons de peau,

mais aucune n’a utilisé des cellules de peau en culture (Akiba et al. 1999, Bosset et al. 2003, Martincorena et

al. 2015).

Récemment, notre équipe de laboratoire a publié en utilisant des irradiations chroniques aux UVB (Drigeard

Desgarnier et al. 2017). Cet article démontre l’impact d’une pré-stimulation par une irradiation CLUV sur les

mécanismes de réponses aux dommages à l’ADN. Une irradiation chronique avant une irradiation aigüe retarde

le cycle cellulaire et augmente la réparation des CPD induits par l’irradiation aigüe. Ils ont observé une réparation

de 50,5 % des CPD, 24 h après une irradiation aigüe seule et une réparation de 72 % des CPD, 24 h après une

irradiation aigüe précédée d’une CLUV. Ils ont également observé des CPD résiduels qui persistent au moins

24 h après l’irradiation, probablement en s’accumulant dans les régions résistantes à la réparation (Rochette

and Brash 2010). Donc, mon projet a été développé pour mieux comprendre l’implication des CPD résiduels

induits par une irradiation CLUV dans les cellules de la peau et dans l’initiation des cancers cutanés non

mélanocytique.

32

33

2. Objectifs Des données d’études précédentes et des données préliminaires de notre laboratoire ont montrées qu’une

irradiation chronique aux rayons UVB induit des dommages qui ne semblent pas être réparés et qui s’accumulent

dans le génome (Courdavault et al. 2004, Rochette and Brash 2010, Drigeard Desgarnier et al. 2017). Mon

projet de maîtrise avait comme objectif d’étudier l’impact des CPD résiduels induits par une irradiation chronique

aux rayons UVB dans le génome de fibroblastes dermiques humains. Le projet a été divisé en quatre volets

distincts (1) la dilution et la persistance des CPD résiduels, (2) la localisation des CPD résiduels dans le génome,

(3) la fréquence de chaque type de dommages et (4) l’impact des CPD résiduels sur la stabilité génomique.

Tout d’abord, nous avons voulu observer la distribution des CPD résiduels à la suite de l’irradiation, afin de

comprendre comment ceux-ci se diluent dans le génome au cours des divisions cellulaires post-irradiation et

comment ces divisions cellulaires sont affectées par les dommages. L’observation de zones d’accumulations

des CPD dans le génome lors du premier objectif nous a amené à nous interroger sur leur localisation. Dans le

deuxième volet, nous avons voulu connaître l’effet de la compaction de la chromatine sur l’accumulation des

CPD résiduels. En séparant l’hétérochromatine et l’euchromatine, nous avons voulu observer la localisation des

CPD résiduels dans le génome.

Pour le troisième volet, nous avons voulu connaître la fréquence et la composition de chacun des types de

dommages résiduels. Nous avons voulu quantifier les deux types de dommages UV-induits formés dans le

génome, soit les CPD et les 6-4 PP. La composition en pyrimidines de ces dommages a un impact sur leur

mutagénicité, donc sur leur potentiel d’initiation de la cancérogénèse cutanée. Finalement, pour le dernier volet,

l’impact des CPD résiduels sur la stabilité génomique a été évalué. Nous avons voulu déterminer l’impact des

CPD résiduels sur la stabilité génomique en observant la quantité de SCE dans les cellules irradiées avec le

régime chronique.

34

35

3. Matériel et méthodes

36

3.1. Culture cellulaire et récolte Quatre cultures primaires de fibroblastes dermiques provenant de réductions mammaires de femmes âgées

entre 18 et 38 ans ont été obtenues de la banque de cellules du Laboratoire d’organogenèse expérimentale.

Les cellules du projet étaient toutes utilisées à des passages allant de 3 à maximum 12. Nous avions créé une

banque de cellules avec plusieurs tubes de chaque lignée à différents passages, donc différents tubes contenant

les mêmes lignées primaires étaient utilisés à chaque expérience. Tout d’abord, environ 500 000 cellules ont

été ensemencées dans des plats de Pétri de 10 cm contenant du milieu de type Dulbecco's Modified Eagle

Medium supplémenté avec 5 % de sérum fétal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine. Le milieu était

remplacé par du milieu frais tous les 2-3 jours. Les plats de Pétri étaient maintenus en incubation à 37°C et à

5 % de CO2 jusqu’à ce que les cellules soient confluentes.

La récolte des cellules a été faite en enlevant le milieu de culture des plats de Pétri et en ajoutant de la trypsine,

0,05 % pour les cellules non irradiées et 0,25 % pour les cellules irradiées. Une incubation d’environ 5 min a été

faite afin de décoller toutes les cellules du plat. Du milieu de culture a été ajouté, environ le double de la quantité

de trypsine, afin d’inhiber la trypsine. Les cellules en suspension ont été transférées dans des tubes, puis

centrifugées (10 min, 500 g, température pièce).

3.2. Irradiation

Deux régimes d’irradiation ont été utilisés dans le cadre du projet; l’irradiation chronique (CLUV), composée de

plusieurs petites irradiations répétées et l’irradiation aigüe, composée d’une seule irradiation. La CLUV était

composée de 15 irradiations de 75 J/m2 d’UVB chacune, données à des intervalles de 12 h, pour un total de

1125 J/m2 d’UVB. L’irradiation aigüe utilisée était une seule dose unique de 400 J/m2 d’UVB. Avant de débuter

les irradiations, les cellules étaient amenées et maintenues à confluence. Lors de chaque irradiation, le milieu

était remplacé par du PBS la durée de l’irradiation. Le milieu était filtré par un filtre de 0,2 μm (Sarstedt),

permettant de retirer tous les débris cellulaires et d’éviter les contaminations bactériennes potentielles. Les

cellules contaminées n’étaient pas conservées pour les analyses subséquentes et étaient jetées. Ensuite, les

cellules étaient lavées 2 fois au PBS, pour retirer complètement le milieu et éviter la formation d’espèces

réactives de l’oxygène par l’irradiation aux UV du milieu de culture. L’irradiateur était préchauffé, puis le flux

(W/m2) lu à l’aide d’un radiomètre (UVX radiometer, UVP). Le calcul permettant de connaître la durée de

l’irradiation en seconde était le suivant :

(𝐹𝑙𝑢𝑥

0.1) ∗ 𝐷𝑜𝑠𝑒 (

𝐽

𝑚2) = 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑠 (secondes)

37

Les cellules étaient irradiées à température pièce, pour une durée de 10 à 15 secondes pour les irradiations

chroniques et de quelques minutes pour les irradiations aigües. Le milieu filtré était remis dans les plats de

Pétris en ajoutant 20% de milieu frais supplémentaire. Un filtre d’acétate de cellulose (Kodacel TA-407, clear

0.015 in, Eastman-Kodak Co.) était placé au-dessus des pétris lors de chaque irradiation, afin de bloquer les

longueurs d’onde inférieures à 290 nm et d’éviter les contaminations d’UVC.

Les cellules irradiées avec la dose aigüe étaient récoltées immédiatement, tandis que les cellules irradiées avec

la CLUV étaient replacées dans l’incubateur avant la prochaine irradiation 12 h plus tard. Les cellules irradiées

avec la CLUV étaient toujours récoltées 12 h après la dernière irradiation.

3.3. Dilution et persistance des CPD résiduels

Dans l’intention d’étudier la distribution, la persistance et la dilution des dommages résiduels après l’irradiation

chronique, les cellules ont été récoltées puis étalées sur lames. Pour réaliser cet objectif, la récolte de 5 à 10

millions de cellules a été faite 12 h après la dernière irradiation de la CLUV. Les cellules ont été réensemencées

à environ 500 000 cellules par Pétri de 10 cm, dans 6 Pétris pour permettre la division cellulaire. Une fois par

jour, 0,05 μg/ml de colcémide étaient ajoutés dans le milieu des cellules prêtes à être récoltées et laissés pour

une incubation de 90 min à 37 °C. La colcémide permet la dépolarisation des microtubules et d’arrêter le

processus de division cellulaire. Les cellules ont été lavées au PBS et décollées des Pétris avec de la trypsine

(0,25 %). Une fois les cellules en suspension, une centrifugation de 10 min, 500 g à température pièce était faite

pour enlever la trypsine et le milieu. Ensuite, 10 ml de KCl (1 mM), préchauffé à 37 °C a été ajouté aux culots

de cellules en mélangeant continuellement à faible intensité, afin de faire éclater le cytoplasme des cellules en

préservant les noyaux. Par la suite, le tout fut incubé 8 min à 37 °C, puis centrifugé 5 min à 500 g (température

pièce) afin de culoter les noyaux et retirer les débris cellulaires. Les culots de noyaux étaient fixés 2 fois en

ajoutant 10 mL de Carnoy (3:1, Méthanol : Acide acétique, préparé frais tous les jours) en mélangeant

continuellement. Le tout était incubé 10 min à température pièce puis centrifugé 5 min à 500 g (température

pièce). Le culot de noyaux fut ensuite suspendu dans 1 ml de Carnoy. Finalement, l’étalement des

chromosomes était fait en faisant tomber une à deux gouttes de solution (Carnoy/noyaux) sur lame et ensuite

séchée à l’air libre. Une fois les lames séchées, elles étaient conservées à l’abri de la lumière, à température

pièce.

Les CPD résiduels ont été révélés sur les étalements de chromosomes par immunocytofluorescence (IF). Tout

d’abord, les lames ont été fixées dans un bain d’éthanol (70 %) pour 15 minutes à -20 °C. Ensuite, les lames

ont été trempées dans un bain de solution 1 (50 Mm Tris-HCl pH 7,2, 1 mM KCl et 0,3 % Triton X-100) et

incubées 30 min à 37 °C. Les lames ont été lavées avec du tampon tris buffered saline (TBS) 3 fois pour 5 min

38

chaque fois. Un traitement à la RNase A (100 µg/ml) dans du TBS pour 1 h à 37 °C a été fait permettant de

retirer toutes les molécules d’ARN. L’ADN des lames a été dénaturé avec une solution fraîche de NaOH (0,07 N)

dans de l’éthanol (70 %) pour 2 min. Ensuite, les lames ont été plongées dans des bains d’éthanol (70 %, 80 %,

90 % et 100 %), puis séchées complètement à l’air. Les protéines sur les lames ont été dégradées avec une

incubation de 10 min à 37 °C dans une solution de protéinase K (10 µg/ml) diluée dans la solution 2 (20 mM

Tris-HCl, pH 7,4 et 2 mM CaCl2). Trois lavages de 5 min dans le TBS ont été faits. Les lames ont été placées

dans un bain d’anticorps CPD, dilué 1 :1500 dans la solution 3 (TBS, 5 % d’albumine de sérum bovin et 0,05 %

Tween 20), pour 1 h à 37 °C dans une chambre humide. Les lames ont été lavées une seconde fois dans du

TBS, 3 fois 5 min. L’anticorps secondaire, anti-souris conjugué au Alexa Fluor 488, a été dilué 1 :2500 dans la

solution 3 pour plonger les lames durant 2 h à température pièce dans une chambre humide. Pour terminer, les

lames ont été lavées au TBS et trempées 5 min dans un bain de DAPI (20 mg/ml), dilué dans du TBS, 25 l

DAPI dans 50 ml de TBS. Un dernier lavage a été fait, puis les lames ont été recouvertes de slow fade et d’une

lamelle. Celles-ci ont été utilisées dans la semaine suivant le marquage et ont été conservées à -20 °C dans

une boîte opaque. Les images des chromosomes métaphasiques ont été obtenues à l’aide du microscope Zeiss

et du logiciel AxioVision. Ensuite, avec le logiciel ImageJ (1.48v, Maryland, USA) les chromosomes ont été

comptés et classifiés en trois catégories. Le premier type de chromosome observé comportait des dommages

sur les deux chromatides sœurs, le second type de chromosome observé comportait des dommages sur une

seule chromatide sœur, tandis que le troisième type de chromosome ne comportait aucun dommage. Ainsi, la

quantité de chromosome de chaque type a été transposée en pourcentage sur le nombre de chromosomes

total, pour les 6 jours suivants l’irradiation.

3.4. Slot blot

Un immuno slot blot a été utilisé afin calculer la quantité de CPD résiduels. L’extraction de l’ADN à partir des

cellules en culture a été faite avec une trousse « DNeasy Blood and tissue » de Qiagen, en suivant exactement

le protocole fourni. Une étape d’élimination de l’ARN a été faite, par un traitement à la RNase (100 g/ml, 37 °C,

6 min). Le culot de cellules a été récolté, tel que décrit en 3.1, suspendu dans 200 μl de PBS, puis incubé à

température pièce pour 2 min. Ensuite, 200 μl de buffer AL a été ajouté et incubé à 56 °C pour 10 min et 200 μl

d’éthanol (100 %) a été ajouté et la solution bien mélangée. La solution liée à une colonne de silice par

centrifugation (1 min à 6000 g, à température pièce). La colonne a été rincé 1X à l’aide de 500 μl de Buffer AW1

et 1X avec 500 μl de Buffer AW2. L’ADN lié à la colonne fut ensuite élué à l’aide de 200 μl de Buffer AE.

L’ADN extrait a été mesuré avec un lecteur nanodrop (Thermo Scientific NanoDrop 2000 spectrophotometer),

puis dilué à 8 ng/µl dans l’eau distillée. Tout d’abord, 47 µl d’ADN à 8ng/µl a été dénaturé en y ajoutant 3 µl de

NaOH 5N et en incubant pour 60 min à 55 °C. Ensuite, 50 μl d’acétate d’ammonium 1 M a été ajouté. Environ

39

6 morceaux de papier Whatman ont été trempés pour 5 min dans un bain d’acétate d’ammonium 1 M. La

membrane de nitrocellulose (Bio-Rad) a été trempée dans un bain d’eau distillée durant 5 min, puis dans un

bain d’acétate d’ammonium 1 M, 5 min supplémentaires. La membrane a été placée au centre des papiers

Whatman dans l’appareil à slot blot et le vide a été fait. Chaque puit de l’appareil à slot blot a été bloqué en y

ajoutant 100 μl d’acétate d’ammonium 1M, puis 100 μl de la solution contenant l’ADN a été ajoutée dans les

puits. L’ADN a été fixé sur la membrane en chauffant durant 2 h à 80 °C. La membrane a été bloquée 30 min

dans BB Buffer (50 mM Tris 1M, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,5 µl/mL de Tween-20) contenant 5% de lait écrémé.

Ensuite, la membrane a été placée durant une nuit complète dans un bain à 4 °C de solution d’anticorps primaire

anti-CPD dilué 1 : 5000 dans le BB Buffer et 1 % de lait écrémé. La membrane a été rincée dans un bain de BB

Buffer avant d’être trempée dans un bain d’anticorps secondaire anti-souris couplé au HRP dilué à 1 : 10000

dans un bain de BB Buffer et 1 % de lait écrémé. La membrane a été rincée 3 fois de plus dans du BB Buffer et

une dernière fois dans du PBS 1 X. La chimiluminescence a été révélée sur scanner et quantifié par Photoshop.

Afin de contrôler la quantité d’ADN sur la membrane, elle fut hybridée à l’aide d’un anticorps ciblant l’ADN

monocaténaire. La membrane a été tout d’abord strippée à l’aide du Restore plus western blot stripping buffer

(ThermoFisher scientific). Pour ce faire, la membrane a été placée dans un bain contenant 6 ml de stripping

solution pour 15 min, à température pièce. La membrane a été lavée avec du BB Buffer, puis bloquée avec une

solution de lait écrémé 5 % dilué dans du BB Buffer environ 30 min à température pièce. La membrane a été

placée dans une solution de BB Buffer avec un anticorps contre l’ADN monocaténaire dilué 1 : 1000 dans du

BB Buffer, durant une nuit complète à 4 °C. La membrane a été lavée une fois de plus dans le BB Buffer, puis

placée pour 1 h à 37 °C dans un bain d’anticorps secondaire, anti-souris couplé au HRP, dilué 1 : 10000 dans

du BB Buffer. Ensuite, la membrane a été lavée une dernière fois puis la chimioluminescence révélée avec la

solution d’ECL (ThermoFisher scientific). La quantité d’ADN a été quantifiée avec li logiciel C-DiGit1 Blot

Scanner (LI-COR Biosciences) et la quantité de dommage par µg d’ADN calculée.

3.5. Localisation des CPD résiduels dans le génome

Afin de déterminer la localisation des CPD résiduels dans les différents niveaux de compaction de chromatine,

nous avons voulu séparer l’hétérochromatine de l’euchromatine en utilisant un protocole d’immunoprécipitation

de la chromatine (ChIP). Le ChIP kit (ab500) de la compagnie Abcam a été utilisé pour les premières étapes du

protocole, soit la fixation cellulaire, la collection, la lyse ainsi que l’immunoprécipitation. Les étapes de

purification de l’ADN ont été modifiées afin d’optimiser la quantité d’ADN récoltée.

Tout d’abord, les cellules ont été irradiées selon les deux régimes (CLUV et UVB aigüe). Environ 20 à 25 millions

de cellules par cultures ont été utilisées. Pour fixer les protéines sur l’ADN, les cellules ont été incubées 10 min

40

à température pièce dans une solution composée du Buffer A (fourni par la compagnie, composition inconnue),

de PBS et de formaldéhyde (~1,1 %). De la glycine a été ajoutée, pour absorber le formaldéhyde, puis les deux

solutions ont été retirées par centrifugation (5 min, 500 g, 4 °C). Le culot a été lavé avec du PBS préalablement

refroidit à 4 °C. Ensuite, la lyse cellulaire a été obtenue par une incubation de 10 min à température pièce dans

le Buffer B (fourni par la compagnie, composition inconnue). La solution a été centrifugée (5 min, 500 g, 4 °C),

et incubée (10 min à 4 °C) dans le Buffer C (fourni par la compagnie, composition inconnue) conservé à 4 °C.

La solution de cellule lysée a été centrifugée à nouveau, afin de retirer les débris cellulaires (5 min, 500 g, 4 °C).

Le culot d’ADN/protéines a été suspendu dans le Buffer D (fourni par la compagnie, composition inconnue),

auquel l’inhibiteur de protéase fourni dans le kit a été ajouté. L’ADN a ensuite été fragmenté par sonication

(Sonic dismembrator Model 100, Fisher Scientific), afin d’obtenir des fragments d’ADN de 200 à 500 pb. La

grosseur des fragments permettait de conserver les nucléosomes, qui contiennent des fragments d’ADN de

147 pb. L’ADN fragmenté a été dilué dans le ChIP Buffer 1X (fourni par la compagnie, composition inconnue)

combiné à l’inhibiteur de protéase et le mélange a été séparé dans des tubes de 1 ml. Un de ces tube a été

congelé à – 20 °C, afin de servir de référence d’ADN génomique total.

Les anticorps ont été ajoutés aux tubes d’ADN, soit un anti-H3K9me3 (hétérochromatine), un anti-H3K9ac

(euchromatine) et un anti-H3 (contrôle positif). Un échantillon n’a pas reçu d’anticorps et a été conservé tel quel,

afin de servir de contrôle négatif. Les échantillons ont été placés sur une plaque rotative à 4 °C, durant une nuit

complète, afin de permettre aux anticorps de se lié aux protéines. Le lendemain, les billes de sépharose ont été

lavées et activées. Pour ce faire, elles ont été suspendues dans le ChIP Buffer, centrifugées 3 min, 500 g, à

4 °C. Le surnageant a été enlevé, puis les billes suspendues à nouveau dans le ChIP buffer, suivi d’une

centrifugation pour enlever le surnageant. Le culot de billes a été suspendu dans le ChIP buffer une dernière

fois et divisé dans des nouveaux tubes de 1 ml. Les échantillons d’ADN ont été centrifugés 10 min, 14000 g à

4 °C, pour en retirer les débris cellulaires et le surnageant contenant l’ADN a été placé dans les tubes contenant

les billes. Les tubes contenant le mélange d’ADN et de billes ont été incubés 1 h sur plaque rotative à 4 °C.

Finalement, pour conserver l’ADN lié aux anticorps et aux billes, les billes ont été lavées avec le ChIP buffer,

suivi d’une centrifugation de 3 min, 500 g, 4 °C. Cette étape a été répétée quatre fois, afin de retirer tout l’ADN

n’étant pas lié aux billes.

Les étapes suivantes (reverse cross-link et traitement à la protéinase K) ont été modifiées du protocole original

et ont été adaptées du protocole d’immunoprécipitation de la chromatine de l’Université de Médecine Johns

Hopkins (2013). Afin de séparer l’ADN et les protéines, du ChIP buffer contenant 0,3M de NaCl a été ajouté aux

échantillons. Les échantillons ont été incubés durant une nuit complète à 65 °C. Le lendemain, une incubation

de 2 h à 45 °C a été faite, dans une solution de protéinase K (40 μg/ml) et de tampon de Tris-Hcl pH 7,5 (50 mM),

d’EDTA (25 mM), SDS (1.25 %). La dernière étape, la purification de l’ADN a été faite à l’aide de la trousse de

41

purification pour produits PCR de Qiagen selon le protocole de la compagnie (Qiagen QIAquick PCR purification

kit). Cette trousse permet de purifier l’ADN en retirant tous les fragments inférieurs à 200 pb. Le protocole a été

suivi selon les recommandations du fabriquant.

L’ADN a été mesuré à l’aide de la technique du PicoGreen. Une courbe standard a été établie avec de l’ADN

de concentration connue. Le PicoGreen 1X, dilué dans du tampon TE, a été ajouté aux échantillons suivi d’une

incubation de 5 min dans le noir. La fluorescence des échantillons et de la courbe standard a été lue à l’aide de

l’appareil Rotor-Gene Q (Qiagen) et du logiciel Rotor-Gene Q – Pure Detection (v2.0.2). Cette technique a été

utilisée pour sa précision et sa sensibilité.

L’efficacité du protocole de ChIP pour séparer l’hétérochromatine et l’euchromatine a été validée à l’aide de la

quantification de deux gènes par PCR quantitatif. Les deux gènes choisis étaient GAPDH, un gène constitutif

trouvé dans l’euchromatine et Sat2, une séquence génique répétée trouvée dans la région péricentromérique

de l’hétérochromatine (Tilman et al. 2012). Les séquences des quatre amorces de la réaction sont présentées

dans le tableau 1 et proviennent de Tilman et al. 2012. Le programme PCR utilisé comportait deux étapes, soit

un cycle de dénaturation de 10 sec à 95 °C, puis la liaison et l’élongation en 40 cycles de 40 sec à 60 °C et a

été réalisé grâce à l’appareil Rotor-Gene Q (Qiagen) et au logiciel Rotor-Gene Q – Pure Detection (v2.0.2). La

réaction PCR était composée de SybeRGreen mix (1X) (Bio-rad), des amorces forward et reverse (0.1 M

chaque) et d’ADN (0,04 ng/µl).

GAPDH Forward : 5'TACTAGCGGTTTTACGGGCG Reverse : 5'TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA

Sat2 Forward : 5’CATCGAATGGAAATGAAAGGAGTC Reverse : 5’ACCATTGGATGATTGCAGTCAA

Tableau 1. Séquences nucléotidiques des amorces forward et reverse utilisées pour les qPCR des gènes GAPDH et Sat2. Séquences tiré de Tilman et al. 2012.

Les résultats obtenus par le qPCR, ont été transformés en ratio par la méthode du ΔΔCT, afin de quantifier le

gène d’intérêt dans chacune des fractions, par rapport à la quantité de ce même gène dans la fraction contrôle.

Les résultats obtenus étaient comparés à l’aide du test t de Student, valeurs bilatérales et non pairées, : 0.05.

La quantité de CPD résiduels dans chaque fraction a été mesurée à l’aide d’un ELISA. Les 96 puits des

microplaques ont été remplis avec 50 μl d’une solution de protamine de sulfate (0,003 %). Les microplaques ont

été placées une nuit complète à 37 °C, afin d’assécher complètement la solution. Le lendemain, les plaques

étaient lavées 3 fois avec 100 μl d’eau distillée par puits. Les plaques étaient séchées à nouveau, puis conservée

42

au noir et à température pièce jusqu’à leur utilisation. La courbe standard était préparée en utilisant l’ADN de

cellules irradiées avec différentes doses d’UVB, allant de 0 à 800 J/m2. L’ADN était dilué à 0,2 ng/μl et dénaturé

à la chaleur (100 °C pour 10 min). Immédiatement après, 50 μl d’ADN étaient distribués dans les puits des

microplaques précédemment traitées. Les plaques étaient séchées une nuit complète à 37 °C. Ensuite, les

plaques étaient lavées 5 fois avec 150 μl de PBS-T (0.05 % Tween-20 dans du PBS), puis bloquées avec 150 μl

de FBS 2 % dilué dans du PBS et incubées avec un anticorps anti-CPD (1 :1000) 30 min à 37 °C. L’anticorps

secondaire, Biotin-Goat anti-mouse IgG (Life Technologies), a été dilué à 1 : 1000 dans du PBS (incubation

30 min à 37 °C). Les puits ont été lavés avec 100 μl de PBS-T. La peroxidase-streptavidine a été diluée dans

du PBS, 1 : 5000 (incubation 30 min à 37 °C). Un autre lavage au PBS-T a été fait avec du PBS-T et 150 μl de

tampon citrate-phosphate pH 5.0 (5,10 g d’acide citrique monohydrate, 7,30 g de Na2HPO4 et 1000 mL d’eau

distillée) ont été ajoutés dans chaque puit. La solution substrat a été préparée avec 4 mg d'O-Phenylene

diamine, 2,3 μl d’H2O2 (30 %) et 10 ml citrate-phosphate buffer pH 5.0. Le tampon citrate-phosphate était laissé

dans les puits durant la préparation de la solution substrat, qui devait être préparé au moment de l’utilisation.

Lorsque cette dernière était prête, le tampon était enlevé des puits et 100 μl de solution substrat étaient ajoutés.

Une dernière incubation était faite (30 min à 37 °C) et finalement la réaction enzymatique était arrêtée en

ajoutant 50 μl d’H2SO4 (2M) dans chaque puit. La densité optique des puits était mesurée en lisant l’absorbance

à 492 nm par un spectrophotomètre à microplaque. Les densités optiques obtenues ont été transformées en

dose équivalente d’UV, à l’aide des valeurs de la courbe standard. Puis, les doses équivalentes ont été

transformées en ratios : dose équivalente de l’échantillon sur dose équivalente de l’échantillon contrôle. Les

ratios des obtenus pour l’euchromatine et l’hétérochromatine ont été comparés entre eux par un test t de

Student, valeurs bilatérales et non pairées, : 0.05.

3.6. Fréquence de chaque type de dommages résiduels

Dans l’intention de vérifier la fréquence de chaque type de CPD et de 6-4 PP résiduels, nous avons utilisé une

technique de LC-MS/MS permettant de discriminer chacun des types dipyrimidinique des photoproduits. Les

cellules irradiées (CLUV ou UVB aigüe) ont été récoltées et lavées au PBS, 12 h après la fin de l’irradiation

chronique ou immédiatement après l’irradiation aigüe. Les cellules ont été congelées à sec à –80 °C et les culots

ont été envoyées sur glace sèche au laboratoire du Professeur Thierry Douki (CEA, Grenoble, France). Les

échantillons ont été analysés par chromatographie liquide couplé à une analyse de spectrométrie de masse en

tandem (LC-MS/MS). Brièvement, les échantillons ont été injectés dans le système de chromatographie 1100

micro-HPLC (Agilent Technologies, Massy, France), couplé à un système de spectrométrie de masse API 3000

(Perkin-Elmer/SCIEX, Thornhill, Canada). Un gradient d’acétonitrile dans 2 mM d’acétate d’ammonium triéthyl,

a été fait, puis du méthanol pur a été ajouté. La solution éluée était lue par un spectrophotomètre à 280 nm, puis

par le spectromètre de masse. Les dommages résiduels recherchés lors de ces analyses comprenaient les CPD

43

de type CT, TC et TT en plus des 6-4 PP de type TC et TT. Les valeurs brutes obtenues étaient exprimées en

nombre de lésions par millions de bases, elles ont été transformées en pourcentage sur la quantité de dommage

total. Les CPD de type CC, les 6-4 PP de type CT et CC n’ont pas été détectés par la technique, leur quantité

était probablement trop faible pour permettre leur détection.

3.7. Échanges de chromatides sœurs

Pour ce dernier volet, les cellules ont été irradiées à selon le régime CLUV seulement. Suite à l’irradiation, les

cellules ont été récoltées et ensemencées dans de nouveaux Pétris. Lors de l’ensemencement, du BrdU (10 μM)

a été ajouté dans le milieu. Ensuite, le milieu a été remplacé 2 fois aux 24 h, avec du milieu frais contenant du

BrdU. Lors des jours 3, 4 et 5 suivant l’irradiation, les chromosomes ont été récoltées et étalées sur lames tel

que décrit dans la section 3.3. Le BrdU a été révélé en utilisant un anticorps primaire anti-BrdU (Santa Cruz)

(dilué 1:500) et l’anticorps secondaire conjugué à l’Alexa fluor 594 (Abcam) (dilué 1:1000). Les lames ont été

observées et photographiées avec le microscope Zeiss et le logiciel AxioVision. Pour chaque métaphase, les

chromosomes comportant un SCE étaient comptés et les chromosomes ayant une chromatide sœur marquée

au BrdU. Ensuite, le pourcentage de SCE sur le nombre de chromosomes avec une chromatide sœur marquée

a été calculé. Le pourcentage de SCE des cellules irradiées a été comparé au pourcentage de SCE des cellules

contrôles par un test t de Student, valeurs bilatérales et non pairées, : 0.05

44

45

4. Résultats

46


Premièrement, la quantité de CPD résiduels formés par les deux types d’irradiation (CLUV et UVB unique aigüe)

a été calculée à partir des résultats du slot blot (Fig 12.A). La figure 12.B présente les ratios de CPD résiduels

pour les deux régimes d’irradiation, soit Aigüe/Aigüe et CLUV/Aigüe. La quantité de CPD résiduel de l’irradiation

CLUV (1125 J/m2 d’UVB totaux) a été comparée à la quantité de CPD formés par l’irradiation aigüe (400 J/m2

d’UVB). À la suite de l’irradiation CLUV, avec une dose cumulée environ 3 fois plus élevée que l’irradiation

aigüe, la quantité de dommages persistants est équivalente à 60 % des dommages totaux induits par l’irradiation

aigüe. Ainsi, la quantité de CPD résiduels induits par la CLUV représente la quantité de CPD qui serait induite

par une irradiation aigüe de 240 J/m2 d’UVB. À partir de ceci, il est possible de déduire que les CPD résiduels

représentent environ 20 % des CPD totaux induits par la CLUV. Cependant, il est important de mentionner que

les CPD résiduels se réparent dans les 12 à 48 heures après les irradiations. Il est probable qu’une partie des

CPD observés dans les cellules irradiées avec la CLUV aient été induits par les 2 ou 3 dernières irradiations du

traitement. Les cellules n’auraient pas eu suffisamment de temps pour réparer complètement ces dommages,

donc parmi les 20 % de CPD dits résiduels de l’irradiation CLUV, une portion de ces CPD seraient plutôt non

réparés.

Figure 12. Quantité de CPD résiduels induits par les régimes d’irradiation aigüe et CLUV. La quantité de CPD induits par les deux types d’irradiation, CLUV et aigüe, a été mesuré par slot blot, immédiatement à la fin des irradiations. Les CPD formés lors de l’irradiation aigüe ont servi de référence pour déterminer la quantité de CPD résiduels persistant dans le génome après l’irradiation CLUV. A) Slot blot de la quantité de CPD résiduels dans les cellules

Aigüe CLUV

UV

Sans UV

Rat

io C

PD

Aigüe CLUV

A)

B)

47

irradiées avec les régimes d’irradiation aigüe et CLUV, et les cellules contrôles non irradiées. B) Ratios des CPD résiduels pour les deux régimes d’irradiation, calculés à partir du slot blot en A. Les données montrent les moyennes ± SEM, N=4, n = 3.

Ensuite, sachant que la division cellulaire est ralentie mais se poursuit après une irradiation CLUV, la rapidité

de division cellulaire a été comparée pour les cellules ayant été irradiées (CLUV) et pour les cellules contrôles,

n’ayant pas reçues d’UV (NoUV). La quantité de cellules a été calculée pour les 6 jours suivant l’irradiation. Les

courbes de divisions cellulaires obtenues sont présentées dans la figure 13. Les résultats permettent d’observer

que la division cellulaire des cellules ayant reçu une CLUV est plus lente que les cellules n’ayant pas reçues

d’UV. Les cellules irradiées avec la CLUV ont doublées durant les 6 jours suivant l’irradiation. En effet, au jour

6, la quantité de cellules n’ayant pas été irradiées est 4,50 fois plus élevée qu’au jour 1, tandis que la quantité

de cellules issues de l’irradiation CLUV est 2,17 fois plus élevée au jour 6 qu’au jour 1. Donc, les cellules

irradiées avec la CLUV se divisent 2 fois moins vite que les cellules non irradiées.

Figure 13. Courbe de division cellulaire pour les cellules irradiées contrôles. Les cellules ont été comptées durant les 6 jours suivant l’irradiation. La quantité obtenue pour chaque jour été rapporté sur la quantité de cellules du départ, au jour 1, pour obtenir le nombre de divisions cellulaires. La courbe rouge représente la division cellulaire des cellules contrôles (NoUV), tandis que la courbe bleue représente la division cellulaire des cellules à la suite de l’irradiation chronique (CLUV). Les deux droites hachurées montrent les tendances linéaires de la division cellulaire des deux groupes de cellules. Les données montrent les moyennes ± SEM, N=4, n = 3.

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

1 2 3 4 5 6

Div

isio

n ce

llula

ire

Temps post-irradiation (jours)

NoUV

CLUV

48

Après avoir démontré que les cellules ayant reçu une irradiation CLUV se répliquent, nous avons tenté de

déterminer si les CPD induits dans ces cellules étaient dilués par les divisions cellulaires. Pour ce faire, les

cellules ayant reçu une CLUV furent ensemencées à faible densité et les métaphases des cellules en division

ont été récoltées à tous les jours pendant 7 jours afin d’évaluer la présence de CPD sur les chromosomes. Ainsi,

nous avons observé et classé les chromosomes selon trois catégories (2, 1 ou 0 chromatide endommagée).

La figure 14 présente les photos représentatives de cellules métaphasiques, marquées par

immunofluorescence, qui ont permis de quantifier les différents types de chromosomes retrouvés dans les

cellules post-irradiation. Les images de la première colonne montrent le marquage des CPD à l’aide d’un

anticorps spécifique, celles de la seconde colonne montrent la contre-coloration de l’ADN au DAPI et les images

de la dernière colonne montrent une superposition des deux premières.

Figure 14. Immunocytofluorescence montrant les CPD résiduels sur les chromosomes. La première colonne représente le marquage des CPD en vert, la deuxième colonne représente le marquage de l’ADN en bleu et la dernière colonne représente une superposition des deux premières colonnes. La première ligne représente une métaphase où tous les chromosomes contiennent des dommages résiduels sur les deux chromatides sœurs, la deuxième ligne représente une métaphase pour laquelle la majorité des chromosomes contiennent des dommages résiduels sur une seule chromatide sœur et la dernière ligne représente une métaphase où les chromosomes ne contiennent plus de dommages résiduels.

Deux chromatides

endommagées

Une chromatide endommagée

Aucune chromatide endommagée

CPD DAPI Superposition

49

Les résultats de l’analyse de la distribution des évènements de distribution des CPD dans les chromosomes,

ont été compilés dans le graphique de la figure 15. Les cellules étaient récoltées 12h après la dernière irradiation

de la CLUV (Jour 1), puis tous les 24h suivantes. Les chromosomes comportant des CPD sur les deux

chromatides sœurs représentent 100% des chromosomes observés au premier jour suivant l’irradiation. Ce type

de chromosome diminue au deuxième jour à 71,34 % et diminue à 19,97 % au jour 3. La quantité de

chromosomes ayant des dommages sur les deux chromatides sœurs diminue encore au quatrième jour, puis

reste stable jusqu’au jour 7 à environ 5 %, donc certaines cellules ne se diviseraient plus à partir du jour 4. La

courbe des chromosomes ayant une seule chromatide sœur débute à 0 au jour 1, augmente à 28,36 % au jour

2, double à 60,58 % au jour 3, où elle atteint son maximum avant de redescendre lentement jusqu’à 19,03 %

au jour 7. Enfin, les chromosomes n’ayant aucun dommage résiduels sur les deux chromatides sœurs ne

s’observent pas avant le jour 3 où ils y sont à 15,92 %, puis ils augmentent lentement jusqu’à 82,63 % au jour 7.

Figure 15. Fréquence des CPD observés sur les chromosomes lors des divisions cellulaires à la suite de l’irradiation CLUV. Les CPD résiduels ont été marqués par immunofluorescence sur des étalements de cellules métaphasiques, puis les chromosomes ont été comptés et classés, selon la distribution des CPD sur les deux chromatides sœurs d’un même chromosome. Trois évènements de distribution des CPD ont été quantifiés soit, les chromosomes avec les deux chromatides sœurs endommagées (courbe orange), les chromosomes avec une chromatide sœur endommagée (courbe bleu pâle) et les chromosomes non endommagés (courbe bleu foncé). Les données montrent les moyennes ± SEM, N=4, n = 3.

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7

Fré

quen

ce d

es é

vène

men

ts (

%)


Deux chromatidessoeursendommagées

Une chromatidesoeur endommagée

Aucune chromatideendommagée

50


Sachant que les CPD résiduels s’accumulent et persistent, nous avons voulu observer leur localisation dans le

génome, tout d’abord en s’intéressant à l’impact de la compaction de la chromatine sur l’accumulation et la

persistance des CPD résiduels. Alors, l’ADN des cellules irradiées a été extrait, soit 12h après la dernière

irradiation de la CLUV et immédiatement après l’irradiation aigüe. L’hétérochromatine et l’euchromatine ont été

séparés par un protocole d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et la quantité de CPD résiduels a été

analysée dans les deux fractions d’ADN. Cependant, afin de valider le protocole de ChIP, la quantité des gènes

GAPDH et Sat2 a été comparée dans les deux fractions obtenues, et ce, pour les deux types d’irradiations

indépendamment. Ces deux gènes ont été choisi, car GAPDH est un gène constitutif, il est constamment

transcrit et fait partie de l’euchromatine, tandis que la séquence satellite Sat2 est une séquence

péricentromérique normalement non transcrite, qui fait partie de l’hétérochromatine. Donc, la quantité des deux

gènes a été analysée dans chacune des fractions d’ADN extraite pour les cellules ayant été irradiées avec le

régime CLUV et avec le régime aigu. La figure 16 présente les quantités relatives des gènes de chaque fraction,

ainsi que la valeur contrôle représentée par la ligne pointillée. La valeur contrôle représente la concentration de

chaque gène dans la fraction d’ADN immunoprécipitée avec l’anticorps H3. Les étoiles montrent les valeurs

significativement différentes les unes des autres. Ainsi, pour les cellules des deux types d’irradiations, la quantité

de GAPDH a été enrichie dans l’euchromatine (Aigüe : P˂ 0,005 et CLUV : P˂ 0,05), tandis que et la quantité

de Sat2 semble avoir été enrichie dans l’hétérochromatine, cependant les valeurs ne sont pas significativement

différentes.

51

Figure 16. Quantification relative de GAPDH et de Sat2 pour les cellules irradiées avec un régime aigu et un régime CLUV, dans l’hétérochromatine et l’euchromatine. La quantité des gènes GAPDH et Sat2 ont été mesurée dans l’euchromatine (vert) et l’hétérochromatine (bleu) des cellules irradiées avec le régime CLUV et des cellules irradiées avec le régime aigu. Ces mesures ont été comparées à la quantité de chaque gène dans l’ADN global (ligne pointillée). Les données montrent les moyennes

± SEM, Aigüe : N = 3, n = 3, CLUV : N = 4, n = 3. **P˂0,005 et *P˂0,05; Test t de Student.

Ensuite, la quantification des CPD résiduels dans l’hétérochromatine et l’euchromatine a été déterminée par

ELISA, afin d’observer l’impact de la compaction de la chromatine sur l’accumulation des CPD résiduels. La

figure 17 montre la quantification des CPD dans l’hétérochromatine et l’euchromatine des cellules irradiées avec

les deux régimes d’irradiations, CLUV et aigüe. Les résultats obtenus sont présentés sous forme d’un ratio de

la quantité de CPD résiduels de chaque fraction d’ADN, sur la quantité de CPD dans l’ADN global, valeur qui

est représenté par la ligne pointillée. Pour les cellules ayant reçu une irradiation aigüe, la quantité de CPD

résiduel est similaire dans l’hétérochromatine et dans l’euchromatine, en plus d’être similaire à la quantité de

CPD de l’ADN global. Par contre, pour les cellules ayant reçu une irradiation chronique, il y a une différence

significative entre la quantité de CPD dans les deux fractions. L’hétérochromatine des cellules irradiées avec le

régime CLUV, contient environ deux fois plus de CPD l’euchromatine. De plus, l’hétérochromatine contient un

plus de CPD résiduels que l’ADN global, tandis que l’euchromatine en contient moins.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4Q

uant

ifica

tion

rela

tive

H3K9ac

H3K9me3

GAPDH Sat2

**

*

Aigüe CLUV CLUV Aigüe

52

Figure 17. Quantification relative des CPD résiduels dans l’hétérochromatine et l’euchromatine immédiatement après les irradiations aigüe et chronique (CLUV). La quantification des CPD résiduels dans l’hétérochromatine (bleu), dans l’euchromatine (vert) et dans l’ADN global (ligne pointillée) a été faite par ELISA, pour les cellules ayant reçues une irradiation chronique ou une irradiation aigüe. Les cellules étaient récoltées immédiatement après l’irradiation aigüe et 12h après la dernière irradiation chronique. Les valeurs sont présentées sous forme de ratio de la quantité de CPD de la fraction mesurée sur la quantité de CPD dans l’ADN global. Les données montrent les moyennes ± SEM, Aigüe : N = 3, n = 3, CLUV : N

= 4, n = 3. *P˂0,05; Test t de Student.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5Q

uant

ifica

tion

rela

tive

des

CP

DH3K9ac

H3K9me3

Aigüe CLUV

*

53

4.3. Fréquence de chaque type de dommages résiduels

Les CPD et les 6-4PP peuvent être induits sur les différents types dipyrimidiniques (TT, TC, CT et CC). Ainsi, la

fréquence des dommages résiduels dans les différents types dipyrimidiniques a été quantifiée par la technique

LC-MS/MS. Les résultats bruts étaient obtenus en nombre de lésions par millions de bases et ils ont été

transformés en pourcentages par rapport au nombre de dommages total, ces derniers sont présentés dans les

figures 18 et 19.

Le pourcentage de CPD de type TT était de 84,70 % ± 3,07 et le pourcentage de CPD de type TC était de

21,1 % ± 3,1 dans les cellules irradiées avec la CLUV. Dans les cellules irradiées avec une dose aigüe, le

pourcentage des CPD de type TT était de 77 % ± 3.16 et le pourcentage des CPD de type TC était de

13,5 % ± 1,6. Les CPD résiduels de type CT étaient induits selon un pourcentage très similaire par les deux

types d’irradiation, soit de 1,8 % ± 2,0 pour les cellules irradiées avec une CLUV et de 1,9 % ± 1,5 pour les

cellules irradiées avec une dose aigüe. Finalement, aucun CPD de type CC n’a été détecté dans les cellules

irradiées avec les deux types d’irradiations.

La composition des CPD résiduels induits dans les cellules ayant reçues une irradiation aigüe d’UVB, est de

77 : 21 : 2 : 0, pour les dommages TT : TC : CT : CC. La composition des dommages résiduels pour les cellules

ayant reçues une irradiation chronique est de 85 : 13 : 2 : 0, pour les dommages TT : TC : CT : CC. La figure

16 représente les pourcentages de chaque type de CPD pour les deux régimes irradiations. La quantité de CPD

de type TT est significativement plus élevée dans les cellules irradiées avec une dose CLUV que dans les

cellules irradiées avec une dose aigüe (P˂0,05). La quantité de CPD de type TC est significativement plus

élevée dans les cellules irradiées avec une dose aigüe que dans les cellules irradiées avec une dose CLUV.

Ainsi, les cellules irradiées avec une dose CLUV contiennent plus de CPD de type TT, tandis que les cellules

irradiées avec une dose aigüe contiennent plus de CPD de type TC.

La figure 19 montre les pourcentages de 6-4 PP induits dans les cellules par les deux régimes d’irradiations

Pour ce type de dommage, seul les 6-4 PP de type TT et TC ont été détectés lors des analyses. Le régime

d’irradiation aigüe a induit 34 % de TT et 66 % de TC, tandis que l’irradiation chronique a induit 40 % de TT et

60 % de TC. Aucune différence significative n’a été observée entre les deux types d’irradiations, pour les deux

types de 6-4 PP.

54

Figure 18. Pourcentage de chaque type de CPD résiduels induits par les irradiations aigüe et chronique. Les analyses LC-MS/MS ont permis d’obtenir le pourcentage de chaque type de CPD (TT, TC ou CT) sur la quantité totale de CPD résiduels de l’analyse, pour les cellules irradiées avec le régime d’irradiation aigüe (jaune) ou le

régime CLUV (rouge). Les données montrent les moyennes ± SEM, N = 4 *P˂0,05; Test t de Student.

Figure 19. Pourcentage de chaque type de 6-4 PP résiduels induits par les irradiations aigüe et chronique. Les analyses LC-MS/MS ont permis d’obtenir le pourcentage des 6-4 PP de type TT ou TC sur la quantité totale de 6-4 PP des analyses, pour les cellules irradiées avec le régime d’irradiation aigüe (jaune) ou le régime CLUV (rouge). Les données montrent les moyennes ± SEM, N = 4

0

20

40

60

80

100

TT TC

6-4

PP

(%

)

Aigüe

CLUV

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

TT TC CT

CP

D (

%)

Aigüe

CLUV

*

*

55


À partir des immunocytofluorescence de la section 4.1, les échanges de chromatides sœurs (SCE) ont été

comptés dans les cellules irradiées avec la CLUV, durant les jours 2 à 6 suivant l’irradiation. Il était possible de

visualiser ces évènements seulement dans les chromosomes ayant 1 chromatide contenant des CPD. La figure

20 montre un exemple d’une cellule métaphasique en immunofluorescence comportant des SCE, pointés par

les flèches blanches.

Figure 20. Immunocytofluorescence d’une métaphase de cellule irradiée avec la CLUV et comportant des échanges de chromatides sœurs. La première image montre l’ADN marqué au DAPI (en bleu), la seconde image montre les CPD marqué avec l’anticorps anti-CPD (en vert) et la dernière image montre une superposition des deux premières. Les flèches blanches pointent des chromosomes comportant des échanges de chromatides sœurs.

DAPI CPD Superposition

56

La figure 21 présente la quantification des SCE pour les jours 2 à 6, à la suite de l’irradiation CLUV. La quantité

de SCE a été rapportée en pourcentage sur la quantité de chromosomes qui comportent une chromatide

endommagée par les CPD. La droite de la figure 20 montre que, malgré une diminution apparente aux jours 3

et 4, il y a une augmentation globale des SCE d’environ 5 % dans les cellules irradiées avec la CLUV, cependant

cette augmentation n’est pas significative.

Figure 21. Pourcentage d’échanges de chromatides sœurs lors des divisions cellulaires post-irradiation, chez les cellules irradiées avec une CLUV. Les immunocytofluorescences (fig 21) ont permis de calculer la quantité d’échanges de chromatides sœurs lors des 6 jours suivant l’irradiation CLUV. Les échanges de chromatides sœurs diminuent au départ mais augmentent au jour 6, jusqu’à 5 % de plus qu’au jour 2. Les données montrent les moyennes ± SEM, N = 4, n = 3.

L’analyse des échanges sur les chromosomes contenant des CPD sur une seule chromatide permettait

d’évaluer les SCE sur les chromosomes endommagés et ne permettait pas d’effectuer une comparaison avec

les cellules non-irradiées. Ainsi, nous pouvions affirmer qu’il y a des SCE induits dans les cellules soumises à

une CLUV. Cependant, il n’était pas possible d’évaluer si le taux de SCE des cellules irradiées avec une CLUV

est plus ou moins élevé que le taux de SCE des cellules non-irradiées. Ainsi, afin de vérifier l’impact réel de la

présence des CPD résiduels sur la stabilité du génome, les échanges de chromatides sœurs ont été quantifiés

par incorporation de BrdU. Pour ce faire, au troisième jour suivant l’irradiation chronique, la quantité de SCE des

cellules ayant reçue une CLUV a été comparée avec la quantité de SCE des cellules n’ayant pas été irradiée.

La figure 22 présente les images ayant permis d’observer les échanges de chromatides sœurs. La première

présente le marquage du BrdU en immunocytofluorescence, la seconde montre la contre-coloration au DAPI,

tandis que la dernière montre la superposition des deux premières. La figure 23 présente la quantification des

SCE pour chacun des groupes de cellules, l’astérisque signifie qu’il y a une différence significative entre les

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7

Éch

ange

s de

chr

omat

ides

soe

urs

(%)


CLUV

57

deux groupes. Donc, La quantité de SCE dans les jours post-irradiation est plus élevée pour les cellules irradiées

que pour les cellules contrôles.

Figure 22. Immunocytofluorescence des chromosomes ayant incorporé le BrdU et comportant des échanges de chromatides sœurs. La première image représente le marquage en rouge du BrdU incorporé dans l’ADN, la seconde image représente l’ADN contre coloré au DAPI en bleu et la dernière image est une superposition des deux premières. Les flèches blanches pointent les échanges de chromatides sœurs.

Figure 23. Quantification des échanges de chromatides sœurs dans les cellules ayant reçues une irradiation chronique et pour les cellules contrôles. Les échanges de chromatides sœurs ont été comptés pour les cellules contrôles (gris) et pour les cellules irradiées avec le régime CLUV (rouge), lors du troisième jour suivant l’irradiation CLUV. Les données montrent les moyennes

± SEM, N = 4, n = 3. *P˂0,05; Test t de Student.

BrdU Superposition DAPI

0

5

10

15

20

25

30

35

J3

Éch

ange

s de

chr

omat

ides

soe

urs

(%)

NoUV

CLUV

*

58

5. Discussion

59

Peu d’études ont été menées sur l’impact d’une irradiation chronique aux UVB, la majorité des études utilisent

plutôt un régime d’irradiation avec une dose unique et aigüe (Di Nuzzo et al. 1998, Douki et al. 2000, Courdavault

et al. 2004, de Lima-Bessa et al. 2008). Cependant, le régime d’irradiation aigüe n’est pas représentatif de

l’exposition solaire de l’humain, particulièrement à nos latitudes, où le rayonnement solaire est plus faible et les

expositions majoritairement de courte durée. Les irradiations chroniques ont souvent été utilisées sur des

cellules humaines ou des souris glabres, afin de démontrer l’impact de l’accumulation d’expositions sur l’initiation

de la cancérogenèse cutanée, toutefois les connaissances au niveau moléculaire sont incomplètes (Berg et al.

1996, Mitchell et al. 1999, Zhang et al. 2001, Rebel et al. 2001, Rebel et al. 2012, Roshan and Jones 2012).

Des analyses préalables effectuées dans notre laboratoire ont permis d’observer que les irradiations chroniques

aux UVB induisent la formation de CPD résiduels. Ces dommages résiduels persistent dans le génome, car ils

y sont réparés très lentement ou probablement pas réparé du tout dans certaines régions. Les impacts de ces

CPD résiduels sur le génome sont peu connus et leur présence amène beaucoup de questionnement sur leur

potentiel rôle dans l’initiation de la carcinogenèse cutanée.


L’objectif de ce volet était d’observer la persistance des CPD résiduels dans le génome et de comprendre leur

dilution au cours des divisions cellulaires. L’observation de la dilution des CPD résiduels dans le génome a été

faite durant les sept jours suivant l’irradiation chronique. Il a été démontré que la présence de dommages sur

l’ADN peut causer l’arrêt du cycle cellulaire et/ou l’apoptose (Courdavault et al. 2004). L’arrêt du cycle cellulaire

permet à la cellule de réparer les dommages avant d’entreprendre la réplication de l’ADN et la division cellulaire.

À l’inverse, la voie de l’apoptose est favorisée lorsque la quantité de dommages est trop importante pour

permettre une réparation efficace. Une analyse précédente, sur des cellules irradiées par différentes doses

uniques d’UVB, a démontré que la présence des dommages résiduels n’inhibe pas la division cellulaire 24 h

après l’irradiation (Courdavault et al. 2004). De plus, cette même étude a permis d’observer que le nombre de

divisions cellulaires est en corrélation négative avec l’augmentation de la dose d’UV (Courdavault et al. 2004).

Ainsi, à la suite de l’irradiation CLUV sur les fibroblastes dermiques, le même phénomène est visible, les cellules

se divisent plus lentement que les cellules n’ayant pas reçues d’UV (Fig 13). Le double de la population cellulaire

est atteint après 5 jours pour les cellules soumises à l’irradiation CLUV, tandis que la population de cellule non

irradiée double après 2 à 3 jours. De plus, des analyses récentes effectuées dans notre laboratoire ont permis

d’observer que l’irradiation CLUV n’induit pas ou très peu d’apoptose dans les fibroblastes utilisés. Différentes

doses d’irradiations CLUV ont été utilisées et il semble y avoir une augmentation de l’apoptose avec la dose la

plus élevée d’irradiation, toutefois aucun résultat de différence statistiquement significative (Drigeard Desgarnier

et al. 2017). Donc, nous avons observé que la quantité de cellules du groupe contrôle est deux fois plus élevée

60

que la quantité de cellules irradiées avec la CLUV, au sixième jour après l’irradiation CLUV. Les 2 tendances

linéaires de la division cellulaire ne sont pas parallèles, celle des cellules non irradiées augmente plus

rapidement que celle des cellules irradiées. Ce qui signifie que la présence de CPD résiduels ralentit la division

cellulaire, au moins durant les 6 jours après l’irradiation CLUV.

La dilution des CPD résiduels a été analysée durant les 7 jours post-irradiation CLUV, dans les cellules en

division. La figure 24 représente la dilution des CPD résiduels, qui se fait selon le modèle de la réplication semi-

conservative. Au jour 1, 100 % des chromosomes possèdent des CPD résiduels sur les deux chromatides

sœurs. Lors de la première division cellulaire, les deux brins d’ADN de la cellule mère se répliquent pour former

les chromosomes. Dans tous les chromosomes nouvellement formés, chaque chromatide sœur est composée

d’un brin initial endommagé et du brin nouvellement synthétisé sans dommage. Donc, l’immunocytofluorescence

après la première division montre des chromosomes qui contiennent des dommages sur les deux chromatides.

Lors de l’anaphase, les chromatides sœurs sont séparées également dans chacune des cellules filles. Ces

cellules possèdent de l’ADN double brin, qui contient des CPD résiduels sur le brin initial seulement, tandis que

le brin nouvellement synthétisé n’est pas endommagé. Lors de la seconde division cellulaire, l’ADN se réplique

à nouveau pour former des chromosomes, qui possèdent une chromatide sœur sans dommage, et une seconde

chromatide sœur qui possède le brin initial endommagé par l’irradiation. C’est à cette étape qu’on observe des

chromosomes contenant des CPD résiduels sur une chromatide sœur seulement. En théorie, lors de la

deuxième division cellulaire, toutes les métaphases observées devraient être composées de chromosomes

contenant une seule chromatide sœur endommagée. Cependant, nous avons observé qu’au deuxième jour,

71,34 % des chromosomes contiennent toujours des CPD résiduels sur les deux chromatides sœurs et

seulement 28,36 % des chromosomes sont endommagés sur une seule chromatide sœur. Ce qui démontre que

la majorité des cellules n’a effectué qu’une seule division au 2ème jour et une minorité en est à leur 2ème division.

Autrement dit, les cellules ne se divisent pas toutes au même rythme, ce qui est attendu étant donné qu’elles

n’ont pas été synchronisées lors des analyses. De plus, l’irradiation chronique provoque un ralentissement du

cycle cellulaire et l’importance de ce dernier peut varier selon la quantité de dommages présents sur l’ADN. De

ce fait, certaines cellules, environ 5 %, en sont à leur première division cellulaire lors du septième jour post-

irradiation. Au fil du temps, plus il y a de divisions cellulaires plus la quantité de chromatides sœurs

endommagées diminue par rapport aux chromatides sœurs n’ayant plus de dommages. Au jour 7, la majorité

des chromosomes (82,63 %) ne comporte plus de dommage, tandis qu’une minorité (19,03 %) de chromosomes

comporte des dommages résiduels sur une seule chromatide sœur. Ce sont les brins d’ADN initialement

endommagés qui se diluent au travers des cellules, lors des divisions cellulaires. Donc, la théorie de la dilution

des CPD résiduels est la plus probable, étant donné que l’apoptose UV-induite n’est pas augmentée

significativement dans les cellules irradiées avec la CLUV. Les CPD résiduels qui persistent dans les cellules,

sont dilués au travers des divisions cellulaires à la suite de l’irradiation.

61

Il a été démontré que la réplication de l’ADN est possible, à la suite d’une exposition aux UV, grâce aux

mécanismes de tolérance des dommages, qui sont l’évitement des dommages et la synthèse translésionnelle.

Ces deux mécanismes sont présentés dans la section 1.4.2. Ces mécanismes permettent aux cellules de

poursuivre dans le cycle cellulaire, même lorsque des dommages persistent. Cependant, les polymérases

translésionnelles peuvent être fidèles ou infidèles, ces dernières favorisent l’apparition de mutations, dû aux

dommages induits par les UV. Ces mécanismes permettent aux cellules de progresser dans le cycle cellulaire,

malgré la présence de dommages à l’ADN. La présence de ces mécanismes pourrait être un compromis entre

l’augmentation de l’instabilité génétique et le maintien de l’intégrité génomique, qui confère un avantage sélectif

pour les cellules (Knobel and Marti 2011).

Il est probable que la dilution des dommages dans le génome favorise la conservation de l’intégrité génomique

et favorise la diminution de la formation de mutations génétiques. Les probabilités qu’un dommage donne lieu

à une mutation génétique sont liées à plusieurs facteurs, dont la quantité de lésions induites et la rapidité de

réparation. Lorsque la quantité de CPD résiduels dans le génome augmente et que ceux-ci persistent, la

probabilité que ces dommages induisent des mutations augmente aussi. La dilution des dommages à travers

plusieurs cellules devient un avantage sélectif qui diminue les probabilités de mutations au sein de chaque

cellule (Hollander and Fornace 2002). Selon la théorie de la mutagenèse somatique, la probabilité d’apparition

de mutations est due à 3 conditions: la fréquence de formation des dommages, le taux de réparation et les

erreurs des polymérases (Holmquist and Gao 1997, Bastien et al. 2013). Donc, lorsque les dommages sont

induits fréquemment, qu’ils ne sont peu ou pas réparés et qu’ils s’accumulent, les probabilités d’initiation de la

cancérogenèse cutanée augmentent. Cependant, dans la peau les cellules ne se divisent pas de manière

homogène, comme les fibroblastes en culture. Par exemple les fibroblastes de peau ne se divisent pas et les

kératinocytes se divisent rapidement. Il est donc possible que l’accumulation des dommages soit plus importante

dans certaines cellules de la peau. Dépendamment du type cellulaire endommagé, cette accumulation peut faire

augmenter ou freiner les possibilités de mutations et de cancérogenèse. Afin qu’une cellule devienne

cancéreuse et initie la tumorigenèse, elle doit être en division cellulaire. Tel qu’il a été démontré par

Martinocorena et al. (2015), la peau exposée aux rayons solaires est composée d’un agencement de

populations de cellules clonales et mutées. Une grande majorité des cellules de la peau possèdent plusieurs

mutations conductrices, toutefois elles ne démontrent pas de signe de transformation tumorale. Donc, les

différentes combinaisons des étapes menant à la transformation tumorale ne sont pas encore bien comprises.

62

Figure 24. Dilution des CPD résiduels dans les chromosomes des réplications post-irradiation. À la suite de l’irradiation les deux brins d’ADN sont endommagés par les CPD. Lors de la première division cellulaire, les brins endommagés sont répliqués et se divisent dans chaque chromatide sœur. Le brin nouvellement synthétisé ne comporte pas de dommage, tandis que le brin initial en comporte toujours. L’IF montre un chromosome endommagé sur les deux chromatides sœurs. Lors de la deuxième division cellulaire, chaque brin se réplique à nouveau. Selon le mode de réplication semi-conservative, les brins endommagés se séparent dans 2 chromosomes où ils se répliquent et permettent d’observer une chromatide sœur endommagée. Les brins synthétisés lors de la première réplication se répliquent à nouveau pour former la seconde chromatide sœur non endommagée des chromosomes. Les chromosomes de la deuxième division cellulaire, possèdent une chromatide sœur endommagée seulement. Au fil des divisions cellulaires, de moins en moins de chromosomes comportent des dommages persistants.

2e division X divisions

CPD

Brin endommagé

Brin nouvellement synthétisé

Deux chromatides

sœurs endommagées

Une chromatide

sœur endommagée

Aucune chromatide

sœur endommagée

1e division

63


Les immunocytofluorescences (IF) de la figure 13 ont permis d’observer que les CPD résiduels semblent

s’accumuler dans certaines régions précises du génome. Cependant, la localisation exacte des CPD résiduels

dans ces régions ne pouvait pas être déterminée avec les IF. La résolution obtenue avec la technique

d’immunofluorescence utilisée n’est pas suffisante, pour déterminer si les CPD sont situés dans

l’hétérochromatine ou l’euchromatine. Afin de déterminer plus précisément la localisation des CPD résiduels

dans le génome, nous avons utilisé une technique de ChIP suivi d’un ELISA. L’euchromatine et

l’hétérochromatine ont été isolées par le ChIP et les dommages résiduels ont été quantifiés dans chaque région

de la chromatine par l’ELISA. Ainsi, nous avons pu déterminer laquelle des deux régions est la plus propice à

l’accumulation des CPD résiduels. Plus précisément, nous avons voulu observer l’impact de la compaction de

la chromatine sur l’accumulation et la persistance des CPD résiduels induits par les régimes d’irradiations CLUV

et aigüe.

Tout d’abord, les deux régions de la chromatine ont été séparées par la technique de ChIP. Deux anticorps ont

été choisis pour réaliser cet objectif, soit un anticorps se liant à la lysine 9 acétylée de l’histone H3 (H3K9ac) et

un anticorps se liant à la lysine 9 triméthylée de l’histone H3 (H3K9me3). Ces modifications post-traductionnelles

ont été choisies, car H3K9ac est une modification caractéristique de l’euchromatine, tandis que H3K9me3 est

une modification caractéristique de l’hétérochromatine constitutive (Cohen and Jia 2014), (Johnstone and Baylin

2010). Pour confirmer que le produit final immunoprécipité contenait majoritairement de l’ADN provenant de

chacune des régions désirées, des PCR quantitatifs (qPCR) ont été faits en utilisant une séquence génique

retrouvée dans chacune des régions (Tilman et al. 2012). Premièrement, la quantité du gène GAPDH a été

mesurée dans chacune des fractions, (euchromatine, hétérochromatine, contrôle positif et contrôle négatif). Les

valeurs obtenues ont été transformées en ratio et comparées à la valeur de la fraction contrôle positif. Le résultat,

présenté à la figure 16, a permis de confirmer que les fractions extraites avec l’anticorps H3K9ac étaient plus

concentrées en GAPDH que la fraction contrôle, tandis que les fractions extraites avec l’anticorps H3K9me3

étaient moins concentrées en GAPDH que la fraction contrôle. Les deux résultats obtenus étaient

statistiquement significatifs, nous permettant d’affirmer que la fraction extraite avec l’anticorps H3K9ac contenait

majoritairement de l’euchromatine, tandis que la fraction extraite avec l’anticorps H3K9me3 contenait

majoritairement de l’hétérochromatine (Zhang et al. 2015). Ensuite, la quantification de la séquence satellite

Sat2 a permis d’observer les tendances inverses. Le gène Sat2 était enrichi dans les fractions extraites avec

l’anticorps H3K9me3, tandis que la quantité du gène Sat2 dans la fraction H3K9ac était moins grande que dans

la fraction contrôle. Ces tendances étaient attendues, cependant ce résultat n’était pas significatif. Il est probable

que la séquence Sat2, qui est une séquence satellite péricentromérique, soit hypométhylée et transcrite dans

les cellules irradiées (Qu et al. 1999). Il est mentionné par Tilman et al. (2012) que la transcription de séquences

64

satellites peut être faite en réponse à un stress, tel que les UV, afin de faciliter la reconstruction de

l’hétérochromatine. Donc, la séquence Sat2, choisie pour le qPCR est probablement transcrite en réponse au

stress induit par les irradiations CLUV et aigües. Des modifications des marques post traductionnelles des

histones sont nécessaires pour permettre la transcription des séquences péricentromériques. La diminution de

la triméthylation de la lysine 9, qui recrute les protéines de compaction de la chromatine, permet l’ouverture de

la chromatine et la transcription de la séquence. Les variations des marques post-traductionnelles, stimulées

par les irradiations, pourraient expliquer les résultats non significatifs. De plus, en améliorant la technique de

ChIP pour obtenir une fraction d’hétérochromatine plus pure, il serait probable que les résultats soient plus

précis et permettent d’obtenir une différence encore plus marquée de la quantité de CPD résiduels entre les

deux régions. Autrement, la transcription et l’hypométhylation des séquences satellites sont des phénotypes

fréquemment observées chez les cellules cancéreuses (Plohl et al. 2014). L’hypométhylation du génome est

observée tôt dans les cellules précancéreuses et pourrait favoriser l’instabilité génomique des séquences

répétées (Ferguson et al. 2015). Une validation de la transcription de la séquence Sat2 pourrait être un indicateur

intéressant, afin de déterminer s’il y une hypométhylation de l’hétérochromatine des cellules irradiées par la

CLUV.

Ensuite, la quantification des CPD résiduels par ELISA a été faite dans les deux fractions obtenues avec le

ChIP, pour les cellules irradiées avec les deux régimes. Le résultat montre que pour les cellules irradiées avec

le régime aigu, les CPD sont répartis de manière homogène entre l’euchromatine et l’hétérochromatine. Par

contre, pour les cellules irradiées avec la CLUV, il y a une différence significative entre la quantité de CPD

résiduels dans l’hétérochromatine et dans l’euchromatine. Pour ces cellules, deux fois plus de CPD résiduels

ont été observés dans l’hétérochromatine. Plusieurs phénomènes permettent d’expliquer cette différence

significative. Tout d’abord, les télomères sont composés de deux séquences de cinq nucléotides : 5’TTAGGG3’

et 5’CCCTAA3’. La composition en nucléotides de ces séquences les rend particulièrement sensibles aux

dommages UV-induits. Il a été démontré que dans l’environnement cellulaire, ils sont sept fois plus sensibles à

l’induction des dommages que d’autres régions, comme le gène p53. De plus, dans les télomères, les CPD sont

tolérés et leur réparation est presque inexistante, permettant leur accumulation dans l’hétérochromatine

(Rochette and Brash 2010). L’hypothèse principale permettant d’expliquer l’absence de réparation dans

l’hétérochromatine, est que la compaction de l’ADN et la présence de protéines de compaction empêchent les

protéines de la NER d’accéder aux dommages. Certaines analyses ont démontré que la réparation des CPD

sur l’ADN nu est plus rapide que la réparation des CPD dans la chromatine. Donc, lorsque l’accès aux

dommages est réduit, l’efficacité de réparation par la NER est aussi réduite, voire presque complètement inhibée

si les dommages sont inaccessibles (Lans et al. 2012), (Zavala et al. 2014). De plus, il a été démontré qu’une

grande partie du centromère est composé de séquences répétées, comme les séquences satellites, les SINE

(short interspersed elements) et les LINE (long interspersed elements) (Singer 1982), (Prades et al. 1996), (Plohl

65

et al. 2014). Ces séquences ont aussi été reconnues pour leur prédisposition à la formation de CPD,

principalement dû à la présence de plusieurs thymines successives. Cependant, la présence des séquences

polyA : T est moins favorable à la formation de nucléosomes. L’accès aux dommages à l’intérieur de ces régions

est moins restreint que dans l’hétérochromatine. Alors, les séquences péricentromériques sont des régions

sensibles à la formation de dommages UV-induits, mais où la réparation pourrait être moins restreinte que dans

les télomères (Wyrick and Roberts 2015). Étant donné l’importance des séquences péricentromériques dans

divers processus cellulaires, comme la ségrégation des chromosomes et le maintien d’hétérochromatine,

l’accumulation de dommages dans cette région pourrait être dommageable pour la cellule (Plohl et al. 2014).

Donc, pour effectuer la réparation des dommages UV-induits par la NER, des modifications et réarrangements

de la chromatine sont nécessaires (Sugasawa et al. 1993, Gong et al. 2005, Osley et al. 2007). L’ouverture et

la relaxation de la chromatine sont faites par plusieurs facteurs, qui sont recrutés par la présence de dommages

à l’ADN. Plusieurs études ont souligné l’importance de la structure de la chromatine, pour la réparation des

dommages à l’ADN (Lans et al. 2012, Czaja et al. 2012, Osley et al. 2007, Palomera-Sanchez and Zurita 2011).

La position des nucléosomes a aussi un impact sur la réparation, qui est possible seulement lorsque l’ADN est

dépourvu de nucléosomes sur une séquence d’au moins 100 pb (Huang and Sancar 1994, Adam and Polo

2012).

Un dernier mécanisme favorise la réparation des CPD dans l’euchromatine et empêche l’accumulation des

dommages résiduels dans cette région de la chromatine, la TC-NER (Hanawalt 2001). L’ADN activement

transcrit est continuellement parcouru par la machinerie de transcription, qui est bloquée par la présence d’un

CPD. La TC-NER est recrutée pour réparer les dommages qui bloquent l’ARN polymérase II (Hanawalt 2001),

(Hanawalt et al. 2003). La TC-NER permet d’augmenter les probabilités qu’un dommage sur un gène transcrit

soit réparé, par rapport à l’ADN du reste du génome (Denissenko et al. 1998, Balajee and Bohr 2000, Hanawalt

2001). Le résultat de localisation des CPD résiduels dans les cellules ayant reçues une dose aigüe d’UVB, vient

appuyer ces explications. La quantité de dommages après une seule irradiation est équivalente dans

l’hétérochromatine et l’euchromatine, ce n’est donc pas la formation des dommages qui a un impact sur leur

localisation, mais plutôt la réparation des gènes actifs entre les irradiations du régime chronique qui prévient

l’accumulation dans l’euchromatine mais pas dans l’hétérochromatine (Reed 2011). Néanmoins, l’euchromatine

contient toujours des dommages, ce qui suggère que la condensation de la chromatine n’est pas le seul

mécanisme impliqué dans l’accumulation des CPD résiduels.

La figure 25 illustre l’hypothèse la plus probable, selon nous, expliquant l’accumulation des CPD résiduels dans

l’hétérochromatine suite à une irradiation CLUV. Au moment de la première irradiation, les CPD s’accumulent

aléatoirement sur le génome, autant sur l’hétérochromatine que sur l’euchromatine. Durant les 12 h qui séparent

chaque irradiation, la réparation des CPD de l’euchromatine est faite par la NER, cependant dans

66

l’hétérochromatine les protéines et la compaction de l’ADN par les nucléosomes empêchent l’accès aux

dommages et rendent la réparation difficile. Les fractions d’hétérochromatine constitutive, contenant les

télomères et le centromère, ne se décondensent pas complètement causant l’accumulation de dommages

résiduels, qui persistent sur le génome (Arora et al. 2012). De plus, la confluence cellulaire maintenue lors des

irradiations limite la réplication cellulaire et la décondensation complète des séquences d’hétérochromatine.

Figure 25. Hypothèse expliquant l’accumulation des CPD résiduels dans l’hétérochromatine. Lors de la première irradiation d’un régime d’irradiations chroniques, les dommages se forment dans l’hétérochromatine et dans l’euchromatine de manière égale et relativement aléatoire. Dans l’hétérochromatine la réparation des CPD est plutôt difficile dû à la présence de protéines qui permettent la compaction de la chromatine. Dans l’euchromatine la réparation des CPD est plus facile, l’accès aux dommages pour les protéines de réparation est favorisé. À chaque irradiation, les dommages s’accumulent dans l’hétérochromatine, ce sont les CDP résiduels (en jaune), tandis que les dommages présents dans l’euchromatine sont majoritairement formés à chaque nouvelle irradiation.

Hétérochromatine Euchromatine Irradiation chronique

Dommage nouvellement induit

Dommage résiduel

Légende

NER

Réparation difficile

67

5.3. Fréquence des photo-dommages sur les différents sites dipyrimidiniques

La technique d’ELISA utilisée précédemment nous a permis d’obtenir une quantification relative des CPD

résiduels dans les états de la chromatine, par contre cette technique ne permettait pas de quantifier précisément

les différents types de dommages, i.e. les CPD et les 6-4 PP dans les différents types dipyridiniques. Alors, pour

analyser la composition des dommages résiduels dans le génome entier, une technique de LC-MS/MS a été

choisie (Douki et al. 2000, Douki and Cadet 2001). La distribution des dommages résiduels formés par les deux

types d’irradiations (chronique et unique) a été analysée et comparée. Ainsi, nous avons pu déterminer l’impact

du régime d’irradiation CLUV sur la composition des dommages résiduels. La technique de LC-MS/MS a été

choisie, car la majorité des autres techniques utilisées pour ce type d’analyse ne permettait pas d’obtenir un

résultat aussi complet. Les autres techniques étaient limitantes, soit au niveau des types de dommages, par

exemple avec l’ELISA, soit par rapport à la section du génome pouvant être analysée, par exemple avec la

ligation-mediated PCR (LMPCR). L’analyse par LC-MS/MS, de la composition des types de dommages

résiduels trouvés dans le génome entier, a permis de détecter les 3 types de CPD les plus abondants (TT, TC

et CT) et les 2 types de 6-4 PP (TT et TC). Les résultats obtenus sont semblables à plusieurs autres études

précédentes. Les CPD de type TT étaient les plus fréquents, suivis par les TC et les CT, tandis que les CPD de

type CC, qui sont les moins fréquents, n’ont pas été détectés dans notre analyse (Mitchell et al. 1992, Pfeifer

1997, Douki and Cadet 2001). La fréquence des CPD pour les cellules irradiées avec le régime CLUV était de

84,70 % ± 3,07 de type TT, ce qui est plus élevé que pour les cellules irradiées avec une dose aigüe, où le

pourcentage de type TT était de 77 % ± 3.16. Le pourcentage de CPD de type TC était à l’inverse plus grand

dans les cellules irradiées avec la dose aigüe (21,1 % ± 3,1) qu’avec la CLUV (13,5 % ± 1,6). Les CPD résiduels

de type CT étaient induits selon un pourcentage très similaire par les deux types d’irradiation (Aigüe: 1,9 % ±

1,5 ; CLUV: 1,8 % ± 2,0), tandis qu’aucun CPD de type CC n’a été détecté pour les deux irradiations. Plusieurs

facteurs font varier la composition des CPD et des 6-4 PP formés dans le génome, par exemple les séquences

d’ADN, les longueurs d’onde de l’irradiation et la méthode d’analyse des dommages. Cependant dans notre

étude, à l’exception du régime d’irradiation, tous les facteurs étaient les mêmes. D’autres facteurs doivent être

pris en compte pour expliquer la différence entre la composition des dommages résiduels des cellules irradiés

avec les régimes CLUV et aigu.

Premièrement, les analyses de Mitchell et al. (1992) ont permis de comparer l’induction des dommages par les

UVB et les UVC, par une technique de digestion de l’ADN par la T4 endonucléase V. Dans cette étude, des

plasmides d’une séquence spécifique Alu1 de 257 pb ont été irradiés. Cette enzyme est isolée de bactéries E.

coli infectées par le bactériophage T4 et permet la réparation des CPD (Cafardi and Elmets 2008). Donc, en

connaissant la séquence génomique, il est possible de déterminer la composition en pyrimidines des CPD. Cette

étude a permis d’observer qu’en plus de la structure et de la séquence, les longueurs d’onde influencent le type

68

de dommage formé. La présence de purines, particulièrement les guanines, en 5’ d’un dimère de pyrimidines

inhibe la formation des CPD, tandis que la présence d’une pyrimidine en 5’ d’un dimère de pyrimidines favorise

la formation des CPD. Ensuite, une seconde étude démontrant des résultats semblables aux nôtres est celle de

Douki et Cadet (2001). Ces derniers ont optimisé le développement de la technique de détection des types de

dommages UV-induits dans le génome entier, la technique de LC-MS/MS, utilisée dans notre projet. En plus de

quantifier les CPD et les 6-4PP en même temps, cette technique permet de parcourir le génome entier et de

quantifier tous les CPD, même ceux dont les cytosines ont été désaminées. Finalement, les analyses de

Rochette et al (2003) ont démontrés des compositions en CPD différents des nôtres et des analyses

précédentes. Ils ont obtenus des proportions de TT : TC : CT : CC d’environ 28 : 26 : 16 : 30, pour les cellules

irradiées avec les UVB, les UVC et un simulateur de lumière solaire (Rochette et al. 2003). Cependant, la

séquence analysée dans cette étude était un locus aprt une séquence riche en cytosine, ce qui expliquerait la

plus grande proportion de CPD de type CC que dans notre analyse, qui ciblait le génome entier.

L’objectif précédent a permis d’observer une accumulation des CPD résiduels majoritairement dans

l’hétérochromatine, donc à l’intérieur de régions d’ADN inactives et condensées. L’hétérochromatine contient

les séquences télomériques et centromériques, qui sont composées d’une multitude de séquences répétées

(Plohl et al. 2014). Les télomères sont composés de la séquence 5’TTAGGG/5’CCCTAA. La séquence sur le

brin G est composée d’un dimère de thymines et la séquence sur le brin C est composée de quatre pyrimidines

qui se suivent. Ces séquences trouvées des milliers de fois dans le génome sont des points chauds de formation

des dommages UV-induits. De plus, il a été démontré que les séquences contenant plusieurs pyrimidines

subséquentes favorisent la formation de dommages. Donc, sur un brin la formation de CPD de type TT est

possible, tandis que sur le brin opposé, les CPD de type CC et CT peuvent être formés, facilitant la formation

de CPD sur le génome, dans une région où la réparation est très faible (Brunk 1973, Rochette and Brash 2010).

Les CPD de type CC sont formés moins fréquemment que les autres types de CPD et aucun CPD de type CT

ne peut être formé dans les télomères, ce qui peut expliquer en partie leur faible représentation dans nos

analyses. De plus, aucun dommage de type CC n’a été observé, ce qui pourrait être expliqué par la désamination

des cytosines et des 5’-méthylcytosines contenues dans les CPD. Les cytosines sont naturellement désaminées

en quelques jours même en quelques heures, lorsqu’ils sont dans un CPD, pour devenir un uracile. Tandis que

les 5’-méthylcytosines sont désaminées encore plus rapidement, en quelques heures et deviennent des

thymines. Les uraciles ainsi formés dans les CPD peuvent être reconnus et excisés par les Uracil DNA

glycosylases. Étant donné, la durée de l’irradiation chronique, la quantité de CPD résiduels contenant des

cytosines est diminuée par rapport aux CPD de type TT, dû à la désamination des cytosines et à la réparation

de l’uracile formé. De plus, il est probable que les cytosines des régions péricentromériques fortement méthylées

aient été désaminées pour devenir des thymines. Les analyses de LC-MS/MS permettent la reconnaissance

des cytosines désaminées en uraciles, mais cette méthode ne permet probablement pas de différencier les 5’-

69

méthylcytosines désaminées en thymines, des thymines réelles (Cannistraro and Taylor 2009). Une hypothèse

supplémentaire serait que les cellules favorisent la réparation des CPD contenant une cytosine, en tant que

mécanisme de protection contre la mutagenèse UV-induite. Cependant, il a été démontré que la protéine XPC

se lie aux dommages sans préférences, elle n’a pas d’affinité pour un type de dommage précis (Shell et al.

2013, Lee et al. 2014, Geacintov and Broyde 2017). Alors, ici aussi des études supplémentaires sont

nécessaires pour comprendre les mécanismes qui favoriseraient la réparation des CPD contenant une cytosine,

au profit des CPD de type TT.

Nos analyses ont démontré qu’une majorité de CPD résiduels se situent dans l’hétérochromatine, qui est, en

majeure partie, constituée des télomères et des centromères. Ces régions sont fortement méthylée et les

cytosines méthylées peuvent être désaminées encore plus rapidement que les cytosines non modifiées.

Cependant, les cytosines méthylées se trouvent majoritairement dans les séquences CpG. Ces séquences

n’existent pas dans les télomères, mais elles sont trouvées en grande quantité dans les régions

subtélomériques, qui sont incluses dans l’hétérochromatine (Lee et al. 2009, Steinert et al. 2004, Brock et al.

1999). De plus, les cytosines méthylées ont un maximum d’absorption plus près des longueurs d’onde des UVB

(280 à 315 nm) que les cytosines non modifiées. Le maximum d’absorption des cytosines est de 267 nm, tandis

que l’ajout d’une méthylation décale le maximum d’absorption à 273,5 nm (Ploeser and Loring 1949, Barbatti et

al. 2010). Donc la formation des CPD par les UVB est 15 fois plus fréquente sur ces cytosines méthylées

(Rochette et al. 2009). En plus de favoriser la formation des CPD, les séquences CpG avec une cytosine

méthylée favorisent la désamination des cytosines en thymine. Les CPD résiduels sont composés en apparence

d’une plus faible quantité de CPD contenant des cytosines, toutefois cette observation peut être due à la

transformation des cytosines en thymines dans les CPD. La faible représentation des CPD contenant des

cytosines dans les cellules irradiées avec le régime CLUV, peut aussi être due à la présence des séquences

SINE. Ces séquences trouvées dans l’hétérochromatine contiennent plusieurs séquences CpG. Ces cytosines

ont aussi la possibilité d’être désaminées et transformées en thymine (Daniel et al. 2015).

Enfin, la quantité de 6-4 PP observée n’était pas différente entre les cellules irradiées avec les deux régimes.

Cependant, en observant les résultats bruts la quantité de 6-4 PP était plus importante dans les cellules irradiées

avec le régime aigu qu’avec le régime CLUV. La quantité de 6-4 PP de type TT en nombre de lésions par million

de bases était de 1,38 pour les cellules irradiées avec le régime aigu et de 0.28 pour les cellules irradiées avec

le régime CLUV. Tandis que pour les 6-4 PP de type TC, 2,9 lésions par million de bases pour les cellules

irradiées avec le régime aigu et de 0,25 lésions par million de bases pour les cellules irradiées avec le régime

CLUV. Alors, la quantité de 6-4 PP de type TT des cellules irradiées avec le régime aigu est 5 fois plus élevée,

tandis que la quantité de 6-4 PP de type TC est plus de 10 fois plus élevée pour ces mêmes cellules. Les 6-

4 PP sont réparés plus rapidement que les CPD. Il a été démontré que plus de 80 % des 6-4 PP sont réparés

70

en moins de 24 h après une irradiation et environ 100 % des 6-4 PP sont réparés après 24 h (Perdiz et al. 2000,

Courdavault et al. 2004). La quantité différente de 6-4 PP induits par les deux types d’irradiation peut être due

à la rapidité de réparation de ces dommages. Douze heures séparent chaque irradiation dans le régime CLUV,

ce qui alloue suffisamment de temps pour la réparation d’une majorité des 6-4 PP, les empêchant de

s’accumuler. De plus, les cellules irradiées avec l’irradiation aigüe étaient récoltées immédiatement après

l’irradiation, donc aucun temps n’était alloué pour la réparation des dommages. Pour ajouter à cela, les cellules

irradiées avec le régime chronique étaient récoltées 12 h après la dernière dose d’UVB, donc le processus de

réparation pouvait être effectué.


Les échanges de chromatides sœurs sont reconnus en tant qu’indicateur de la stabilité génomique (Nakanishi

and Schneider 1979, Palitti et al. 1982). L’augmentation de leur fréquence est un indicateur de la présence de

dommages à l’ADN et d’instabilité génomique, causés par l’effet d’agents toxiques, tels que les rayons UV, les

radiations ionisantes et le tabagisme (Sahin et al. 2009). Les immunocytofluorescences des figures 19 et 20 ont

permis d’observer une augmentation et une accumulation des échanges de chromatides sœurs dans les cellules

irradiées avec le régime CLUV. L’augmentation des échanges de chromatides sœurs suggère que les

irradiations chroniques augmentent l’instabilité génomique. Afin de valider cette observation, nous avons voulu

comparer la quantité de SCE dans les cellules irradiées avec le régime CLUV et dans les cellules n’étant pas

irradiées. Le résultat obtenu est similaire aux résultats d’analyses précédentes, qui ont démontrés une

augmentation des SCE à la suite d’une exposition à un agent génotoxique (Sahin et al. 2009, Tug et al. 2013,

Gajski and Garaj-Vrhovac 2010). Le BrdU a aussi été reconnu pour favoriser la formation des SCE dans les

cellules (Zhao et al. 1992). Toutefois, les cellules du groupe irradié et du groupe contrôle subissaient le même

traitement et ont reçues la même concentration de BrdU étaient ajouté dans le milieu cellulaire. La différence

observée ne peut donc pas être attribuée à l’ajout de BrdU (Wilson and Thompson 2007). Nous avons observé

une quantité d’échanges de chromatides sœurs significativement plus élevée dans les cellules irradiées par

rapport aux cellules contrôles. Cette augmentation peut s’expliquer par l’action de deux mécanismes cellulaires,

un premier permettant la réplication de l’ADN en présence de dommages, l’évitement des dommages (section

1.4.2.2) et un second permettant la réparation de l’ADN, la recombinaison homologue.

Le mécanisme d’évitement des dommages est recruté par la polyubiquitination de PCNA, par le complexe

protéique SHPRH, une protéine humaine homologue de Rad5 (Unk et al. 2006). Le brin nouvellement synthétisé

de la chromatide sœur opposée est utilisé comme brin modèle pour la synthèse de l’ADN. Cette voie permet

d’éviter la formation de mutation lors de la synthèse de l’ADN, cependant, lors du processus, il se forme une

jonction entre les chromatides sœurs. Il a été démontré chez la levure, que la voie d’évitement des dommages

71

est favorisée lorsque ces cellules sont irradiées par une faible dose chronique d’UV (Hishida et al. 2009). Il serait

probable que le même phénomène s’observe dans nos cellules, car ces mécanismes sont conservés pour toutes

les cellules eucaryotes. Il a été démontré, pour des cellules HeLa, que la polyubiquitination de PCNA est visible

à partir de 1,5 h après une irradiation aux rayons UV et persiste jusqu’à 24 h après (Chiu et al. 2006). Pour que

la polyubiquitination de PCNA soit faite, il faut tout d’abord une première ubiquitination de la lysine 164 de PCNA

par la voie de RAD6, puis le recrutement du complexe UBC13/MMS2 s’associe à la protéine RAD5, liée à la

chromatine, permet la polyubiquitination de PCNA. Chez l’humain, la protéine SHPRH est recrutée par la

présence de dommages à l’ADN pour procéder à la polyubiquitination de la lysine 63 de PCNA (Saugar et al.

2014). Les facteurs déterminant quel mécanisme de tolérance des dommages est utilisé dans les cellules

humaines sont mal connus. Cependant, il a été reconnu que le stade du cycle cellulaire a un impact sur le choix

du mécanisme de tolérance des dommages.

L’augmentation de la synthèse translésionnelle dans les cellules irradiées aux rayons UV est reliée à

l’augmentation des mutations dans ces cellules (Chiu et al. 2006). Donc, la synthèse translésionnelle n’est

probablement pas le mécanisme le plus souhaitable, particulièrement en cas d’irradiation chronique, où les

dommages s’accumulent continuellement. Afin de diminuer les probabilités de mutations, il est probable que les

cellules tendent à favoriser le mécanisme d’évitement des dommages, malgré la formation de SCE. Une

augmentation des protéines de cette voie pourrait suggérer que l’augmentation des SCE est liée à une

augmentation de l’évitement des dommages au profit de la TLS. De plus, certaines protéines permettent une

protection cellulaire contre les SCE, par exemple BLM qui est recrutée en amont de la voie de l’évitement des

dommages. La protéine BLM permet la résolution des jonctions de Holliday. L’importance de la protéine BLM

pourrait aussi être investiguée pour son implication dans la résolution des jonctions de Holliday, elle inhibe la

formation des SCE lors de la phase S. Cette protéine s’accumule dans les phases S et G2 du cycle cellulaire et

particulièrement en phase S lorsque la réplication est inhibée. Donc, il est probable que la diminution de la

réplication et l’arrêt des fourches de réplication induites par les dommages UV-induits permettent l’accumulation

de BLM (Cipolla et al. 2016, Branzei and Szakal 2016). Le syndrome de Bloom est une maladie caractérisée

par des mutations dans le gène de la protéine BLM. Cette maladie présente des symptômes de sensibilité aux

rayons solaires ainsi qu’une prédisposition plus élevée aux cancers cutanés. De plus, les cellules provenant de

patients atteints du syndrome de Bloom présentent une instabilité génétique et une quantité de SCE plus élevée

que la normale (van Wietmarschen and Lansdorp 2016). Donc, il serait intéressant de quantifier cette protéine

et ses différentes modifications post-traductionnelles. Cette analyse permettrait d’observer son importance dans

la formation des SCE pour les cellules irradiées avec un régime chronique en comparaison avec les cellules

contrôles.

72

Le second mécanisme pouvant être responsable de la formation des SCE est la recombinaison

homologue. Dans les cellules ayant été irradiées, le recrutement de la recombinaison homologue s’explique par

la présence de CPD résiduels sur l’ADN lors de la réplication. La distorsion de ces dommages bloque la

polymérase réplicative et il se produit une régression de la fourche de réplication. Lorsque le dommage se situe

sur le brin discontinu, la polymérase est arrêtée au dommage, tandis que la réplication du brin continue se

poursuit. Ensuite, la polymérase bloquée est dissociée du brin pour être replacée en amont du dommage. La

section d’ADN contenant le dommage est monocaténaire. La protéine RPA se fixe à l’ADN simple brin dans le

génome, ce qui permet le recrutement de la protéine ATR (Burrows and Elledge 2008). Lorsque le dommage

se situe sur le brin continu, le complexe de réplication peut rester associé ou se dissocié du brin d’ADN, pour

poursuivre la réplication en amont du dommage, laissant une section monocaténaire. Cependant, il arrive que

la fourche de réplication soit bloquée et dissociée de l’ADN sans pouvoir poursuivre en amont de la lésion, il y

a alors une régression de la fourche de réplication. Il se forme une pseudo-cassure double brin sur l’ADN, cette

lésion est réparée par un mécanisme similaire à la recombinaison homologue. La protéine ATM se fixe sur le

site du dommage pour recruter les protéines du complexe Mre11. Ce complexe permet la réparation de la

cassure double brin par le mécanisme de la recombinaison homologue (Yeeles et al. 2013, Bakkenist and

Kastan 2015). Le mécanisme principal de réparation des cassures double brins chez l’humain est la

recombinaison homologue, toutefois ce mécanisme permet la formation de jonctions de Holliday. La résolution

de ces jonctions peut occasionner des échanges de chromatides sœurs, selon le sens du clivage de l’ADN. La

figure 10 présente les jonctions de Holliday et la possibilité ou non d’échange de chromatide sœur, selon le sens

de la résolution des jonctions (Matos and West 2014).

Finalement, la formation de SCE dans les cellules irradiées aux UV est probablement due à deux mécanismes.

Le premier, l’évitement des dommages, permet de poursuivre la réplication en tolérant les dommages UV-induits

et le second est un mécanisme de recombinaison homologue, qui survient lors d’une régression de la fourche

de réplication. Dans les deux cas, les protéines ATR et ATM permettent le recrutement de protéines de

réparation de la recombinaison homologue, par exemple Rad51. L’investigation de l’implication de la protéine

Rad51 à la suite des irradiations aux UV permettrait de confirmer que les mécanismes de l’évitement des

dommages et de réparation des cassures, induites par les fourches de réplication sont responsables de la

formation des SCE.

Récemment, des travaux ont été faits sur des cellules de peau de souris irradiées avec des expositions

chroniques. Ces expositions ont causées la formation de cellules quiescentes contenant des CPD résiduels. En

forçant les cellules à se répliquer, les chercheurs ont observés la formation de carcinomes spinocellulaires.

Pourtant, des analyses ont démontrées que ces cellules cancéreuses ne contenaient pas les mutations

signatures des UV (van de Glind et al. 2016). Les auteurs de cette étude n’ont pas précisé la raison de la

73

formation des cancers observés, cependant plusieurs hypothèses peuvent être émises. Selon nos travaux, la

présence des CPD résiduels dans ces cellules favoriserait l’instabilité génomique et ferait augmenter la

fréquence des SCE. L’instabilité génomique induite par les CPD résiduels pourrait ainsi être en cause dans la

formation des cancers cutanés.

74

75

6. Conclusion

76

Depuis plusieurs années, les études épidémiologiques ont fait le lien entre l’accumulation d’expositions aux

rayons solaires et la formation des cancers de la peau. Afin de simuler l’exposition solaire humaine, plusieurs

équipes de recherche ont soumis des modèles vivants à des expositions chroniques de différents types de

rayons solaires. Ces études ont démontrées que parmi les longueurs d’onde émises par le soleil, les UVB étaient

en cause dans l’initiation de la carcinogenèse cutanée. Les UVB sont responsables de la formation de

dommages pré-mutagènes, les CPD. Ces dommages sont responsables de la formation de mutations de

transitions C→T et CC→TT, retrouvées dans les cancers cutanés non mélanocytiques. Dans notre laboratoire,

des fibroblastes de peau ont été soumis à une irradiation chronique composée de plusieurs doses répétées et

non létales d’UVB (75 J/m2 aux 12 h durant 7,5 jours). Les irradiations chroniques forment des CPD, qui

s’accumulent dans le génome et y persistent durant au moins 7 jours à la suite de l’irradiation. L’objectif de mon

projet était de comprendre l’impact de ces dommages résiduels dans le génome. Quatre objectifs ont été fixés,

soit d’observer leur distribution lors des divisions post-irradiation, de déterminer leur localisation dans la

chromatine, de quantifier les types de dommages qui composent les dommages résiduels et enfin, nous avons

voulu observer leur impact sur la stabilité génomique.

La première partie du projet a permis de déterminer que les CPD résiduels, qui persistent dans le génome, sont

dilués lors des divisions cellulaires, selon la réplication semi-conservative. Nous avons aussi observé que la

présence des CPD résiduels cause un ralentissement important de la division cellulaire. Pour le deuxième

objectif, nous avons utilisé une technique d’immunoprécipitation de la chromatine, suivi d’un ELISA pour

déterminer qu’une plus grande quantité de CPD résiduels s’accumulent dans l’hétérochromatine que dans

l’euchromatine. Cette différence pourrait être due à la compaction de l’ADN et à la présence de protéines de

compaction de l’ADN. Ces protéines freinent la réparation des dommages dans l’hétérochromatine en

empêchant les protéines de la NER d’accéder aux dommages et de s’y lier. De plus, la réparation constante des

CPD sur les gènes actifs par la TC-NER et la réparation des brins non transcrits de l’euchromatine par la GG-

NER empêche l’accumulation des CPD dans l’ADN actif.

Pour la troisième partie de projet, nous nous sommes intéressés à la fréquence de chaque type de dommage

résiduel. Les analyses de LC-MS/MS, ont permis de quantité trois types de CPD (TT, TC et CT), ainsi que deux

types de 6-4 PP (TT et TC) dans les cellules irradiées avec la CLUV et avec une dose aigüe. La quantité de

CPD de type TT était significativement plus élevée dans les cellules irradiées avec la CLUV, tandis que la

quantité de CPD de type TC était plus élevée dans les cellules irradiées avec une dose aigüe. Une hypothèse

pour expliquer cette différence est probablement que les cytosines et les 5’-méthylcytosines dans les CPD

résiduels perdent leur groupement amine. Cette transformation se produit naturellement sur les cytosines,

toutefois de manière assez lente, tandis que dans les CPD la désamination est beaucoup plus rapide et peut se

faire en quelques heures. Donc, les CPD contenant des cytosines semblent être moins fréquent lors des

77

analyses de LC-MS/MS, car les cytosines ont été désaminées en uracile ou en thymine. De plus, les uraciles

de l’ADN sont reconnus et excisés par les Uracil DNA glycosylases qui diminuent les risques de mutations

génétiques.

Dans la dernière partie du projet, nous nous sommes intéressés à l’impact de la présence des CPD résiduels

sur la stabilité génomique. Pour s’y faire, nous avons comparé la quantité d’échanges de chromatides sœurs

dans les cellules irradiées avec la CLUV et les cellules non irradiées. Les échanges de chromatides sœurs

étaient significativement plus élevés dans les cellules irradiées que dans les cellules non irradiées. Cette

différence suggère une instabilité génomique causée par la présence des CPD résiduels. Deux mécanismes

pourraient permettre l’augmentation des SCE dans les cellules irradiées. Le premier est la voie de l’évitement

des dommages et le second est la réparation de la régression des fourches de réplication. Ces deux

mécanismes engendrent la formation de jonctions de Holliday et utilisent des protéines de la recombinaison

homologue. La résolution des jonctions Holliday formés par ces mécanismes peut entrainer des échanges de

chromatides sœurs. De plus, il est probable que ces mécanismes soient favorisés dans les cellules irradiées

par le régime chronique, afin d’éviter les mutations et l’apoptose.

Globalement, nos résultats démontrent que les mécanismes de réparation des cellules ont des limitations, tous

les dommages ne sont pas réparés et certains persistent. Toutefois, nos analyses semblent démontrer que les

mécanismes de réparation favorisent la réparation des dommages mutagènes, en laissant persister les CPD de

type TT. Ce mécanisme pourrait éviter la formation rapide de mutations cancérigènes, mais à long terme

favoriserait l’instabilité génique qui mènerait aussi à l’initiation des cancers cutanés.

Mon projet avait comme objectif général de caractériser les CPD résiduels induits par une irradiation chronique

aux UVB, afin de mieux comprendre l’impact des dommages résiduels dans le génome. Toutefois, plusieurs

questions restent sans réponses. Quel mécanisme de tolérance des dommages est favorisé par les cellules

irradiées par une CLUV, la TLS ou l’évitement des dommages? Est-ce que l’évitement des dommages et la

recombinaison homologue sont responsables de l’augmentation des SCE? Est-ce que l’instabilité génomique

induite par les CPD résiduels pourrait être un facteur promouvant l’initiation de la cancérogenèse cutanée?

Pour répondre à ces questions, plusieurs analyses sont possibles. Tout d’abord, le mécanisme de tolérance des

dommages le plus utilisé à la suite de chaque irradiation pourrait être déterminé en quantifiant la protéine PCNA

et ses modifications post-traductionnelles, soit l’ubiquitination ou la polyubiquitination. Cette analyse permettrait

aussi de déterminer si le régime chronique favorise l’utilisation de l’évitement des dommages pour éviter les

mutations signatures des UV. Ainsi, il serait possible d’identifier la voie de tolérance des dommages qui est en

majorité responsable de l’accumulation et de la persistance des CPD résiduels. Il serait possible de déterminer

l’impact des mécanismes d’évitement des dommages et de recombinaison homologue dans l’augmentation des

78

SCE, en comparant la quantité de la protéine Rad51/BLM dans les cellules des deux régimes d’irradiation. En

terminant, il serait pertinent d’investiguer l’instabilité génomique induit par les irradiations chroniques. Sachant

que l’instabilité favorise l’initiation de la cancérogenèse des cellules et que les séquences satellites

péricentromériques sont sensibles à l’instabilité, il serait intéressant d’investiguer les mécanismes de maintien

de la stabilité de ces séquences.

79

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Persistance des dommages à l’ADN induits par une ... · 6-4 PP Photoproduit de pyrimidine (6-4) pyrimidone ADN Acide désoxyribonucléique ARN Acide ribonucléique ATM «Ataxia