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AIRD Agence Inter-établissements de Recherche pour le Développement
Programme d’Excellence pour l’Enseignement et la Recherche au Sud PEERS-AAP 2012. Projet SudBiotech-Bénin
Vème ATELIER SOUS-REGIONAL SUR LA BIOLOGIE MOLECULAIRE,
LES BIOTECHNOLOGIES VEGETALES ET LA BIOINFORMATIQUE
26 – 31 Mai 2014
ISBA Campus du Champ de foire - Centre du Riz pour l’Afrique - Campus Numérique AUF Cotonou, Bénin.
Remerciements
L’ensemble de l’équipe pédagogique Franco-Béninoise remercie très sincèrement les collègues et
partenaires qui, depuis 2008, apportent un soutien sans faille à l’initiative SudBiotech :
• Le Professeur Michel Dron de l’Université Paris-Sud Orsay, qui nous a aidés à initier les
premières opérations d’enseignement des Biotechnologies en présentiel au Liban puis au
Burkina Faso, un pari risqué, mais qui a abouti a la formation d’une équipe soudée et
enthousiaste !
• Le Docteur Serge Hamon, Directeur de l’UMR DIADE à l’IRD Montpellier, qui a favorisé
l’émergence de SudBiotech dans le réseau Biotechnologies de l’Agence Universitaire de la
Francophonie,
• Le Professeur Ambaliou Sanni, qui a porté SudBiotech sur les fonts baptismaux en 2008 et
n’a jamais ménagé ses efforts pour pérenniser notre présence au Bénin,
• Les représentants de l’IRD au Bénin, Gilles Bezançon et avant lui Bruno Bordage, qui ont
toujours su faciliter nos séjours,
• Philippe Menozzi, Correspondant du Cirad au Bénin, pour son appui constant et son aide
logistique sans faille,
• Le personnel administratif et de recherche de l’ISBA, pour qui la présence joyeuse et
bruyante d’un groupe d’étudiants très motivés a pu être une cause de dérangement
temporaire
• Enfin et surtout, nos étudiants et apprenants, une population renouvelée chaque année
mais qui partage depuis 2008 les mêmes valeurs d’enthousiasme, de motivation et de
curiosité scientifique. Merci encore pour vos questions pertinentes, vos interrogations
sincères et votre engagement.
L’Equipe Pédagogique SudBiotech 2014
Projet SudBiotech, France Dr NATO Aimé, Université Paris-Sud Orsay : [email protected] Dr SABOT Francois, IRD, UMR DIADE, Montpellier : [email protected] Dr HENRY Yves, CNRS Orsay : [email protected] Dr RIVAL Alain, CIRAD, UMR DIADE, Coordinateur : [email protected]
LBBM/FAST/UAC, Bénin Prof SANNI Ambaliou: [email protected] Dr AYI FANOU Lucie: [email protected]
Dr ATINDEHOU Mènovè Cynthia: [email protected]
Dr LAGNINKA Latifou: [email protected]
Dr CHABI Nicodème: [email protected];
Dr ADEOTI Kifouli: [email protected]
Africa Rice, Bénin Dr NJIONDJOP Marie-Noelle : [email protected]
Dr SOW Mounirou: [email protected]
Mme FATONDJI Blandine : [email protected]
Mr GOUDA Comlan Arnaud: [email protected]
Mr GBEDISSI Loris: O.M.O.: [email protected]
Conférences préliminaires Deux enseignants-chercheurs de l’équipe pédagogique SudBiotech, Aimé Nato et Alain Rival, ont
eu l’honneur d’être les invités de la 3ème Conférence Publique de l’Académie Nationale des
Sciences, Arts et Lettres du Bénin qui s’est tenue le 23 Mai 2014 à Cotonou (Annexe 1). Cette
Conférence était origanisée à l’ISBA, en présence du Secrétaire Perpétuel, du Président de
l’Académie et de nombreux Académiciens, ainsi que des représentants de l’Ambassade de France,
de l’IRD, du Cirad, de l’INRAB et du Centre du Riz pour l’Afrique (AfricaRice).
Des débats très animés ont suivi les conférences, auxquels ont participé Académiciens et
Enseignants-Chercheurs de l’Université Abomey-Calavi. Les résumés des deux conférences son
présentés ci-après :
Les biotechnologies végétales au service de l’agriculture : les opportunités africaines
Aimé NATO Université Paris-Sud, Orsay, France.
Avec plus de 5% de croissance économique par an, l’Afrique ne peut laisser indifférents les décideurs économiques, même si les défis sont considérables. En 2050, les Africains vont constituer un des plus grands marchés de la planète avec des classes moyennes pouvant représenter jusqu’à 500 millions de personnes. Comme la majorité de la population des pays Africains habite en zones rurales et dépend directement de l’Agriculture pour sa survie, ce secteur reste le principal vecteur de développement des économies africaines.
Aujourd’hui, la Planète ne peut plus s’offrir une nouvelle révolution verte, basée sur l’utilisation massive d’engrais et de pesticides. L’augmentation escomptée de la productivité et de la sécurité alimentaires doivent désormais se dérouler dans un contexte de développement rural durable, capable d’éradiquer la pauvreté et de porter les classes moyennes émergentes sans incidences négatives sur les hommes et leur environnement.
Les progrès récents et les outils de la Biologie Moléculaire, les promesses de la transgénèse végétale ouvrent des perspectives nouvelles aux Biologistes, aux Généticiens et aux Agronomes concernés par le développement de l’Afrique et, en premier lieu, aux scientifiques du Continent eux-mêmes. Ces approches innovantes permettent des gains considérable en productivité en approfondissant nos connaissances sur la diversité génétique des espèces cultivées, en facilitant l’innovation dans la création variétale et en assurant un transfert rapide du progrès génétique vers les utilisateurs finaux.
A quelques exceptions près, la plupart des pays d’Afrique ont encore un accès limité à ces technologies, très demandeuses en investissements, en infrastructures et en compétences scientifiques. Ces dernières années, certains pays d’Afrique de l’Ouest, dans le but de moderniser leur Agriculture, se sont engagés en faveur de l’introduction d’organismes génétiquement modifiés ou OGM. « Ces OGM peuvent apporter beaucoup, mais à des conditions précises. Un des risques, c’est que l’on force les décideurs africains à accepter des produits qui n’ont pas été développés pour leurs pays et qui peuvent présenter des risques pour l’Ecologie fragile de ces pays », (Alain Weil, Cirad).
Aujourd’hui, l’un des défis principaux à relever par notre communauté scientifique est celui de la formation de cadres scientifiques, rompus à ces nouvelles technologies et à leur utilisation aux fins de développement agricole durable.
Ces cadres africains doivent maitriser les biotechnologies, en connaitre parfaitement les risques réels et les enjeux économiques, environnementaux et sociaux et les conditions de leur acceptabilité publique, afin d’intervenir utilement sur les politiques publiques.
Le Palmier à huile : un vecteur de développement durable au Bénin ?
Alain RIVAL
UMR DIADE, Cirad Montpellier, France.
Les bailleurs et les ONG internationaux s’accordent pour donner à la culture du palmier à huile un rôle incontournable dans l’éradication de la pauvreté dans les pays tropicaux. En moins d’un siècle, cette culture est passée du statut de vivrière mineure en Afrique à l’une des productions agricoles majeures à l’échelle mondiale. Quand il est correctement planifié par les gouvernements locaux ou régionaux, le développement du palmier à huile se traduit par un fort développement économique et une importante réduction de la pauvreté rurale. Mal gérée, l’extension des plantations risque de se traduire par la disparition de forêts à grande valeur de conservation, avec des impacts négatifs sur les communautés rurales. L’ensemble des acteurs (gouvernements, entreprises, centres de recherche agronomiques nationaux, communautés locales, ONG nationales et internationales) doivent élaborer une stratégie préventive. Cette concertation doit prendre appui sur les standards de certification élaborés par l’IFC et la RSPO (Roundtable on Sustainable Palm Oil), constituant une base de travail reconnue internationalement.
Après des débuts prometteurs au siècle dernier, la filière huile de palme béninoise semble actuellement confrontée à des contraintes spécifiques. Un secteur industriel assez peu développé et un secteur artisanal très peu mécanisé la rendent atypique parmi les autres pays producteurs du golfe de Guinée. La compréhension des dynamiques internes de la filière au Bénin est un pré requis indispensable à sa relance.
Toute stratégie d’expansion durable de la filière huile de palme devra désormais intégrer : i) l’intensification écologique des plantations existantes, avec la diffusion de matériel végétal sélectionné, une fertilisation raisonnée et le recyclage des effluents, ii) les petits planteurs au développement des complexes agroindustriels, soit par la mise en place de contrats de production, soit par des mesures de soutien à l’agriculture familiale (fourniture de plants sélectionnés et de fertilisants, microcrédit, encadrement technique, formation, etc.), iii) la conservation de la biodiversité et du domaine forestier permanent, en privilégiant le développement de zones déjà déforestées ou dégradées, iv) l’application contrôlée des principes et des critères RSPO qui doivent être interprétés en fonction des contraintes locales et intégrés dans les politiques et réglementations nationales, v) le respect des droits des communautés locales, en recueillant leur consentement libre, informé et préalable, et une large communication de tout développement de nouvelles plantations et vi) l’examen du droit foncier, du cadastre quand il existe et le respect de la réglementation relative à l’acquisition des terres.
Présentation
Le lundi 26 Mai 2014 a débuté, à l’Institut des Sciences Biomédicales Appliquées (ISBA) de Cotonou, la 5ème édition de l’Atelier Sous-régional sur la Biologie Moléculaire, les Biotechnologies Végétales et la Bioinformatique. Le programme scientifique de ce 5éme Atelier est donné en Annexe 2. L’objectif de cet Atelier est de permettre à chaque participant de renforcer ses connaissances en biologie moléculaire et biotechnologies végétales : il s’agit avant tout de démystifier les biotechnologies, d’appréhender leurs fondamentaux afin de s’approprier les techniques et les concepts. La promotion SudBiotech 2014 se composait de 21 étudiants au total, offrant une répartition relativement homogène en matière d’horizons scientifiques et de niveaux de formation (voir la liste des participants en Annexe 3). Il importe de noter la présence de deux participants originaires de l’Université de Lomé, Togo (un Doctorant et un Enseignant-Chercheur) signe de l’ouverture de la Formation SudBiotech aux communautés scientifiques de la sous-région. Les 21 apprenants présents se sont répartis en 4 groupes de travail homogènes, chaque groupe désignant un Rapporteur. Les Rapporteurs de Groupe auront la charge de rendre compte quotidiennement à l’ensemble du groupe des avancées de la journée écoulée et de réunir l’essentiel des informations partagées dans le présent Rapport de Formation, qui est revu par les Formateurs. Pour cette cinquième édition, l’Atelier SudBiotech a bénéficié d’infrastructures de très grande qualité : de nouveaux Laboratoires gracieusement mis à disposition par l’équipe du Dr Lagninka et une confortable salle de conférence attenante. La couverture médiatique de l’Atelier a été relayée auprès des media de la presse écrite : Le Soleil du Bénin, Fraternité, L’Informateur, L’Evénement Précis (voir Annexe 7).
Répartition des participants par niveau de compétence Répartition des participants par sexe
JOUR 1 Totipotence, plasticité morphogénétique et plasticité métabolique
L’Atelier a débuté par la présentation des formateurs, les Dr Aimé NATO, Francois SABOT et Alain RIVAL, puis par celle des étudiants. Chaque apprenant a précisé sa formation initiale et ses attentes par rapport à la semaine d’Atelier proposée. Le parcours pédagogique a été présenté, qui conduira les participants des fondamentaux de la biologie végétale jusqu’au génie génétique et à ses applications en agriculture. La Micropropagation concerne la partie des biotechnologies qui s’intéresse à la multiplication conforme et à l’exploitation de la plasticité métabolique des plantes en vue des applications dans les domaines agricole et industriel. L’une des techniques utilisées pour y parvenir est la Culture In Vitro (C.I.V.) qui utilise les différents concepts fondamentaux de la construction d’une plante. Quels sont alors les apports de la C.I.V. dans la compréhension des concepts fondamentaux de la construction d’une plante ? Pour répondre à cette question, il faut maitriser l’aspect théorique et pratique de la culture in vitro et l’effet des hormones et des signaux environnementaux sur la réponse des plantes. La technique a été présentée par le Dr Aimé Nato. Elle consiste à cultiver dans une boite de Pétri ou dans un tube à essai, divers explants (cellule, tige, feuille, racine, …) en milieu contrôlé et en conditions aseptiques. Plusieurs conditions sont nécessaires pour la réussite de ces cultures :
• La maîtrise de la biologie de l’espèce végétale utilisée,
• La nature et l’état physiologique de l’explant,
• Le milieu de culture utilisé, qui doit contenir des macroéléments, des micro-éléments, des vitamines et une balance hormonale adéquate,
• Les facteurs externes, tels que la température, la lumière (photopériode, intensité, longueur d’onde,...) qui doivent être adaptés.
Les tubes et boites de Pétri contenant les cultures in vitro de Tabac (Nicotiana tabaccum) ont été préparées à l’Université de Paris-Sud Orsay par le Dr Aimé Nato, sur quatre milieux de culture (T, A, B, C) en utilisant trois types d’explants (disque de feuille, fragment de tige, racine) cultivés à la lumière ou à l’obscurité.
Elles ont été observées en détail et analysées collectivement.
Au total, 120 boites de culture ont ainsi été préparées en amont de l’Atelier à l’Université Paris-Sud par Aimé Nato, permettant ainsi aux participants de travailler dans des conditions expérimentales optimales sur du matériel végétal de qualité.
Le financement PEERS a permis d’équiper la salle de Travaux Pratiques avec le matériel suivant : 4 jeux complets de micropipettes, microcentrifugeuse, spectrophotomètre, thermocycleur PCR et congélateur -20°C dédié au Projet.
Les nouveaux locaux à l’UAC - ISBA Cultures d’explants foliaires de Tabac [lumière/obscurité]
Flexibilité morphogénétique en réponse aux signaux hormonaux Lignées de Tabac sauvage (WT) et Albina et lumineux
Observer et comprendre … Réponses morphogénétiques in vitro à la lumière
Les observations sont résumées dans les tableaux suivants :
• A la lumière
Milieux
Organes T A B C
Disque de
feuilles
Organe intact Présence de colonies
de cellules sans
différenciation
Présence de boutures
de plantes (feuilles et
tiges)
Présence de plantes
entières avec racines
de couleurs vertes
Tige Organe intact Présence de colonies
de cellules sans
différenciation
Présence de boutures
de plantes (feuilles et
tiges)
Présence plantes
entières avec racines
de couleur verte
Conclusion Sans hormone, pas
de développement
de la plante
L’hormone du milieu A
favorise la prolifération
sans différenciation des
cellules
L’hormone du milieu
favorise la
différenciation mais
inhibe la rhizogenèse
Le milieu favorise la
formation des racines
• A l’obscurité
Milieux
Organes T A B C
Disque de
feuilles
Aucune observation Présence de colonies de
cellules sans
différenciation
Présence de boutures
de plantes (feuilles et
tiges)
Présence de plantes
entières avec racines
Tige Aucune observation Présence de colonies de
cellules sans
différenciation de
couleur blanche
Présence de boutures
de plantes (feuilles et
tiges) de couleur
blanche
Présence plantes
entières avec racines
de couleur blanche
Conclusion Sans hormone, pas
de développement
de la plante
L’hormone du milieu A
favorise la prolifération
sans différenciation des
cellules
L’hormone du milieu
favorise la
différenciation mais
inhibe la rhizogenèse
Le milieu favorise la
formation des racines
Milieu T : milieu témoin sans hormone ;
Milieu A : milieu riche en auxine et très pauvre en cytokinine ;
Milieu B : riche en cytokinines et très pauvre en auxine ;
Milieu C : pauvre en auxine et ne contenant pas de cytokinine.
Ces observations permettent d’énoncer les conclusions suivantes :
1. La lumière est indispensable pour la régénération de plantes chlorophylliennes. 2. Les régulateurs de croissance (hormones) affectent le devenir des cultures. 3. Un rapport élevé auxine/cytokinine entraine la dédifférenciation et la prolifération
cellulaire. 4. Un rapport élevé cytokinine/auxine entraine le bourgeonnement des cultures. Enfin, une
très faible dose d’auxine, en absence de cytokinine, permet la rhizogenèse. Une mutagenèse chimique a permis d’obtenir un mutant albinos de tabac Albina. Cette plante, dépourvue de chloroplastes fonctionnels, ne réalise pas de photosynthèse. Une telle plante ne pourrait survivre en milieu naturel. In vitro, en présence de sucres dans le milieu de culture, elle développe d’autres mécanismes de carboxylation nécessaires à son métabolisme : on parle de flexibilité métabolique. Les cultures in vitro apportent des modèles d’étude de grande qualité pour comprendre la flexibilité morphogénétique métabolique caractéristiques des plantes supérieures. En outre, les applications des cultures in vitro sont multiples, elles ont été développées dans plusieurs domaines afin d’exploiter leur plasticité métabolique. Citons par exemple le domaine biomédical et biopharmaceutique (insuline, antibiotiques, médicaments, ….), le domaine agricole (production à l’échelle industrielle de plantes « élites » par clonage : Gerbera, orchidées, palmier à huile, bananier,….). Application à la micropropagation du palmier à huile par embryogenèse somatique. Alain Rival
Une application industrielle de la totipotence cellulaire, l’embryogenèse somatique, a été présentée par A. Rival, illustrant la micropropagation du Palmier à huile, Elaeis guineensis. L’embryogenèse somatique a permis d’obtenir, à partir d’un individu élite sélectionné de palmier à huile, des milliers de régénérants clonaux, utilisés pour des essais génétiques et agronomiques au champ pour validation, puis commercialisés. L’organe prélevé ici est la feuille immature, qui est mise en culture dans différents milieux en présence d’hormones durant une période appropriée. Les premiers essais au champ ont confirmé le gain génétique apporté par la sélection précise des têtes de clones. Le changement d’échelle effectué dans des unités pilotes disséminées en pays producteur (Côte d’Ivoire, Indonésie, Malaisie, Costa-Rica…) a permis d’identifier deux difficultés majeures : les couts de production et la fidélité génétique des régénérants, qui ont suscité autant de programmes de recherche. L’exposé a montré la succession des phases d’innovation, en forme de boucles imbriquées, qui ont accompagné le transfert de la technologie de micropropagation du Laboratoire de recherche vers ses utilisateurs finaux.
JOUR 2
Lecture biochimique des processus de prolifération et de différenciation cellulaires - Expression de deux carboxylases majeures (PEPC et RuBisCO)
Les objectifs de cette deuxième journée sont de :
1. vérifier si la teneur en protéines solubles totales des organes peut être utilisée comme marqueur des différents processus de croissance et de développement de la plante
2. déterminer l’éventuel impact du signal lumineux sur la croissance et l’activité enzymatique des plantes.
Les différentes étapes de cette séance de TP consistent en l’extraction des protéines solubles, le dosage colorimétrique des protéines solubles totales et l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide, suivie de la détection in situ de l’activité enzymatique de la PEP Carboxylase, choisi comme marqueur métabolique.
Extraction des protéines
Pour extraire toutes les protéines solubles des tissus, nous avons pesé à la balance de précision une petite quantité de masse fraiche (0,5 à 1,5 g) de chacun des différents matériels d’étude. A partir de plusieurs espèces végétales (tabac, blé, maïs), différents organes (feuilles, germinations, cultures in vitro, racines) ont été échantillonnés ainsi que divers tissus (chlorophyllien, albinos, étiolé) qui ont été prélevés et lyophilisés ou frais. Nous avons broyé à 4°C les échantillons dans un mortier, en présence d’une solution tampon (Tris-HCl ph=8, MgCl2 10mM, PMSF 0,5 mM et DTT 5 mM). La solution obtenue est alors transvasée dans des tubes Eppendorf. Durant ces étapes, le matériel (mortier, Eppendorf) est placé dans de la glace pour éviter la dégradation des protéines. Les tubes sont alors centrifugés à 12,000 tours /min durant 10 minutes à 4°C. Le surnageant est récupéré et placé dans la glace.
Dosage colorimétrique des protéines Extraction des protéines solubles totales par broyage à 4°C
Dosage colorimétrique
Le dosage colorimétrique est effectué à partir d’un aliquote prélevé dans une solution de 1000 µL contenant 780 ou 790 µL d’eau, 20 ou 10 µL du surnageant (Extrait Enzymatique Brut ou EEB) et 200 µL d’un réactif spécifique des protéines (Bradford). Cette solution est homogénéisée, puis placée dans le colorimètre en vue de lire la DO. A partir de cette DO, nous avons réalisé une courbe d’étalonnage Bio-Rad (DO inférieure à 1, c'est-à-dire dans la partie linéaire de la courbe d’étalonnage) pour déterminer la quantité de protéine contenue dans 10 µL d’EEB. En fonction de la quantité de protéines contenue dans 10 µL d’EEB extrait de chaque matériel végétal testé, nous avons déterminé les volumes à prélever pour réaliser le dépôt avant électrophorèse. Ce dosage nous a permis de connaitre la quantité de protéines solubles totales présente dans 10 µL de solution. Connaissant le volume total de notre solution de départ et la masse de matière végétale prélevée, nous avons quantifié la teneur en protéine en µg/g de matière fraiche. Les différents matériels utilisés, les résultats obtenus et les différentes interprétations sont résumés dans le tableau suivant :
Matériel
Végétal
Protéines solubles totales
PST (µg/ g PMF)
T 750
A 950
B 1500
Fv L 7610
Fv Obs 2290
Falbina L 5460
Falbina Obs 3230
Maïs étiolé L 34000
Maïs vert L 50000
Blé Obs 9980
Blé vert L 18210
Racines Maïs 3000
Racines Blé 1650
La comparaison entre traitements T, A et B indique une forte teneur en protéines solubles chez le témoin, et la présence d’une plus grande quantité de protéines solubles lors de la différenciation et une plus faible lors de la prolifération. La teneur en protéines solubles totales varie avec le stade de développement de la plante.
La comparaison entre Feuilles vertes à la lumière et feuilles albinos à la lumière indique que la plante albinos possède globalement 50% de protéines en moins que son homologue chlorophyllienne. Dans la mesure où la lignée de tabac albinos ne possède pas de RubisCO par mutation, nous pouvons poser comme hypothèse que le défaut de RubisCO suffit à expliquer la chute mesurée de la teneur en protéines solubles totales. Cette hypothèse devra être vérifiée par détection immunochimique de la RubisCO (test d’Ouchterlony). Le maïs étiolé contient moins de protéines solubles que le maïs chlorophyllien, mais à un niveau remarquablement élevé (34 000 et 50000 µg par g de matière fraiche). Il en va de même pour les germinations étiolées ou chlorophylliennes du blé tendre, dont la teneur en protéines solubles totales est néanmoins plus basse (11000 et 17500 µg par g de matière fraiche). Notons que ces quatre matériels proviennent d’extraits lyophilisés, indiquant que la teneur en eau des divers extraits frais est très forte (90-95%). Lorsque l’on s’intéresse aux racines, de maïs et de blé tendre, les teneurs en protéines solubles totales sont basses. Mise en évidence d’une activité PEPC carboxylase par détection de l’activité enzymatique sur gel
Afin de travailler sur des quantités de PST comparables, nous avons déposé des volumes précis de nos extraits EEB sur des gels de polyacrylamide.
L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide reste un exercice délicat …
Après migration (à 4°C, sous 100 volts, durant 2,5 heures) les gels ont été démoulés, placés dans une boite de Petri, puis incubés 15 à 20 minutes dans une solution tampon (0,1 M Tris pH=8) contenant les substrats de la PEPC (PEP, Bicarbonate) en concentrations optimales. Le colorant Fast Violet Blue (10 mg) colore en rouge vif le produit de la réaction enzymatique détecté sur le gel. Tous les organes étudiés ont révélé la présence d’une activité PEPC mesurable, indiquant ainsi que la technique d’immunodetection par anticorps secondaire utilisée est très efficace. L’activité PEPC apparait plus intense chez les germinations vertes que chez celles étiolées de maïs, par contre elle est plus intense chez les germinations étiolées que chez celles chlorophylliennes dans le cas du blé tendre.
Révélation l’activité PEP Carboxylase sur gel de polyacrylamide après électrophorèse native : 30 µg de protéines solubles totales sont déposées dans chaque puits. T: témoin culture sans hormone A: culture en milieu riche en auxine, favorable à la prolifération cellulaire B: culture en milieu riche en cytokinine, favorable à la différenciation cellulaire cellulaire Fv: feuilles de vitroplant de tabac sauvage alpha: feuilles de vitroplant de tabac albina
Immunodétection de la RubisCO par test de Double Immuno Diffusion (DID) d’Ouchterlony
La méthode de double diffusion en gel d’Ouchterlony est une méthode d'immunoprécipitation fondée sur la diffusion passive d’antigènes et d’anticorps en milieu solide (gel d’agarose) à partir de puits placés en vis à vis. Lorsque les molécules d'anticorps rencontrent les molécules d'antigènes, la liaison antigène-anticorps conduit à la précipitation des complexes immuns dans la zone de rencontre si l’anticorps reconnaît l’antigène. Le précipité se forme dans la zone où les concentrations des deux solutions sont optimales pour que la quantité d’anticorps sature les sites antigéniques, c'est à dire la zone d’équivalence.
Les précipités se présentent sous la forme d’un arc blanchâtre visible à l’œil nu. La méthode d’Ouchterlony peut être utilisée notamment pour détecter la présence d’anticorps spécifiques dans un sérum, pour mettre en évidence un antigène donné dans un liquide biologique, pour
déterminer la zone d'équivalence ou pour évaluer le degré d'identité (nul, total ou partiel) entre différentes protéines antigéniques. En effet, des antigènes possédant une identité partielle avec celui contre lequel ont été produits les anticorps sont susceptibles de donner une réaction croisée conduisant à des arcs de précipitation d’aspect particulier. On peut ainsi identifier des relations de parenté entre les organismes dont proviennent les antigènes et celui ayant fourni les anticorps. Un gel d'agarose est coulé, sur des lames porte-objet de microscopie, et des puits équidistants sont creusés dans le gel. Un sérum dirigé contre un antigène déterminé est placé dans le puits central et les solutions d'antigènes à tester sont placées dans les puits périphériques. Après quelques heures de diffusion, les arcs de précipitation sont examinés à l’œil nu mais ils peuvent aussi être colorés pour améliorer leur visibilité.
Test de Double ImmunoDiffusion d’Ouchterlony ACR= Anticorps polyclonal Anti-RubisCo de Tabac;
FL : Feuilles de Tabac à la lumière ; FO : Feuilles de Tabac à l’obscurité ; ME : Germinations de Maïs
étiolées; MV : Germinations de Maïs chlorophylliennes ; BE: Germinations de Blé étiolées; BV :
Germinations de Blé chlorophylliennes.
Révélation et interprétation des test de Double ImmunoDiffusion d’Ouchterlony à l’aide Anticorps polyclonaux Anti-RubisCo de Tabac
F L
F O
ACR
ME
MV
BE
BV
Probablement du fait de dépôts de quantités trop faibles de protéines solubles (la PEPC ne représente en fait qu’environ 0,1% des protéines solubles totales) l’anticorps anti-PEPC n’a pas permis de déceler clairement la PEPC dans les échantillons analysés. En ce qui concerne la RubisCO (Ribulose bisphosphate carboxylase), en premier lieu le sérum pré-immun (témoin négatif) ne montre, comme attendu, aucune réponse avec les échantillons testés. Il est donc possible d’utiliser l’anticorps polyclonal anti-RubisCO. Un point important est l’absence de réponse des racines de blé ou de maïs. Dans la mesure où l’anticorps anti-RubisCO détecte par ailleurs la présence de cette protéine chez les deux espèces, il est probable que cette protéine soit absente des racines. Les tests d’Ouchterlony réalisés par l’ensemble des groupes de travail indiquent par ailleurs que:
• le Tabac chlorophyllien accumule beaucoup plus de RubisCO que le tabac albinos. L’absence totale de RubisCO dans cet extrait permettrait donc d’expliquer la chute en PST notée précédemment
• la synthèse de RubisCO dans la germination de blé ne dépend pas de la lumière
• les arcs d’immunoprécipitation ne sont pas totalement jointifs lorsque l’on compare les protéines RubisCO extraites du même organe chez le tabac et le blé, le tabac et le maïs. On peut donc en déduire que des différences de structure existent chez ces différentes protéines, qui partagent toutefois la même fonction.
JOUR 3 Visite de la Plateforme de Génétique et Génomique du riz en Afrique.
Centre AfricaRice.
Le Mercredi 28 Mai s’est tenue la quatrième journée de l’Atelier, délocalisée sur la Plateforme de Génétique et Génomique du riz du Centre International AfricaRice, situé a Cotonou. L’objectif global de cette journée est une initiation aux techniques permettant d’extraire l’ADN puis d’en analyser la diversité par marqueurs moléculaires en utilisant la Polymerase Chain Reaction. L’ensemble des protocoles utilisés au cours de cette journée est donné en Annexe 4 . Dirigée par le Dr Marie-Noelle Ndjiondjop, cette plateforme a pour vocation de valoriser les ressources génétiques de riz originaires et cultivées en Afrique. Elle utilise les outils biotechnologiques, notamment moléculaires, afin de déterminer la diversité des ressources génétiques collectées par le Centre du Riz pour l’Afrique où elles sont conservées et préservées. Cette diversité est ensuite utilisée dans des programmes d’identification et de cartographie de nouveaux gènes de résistance liés aux problèmes (agronomiques, biotiques et abiotiques) de la riziculture en Afrique avant d’être intégrée dans des programmes de Sélection Assistée par Marqueurs. Les marqueurs moléculaires servent à améliorer certaines variétés de riz populaires du Mali, Burkina Faso, Nigeria et Cote d’Ivoire pour leur résistance au virus de la panachure jaune. Ces variétés améliorées sont à ce jour en cours d’évaluation chez les paysans des pays concernés en vue de leur vulgarisation. La plateforme héberge également divers chercheurs, notamment du Cirad, dont l’approche est d’utiliser l’outil moléculaire pour suivre la migration des insectes.
L’un des objectifs majeurs de la Plateforme est de se consacrer à une formation d’avant-garde d’étudiants, techniciens et chercheurs des centres de recherche agronomique des pays membres ainsi que leurs universitaires.
Initiation à la Polymerase Chain Reaction (PCR)
L’extraction de l’ADN génomique de riz (deux lignées, hybrides F1 et F2) a été réalisée selon un
protocole rapide ou un protocole lent, proposés par l’équipe AfricaRice.
La quantification de l’ADN s’effectue par spectrophotométrie (Nanodrop).
L’expérimentation se poursuit par :
1. Amplification des séquences ADN par PCR (Réaction de Polymérisation en Chaine)
2. Migration sur gel d’agarose (2%) et photographie des gels sous UV après action du BeT.
Figure 7: Analyse par PCR d’hybrides entre deux espèces cultivées de riz. MT = Marqueurs de Taille;
P1: Parent 1 : Oryza sativa; P2: Parent 2 : Oryza glaberrima ; HF1 = Hybrides F1.
La réaction PCR permet, grâce à un choix judicieux d’amorces discriminantes, de différencier aisément les deux espèces de riz cultivés Oryza sativa et Oryza glaberrima, ainsi que leurs hybrides F1. L’hybride n°3 semble résulter d’une autofécondation du Parent2.
Marqueurs Moléculaires et Etudes de Diversité Génétique, Kifouli ADEOTI (UAC):
Dans un premier temps, les principaux marqueurs moléculaires sont décrits (principalement RFLP et ISSR), en insistant sur leurs avantages/inconvénients respectifs ; leurs conditions de mise en œuvre sont comparées. Les principaux résultats issus du récent travail de Thèse sont présentés, illustrant l’utilisation de marqueurs moléculaires de type AFLP dans l’étude de 4 espèces de légumes feuilles au Bénin. La distribution géographique des 4 espèces sur le territoire béninois aéré établie. La diversité génétique au sein de chaque espèce s’est révélée faible. L’étude a permis de mettre en évidence des flux de gènes entre accessions cultivées et sauvages chez Sesamum radiatum.
MT P1 P2 HF1 HF1 HF1 HF1
JOUR 4 Plasticité métabolique : Importance de la levée de la dormance.
Après une observation détaillée du caryopse de blé, il nous est proposé : 1. d’assister au début du développement de ce grain (levée de dormance) par imbibition
(entrée de molécules d’eau). 2. de démontrer l’importance de cette entrée d’eau. 3. de suivre les différentes étapes de la germination. 4. de mettre en évidence l’importance de la lumière de croissance sur les jeunes
germinations de blé, pour la synthèse des différents pigments.
Expérimentation
Effet de l’imbibition o Pesée de 12 grains secs…imbibition (molécule d’eau) pendant 15h. Les molécules
d’eau pénètrent dans les grains. o Pesée des grains imbibés.
Nous calculerons la quantité d’eau absorbée par les trente grains, puis la quantité d’eau dans un seul de ces grains. Les jeunes germinations de blé cultivées à la lumière sont vertes alors que celles maintenues à l’obscurité sont jaunes. Cela montre qu’il y a une différence de pigmentation (pigments verts ou pigments jaunes)
o Observation des grains mis à germer : l’imbibition a enclenché un début de germination qui a provoqué la sortie de la racine (au bout de deux jours) Donc la germination est un processus continu.
o L’observation de la constitution d’un caryopse de blé imbibé d’eau. Le schéma suivant résume toutes ces observations :
1 : poils (stigmates). 2 : téguments (écorce). Le caryopse est un fruit car l'écorce est le résultat de la fusion des téguments de la graine et de
la paroi de l'ovaire. 3 : albumen. 4 : cotylédon unique. 5 : épicotyle (capuchon recouvrant la gemmule). 6 : première feuille. 7 : scutellum. 8 :
gemmule. 9 : tigelle. 10 : radicule. 11 : coiffe. 12 : coléorhize (capuchon recouvrant la radicule).
La germination débute par la sortie de la radicule suivie très rapidement de l'émergence du coléoptile. Celui-ci grandit essentiellement par élongation cellulaire. Il protège les premières feuilles et l'apex caulinaire. Il s'allonge davantage chez les plantes cultivées à l'obscurité. Par contre, les premières feuilles ont une croissance sensiblement égale à la lumière et à l'obscurité. La différence porte essentiellement sur la couleur (synthèse de chlorophylle et photosynthèse).
Germinations de grains de blé de 4, 6, 7 et 8 jours cultivés à 20°C sur de la vermiculite à l'obscurité (à gauche) ou à la lumière (à droite).
Le coléoptile de blé, de taille plus grande que le coléoptile d'avoine, permet de réaliser plusieurs
types d'expériences : croissance auxinique, phototropisme, etc. Les grains doivent être cultivés à
l'obscurité. En effet, le coléoptile étiolé manifeste une croissance par élongation plus grande que
celle du coléoptile cultivé à la lumière.
Blé Poids initial Poids final delta P B1 1,28 1,90 0,62 B2 1,06 1,60 0,54 B3 1,10 1,59 0,49 B4 0,90 1,30 0,40 B5 1,24 2,10 0,86 Mais
M1 2,40 3,60 1,2 M2 2,26 3,40 1,14 M3 2,33 3,38 1, 05 M4 2,36 3,33 0,94 M5 2, 40 3,60 1, 20
L'imbibition des graines est un signal puissant pour la levée de la dormance. On constate après 24 heures une forte entrée des molécules d'eau, pouvant représenter jusqu'à 50% du poids initial des semences, qui semble indiquer que l'embryon végétal est susceptible de résister à telles fortes pressions. Les observations ultérieures sur les 5 jours suivants ont permis de définir rigoureusement les étapes de la germination, de caractériser les processus de croissance et de développement et démontrer l'impact du signal lumineux pour la morphogenèse de la jeune plantule du Blé ou du Mais. Le schéma général de développement a été proposé et discuté à la fin des expériences.
Représentation schématique des évènements intervenant en cours de germination du caryopse de blé : Imbiblition =>
Germination => Croissance & Développement => Floraison => Fécondation => Fructification => Embryogenèse =>
Déshydratation => Dormance.
Plasticité métabolique : La production de métabolites secondaires. Latifou Lagnika
Les recherches en cours concernent le métabolisme secondaire de plantes supérieures, capables de produire des phénols, terpènes, saponines dont certains présentent un intérêt pharmaceutique. La flore béninoise renferme une biodiversité intéressante en plantes médicinales, qui est exploitable par diverses approches biotechnologiques. Le propos n’est pas d’aboutir directement à la fabrication d’un médicament, mais d’identifier et de caractériser les composants chimiques principaux des principes actifs. La démarche repose sur les savoirs traditionnels détenus par les tradipraticiens locaux, elle s’appuie sur réseau international pour l’identification et la caractérisation des molécules d’intérêt (antipaludéens, trypanocides, leishmaniocides).
Plasticité phénotypique. Génotype et phénotype. Alain Rival
Les relations entre génotype (l’information génétique transmissible contenue dans l’ADN) et phénotype (l’ensemble des caractères exprimés par un individu) sont complexes ; elles constituent une boite noire pour les sélectionneurs et les physiologistes moléculaires. L’usine cellulaire génère les constituants de la matière organique (protides, glucides, lipides) mais aussi ses propres réseaux de régulation qui gouvernent l’expression des gènes. Le concept un gène => une protéine => une fonction a depuis longtemps fait la place a la notion de réseaux de gènes modulés par des voies de signalisation complexes. L’approche épigénétique ouvre, pour l’ensemble des êtres vivants incluant les Plantes Supérieures, de nouvelles voies de compréhension de ces systèmes intégrés. Elle permet d’approcher la régulation de l’expression des génomes et la plasticité phénotypique, non seulement à la fois a l’échelle de la réponse immédiate aux stress environnementaux mais aussi à l’échelle de l’évolution des génomes et de leur structure.
JOUR 5 Visite du Campus Numérique de l’Agence Universitaire de la Francophonie
Initiation à la Bioinformatique
Au cours de la formation SudBiotech 2014, nous avons introduit un module d'introduction à la Bioinformatique appliquée à la génomique. Ce module s'est découpé en deux phases:
1. Une première phase avec une présentation générale, accompagnée d'une application directe en utilisant le logiciel pour dessiner et valider des amorces PCR sur une séquence donnée. Cette séance préparait utilement les étudiants au module suivant d’initiation pratique à la PCR réalisée le lendemain à Africa Rice.
2. Une deuxième phase plus générale, comprenant la recherche de séquence nucléique de gènes au NCBI via des mots-clefs, une analyse de la protéine dérivée en BLAST (avec présentation des mécanismes sous-tendant BLAST) pour identifier des séquences homologues, une analyse fonctionnelle avec Interproscan pour identifier des fonctions biochimiques potentielles de la protéine.
Les étudiants ont ensuite assisté à une présentation sur les nouvelles technologies de séquençage et leurs applications potentielles. Le module s’est conclu par une discussion fournie et très intéressante sur les applications de la bioinformatique aux problématiques de recherche propre a chaque étudiant, ainsi que sur l'impression de dépendance perçue par les chercheurs africains envers leurs homologues du Nord sur les accès à ces ressources de séquençage. A la fin de ce module, les étudiants ont acquis de solides notions de bases sur l'analyse de séquences in silico, ainsi qu'une vue plus éclairée sur les possibilités de ces approches.
JOUR 6
Des outils pour démarrer sa carrière scientifique et sa mobilité
Outils pour la gestion de projets Scientifiques : Alain RIVAL, Francois Sabot
La recherche publique avance désormais au rythme de la raréfaction des crédits récurrents et la multiplication de projets compétitifs, souvent collaboratifs et dotés de crédits non-récurrents sur des pas de temps courts. La recherche de financement, la préparation, la négociation puis la gestion et le reporting de projets de recherche font désormais partie de l’univers du chercheur. Il importe de doter les Etudiants se destinant à ce type de carrière des outils génériques utiles à l’ensemble de ces activités : Sources de financement, Curriculum Vitae adapté, Chronogramme et Schéma logique des Projets, etc...
Questionnaire d’évaluation
Un questionnaire destiné à l’évaluation par les apprenants de l’impact de l’Atelier est distribué. Son exploitation servira utilement à l’amélioration des prochaines sessions de l’Atelier, au Bénin comme dans d’autres pays du Sud.
Les retours d’évaluation de la part des apprenants 2014 se sont avérés extrêmement positifs, en termes de contenu du parcours pédagogique et de disponibilité des enseignants.
Les points à améliorer concernent principalement l’intégration de nouvelles expérimentations et l’amélioration des conditions de leur réalisation. L’Atelier a été très dense avec quelques journées de plus de 12 heures !
Il faudra sans doute alléger le programme si les financements ne permettent pas de programmer les prochaines sessions sur 10 jours complets.
Le Vème Atelier SudBiotech s’est conclu par la remise des diplômes et le verre de l’Amitié entre Etudiants et Enseignants.
Perspectives Depuis 2008, cinq éditions de l’Atelier SudBiotech se sont succédé au Bénin. Elles ont bénéficié à des groupes d’étudiants et d’apprenants très variés et chaque édition s’est enrichie des expériences précédentes. L’édition 2014 n’échappe pas à la règle… nos erreurs et nos avancées seront profitables à l’Edition 2015 à venir sur financement PEERS –AIRD.
Les points de satisfaction
1. La qualité des apprenants: un groupe plus compact en compétence, extrêmement appliqué et passionné, avec des individualités visiblement armées pour aller loin.
2. L’intégration réussie de la Bio-informatique: Francois Sabot a brillamment réussi son examen de passage et il est désormais intégré à l’unanimité dans l’équipe enseignante.
3. Le soutien sans faille de nos collègues d’AfricaRice: un grand merci à Marie-Noelle, Blandine, Mounirou, Arnaud et l’équipe qui a préparé et conduit un programme précis, complet et bien centré sur la PCR.
4. La réussite de la session TP Bio-Informatique sur le Campus Numérique de l’AUF, malgré la défaillance malencontreuse du fournisseur Internet.
5. Les superbes salles de conférence et de TP contiguës, un immense progrès dans la logistique, qui nous a apporté ainsi qu’aux étudiants un confort sans précédent: un grand merci a Latifou, Cynthia, Majid et toute l’équipe.
6. La présence et le soutien quotidien de l’équipe béninoise, enseignants et doctorants qui ont grandement facilité notre vie quotidienne!
7. L’Atelier a récolté un satisfecit global de la part des étudiants, exprimé dans l’enquête de satisfaction: L’approche TP a été appréciée et a été souvent jugée trop courte.
8. Enfin, l’apparition de la clef USB de 8Go à la place du DVD de l’Etudiant: un gain en temps de gravure et en volume de données bien apprécie!
Les points à améliorer
1. La cantine et les pauses-cafés: LE point noir récurrent de SudBiotech: Les quantités et la qualité n’étaient pas au rendez-vous cette année encore: plats froids si retard dans les manips, distribution au compte-goutte des viennoiseries et des boissons, portions minimales… Il faudra sans doute changer de fournisseur et de formule, en optant peut-être pour une restauration rapide livrée sur place à la commande.
2. La programmation des Cours/TP/TD à l’avance et sa prise en main par l’équipe locale: Apres 5 ans, il est temps de mettre au point ensemble des actions pédagogiques basées sur des modèles tropicaux, et répondant à des questions d’intérêt pour la Sous-région, en harmonie avec nos partenaires d’AfricaRice : germination/conservation des semences, résistance a la sécheresse, certification du matériel végétal … Il y a de la place pour trouver des sous-modules cohérents, capables d’intégrer l’ensemble de l’ approche pédagogique qui a fait le succès et l’originalité de SudBiotech jusqu’ici: Génomique/Protéomique/Bioinformatique pour une approche intégrée de la plasticité métabolique et moléculaire des Plantes.
3. Une fois encore, l’enquête de satisfaction auprès des stagiaires révèle un programme très (trop ?) dense et un manque de temps pour digérer et approfondir, même si la disponibilité des enseignants a été saluée.
SudBiotech 2014 est mort, vive SudBiotech 2015!
1. Nous bénéficierons a minima (un co-funding du bureau régional de l’AUF ou du Ministère Béninois est toujours possible) d’une enveloppe budgétaire de l’Agence-IRD équivalente a celle octroyée en 2014, prévoyant l’organisation d’une Ecole-Chercheurs de deux semaines à Cotonou.
2. L’occasion est belle d’élargir et approfondir notre programme pédagogique, en y intégrant, par exemple, un sous-module de phytopathologie porté par de nouveaux enseignants (Dr Bellafiore pour l’IRD).
3. Le site web de SudBiotech est désormais hébergé par le Cirad (http://www.cirad.fr/enseignement-formation/formation-professionnelle/biotechnologie-vegetale). A nous de l’utiliser pour y poster les informations de tous types, sur les bourses de mobilité, stages, formations ou informations diverses (dont le présent rapport de formation 2014). On y postera également quelques publications de référence utiles à nos apprenants.
Annexes
Annexe 1 : Annonce de la Conférence Publique ANSALB
SudBiotech - Vème Atelier sur la Biologie Moléculaire, les Biotechnologies Végétales et la Bioinformatique
Programme d’enseignement
Lundi 26 Mai 2014
08.30 - 10.30
• Ouverture officielle - Accueil
• Tour de table
• Organisation des groupes
• Programme et structure de l’Atelier
15:00 – 16:30 COURS 1: Innovation et changements d’échelle en Biotechnologie
11:00 – 13:00
• COURS 2 : Définition des concepts régissant la
construction d’une Plante Supérieure : Apports des
techniques de Culture in VItro
17:00 – 19:00
TP1: Plasticité Morphogénétique et Plasticité Métabolique
Mardi 27 Mai 2014
08.30 – 09:30
• Debriefing
15:00 – 16:30
TP1: Calculs et Interprétation
TP1: Mise en commun des résultats et Conclusions
09:30 – 13:00
TP2: Recherche de marqueurs Biochimiques des
processus de Prolifération et de Différenciation
17:00 – 19 :00
TD1: BioInformatique : Principes et applications
La Polymerase Chain Reaction (PCR) :
Principe et applications en Biologie Moléculaire
Mercredi 28 Mai 2014
08.30 – 10:00
AFRICA RICE : Centre du Riz pour l’Afrique
15:00 – 16:30
AFRICA RICE : Centre du Riz pour l’Afrique
10:30 – 13:00
TP3 : Initiation à la PCR et ses applications
17:00 – 18:30
TP3 : Initiation à la PCR et ses applications
Jeudi 29 Mai 2014
08 :30 – 11:00
Débriefing TP1 Débriefing TP2 Débriefing TP3
15:00 – 16 :30
COURS 3 : Application des marqueurs moléculaires aux études de biodiversité
génétique
11:30 – 13:00
COURS 4 : Génétique et Epigénétique
17 :00 – 19 :00
COURS 5: Les composés naturels végétaux à propriétés antiparasitaires et
antimicrobiennes
Vendredi 30 Mai 2014
09:00 – 11:00
CAMPUS NUMERIQUE AUF
15:00 – 16 :30
CAMPUS NUMERIQUE AUF
11:30 – 13:00 TP4 : Bio Informatique
17 :00 – 19 :00 TP4 : Bio Informatique
Samedi 31 Mai 2014
08 :30 – 11:00
Débriefing TP4
15:00 – 16:30 • Questionnaire de satisfaction
• Bilan et perspectives
11:30 – 13:00
TD2: Rédaction et Gestion de Projets de recherche,
Rédaction d’un CV scientifique
17:00 – 18:30 • Remise des Diplômes
Annexe 2
LISTE DES PARTICIPANTS A SUDBIOTECH 2014
ISBA-AfricaRice : 26-31 Mai 2014
N° NOM ET PRENOMS PAYS NIVEAU ADRESSE ELECTRONIQUE
1 ADJE Urielle BENIN MASTER II Biochimie-Biologie
Moléculaire
2 AGBO’SAGA Fulbert BENIN MASTER II Biochimie-Biologie
Moléculaire
3 AGNANDJI Prudence BENIN MASTER II Biochimie-Biologie
Moléculaire
4 BABIO Rafiath BENIN MASTER II Biochimie-Biologie
Moléculaire
5 BADA AMOUZOUN A.
Adonai A.
BENIN MASTER II en Biologie
Végétale
6 BIAO Fortuné BENIN MASTER II Biochimie-Biologie
Moléculaire
7 BOKOBANA Atalaèsso TOGO Doctorant [email protected]
8 CHABI SIKA Karimou BENIN Doctorant Biochimie-Biologie
Moléculaire
9 DANSOU Christian BENIN MASTER II Biochimie-Biologie
Moléculaire
10 ETSE Kodjo Djidjolé TOGO Assistant [email protected]
11 GBAGUIDI Anicet BENIN Doctorant en Génétique [email protected]
12 BAMMITE Damigou TOGO Doctorant [email protected]
13 HODE Y Gisèle BENIN Doctorante en
Phytopathologie
14 AROUNA Rahéanath BENIN Master MTA [email protected]
15 OROBIYI Azize BENIN Doctorant Génétique [email protected]
16 SAGBO Firmin BENIN MASTER II Biochimie-Biologie
Moléculaire
17 SALAMI Hafiz BENIN Doctorant Biochimie-Biologie
Moléculaire
18 TCHATCHEDRE
Mounirou
BENIN MASTER II Biochimie-Biologie
Moléculaire
om
19 TOHOUEGNON
Théophile
BENIN MASTER II Biochimie-Biologie
Moléculaire
tohouegnontheophile@g
mail.com
20 AKLE Iz-deen BENIN Doctorant Biochimie-Biologie
Moléculaire
m
21 WEMBOU Esso-Nan TOGO Doctorant [email protected]
Annexe 3
Vème Atelier de formation sur la Biologie Moléculaire et
les Biotechnologies végétales et la bioinformatique
(SudBiotech)
Laboratoire de Biotechnologie (AfricaRice)
Mercredi 28 mai 2014
RESPONSABLES
Responsable de l’Unité de Biotechnologie : Dr Marie-Noëlle
NDJIONDJOP
Responsable de Laboratoire: Dr Mounirou SOW
Représentant du CIRAD au Bénin: Dr Philippe MENOZZI Rappel sur l’hygiène et la sécurité au sein d’un laboratoire de recherche
Toute manipulation dans un laboratoire nécessite l’utilisation des produits chimiques
dangereux non seulement pour le manipulateur mais également pour l’environnement.
Il est donc important de suivre les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour
la sécurité des biens et des personnes. Par conséquent, il est formellement interdit de
manger ou de boire dans un laboratoire. Il est recommandé pour toute activité de
laboratoire, le port d’une blouse blanche et des gants (en latex, nitrile etc).
Certains solvants utilisés nécessitent d’être préparés et manipulés sous une hotte.
Le Bromure d’Ethidium (BET), produit dangereux pour la santé et classé parmi les
produits CMR (Cancérigène, Mutagène et Reprotoxique) est remplacé au sein de notre
laboratoire par le GelRed. Il y a également le chloroforme, qui est un hépatotoxique et
d’autres produits nocifs par inhalation et pour l’environnement qui doivent être
manipulé avec plus de précaution.
Annexe 4
Les appareils utilisés peuvent également être source de danger lorsqu’ils sont sous
tension. Notamment, les centrifugeuses qui tournent à grande vitesse (un objet soumis à
une force centrifuge, peut être un projectile extrêmement dangereux), les cuves et
générateurs électrophorèses, la micro-onde, et les lampes UV. Les rayons ultraviolets
sont mutagènes. Il est donc impératif de s’en protéger. Activité N°1 : Récolte des jeunes feuilles, extraction d’ADN génomique du riz et quantification
Des jeunes feuilles de riz sont récoltées dans des tubes Eppendorf, puis conservées dans de la
glace. L’ADN de feuille de riz est extrait suivant le protocole ci-dessous.
1-1 Protocole d’extraction rapide
- Broyer dans un mortier environ 4 cm de feuilles fraiches de riz avec 700 µ l de
tampon d’extraction (200mMTris Hcl pH7.5, 250mM Nacl, 25mM EDTA.
0.5%SDS).
- Laisser à température ambiante pendant la durée du broyage
- Centrifuger à 13,000 rpm pendant une minute
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf soigneusement étiqueté
- Ajouter 500 µ l d’isopropanol à froid
- Mélanger par inversion jusqu'à formation de la pelote
- Centrifugé à 13,000 rpm pendant 5min
- Jeter le surnageant en prenant garde de ne pas faire tomber la pelote
- Laver la pelote avec 500 µ l d’éthanol 70°Cà froid puis centrifuger à 12000rpm à
4°C pendant 5min
- Sécher la pelote jusqu’à évaporation totale de l’éthanol
- Suspendre l’ADN extrait dans 200 µ l de tampon TE 0.1X ou dans de l’eau
distillée stérile
- Conserver à -20°C jusqu’à utilisation.
1-2 Dosage et dilution de l’ADN extrait
Quantifier à l’aide d’un spectrophotomètre (Nanodrop) la concentration de l’ADN extrait.
Faire des dilutions spécifiques, afin d’obtenir une concentration d’ADN adéquat pour la
réaction PCR (environ 10 à 15ng/µl).
Activité N°2 : Amplification par PCR Matériel :
Thermocycleur, Tubes 0.5 ml, Micropipette, cônes, portoir, tube ou plaque à PCR, bac à
glace, réactifs de PCR
Réactifs: ADN, DNTPs, Taq ADN polymérase, Primer Forward et Reverse, Tampon10 X,
H2O stérile
Protocole : 1. Déposer 3µl d'ADN dans chacun des puits de la plaque PCR (en fonction du nombre d’échantillons) ; 2. Réaliser un mélange de tous les composants nécessaires pour la réaction dans un tube Eppendorf puis, ajouter l'enzyme polymérase en dernière position ; 3. Répartir 22µl du mélange réactionnel dans chacun des puits de la plaque PCR contenant l'ADN; 4. Mélanger puis lancer l’amplification dans un thermocycleur
Activité N°3 : Electrophorèse sur gel agarose Préparation du gel agarose 3% : Produits et solutions nécessaire: Agarose en poudre ou en pastille Tampon TBE 0.5X (Tris_Borate_EDTA) Bleu de migration Marqueur de taille (50 ou100pb) GelRed
Protocole :
1. Peser 3g d’agarose en poudre dans un bécher puis ajouter 100ml de tampon TBE 0.5X 2. Faire bouillir le mélange dans un four micro-onde (environ 2 min) 3. Laisser légèrement refroidir (environ 10 min) 4. Ajouter 3µl de GelRed et couler le gel dans une cuve contenant des peignes disposés
selon le nombre d’échantillon à analyser 5. Laisser polymériser le gel (environ 20 min) 6. Enlever délicatement les peignes puis déposer le gel dans la cuve à électrophorèse
connectée à un générateur 7. Ajouter 10µl de bleu de migration dans le produit d’amplification 8. Réaliser le dépôt du mélange dans les puits du gel d’agarose préalablement préparé 9. Déposer le marqueur de taille (Poids Moléculaire) 10. Brancher le générateur à la cuve puis lancer la migration à 180V pendant 1h30 (durée
variable selon la taille des amplicons 11. Visualiser le gel aux rayons UV grâce à l’Alpha Imager 12. Enregistrer l’image du gel, imprimer la photo du gel et la coller dans le cahier de
manipulation 13. Interpréter les résultats.
Annexe 5
Annexe 6
Annexe 7
