ROLE DE L'ACTIVITE DEPENDANTE DU ROLE DE L'ACTIVITE DEPENDANTE DU CALCIUM AU COURS DU CALCIUM AU COURS DU

DEVELOPPEMENT ET DE LA DEVELOPPEMENT ET DE LA MATURATION DES NEURONES MATURATION DES NEURONES

GANGLIONNAIRES VESTIBULAIRES DE GANGLIONNAIRES VESTIBULAIRES DE

SOURISSOURIS Présentée par Laurence AUTRETPrésentée par Laurence AUTRET

Le 14 décembre 2005Le 14 décembre 2005

Directeur de thèse : G. DESMADRYLDirecteur de thèse : G. DESMADRYL

Unité 583 INSERMUnité 583 INSERM, INM, Montpellier, France, INM, Montpellier, France

Système vestibulaire

Oreille interne

GanglionVestibulaireOrgane

Vestibulaire

Cochlée

Ganglion vestibulaire

Le ganglion vestibulaire contient les corps cellulaires des neuronesqui connectent les cellules sensorielles et les noyaux vestibulaires

13 14 15 16 17 18 19 20 21 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

NAISSANCE

Mitoses terminales

Différenciation des ce llules sensorie lles

Maturation des ce llules (croissance des stéréocils )

CELLULES SENSO RIELLES

AFFERENCES

Synapses afférentes

Calyces afférents

EFFERENCES

Synapses efférentes

ACT IVIT E PHYSIO L O G IQ UE

MATURATION DES EPITHELIUMS SENSORIELS VESTIBULAIRES

Maturation du système vestibulaire

Canaux calciques dépendants du potentiel

H A U T

S E U IL

B A S

S E U IL

1 S

1 C

1 D

1 F

1 A

1 B

1 E

Ca v1.1

Ca v1.2

Ca v1.3

Ca v1.4

Ca v2.1

Ca v2.2

Ca v2.3

Type L

Type P/Q

Type N

Type R1 G

1 H

1 I

Ca v3.1

Ca v3.2

Ca v3.3

Type T

Deux grandes familles de courants calciques déterminées par leur seuil d’activation

Dans les courants calciques à haut seuil d’activation, plusieurs sous-types caractérisés par leur pharmacologie

Courant imposé Vo ltage imposé

pA

V m

V mIm

m V

HP

Patch c lam p sur ce llu le entiè re

Neuroneiso lé

M ic ropipe tte

Courantssortants

Courantsentrants

V

Deu x m od es d 'en reg istrem en t

Electrophysiologie

Evolution des courants calciques dépendants du potentiel à haut seuil

d’activation au cours du développement

Les conductances de type L restent constantes au cours du développement.

Les conductances de type N augmentent progressivement au cours du développement.

Les conductances de type P présentent un pic d’expression à E17 puis diminuent au cours du développement.

Les conductances de type Q augmentent jusqu’à la naissance puis restent constantes.

J.Physiology 1999, 518.1Chambard and coll.

Cu

rre

nt

de

ns

ity

(p

A/p

F)

(n=8)

*N -type IBa

10

20

30

40

(n=13)(n= 10) (n= 20)

(n=16)

10

20

30

40

L-type IB a

(n= 3)(n= 8) (n=8) (n= 12)

† †

P-type IBa

10

20

30

40

(n=11)

(n=7)(n=14)

Q-type IBa

E15 E17 P0 P4

10

20

30

40

Stage

*

(n= 9 )(n=4) (n= 8) (n=11)

Evolution des courants calciques dépendants du potentiel à bas seuil

d’activation au cours du développement

Le nombre de neurones exprimant un courantLe nombre de neurones exprimant un courantde type T diminue au cours du développement.de type T diminue au cours du développement.Ils ne sont que 20% à la naissance.Ils ne sont que 20% à la naissance.Lorsque la conductance de type T est présente,Lorsque la conductance de type T est présente,elle est soit de forte amplitude soit de faible amplitude.elle est soit de forte amplitude soit de faible amplitude.

J.Physiology 1999, 518.1Chambard and coll.

Cu

rre

nt

de

ns

ity

(p

A/p

F)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

100120

140

E 1 4 E 1 5 E 1 7 P0 P 4

Stage

Cu

rre

nt

de

ns

ity

(p

A/p

F)

0

20

40

60

80

100

120

140

E 1 4 E 1 5 E 1 7 P0 P 4

A

E 14 E15 E17 P0 P4

(n=13)

(n=51)

(n= 43)

(n= 69) (n= 126)

Ne

uro

ns

wit

h L

VA

IB

a (

%)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

100

Développement du système vestibulaire et évolution des courants calciques de type T

E17 P0 P6

POUSSE NEURIT IQUE POUSSE NEURIT IQUESYNA PT OGENESE

SYNA PT OGENESE

0

50

100%

L’expression des courants calciques de type T correspond à une période de pousse neuritique importante et de synaptogenèse

Proportion de cellules exprimant un courant calcique de type T

I- Caractérisation des sous-unités calciques de type T présentes sur le soma du neurone vestibulaire primaire

II- Etude de l’activité électrique

III- Rôle sur la pousse neuritique in vitro

Quelles sont les ou la sous-unités impliquées dans la genèse du courant calcique à bas seuil d’activation?

H A U T

S E U IL

B A S

S E U IL

1 S

1 C

1 D

1 F

1 A

1 B

1 E

Ca v1.1

Ca v1.2

Ca v1.3

Ca v1.4

Ca v2.1

Ca v2.2

Ca v2.3

Type L

Type P/Q

Type N

Type R

?1 G

1 H

1 I

Ca v3.1

Ca v3.2

Ca v3.3

Type T

W hole Brain

Vestibular Ganglia

500bp

500bp

W M

A

B

Caractérisation moléculaire par la technique de RT-PCR

Les ARNm des trois sous-unités sont présents à E17

Caractérisation électrophysiologique

Identification de deux populations de neurones en fonction de l’amplitude du courant calcique de type T

Neurones avec un grand courant : amplitude > 200 pA

Neurones avec un petit courant : amplitude < 60 pA

1 0 0 p A5 0 ms

2 0 0 p A1 0 0 ms

-1 0 0 mV+5 0 mV

1 0 0 p A5 0 ms

2 0 0 p A1 0 0 ms

Cinétiques d’activation et inactivation

200 pA

2 0 ms

-6 0 mV

-5 0 mV

-4 0 mV

-3 0 mV

-1 0 mV

-2 0 mV

-5 0 -4 0 -3 0 -2 0mV

0

4

8

1 2

1 6

2 0

A

ctiv

atio

n(m

s)

- 5 0 -4 0 -3 0 -2 0mV

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

In

act

iva

tion

(ms)

Cinétiques d’activation et d’inactivation rapides des courants calciques de type T pour les deux

populations de neurones :

Cav3.1 and/or Cav3.2

Les neurones ayant un grand courant calcique de type T

5 0 0 p A

1 0 ms

-1 4 0 -1 2 0 -1 0 0 -8 0 -6 00123456

mV

D

ea

ctiv

atio

n(m

s)

- 1 4 0 mV

-6 0 mV

5 0 p A

1 s0 1 2 3 4

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0N

orm

aliz

ed

cu

rre

nt

Interpulse duration (s)

10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 10 -2

0

20

40

60

80

100

8 77

6

411

13

12

12

193 2

8

T-t

ype

curr

ent i

nhib

ition

(%

)

[N i 2+ ]

C o n trô le

R in ça g e

Ni2+ 0.3 µM

Constante de temps de déactivation= 5,28 ms à -60 mV et 0,52 ms à -140 mV : Cav3.2

Constante de temps de réactivation= 1394 ms (lente) et 117 ms (rapide) : Cav3.2

IC50 = 13,4 µM, grande sensibilité au Nickel : Cav3.2

La fraction majoritaire du courant calcique de type T est générée par La fraction majoritaire du courant calcique de type T est générée par CaCavv3.23.2

Identification d’une nouvelle propriété de la sous-unité Cav3.2 : mécanosensibilité

D

Identification d’une nouvelle propriété de la sous-unité Cav3.2 : mécanosensibilité

200 pA50 ms

c ontrol

perf us ion

-100 mV +50 mV

100ms

500 pA

20 s per f us ion

pA

0 200 400 600 800

-3 00

-200

-1 00

0

Time ( s )

1 0 0 p A

2 0 ms

Ca v 3 .2

5 0 p A

2 0 ms

1 0 0 p A

2 0 ms

Ca v 3 .3Ca v 3 .1

Neurones vestibulaires ayant un grand courant calcique de type T

Canaux calciques de type T recombinants

Seule la sous-unité Cav3.2 présente une mécanosensibilité.Seule la sous-unité Cav3.2 présente une mécanosensibilité.Cet effet est réversibleCet effet est réversible

Les neurones ayant un petit courant calcique de type T

200 pA10 m s

c ontrol

Ni 2 +

-1 4 0 -1 2 0 -1 0 0 -8 0 -6 00

2

4

6

8

1 0

1 2

mV

DE

AC

(ms)

200 pA

500 m s

20 pA

500 m s

0 1000 2000 3000 4000

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Norm

alis

ed

I ca

ms

1 = 704.82 = 448.7

Les observations faites sur cette population de neurones sont similaires à celles obtenues après application de 10 µM de nickel sur la population de

neurones ayant un grand courant calcique de type T

Constante de temps de déactivation= 8,6 ms à -60 mV et 1,1 ms à -140 mV

Constante de temps de réactivation= 665 ms

(lente) et 103 ms (rapide)

Ce courant calcique de type T semble généré par Ce courant calcique de type T semble généré par CaCavv3.13.1

Quelle est l’implication du courant induit par cette sous-unité dans la forme du potentiel d’action?

La sous-unité Cav3.2 est majoritairement présente sur le soma des neurones vestibulaires à E17

Conclusion

Cette sous-unité s’active pour des potentiels proches du potentiel de repos de la cellule

Forme des potentiels d’action enregistrés à E17

Potentiel d’action suivi d’une dépolarisation post potentiel (ADP)

Potentiel d’action avec un épaulement sur la phase de repolarisation

Potentiel d’action avec une repolarisation rapide et une

hyperpolarisation post potentiel (AHP)

Induit par Cav3.2 ?

Induit par Cav3.2 ?

Effet de l’application de nickel sur les différentes formes de potentiels d’action

Le nickel induit une disparition de l’ADP

L’activation de ce courant calcique de type T L’activation de ce courant calcique de type T généré par généré par CaCavv3.2 induit une dépolarisation post 3.2 induit une dépolarisation post

potentielpotentielNi2+

Etude du potentiel d’action avec ADP ou potentiel d’action calcique

Corrélation entre la présence d’un grand courant calcique de type T et

une ADP suivant le PA

Le blocage des autres conductances calciques sont sans effet sur le PA

La TTX ne bloque pas la genèse du potentiel d’action calcique

Le grand courant calcique de type T est responsable de l’ADP ou Le grand courant calcique de type T est responsable de l’ADP ou PA calciquePA calcique

Etude du potentiel d’action avec épaulement

Quelle conductance ionique induit un épaulement lors de la phase de repolarisation du potentiel d’action au

cours du développement ?

Etude du potentiel d’action avec épaulement

Applications de 1µM et 10 µM de nickel n’ont pas d’effet sur

l’épaulement mais sur l’ADPApplication de 100µM de cadmium

inhibe l’épaulement

Application de 500 nM d’ω-agatoxine IVA (antagoniste de

canaux de type P/Q) bloque l’épaulement du potentiel d’action

L’ épaulement semble généré par un courant calcique de type PL’ épaulement semble généré par un courant calcique de type P

Conclusion

Cav3.2 génère un courant impliqué dans l’activité électrique

Présence d’une ADP et dans certains cas d’un potentiel d’action calcique.

Augmentation de l’excitabilité cellulaire et entrée massive de calcium

Rôle physiologique de cette activité électrique transitoire

dans la neuritogenèse?

Modèle in vivo impossible

Utilisation de culture de neurones vestibulaires primaires

Pas de pharmacologie spécifique de ces canaux ioniques

Utilisation de la stratégie antisens

Rôle physiologique de ce courant calcique généré par Cav3.2

Principe de la stratégie antisens

ADNc

ARNm

Hybride ARN-ADN

pas de traduction

Technique qui permet de vérifier l’effet de la disparition d’une protéineTechnique qui permet de vérifier l’effet de la disparition d’une protéine

Etude de la pousse neuritique

Cav3.2 Scramble

Les antisens ont été incorporés dans les cellules en vertLes neurones sont marqués en rouge (neurofilaments)

Antisens anti Cav3.2 diminue la pousse neuritique

Suppression du courant calcique de type T

Diminution significative de la pousse Diminution significative de la pousse neuritique dans les neurones transfectés neuritique dans les neurones transfectés avec l’oligonucléotide antisens de Cav3.2avec l’oligonucléotide antisens de Cav3.2

49

23

23

control

AS- Cav3.2

AS- Scramble

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Long

ueur

des

neu

rites

(µ

M)

**

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80

-1400

-1200

-1000

-800

-600

-400

-200

0

200

400

Am

plit

ud

e d

u c

ou

ran

t

Poten tie l m em brana i re (m V)

Neurone vestibulaire

Ca++

Cav3.2

PA avec ADP

Pousse neuritique

Effet sur la formation des synapses??

Conclusion générale et perspectives

Conclusion générale et perspectives

Faible amplitude de courant

Cav3.2Cav3.1

Apparition plus Apparition plus précoce dans le précoce dans le développement?développement?

PA avec épaulement

P/Q ???

Rôle au cours du développement ?Rôle au cours du développement ?

Maturation des conductances potassiques

Les oligonucléotides antisens sont dans le soma des neurones

Neurofilaments sont marqués en rougeLes oligonucléotides sont marqués en vert

Les oligonucléotides ont été intégré le soma des neurones vestibulairesLes oligonucléotides ont été intégré le soma des neurones vestibulaires

Images confocal