BIOCHIMIE, 1974, 56, 1425-1432.

Propridtds d'une ATPase C£+ ou Mg 2+ ddpcndante des membranes plasmiques de lymphocytes.

Effet de la concanavaline A sur les ATPases membranaires.

Jacques DORNAND, Jean-Claude MANI, Magdeleine MOUSSERON-CANET (*), et Bernard PAu.

Equipe de Recherche Photobioorganique du C,V.R.S., Ecole Nationale Sup~rieure de Chimie, 34075 Montpellier Cedex.

(7-7-1974).

Summary. - - The Ca2+-activated ATPase properties of isolated plasma membrane of small lymphoeytcs from young pig mesenterie nodes are charaeterised. This enzyme is activated either by Mg2+ or Ca2+.

A (Na + K +) activated ATPase can be measured if membranes are previously treated by Na deoxyeholate.

Concanavaline A, a lectin which induces tran ,formation of lymphocytes, stimulates Ca2+ or Mg2+-activated ATPases but has no effect on the (Na + K +) -ATPase.

The properties of the Ca2+ stimulated ATPase suggest either that it is involved in Ca2 + transport through the membrane or that it is bound to a contractile protein involved in membrane deformability and permeability.

INTRODUCTION.

Les antigbnes et les phytomitog6nes sont des agents qui p rovoquen t une t r ans fo rmat ion mor- phologique et m6tabol ique des lymphocytes [1]. I1 est main tenan t bien 6tabli que ces agents [2, 3] modif ien t cer ta ines activit6s enzymat iques mem- branaires . Quastel et Kaplan [4] puts Kasakura [5] ont montr6 que la r6ponse des lymphocytes san- guins humains aux mitogbnes 6tait supprim6e in vitro par l 'ouabaine, substance qui inhibe sp6eifi- quement le t ranspor t des ions monovalents , de m6me la pr6sence de cations divalents dans le mi- lieu est requise pour permet t re un d6veloppement de la r6ponse h la Phytoh6magglut in ine (PHA) [6- 8] ; un influx de Ca 2+ est observ6 sous Fact ion de ce mitog6ne [8, 9], ce cat ion 6tant d 'a i l leurs n6ces- saire h l ' i nduc t ion de la r6ponse h la PHA [10]. L 'ensemble de ces r6sultats suggbre qu ' i l existe une corr61ation entre les m6canismes de t ranspor t ionique et l 'act ivi t6 fonct ionnel le des lymphocytes .

Darts ce t ravai l nous nous efforcons de d6finir qnels sont les systbmes ATPasiques pr6sents darts la membrane p lasmique de lymphocytes de gan- glions m6sent6riques de porcs, et quelles peuvent 6tre leur modi f ica t ion sous l 'effet d 'une lectine, la concanava l ine A. Une ATPase (ATP hydrolase E.C.3.6.1.3) activ6e pr6f6rent ie l lement par Ca +2 est raise en 6vidence ; cette ATPase est for tement sti- mul6e par la Concanaval ine A alors que l 'ATPase

To whom all correspondance should be addressed.

(Na ~, K +) n'est pas augment6e. Un r a p p r o c h e m e n t est fait entre cette activit6 ATPase Ca 2+ activ6e et celles pr6sentes dans les membranes de globules rouges [11], de cellules tumorales d 'asci tes et dans les tubules de re in [12] qui sont elles aussi Ca 2+ d6pendantes et sont reli6es h des prot6ines contract i les r6glant la perm6abil i t6 de la mem- brane eellnlaire.

MATERIEL ET METHODE.

Membranes plasmiques.

Les membranes p lasmiques de lymphocy ies sont pr6par6es h par t i r de ganglions m6sent6riques de porcs selon une technique d6cri te par Allan et Crumpton [13]. Toutes les op6rat ions sont r6ali- s6es h 4°C. Les ganglions m6sent6riques (50 g) recuei l l is post mortem dans le tampon 10 mM Tris HC1 7,4, 0,15 M Na C1 (tampon A) sont broy6s par passage h t ravers une grille (diam6tre des trous 1 ram) puts agit6s 15 minutes dans 50 ml de ce tampon et filtr6s sur gaze. Le filtrat est centrifug6 2 fois h 300 g,,oy (15 ran) (Sorvall RC2-B) pour 6It- miner les noyaux et quelques cellules intactes, puts 2 fois h 4 000 gmoy (15 mn) pour 61trainer le culot de mi tochondr ies . Le surnageant est centr i - fng6 h 20 000 gmoy et le culot recuei l l i , contenant les membranes , est mis en suspension avec un volume 6gal de sucrose 80 p. cent dans un lam- pon B (10 mM Tris HC1, pH 7,4) dans un homo- g6n6iseur de Dounce. La suspension est dilu6e

93

1426 J. Dornand, J.-C. Mani, 31. Mousseron-Canet el B. Pan.

60 nfl avec du sucrose 40 p. cent dans le t ampon B et r6part ie entre des tubes h centr i fuger (ul tracen- trifugeuse MSE 65, Swing-Out rotor 3 X 65 nil). On recouvre sans m61anger avec un volume ~gaI de sucrose 30 p. cent dans le t ampon B. On centr i - fuge 18 h h 80 000 gmoy et on recueil le la par t ie f loconneuse h l ' in terface 30-40. Cette fract ion di- lu6e 4 fois avec le t ampon B e s t centrifug6e 1 h h 20 000 gmoy ; le culot remis en suspension duns le ta lnpon B e s t de nouveau s6diment6 duns les mSmes condi t ions ; puts apr~s avoir 6t6 resus- pendu dans le t ampon B, iI est r6part i dans des tubes Eppendor f et soit utilis6 imm6dia tement soil conserv6 dans l 'azote l iquide (on n 'observe pas alors de baisse des activit6s ATPasiques). La frac- t ion ainsi obtenue est fortelnent enr ichie en acti- vit6 5' nucl6otidase (m6thode de Weaver et Boyle [14]), n ' a pas d'activit6 suceinate d6shydrog6nase (M6thode de Duve et al. [15]) ee qui montre qu'elle est exemp te de mi tochondr ies ou de mem- branes mi tochondr ia les ; elle poss~de une activit6 ad6nyl cyclase for tement stimul6e par NaF 10 -2 M (mOhode ut i l isant le dosage d'AM, Pc forln6 h par- t ir d'ATP, h l 'a ide d 'une prot~ine kinase extraite d 'endom6tre de g6nisse [16~, A ~ P c d6pendante) . Bien qu'elle poss6de une 16g6re activit6 glucose 6 phosphatase (m~thode de Swanson [171), les activit6s sp~ci,fiques en ~mole de p r o d u i t / h / m g de prot6ine en 5' nucl6otidase, succinate d6shydro- g~nase et glucose 6 phosphatase 6tant respective- ment 12, 0, et 0,29, on peut se r endre eompte qu'elle n 'est que fa iblement contamin6e par le r6ti- eulum endoplasmique. Ce r~sultat rapport6 par Allan et Crumpton [131 est attribu6 au faible d6ve- loppement ergastoplasmique des petits lympho- cytes.

Des observat ions en microscopie 61ectroniques selon [13] mont ren t que cette f ract ion est essen- t ie l lement eompos6e de v6sicules de membranes lisses.

Suspension de lymphocytes.

Elle est obtenue en compr imant de petits mor- ceaux de ganglions h 4°,C duns un t ampon 10 mM Tris HCI 7,4 0,15 M Na'C1 h l 'a ide d 'un Dounce. Le tissu dispersal est ensuite filtr6 h travers une 6pais- seur de gaze et centrifug6 10 rain. h 600 g. Le culot resuspendu dans le m~me tampon h l 'a ide d 'une pipette Pasteur est res6diment6 h 600 g ; la m~me op6rat ion est r~p6t~e 3 fois. Les cellules et les noyaux 6clat6s sont ensuite 6Iilnin~s par 2 pas- sages successifs sur une colonne de laine de nylon. Le ill]rat con]tent 5 p. cent d '6rythrocytes, 2 p. cent de larges lymphocytes et 93 P. cent de petits lymphocytes don] 9,0 p. cent son] viables comme l ' ind ique le test au bleu de Trypan .

Activitd ATPasique (Ca ~÷ ou Mg -'+) d~pendante.

Elles sont d~termin6es en mesuran t l 'hydrolyse de I'AT, P Tris (2,5 raM) par la f ract ion r iche en n iembranes plasmiques en presence de diff6rents cations, MgC12 ou CaC12 (5 mM), dans 2 ml de tam- pon 60 mM Tris HCI au pH d6sir6 ~ 37°C (l 'eau utilis~e ayant 6t6 d6min~ralis~e). La rSaetion est arr~'t6e par addi t ion d 'un nfl d 'acide tr ichlorac~- t ique 10 P. cent '~ 4°C, et apr~s avoir centrifug6 (15 mn h 10 000 g) les membranes d~natur6es, le phosphate inorganique lib~r~ est dos6 duns le sur- nageant par la m6thode de Beremblum et Chain [18]. La concent ra t ion prot6ique des membranes plasmiques est d6ternlin6e selon la nl6thode de Lowry [19].

Les r6sultats sont exprim6s en vmoles de P,." lib~r6es par heure par mg de protSine. La vitesse d 'hydrolyse de I 'ATP est l in6aire duran t 30 nm pour des concent ra t ions en prot6ine me mbr a na i r e comprises entre 50 et 150 .ag/ml.

Activit~ ATPasiqne (Na ÷, K +) ddpendante ou ouabaine d~pendante.

Elle est 6gale h la diff6rence de l 'activit6 mesu- r6e en pr6sence de 5 mM MgC12, 80 lnM NaCI, 40 mM KC1 0,1 mM EGTA, 1 mM ouabaine (activit6 ouabaine ind6pendante) et de l 'aetivit6 mesur6e en pr6sence des m6mes cations et en l ' absence d 'ouaba ine (activit6 totale) dans du tampon 60 mM Tris H.C1 au pH voulu ; une p r6 incuba t ion de 15 inn de la suspens ion de membranes avec l 'ouabaine ( inhibi teur sp6cifique de l 'ATPase (Na+ K*} d6pendante) 6tant effectu6e avant d 'ajou- ter I 'ATP.

Dans chaque cas une valeur repr6sentant l 'hy- drolyse de I 'ATP dans les condi t ions de la mesure mats en ] 'absence de membrane est re t ranch~e h la mesure.

Produits.

L'ouabaine, l 'o l igomycine, le d6oxycholate de sodium, I 'ATP Tris sont des produi ts Sigma. Le r6actif Elon et le molybdate d ' ammonium utilis6s dans le dosage Pi ainsi que les sels m6tall iques sont des produi ts Merck. L'acide 6 thacrynique est fonrn i par ~ e r c k Sharp et Dohme, le rouge de Ruthen ium par Gnrr Laboratoires, le m6thyl ¢¢D mannopyranos ide et le m~thyl a D galactopyrano- side par Pflanstiehl Laboratories Inc la Concana- val ine A (Pharmacia) est utilis6e sans puri f icat ion ult~rieure. Avant ut i l isat ion I 'ATP Tris est amen6 au pH voulu avec une solution molaire de t r ishy- droxym6thyl a mi nomO ha ne (Fluka).

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

(Ca e÷) A T P a s e m e m b r a n a i r e d e I y m p h o c y t e s . 1427

RESULTATS.

I - - ACTIVITl~ ATPase Ca 2+ ou Mg 2+ DEPENDANTE.

1) Mise e n ~ v i d e n c e .

La p repara t ion de membranes plasmiques pro- voque une hydro lyse de I 'ATP activ6e h la fois par l ' ion Ca 2+ et l ' ion Mg> ; mats l ' ion Mg > n'est pas n6cessaire h l ' ac t iva t ion par l ' ion Ca ~.

Cette hydro lyse en presence d 'une concent ra t ion en cation comprise en 0,2 et 8 mM est repr6sentbe figure 1 ; la vitesse maximale obtenue avec Ca 2"

A S I j Jmo les Pi / h i mg

/ - 10,

:i ;. (~ ~M M ++"

Fro. 1. - - Ef f e t des cations divalents Mgz+ el Ca~* sur la vi tesse d 'hydrolyse de I 'ATP par les membranes . Tampon 60 nlM Tris pH 8,30.

A - - & Mg2+ ; m--m Ca2+ ; o - - o Ca2+ et Mg2+ (1 - 1 ) .

est de 12 ~moles P i / h / m g prot6ine alors qu 'une valeur de 8 ~ m o l e s / h / m g de prot6ine peut 6tre atteinte en pr6sence de Mg 2+ ; d a n s ehaque cas un effet max imal est obtenu pour des concent ra t ions cn eatima de l ' o rd re de 3 mM alors qu 'un effet inh ib i teur est observ6 pour les valeurs sup6rieures

5 raM. Si dans le mi l ieu on place un m61ange Ca2+/Mg 2÷ en p ropor t ion 6quimol6culaire on ob- t ient une courbe situ6e entre celle de Ca 2+ et Mg 2+ seuls. D'ai l leurs si h la concent ra t ion maximale en Ca 2+ 3 mM on rajoute Mg 2* on observe une diminu- t ion de la vitesse de l 'hydrolyse , et inversement l ' add i t ion de Ca 2+ p rovoque une augmentat ion de la vitesse maximale obtenue en pr6sence de Mg 2÷ 3 raM.

paren t 0,82 ~ 0,05 mM) (fig. 2) route combina ison de ces deux ions donne une valeur inf6r ieure h celle de Ca 2+ seul mats sup6rieure 'h celle de Mg 2+ seul. Bien que la m6me Km soit obtenu pour I 'ATP en remplacan t Ca 2+ par ~Mg2+, le vmax en pr6sence de Mg 2+ n'est que 65 p. cent de celui obtenu en presence de Ca ̀ '+ ce qui veut dire que le complexe Ca 2~ ATP est un substrat pr6f6rentiel par r appor t au substrat Mg2+ ATP [20, 21].

2) E f f e t du pH.

La figure 3 repr6sente les activit6s ATPases Ca 2+ d6pendante et Mg 2+ d6pendante en fonct ion du pH, dans chaque cas le pH op t imum se situe vers pH 8,30 ; mats si h pH 7,50 les deux ATPases ont des activit6s ident iques, l 'act ivi t6 maximale obte- nue en pr6sence de Mg 2. n'est que 60 p. cent de celle obtenue en pr6sence de Ca 2+ ; le m ax im um situ6 h pH 8,30 6carte une possible pa r t i c ipa t ion des phosphatases alcal ines de la membrane ; d 'ail- leurs fi pH 10,5 il n 'y a p ra t iquemen t pas d 'hydro- lyse de I'ATP. La courbe de l 'ATPase Ca 2÷ d6pen- dante est tr6s incurv6e ce qui ind ique que l 'on est en pr6sence d 'un peti t nombre d 'enzymes, si ce n'est d 'une seule.

3) P r o p r i ~ t ~ s de l ' A T P a s e Ca ~÷ d ~ p e n d a n t e .

Na ÷ (80 raM) et K ÷ (20 raM) ainsi que les deux cat ions ensemble sont sans effet sur l ' ac t iva t ion de l ' hydro lyse de I 'ATP en pr6sence de Ca 2* ; l 'oua- baine (fig. 4) n 'affccte pas non plus cette ATPase.

11V h/pmolesPi

0,3

0,2

~ 0 o o

_ - 5 I I S m M-I

FIG. 2. - - Courbe selon Line,weaver-Burk de l 'aclivitd ATPase en fonct ion des concentrations en ATP, Cae+, Mg$ ÷. Tampon 60 mM Tris pH 8,30.

9+ • m - - = 2,5 mM ATP -t- Mg- ; - - • 2,5 mM ATP + Ca2~: D - - D 3 mM Mg2+ -4- ATP ; O - - O 3 mM Ca2+ + ATP.

I1 semble qu' i l y ait comp6t i t ion entre Ca 2+ et Mg 2+ pour les m6mes sites de fixation, et que corn- me l 'affinit6 pour Ca 2+ (Kin apparen t 0,30 0,05 raM) est plus forte que celle de Mg2÷ (Kin ap-

Le rouge de ru th6nium (10 -5 - 10 -6 M) qui inhibe l 'ATPase (Ca 2+ d6pendante Mg 2+ activ6e) des mem- branes d '6ry throcytes n 'agit pas sur cette classe

BtOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

1428 J . D o r n ( t n d , J . -C . M a n i , M . M o u s s e r o n - C a n e t e t B . P a u .

d ' e n z y m e [22] ; il en est de m 6 m e de l ' o l i g o n l y c i n e (1.0-20 ~ g / m l ) , i n h i b i t e u r des ATPases Ca 2+ depen - dan te isol6e de m i t o c h o n d r i e s . P a r con t re , r a c i d e 6 t h a c r y n i q u e (fig. 4) qui est un c o m p l e x a n t des g r o u p e m e n t s - S H l i b r e s [23] p r o v o q u e une ba i s se de l ' a c t iv i t6 A T P a s e Ca 2+ d d p e n d a n t e .

AS

/Jmoles Pi / h / m9

10.

5,

FIG. 3. - - E f fe t du pH sur les activitds sp~cifiques des ATPases membranaires , dans le tampon Tris HCl 60 mM.

m - - g ATPase Ca2+ d~pendante ; o - - 0 ATPase Mg2+ ddpendante ; O - - , ~ ATPase (Na +, K ÷) ddpendante.

I I - - ACTIVIT~ A T P a s e (Na ÷ K +) DEPENDANTE DES MEMBRANES PLASMIQUES DE LYMPHOCYTES.

Cette ac t iv i t6 est m e s u r d e c o m m e cela est i nd i - qu6 dans << Mat6r ie l et M6thode >> en u t i l i san t l ' o u a b a i n e COlnme i n h i b i t e u r sp6e i f ique de ce t te k T P a s e . Les v a l e u r s a ins i t r ouv6es son t r a p p o r t 6 e s s u r le t ab leau I ; e l les son t fa ib les p a r r a p p o r t anx v a l eu r s r a p p o r t d e s p o u r les n l e m b r a n e s p l a s m i q u e s d ' a u t r e s t i ssus tel que le fo ie de r a t p a r e x e m p l e [24].

Nous avons t ra i t6 la f r a c t i o n n l e m b r a n a i r e p a r le d 6 o x y c h o l a t e de s o d i u m se lon une m 6 t h o d e d6cr i t e r 6 c e m m e n t p a r S p a c h [25] et m e s u r 6 l ' A T P a s e (Na + K ÷) d d p e n d a n t e de ce t te f r ac t ion . Les r6sul ta ts son t r a p p o r t d s sur la f igure 5 en fonc - t ion de la c o n c e n t r a t i o n en d 6 o x y c h o l a t e de sod ium. L ' A T P a s e (Na ÷ K ÷) d 6 p e n d a n t e a u g m e n t e f o r t e m e n t avec un m a x i m u m ~ 1 p o u r mi l l e en d 6 o x y c h o l a t e a lors que l ' A T P a s e Mg 2+ d 6 p c n d a n t e est p r a t i q u e m e n t i n c h a n g 6 e jusqu 'h ce t te va leu r . Tou tes deux d i m i n u e n t ensui te . I1 est v r a i s e m b l a - ble que le d 6 o x y c h o l a t e d 6 c o u v r e des si tes de Na + et de K + qu i son t i naces s ib l e s l o r s q u e les m e m b r a - nes son t sous f o r m e de v6s icules . La ba i s se d ' ac t i - vi t6 observ6e p o u r des va l eu r s s u p 6 r i e n r e s "h 1 p o u r mi l l e est due h une so lub i l i s a t i on t rop ira-

p o r t a n t e du s u p p o r t p h o s p h o l i p i d i q u e de la m e m - brane . Un effet i d e n t i q u e du d d o x y c h o l a t e a 6t6 d6cr i t dans le cas de m e m b r a n e s p l a s m i q u e s d ' 6 r y t h r o c y t e s [26].

L 'd tude de l ' ac t iv i t6 spdc i f ique (Na + K 0 ddpen- dan te en f o n c t i o n du p H est r ep r6sen t6e f igure 3, on obse rve un m a x i m u m d ' ac t iv i t6 ~ p H 7,55. Afin

TABLEAU I.

Activitd Mg ~+ ddpcndante ou (oua- baine - inddpendante) . . . . . . . .

Act iv i td ( N a + K +) ddpendante ouabafne ddpendante . . . . . . . .

moles Pi/h/mg prot6ine

pH 7,5 pH 8,2

5,40 7,60

0,62 0,70

10

AS p mol es Pi / h l mg

' ; mM ,n.ibi,'oo.

Fro. 4. - - E f f e t des inhib i teurs sur ATPase Ca2' ddpendante ~0 mM. Tris HCI pH 8,3.

O - - O ouabaine ; * - - o acide dthacrynique.

de vdr i f i e r si l ' A T P a s e o u a b a i n e d 6 p e n d a n t e 6tait b i e n ce l le re l i6e au t r a n s p o r t du Na ÷ et du K + nous avons effectu6 des m e s u r e s d ' h y d r o l y s e de I 'ATP p a r les m e m b r a n e s t ra i tdes au d 6 o x y c h o l a t e en p r 6 s e n c e de d ive r s ca t ions , c o m m e r i n d i q n e le t ab leau II , h p H 7,55.

Les va l eu r s r a p p o r t d e s n l o n t r e n t qn ' i l y a une p a r f a i t e s y n e r g i e en t r e Na + et K ÷ et que l ' ac t iv i t6 i nh ibde p a r l ' o u a b a i n e est l ' A T P a s e (Na ÷ K ÷) d6- p e n d a n t e .

La c o n c e n t r a t i o n 10 -3 M e n o u a b a i n e c o r r e s p o n d h une i n h i b i t i o n h 100 p. c e n t de l ' ac t iv i t6 (Na ÷, K 0 d 6 p e n d a n t e qu i res te i n c h a n g 6 e si l ' on a u g m e n t e

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

(Ca e~) A T P a s e m e m b r a n a i r e d e l g m p h o c y t e s . 1429

l a c o n c e n t r a t i o n e n o u a b a ' i n e . A 10 5 M l ' e f f e t i n h i -

b i t e u r e s t 85 p . c e n t d e c e l u i o b s e r v 6 'h 10 -a M. L e s

v a l e u r s N a ÷ 80 raM, K* 20 m M c o r r e s p o n d e n t a u x c o n c e n t r a t i o n s o p t i m a l e s e n c e s i o n s d 6 t e r m i n ~ e s

d a n s le c a s d e l y m p h o e y t e s t h y m i q u e s d e r a t s

[25i et s o n t a p p l i c a b l e s a u x m e m b r a n e s d e l y m -

p h o c y t e s d e p o r e s ; e n e f f e t , p o u r d e s c o n c e n t r a - t i o n s s u p 6 r i e u r e s h 100 m M e n N a ÷ e t 25 m M e n K +

u n e f f e t i n h i b i t e u r d e l ' A T P a s e ( N a + K +) d b p e n - d a n t e e s t o b s e r v 6 .

L ' A T P a s e Ca'-'* d 6 p e n d a n t e c o l n m e ] ' a c t i v i t 6 Mg2-

d 6 p e n d a n t e n ' e s t p r a t i q u e m e n t p a s a f f e c t 6 e p o u r d e s c o n c e n t r a t i o n s e n d 6 o x y c h o l a t e c o m p r i s e s e n -

t r e 0 et 1 p o u r m i l l e . A u e u n e f f e t d e N a + et d e K +

n e p e u t 6 g a l e m e n t ~ t r e n t i s e n 6 v i d e n c e s u r c e t t e A T P a s e Ca 2+ d 6 p e n d a n t e d a n s ]e c a s d e m e m b r a - n e s t r a i t 6 e s a u d 6 o x y c h o l a t e .

II1 --- EFFET DE LA CONCANAVALINE A SUR L'ACTI- VITI~ ATPase DES MEMBRANES DE LYMPIIOCYTES.

L a e o n c a n a v a l i n e A a u n e f f e t s t i m u l a n t s u r l ' a e t i v i t 6 A T P a s e d e s l y m p h o e y t e s i n t a c t s m e s u r 6 e

TABLEAU 1I.

Mg ~+ 5 mM, E G T A 0,1 mM . . . . . . . . . . . Mg ~+ 5 mM, Na + 80 mM, E G T A 0,1 m M . . Mg ~+ 5 mM, K ÷ 20 raM, E G T A 0,I mM. Mg ~+ 5 raM, N a + 80 mM, K + 20 raM,

E G T A 0,1 m M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mg ~+ 5 mM, N a + 80 raM, K + 20 mM,

ouaba ine 10 -:~ M, E G T A 0,1 m M . . . .

Actlvit6 sp6cilique

moles P i /h /mg prot~i ne

5 ,40 5 , 6 0 5 ,80

I0,I

5 ,30

TABLEAU I I I .

E f f e t de la c o n c a n a v a l i n e A s u r les ac l i v i t~s A T P a s e s des l y m p h o c y t e s in tac t s .

Cation Divalent pr6sent

0

Mg:'+

Ca o -

(~t moles Pi lib6r6es par heure par million de lymphocytes) X 103

sans Concanavaline A /, avec Concanavaline A

20

105 - - 140

96 131

U n e s u s p e n s i o n de l y m p h o e y t e s de g a n g l i o n s (107 /ml ) d a n s d u t a m p o n T r i s HC1 60 m M 7,5 NaC1 0,15 M, MgC12 ou CaCl_o 5 mM, es t i neub6e 30 m n en prf isenee de c o n c a n a v a l i n e A 50 y ,g / ml h 37°C. De I 'ATP T r i s h u n e c o n c e n t r a t i o n f ina le de 2,5 m M es t e n s u i t e a jou t6 , l ' i n c u b a t i o n e s t p o u r s u i v i e 30 m n et Pi l ib~r6 es t d~- t e r m i n C

e n p r 6 s e n c e d e M g 2+ o u de Ca "+. O n o b s e r v e u n e

a u g m e n t a t i o n d ' e n v i r o n 30 p . c e n t d e l ' a c t i v i t 6 d e

AS l ]arnoles Pi/h/m9

; ~ ~ DOC °;oo Fro. 5. - - La fract ion membranaire (1 m g / m l ) est

ogitde dt lempdrature ambiante dons 2 nil de tampon Tris HCI 20 mM pH 7,*, E I ) IA 3 raM, ddox.tlcholafe de Na (DOC), Mg~2 + 2 raM, el dialysde 2.~ h d 3°C contre le tampon Tris HCI 20 mM 7,~, 1,5 mM EDTA. Act iv i t6 sp6cif ique.

o - - e A T P a s e Mg2÷ d d p e n d a n t e . = - - m A T P a s e (No +, K +) d 6 p e n d a n t e .

TABLEAU IV,

E f f e t de la c o n c a n a v a l i n e A s u r les ac t i v i t~s A T P a s e s des m e m b r a n e s p l a s m i q u e s de l y m p h o - cy t e s .

i Activit6 sp~cifique ! ~t moles P i / h / m g prot~ine I

Concentrat ion Conea- I naval ine A ~ g /ml I 0 25

A T P a s e Ca ~ ddpcn-[ i i d a n t e . . . . . . . . . . . I 5 , 59 i 7 ,35

t - - - I A T P a s e Mg ~-+ d6pen- I [

d a n t e . . . . . . . . . . . I 5 , 4 0 ! 7 ,75 I

A T P a s e Mg ~+ Na + ] K + ddpendan t e . . . . 4 . 7 5 i 4 , 1 0

75 t00

9 ,30 9 ,10

9 ,00 8 ,80

3 ,40 3 ,35

150

8 , 9 0

8 ,50

3 , 4 0

U n e s u s p e n s i o n de la f r a c t i o n m e m b r a n a i r e des l y m - p h o c y t e s (50-100 ~.g/ml) es t i n c u l ~ e d a n s d u t a m p o n T r i s HC1 60 mM 7,5, MgCI~ ou CaCI.2 5 mM en p r6sence de c o n e a n a v a l i n e A h 37~C p e n d a n t 30 ran. Le ] 'ATP T r i s (2,5 mM) es t e n s u i t e a j o u t ~ l ' i n e u b a t i o n p o u r - su iv i e 30 Inn et P i l ib6r6e es t d~ te rmin~e . L ' ae t iv i t~ (No + K +) d 6 p e n d a n t e e s t m e s u r 6 e s u r des m e m b r a n e s t r a i t 6e s a u p r~a l ab l e p a r le d ~ o x y e h o l a t e de s o d i u m 1 p. mi l l e , c o m m e cela a 6t6 p r ~ c 6 d e m m e n t i n d i q u C

En ce qu i c o n e e r n e les ae t iv i t~s Ca2+ d ~ p e n d a n t e et Mg2+ d ~ p e n d a n t e des r ~ s u l t a t s i d e n t i q u e s s o n t o b t e n u s que les m e m b r a n e s a i e n t ~td ou n o n t r a i t de s p a r le d ~ o x y c h o l a t e 1 p. mi l l e . L ' ac t iv i t6 Mg2+ d ~ p e n d a n t e o e u t ~tre o b t e n u e so i t d i r e e t e m e n t so i t en p r e s e n c e de MgCI2 5 m M NaC1 80 m M KC1 20 m M et d ' o u a b a i n e 10-a M, EGTA 0,1 mM. Les m e s u r e s s o n t ef fec tu~es "~ pH 7,5 p o u r u n e q u e s t i o n de s t ab i l i t~ de la c o n e a n a - v a l i n e A.

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1430 J. Dornand, J.-C. Mani, 31. Mousseron-Canel et B. Pau.

base comme cela est rappor t6 sur le tableau III. Par conire, son effet sur l 'ATPase ouabaine-d6pen- dante est impossible h met t re en 6vidence, car cette derni~re activit6 ne peut 6tre mesur6e sur des cellules lymphocy ta i r e s intactes [27~.

Cet effet s t imulant se re t rouve 6galement sur les activit6s ATPases Ca e÷ d6pendante et Mg 2÷ d6pen- dante des membranes p lasmiques isol6es ; par contre la concanava l ine A n 'augmente pas l 'act i-

TABLEAU V.

Actioitd spdcifique ~moles Pi/h/mg prot~ine.

ConA

I - - ATPase Ca a+

ddpendante 5,50

ATPase Mg "-,+ d~pendante 5,40

+ ConA 50 rr g/ml

9,30

8,90

+ ConA I + ConA 50 ~t g/ml I 50~g /ml

+ m6thyl a D]+ m6thyl ~ D mauno- I galaeto-

pyrann~ido I pyrannside

5,50 8,50

5,30 8,20

Les exp6rienees sont effeetu6es dans les m8mes con- ditions que le tableau IV. Le sucre est ajout6 directe- ment darts le milieu rdaetionnel h 25 mg/ml.

vit6 ouabaine d6pendante et p rovoque au cont ra i re une 16g6re d iminut ion. Un effet iden t ique a d~jh 6t6 rappor t6 sur les activit6s ATPase Mg 2+ d~pen- dante et (Na + K +) d6pendante d 'une pr6para t ion de microsomes de lymphocytes de ganglions m6sen- t6riques de rat [28]. Comme cela est rappor t6 sur le tableau IV un effet m a x i m u m de la concanava- l ine A est obtenu pour une concent ra t ion opt imale situ6e entre 50 et 75 ~g /ml ; en dessus de ces valeurs on observe ensnite un abaissement de la st imulation.

I1 est v6rifi6 que la convanava l ine A est zans effet sur l ' hydro lyse de I 'ATP et ne p rovoque au- cune var ia t ion du pH du mi l ieu r6act ionnel .

Le m6thyl a D mannopyranos ide qui se lie sp6- c i f iquement h la concanava l ine A [29] inhibe l 'effet s t imulant de la lect ine s ' i l est in t rodui t dans le nfilieu r~act ionnel lors de la pr6 incubat ion , pa r contre le m6thyl a D ga lac topyranos ide qui ne se lie pas h la coucanava l ine A [30] a un effet beau- coup moins inh ib i t eur (tableau V).

Le site r6cepteur de la concanava l ine A sur la membrane p lasmique 6tant un site sacchar id ique en comp6ti t ion avec le m~thyl c~ D mannopyrano- side [28] pour la l iaison avec la lectine, ce der- n ier r6sultat confirme que l ' augmenta t ion des acti- vit6s ATPase r6sulte d 'une in te rac t ion membrane

p lasmique concanava l ine A ; le m6thyl a D galac- topyranoside , qui ne peut empOcher eette l iaison, est sans effet.

DISCUSSION.

Comme dans le cas du re in [317, de la muqueuse intest inale [32], du cerveau [33], du r6t iculum sarcoplasmique [343, du p lacenta [35] et des 6ry- ihrocytes [11, 36] une ATPase Ca 2+ d6pendante peut ~tre raise en 6vidence dans une f rac t ion sub- cel lnlaire enr ich ie en membranes p lasmiques de lympbocytes de pore. Cette ATPase ne n6cessite pas Mg2+ et comme les ATPases pr6c6demment cit6es et les ATPases MgU + d6pendantes, elle est in- sensible h l 'effet de Na ÷, K + et de l 'ouabaine. Corn- me le sugg6rent nos r6sultats, cette ATPase peut aussi 6tre activ6e par Mg ~+ et une compOi t ion sem- ble avoir l ieu entre les deux cations pour les m~mes sites de fixation, il est toutefois impossible d 'af f i rmer que l 'on est en pr6sence d 'une seule en- zyme. La pr6sence de g roupes - SH l ibres dans le site actif de l 'ATPase est n6cessaire "h son fonc- t ionnement comme le mont re l ' inh ib i t ion de cette enzyme par l ' ae ide 6 thacrynique ; un r~sultat ident ique a d6jh 6t6 rapport6 "~ propos d 'ATPase Ca .'÷ d6pendante [34-36]. Le fair que l ' o l igomyeine n'agisse pas sur cette ATPase Ca"* d6pendante mont re qu'el le est diff6rente de celle li@ au trans- por t du Ca "+ dans les mi tochondr ies et conf i rme la puret6 de notre pr6para t ion vis-h-vis de mem- branes mi toehondr ia les contandnantes .

De nombreux auteurs ont rapport6 que Ca 2* pou- vait r emplace r Mg2+ pour ac t iver la f rac t ion oua- baine ind~pendante des ATPases membrana i re s [31, 35, 37, 38], mats dans le cas des lymphoeytes comme dans celui du p lacenta [35], l 'effet stimu- la tent de Ca .'+ est sup6rieur h celui de Mg2*, alors que dans le re in [31, 12] et la nmqueuse intest inale [32] un effet inverse est observ6 ; d a n s le cerveau il existe un effet ident ique des deux cations, et dans les 6rythrocytes [11] l 'ATPase est stimul6e par Ca .'+ et inhib6e par Mg 2+.

Les propri6t6s de cette ATPase sugg6rent, soit qu 'e l le jouc un r61e dans le t r anspor t des cat ions divalents, soit qu 'el le est reli6e h des propri6t6s phys iques de la membrane plasnfique et peut en modif ier ]a perm6abil i t6 [11, 12].

L 'ATPase (Na + K +) est diff ici lement mise en 5vi- dence lorsque les membranes plasmiques sont sous for_me de v6sicules, ce qui expl ique les faibles valeurs rapport6es jusqu ' ic i [27, 28, 39, 40]. Le trai- tement au d6oxycholate de Na ÷ d6couvrant des sites de Na ÷ et K + inaccessibles auparavant , per- met une mesure plus coh6rente de l 'ATPase li6e au t ranspor t du Na + et K +.

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(Ca '~) A T P a s e m e m b r a n a i r e d e l g m p h o c g t e s . 1431

Bien q n e sous l ' e f fe t de la p h y t o h d m a g g l u t i n i n e u n e a u g m e n t a t i o n de l ' i n f lux de K ÷ ai t 6t6 obse rv~e d a n s le cas de l y m p h o c y t e s c i r c u l a n t s h u m a i n s [4, 5, 39], nous n ' o b s e r v o n s p a s de s t i m u l a t i o n de l ' A T P a s e (Na ÷ K +) d 6 p e n d a n t e des m e m b r a n e s p l a s m i q u e s de l y m p h o c y t e s de p o r c p a r la c o n c a - n a v a l i n e A, r6su l ta t en a c c o r d avec ce lu i r a p p o r t 6 p o u r les l y m p h o c y t e s de r a t [28]. P a r c o n t r e nous a v o n s mis en 6 v i d e n c e l ' a u g m e n t a t i o n d ' u n e ATP ase Ca 2+ ou Mg 2+ d 6 p e n d a n t e sous l ' e f fe t d ' u n e i n t e r a c t i o n m e m b r a n e - l e c t i n e , le s i te r 6 c e p t e u r de la c o n c a n a v a l i n e A 6 tan t s i tu6e su r la m e m b r a n e p l a s m i q u e des l y m p h o c y t e s [41]. I1 est d o n c v ra i - s e m b l a b l e que ce t te A T P a s e Ca 2+ ou Mg 2+ ac t iv6e est s i tude su r la m e m b r a n e p l a s m i q u e du l y m p h o - cyte . La l e c t i n e p r o v o q u a n t u n e m o d i f i c a t i o n de la p e r m 6 a b i l i t t m e m b r a n a i r e , le fa i t que ce t te A T P a s e Ca .'+ d 6 p e n d a n t e so i t re l i6e h u n e p r o t ~ i n e c o n t r a c t i l e est u n e h y p o t h b s e qui p e u t ~tre env i - sag6e, m a t s n ' e x c l u t p a s la p a r t i c i p a t i o n de ee t te e n z y m e au t r a n s p o r t du Ca .-'+ d o n t l ' i n i l ux est aug- m e n t 6 sous l 'e f fe t de la l e c t i ne [8, 9]. Ce c h a n g e - m e n t de p e r m 6 a b i l i t 6 m e m b r a n a i r e sous l ' e f fe t d ' u n e A T P a s e Ca 2+ d 6 p e n d a n t e ac t iv6e p a r la con - c a n a v a l i n e p o u r r a i t r e n d r e c o m p t e de l ' i n f lux d a n s la ee l lu le de s u b s t a n c e p r o v e n a n t du mi l i eu de c u l t u r e et p o u v a n t e n t r a i n e r la t r a n s f o r m a t i o n des l y m p h o c y t e s .

La m o d i f i c a t i o n de la p e r m 6 a b i l i t 6 i o n i q u e des l y m p h o c y t e s en p r d s e n c e de Ca2+ et d 'ATP , corn- m e cela a 616 fa i l p o u r des ce l lu les de t ub u l e s r e i n a u x [12], d e v r a i t nous f o u r n i r de p lus a m p l e s r e n s e i g n e m e n t s su r ce t te A T P a s e Ca 2+ d 6 p e n d a n t e et n o u s p e r m e t t r e de m i e u x c o m p r e n d r e l ' e f fe t p r i - m a i r e de la l ec t ine .

Ce travail a 6t6 rdalis6 avec l 'aide du C.N.R.S., de I'I.N.S.E.R.M., du C.E.N. et de la FondaHon pour la Recherche Mddicale.

R~SUM~.

Les propridt6s d 'une ATPase Ca2+ ddpendante sont caraet6risdes dans une fract ion for tement enrichie en membranes plasmiques de perils lymphocytes, pr6pa- r6e h par t i r de ganglions m~sentdriques de jcunes porcs. Cette ATPase est stimul6e indSpendamment par Ca2 ~ ou Mg2+.

Par un t ra i t ement au d60xycholate de sodium, l 'ATPase (Na + K ÷) d~pendante de la membrane plas- mique peut ~tre mise en fividence.

La Concanavaline A, une lectine qui indui t la t rans- fo rmat ion des lymphocytes , augmente l 'ATPase Ca2~ ou Mg2+ activde, alva's qn'elle semble sans effet sur l 'ATPase (Na ÷ K+) d6pendante.

Les propri6tfis de l 'ATPase for tement activ6e par Ca2~ sugg6rent soit qu'elle joue un r61e darts le t rans - port du Ca2÷ fi t ravers la membrane , soit qu'elle est

lide h une protdine contracti le agissant sur la d6for- mat ion de la membrane plasmique et modifiant sa l)ermt!abilit6.

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