Annales de pathologie (2009) 29S, S77—S80

SYMPOSIUM / Prédiction de la réponse aux thérapies ciblées

Réponses aux thérapies ciblées : le cancer dupoumon�

Elisabeth Brambillaa,b,c,d

a Institut Albert-Bonniot, Grenoble, Franceb Inserm U823, Grenoble, Francec Université Joseph-Fourier, Grenoble, Franced Département d’anatomie et cytologie pathologiques, CHU Albert-Michallon,38000 Grenoble, France

Accepté pour publication le 28 juillet 2009Disponible sur Internet le 8 octobre 2009

Le cancer du poumon est la première cause de mort par cancer dans le monde. Sa mortalitéavec un taux de survie de 15 % à cinq ans est liée au diagnostic tardif, l’absence d’utilisationde moyens de détection précoce, l’échec des thérapeutiques cytotoxiques convention-nelles. Les connaissances récentes des bases moléculaires de progression ont permis ledéveloppement de méthodes rationnelles de détection, de prévention et de traitement.Plusieurs drogues ciblant les voies de signalisation oncogénique et leurs molécules clés ontété validées sur la base d’essais cliniques de phase III et ont obtenu la reconnaissance FDA,telles les antityrosines kinases (gefitinib, erlotinib, bevacizumab) pour une utilisation chezles patients sélectionnés susceptibles d’en bénéficier en échappant aux effets nocifs. Lasélection des patients est d’ordre clinicopathologique (sexe, type histologique, stades) etles facteurs prédictifs se définissent comme les biomarqueurs dont la présence est liéeà un gain de survie dans la population traitée seulement et n’influencent pas la surviedans la population contrôle ne recevant pas la drogue. La recherche de biomarqueurs deréponse aux thérapies ciblées sur une molécule clé de l’oncogenèse s’applique égalementaux thérapies cytotoxiques dont le mécanisme d’action est identifié et la cible de sélectiondes patients répondeurs (exemple : cisplatine, pemetrexed. . .).

Les cibles thérapeutiques dans le cancer du poumon sont désignées par les voies designalisation des oncogènes les plus fréquemment activés par mutation et où la mutationfait l’objet d’une dépendance par les cellules tumorales pour leur survie et le maintiende leur phénotype tumoral, alors que la cellule normale de l’environnement n’en dépendpas. L’inhibition de l’oncogène induit l’apoptose des cellules tumorales. Ce phénomèned’addiction à l’oncogène offre une considérable susceptibilité pharmacogénique et est trèscaractéristique des deux mutations mutuellement exclusives les plus fréquentes de la voiede l’EGF-R, la mutation EGF-R et la mutation de RAS.

� Symposium présenté le mardi 17 novembre 2009, de 14 h 30 à 16 h 30 dans le Grand Amphithéâtre.Adresse e-mail : ebrambilla@chu-grenoble.fr.

0242-6498/$ — see front matter © 2009 Publie par Elsevier Masson SAS.doi:10.1016/j.annpat.2009.07.033

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es inhibiteurs de l’EGFR

e récepteur à l’EGF et sa voie de signalisation font’objet du ciblage thérapeutique le plus achevé. Les agentsiblant les tyrosine-kinases incluent les inhibiteurs de tyro-ine kinase (TKI) tels que le gefitinib et l’erlotinib, et’anticorps monoclonal cetuximab. Ces agents inhibenta voie de signalisation d’EGF-R, une famille de quatreécepteurs (EGFR1 à EGFR4) qui s’hétérodimérisent parxation de leurs ligands activant l’autophosphorylation duomaine intracellulaire (domaine tyrosine-kinase) (TK), sui-ie de l’activation en cascade d’évènements intracellulairesonduisant à l’accélération de la prolifération, l’inhibitione l’apoptose, l’angiogénèse, l’invasion (métastases) avecour résultat la croissance et la diffusion tumorale. Desutations du domaine tyrosine-kinase de l’EGFR (5 à 10 %

n Europe et États-Unis, 30 à 50 % chez les asiatiques) ontté montrées récemment, souvent associés à une amplifi-ation du gène [1,2]. Elles sont significativement corréléesvec une histologie d’adénocarcinome, l’absence de taba-isme, le sexe féminin et l’ethnicité Est-Asiatique [3]. Cesatients ont plus de 50 % de probabilité de présenter uneutation EGFR et plus de 80 % de chances de réponse auxKI. Les facteurs les plus prédictifs de réponse (80 % deéponse) et de gain de survie sans progression sont les muta-ions des exons 19 (délétions) et 21 (mutations ponctuelles),ui représentent 80 % des mutations. Les mutations prédic-ives de non réponse (résistance) sont la présence d’uneutation de l’exon 20 (isolées 20 %) comme la mutation790 M. En dépit d’une réponse primaire spectaculaire, lesatients rechutent, cependant, conformément au processus’addiction avec une mutation de résistance (T790 M, ampli-cation de Met). Les facteurs prédictifs de survie globale

dentifiés par certains essais cliniques sont l’augmentationu nombre de copies du gène EGFR (amplification et hauteolysomie), dits Fluorescent in situ hybridization (FISH)ositif et le niveau d’expression EGFR par immunohistochi-ie s’est montré corrélé à la survie globale, mais pas à la

éponse dans deux essais cliniques.L’essai clinique IPASS randomisant les sujets asiatiques

on fumeurs porteurs d’adénocarcinomes a apporté lareuve de la signification prédictive de réponse au gefitinibe la mutation EGFR (56 % dans la population) (HR = 0,48)ar rapport à la chimiothérapie (carboplatin, paclitaxel)HR = 2,85) (p < 0,0001).

Les facteurs de sensibilité aux TKI se résument actuel-ement aux facteurs clinicopathologiques suscités, tousndépendants en analyse multivariée, les mutations acti-atrices des exons 19 et 21 de l’EGFR, l’augmentation duombre de copies des gènes EGFR et Her2, et une boucleutocrine active de l’amphiréguline. Les facteurs de résis-ance primaire sont la mutation initiale primaire T790 M,a mutation de RAS (30 % des adénocarcinomes chez lesaucasiens), les mutations isolées de l’exon 20 (insertions,uplications, délétions), l’absence d’expression protéiquee l’EGFR, l’absence de PTEN, la boucle autocrine de’épiréguline. Les facteurs de résistance secondaires asso-iés à la rechute après traitement par TKI sont la mutatione résistance T790 M qui affecte la cinétique de fixation desKI et autorise la fixation de l’ATP au site catalytique tyro-ine kinase, D781Y, des mutations T854A, l’amplification deet qui maintient un haut niveau d’activité de l’EGFR3 et de

a PI3K en dépit de l’inhibiteur, l’augmentation du nombree copies de l’EGFR3 [3].

L’anticorps monoclonal IgG1 (cetuximab) a recu l’aval dea FDA pour le traitement des patients sans mutation de RAS

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ans les cancers colorectaux. Il se lie à l’EGFR en inhibanta fixation de ses ligands mais surtout en activant un phéno-ène ADCC létal pour les cellules tumorales. Les deux essais

liniques (Flex, SO342) ont montré son efficacité, particuliè-ement chez les patients porteurs d’une expression d’EGFRt d’une amplification (à la limite de la signification statis-ique). Ni les mutations de l’EGFR, ni celles de RAS ne sontrédictives.

a mutation de RAS et ses voies deignalisation

a voie RAS, en aval de EGFR est activée de facon aber-ante par mutation de RAS (10 à 15 % des cancers non àetites cellules ; 15 à 35 % des adénocarcinomes) et 90 % dees mutations sont dans l’exon 2 de KRAS, chez les sujetsumeurs et des mutations mineures BRAF (1 à 2 %). Elles sontutuellement exclusives avec celles de l’EGFR. La mutationAS est liée à la résistance aux TKI [4,5], les drogues cibléesur RAS et RAF sont prometteuses à la suite d’essais cliniquese phase I-II mais n’ont pas recu l’autorisation (FDA/AMM) :l s’agit des inhibiteurs de farnesyltransférases (tipifarnib,orafarnib), inhibiteur de BRAF et de MEK (en aval de rasans la voie RAS/RAF/MEK/MAPK).

nhibiteurs de l’angiogenèse

e VEGF est le premier facteur d’angiogenèse et le plusiblé parmi les facteurs d’angiogenèse tumorale dans leancer du poumon. La famille du VEGF inclut six facteurse croissance autocrines (VEGF, A, B, C, D, E et PIGF) etrois récepteurs (VEGFR1, R2, R3 (FLT4). Le bevacizumab, unnticorps monoclonal qui lie toutes les isoformes du VEGFA,recu l’approbation à la suite du résultat des essais de

hase II montrant un bénéfice de survie par addition à lahimiothérapie chez les patients porteurs d’un carcinomeon épidermoïde. Le bénéfice est maximum dans les adé-ocarcinomes. La cible VEGF n’a pas été spécifiquement

ecommandée comme facteur prédictif d’effet thérapeu-ique (sauf l’EGF circulant). Les patients porteurs dearcinome épidermoïde sont à risque d’hémorragie mortelleous bevacizumab, ce qui met en évidence l’importance eta nécessité pour les pathologistes d’exclure ce diagnostic.

Le VEGF est un facteur tyrosine kinase qui est ciblé pares TKI VEGF qui tous ciblent d’autres tyrosines kinasesomme EGFR, c-kit (exemple : vandatenib) et RAF ou suni-inib (ciblant aussi PDGFR).

Les inhibiteurs d’autres cibles de la voie de signalisatione l’EGFR : PI3K (4 % de mutations dans le cancer du poumon,ctivé par la branche PI3K-Akt de la voie ; mTOR une cibleistale de PI3K (analogue de la rapamycine) (temsirolines,verolines), sont en phases I-II des essais cliniques. Aucuneible particulière pour le pathologiste n’est recommandéeour la sélection des patients.

Les inhibiteurs des histones déacétylases (SAHA, etc. . .)t de la méthylation de l’ADN (cinq azacytidine) ont pourffet la réversion de la répression transcriptionnelle impo-ée par la méthylation des îlots CpG des promoteurs desènes suppresseurs de tumeurs où DNA méthyltransférase etistones déacétylases collaborent. Ces gènes ont des effetsntiprolifératifs en activant les gènes suppresseurs.

Les inhibiteurs du protéasome (bortezomib) sont à l’essaivec un effet attendu sur la régulation du cycle cellulaire eta réparation de l’ADN, de l’apoptose et de l’angiogénèse,

Réponses aux thérapies ciblées : le cancer du poumon

toutes fonctions contrôlées par l’ubiquitination protéa-somes dépendantes.

Sélection des patients pour un traitementapproprié

Dans les cancers du poumon au stade avancé, le bénéfice desurvie de la chimiothérapie n’est évident qu’après la sélec-tion des patients susceptibles d’en bénéficier, étant donnéleur résultat limité sur la population générale et leur toxi-cité.

Le cisplatine et le pemetrexed ont des mécanismesd’activité connus dont on peut tirer parti en les utilisantcomme facteurs prédictifs ou pronostiques pour sélection-ner les patients susceptibles d’en bénéficier. Un marqueurde réparation des adduits du cisplatine (ERCC1) appartenantau système Nucleotide Excision Repair (NER) a fait l’objetd’une étude statistique sur les cas de l’essai clinique IALTdestiné à évaluer le bénéfice de survie d’une chimiothérapieadjuvante à base de cisplatine. L’évaluation immunohisto-chimique de ERCC1 a révélé que seuls les patients ayantune tumeur ERCC1 négative (comme ailleurs mRNA-ERCC1négatifs) auparavant bénéficient d’un gain de survie par letraitement adjuvant [6]. Regulatory Unit of RibonucleotideReductase (RRM1) a montré la même corrélation entre saperte (RRM1-) et le bénéfice de survie par le traitement gem-citabine/cisplatine. La surexpression de ces deux gènes deréparation de l’ADN corrélait, par ailleurs, avec un meilleurpronostic mais aucun bénéfice de survie par la chimiothéra-pie à base de cisplatine [6]. Les facteurs de cycle cellulairep27 [7] et d’apoptose (P53, Bax, Fas) ont montré leur rôleprédictif.

Profils d’expression génétiques complexesprédicteurs de réponses thérapeutiques ?

Les nombreuses signatures de profils d’expression des gènes

dans le cancer du poumon ont présenté une grande diver-sité des associations de gènes prédictifs de pronostic(rechutes/survie) et peu de concordance entre elles. Uneméta-analyse a cependant offert un profil prédictif de sur-vie commun (64 gènes) [8] dont l’expression corrélait avecla rechute mais l’intégration de ces signatures complexesen clinique n’a pas été effectuée [9]. Il n’est, d’ailleurs,pas prouvé que les expressions corrélant avec un pronos-tic d’agressivité aient aussi un rôle dans la prédiction derésultats des thérapeutiques non ciblées.

Plus intéressantes sont les recherches d’une signalisa-tion de réponse à une drogue thérapeutique ciblée [10,11].Les signatures protéomiques de réponse aux TKI peuventrecevoir les mêmes critiques. Ces tentatives de signaturesmultigéniques n’ont pas été portées à l’application cliniquepar absence de preuve de reproductibilité.

Les cellules souches de cancer

Caractérisées par un renouvellement par division asymé-trique, la totipotentialité de différentiation, la croissanceillimitée, ces cellules souches de cancer représentent undéfi thérapeutique : la sous-population souche est intrinsè-quement résistante à la chimiothérapie et radiothérapie dueà sa croissance lente, sa capacité d’extrusion des drogues et

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de réparation de l’ADN. Une signature de cellules souchesdu poumon s’est montrée prédictive de réponse à la chimio-thérapie [12].

Les voies Wnt, Notch et Hedgehog jouent un rôle cri-tique en régulant le renouvellement de cellules souchespulmonaires et la morphogenèse. La dérégulation par réacti-vation de ces voies de signalisation dans le cancer conduit àl’expansion des cellules souches, la transformation maligneet l’invasion, et sont des évènements précoces dans la carci-nogenèse. Elles sont des cibles potentielles thérapeutiqueset leurs molécules clés sont accessibles pour des patholo-gistes.

Recommandations pour les pathologistes :prélèvements tumoraux et variablespréanalytiques

Les analyses immunohistochimiques, de FISH et moléculaires(recherche de mutations) se heurtent aux constats de lahaute fréquence d’hétérogénéité des cancers du poumonau niveau moléculaire, de la suffisance du matériel destinéaux analyses moléculaires variées (type de prélèvement),des conditions de collection, de stockages et du type deméthode.

Hétérogénéités tumorales : conséquences

Ni le niveau d’expression de l’EGFR ou de sa forme phos-phorylée (phospho EGFR), ni le niveau d’amplification depolysomie, ni même la mutation ne sont parfaitement homo-gènes, le plus hétérogène étant le nombre de copies du gèneEGFR distribué par régions clusters dans la tumeur primitivealors qu’il est homogène dans la mutation. Cinquante pourcent de patients ont une variation de type mutation entrela tumeur primitive et la métastase [13].

Pour circonvenir l’hétérogénéité clonale, seuls les pré-lèvements tissulaires en quantité suffisante doivent êtreconsidérés (1 à 2 mm minimum). Le matériel cytologique et

TMA ne sont pas validés. La polysomie du chromosome 7 estappréciée relativement au nombre de copies de l’EGFR etpermet contrairement au FISH (une seule sonde EGFR) unevéritable distinction polysomie/amplification. Le FISH est laméthode standard avec un score bien établi (score du Colo-rado) et n’est pas corrélé de facon linéaire aux résultats dela RT-PCR [14].

Les sections précoupées pour FISH ou immunohistochimiene doivent pas être conservées plus de trois mois. La fixationformol de 4 % est standardisée (à condition de prétrancher2 mm maximum pendant la fixation).

Les mutations d’EGFR peuvent être recherchées pardifférentes méthodes non citées ici dont le standard deréférence est le séquencage direct bidirectionnel. Le tissucongelé donne des résultats plus constants et reproductiblesque les prélèvements fixés (100 % contre 90 %). Les prélè-vements inférieurs à une certaine taille (< 1 mm) ont unesensibilité de détection de 90 %. Le ratio cellules tumo-rales/cellules normales de 60 % doit être atteint soit parmacro soit par microdissection pour un résultat optimal.

Enfin et surtout, le rapport final, quels qu’en soient lesacteurs, est sous la responsabilité du pathologiste qui pro-cure le tissu, garantit sa représentativité et sa qualité, lepourcentage de cellules tumorales et la classe histologique.Le pathologiste est en charge du rapport final histomolécu-laire.

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