revue Transmission des Nepovirus par les nématodes Longidoridae

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Transmission des Nepoviruspar les nématodes Longidoridae

G. Demangeat

UMR1131, Santé de la vigneet qualité du vin, Inra,Université Louis Pasteur de Strasbourg.Laboratoire de Virologie et Vection,28 rue de Herrlisheim,68021 Colmar<[email protected]>

Résumé. La propagation des virus de plante à plante est souvent assurée par desorganismes tiers appelés vecteurs. Une classe d’invertébrés souterrains, lesnématodes, peut jouer ce rôle. Des nématodes ectoparasites de la famille desLongidoridae sont responsables de la transmission naturelle de virus appartenantau genre Nepovirus selon un mode semi-persistant non circulant et non multi-pliant. Cette transmission passive des particules virales se déroule au momentdes prises alimentaires des nématodes au niveau des racines. Seul un nombrelimité de Longidoridae est capable d’acquérir et de transmettre 12 des 32 Nepo-virus décrits. Cette particularité reflète une interaction hautement spécifique etsolide qui lie le virus et son vecteur au niveau de l’appareil alimentaire dunématode, probablement par l’intermédiaire d’un récepteur. L’étude du modèlegrapevine fanleaf virus/xiphinema index a montré que cette spécificité d’inter-action est déterminée uniquement par la protéine de capside du virus.

Mots clés : Longidoridae, Nepovirus, transmission, spécificité virus-vecteur

Abstract. Transmission of plant viruses in nature often involves vectors whichare usually plant pests. A class of soil borne invertebrates acts in this way.Ectoparasitic nematodes belonging to the Longidoridae family are responsiblefor the transmission of viruses from the Nepovirus genus using a semipersistant,non circulative mechanism. This passive transmission occurs during the feedingprocess of the nematodes on actively growing roots. However, only a fewlongidorid nematodes are able to acquire and subsequently transmit 12 of the 32known Nepovirus. This singularity reflects a highly specific and strong associa-tion between the virus and the vector likely via a putative receptor on thecuticular lining of the oesophageal tract. Using a reverse genetics approach,investigations on the Grapevine fanleaf virus/Xiphinema index virus-vectorassociation showed that the transmission specificity is solely determined by thecoat protein.

Key words: Longidoridae, Nepovirus, transmission, virus-vector specificity

Les virus de plantes ont en commun, avec tous les parasites,l’obligation de se propager d’hôtes en hôtes pour pouvoir semultiplier. Pour la majorité des virus de plante, cette étapeimplique l’assistance d’un vecteur mobile qui est souventun ravageur ou un parasite des plantes. Pour une grandepartie des virus de plante, ce vecteur est un arthropode etquelques fois un champignon (pour revue sur la transmis-sion de virus de plante, voir Plumb [1]). Mais pour deux

genres de virus, les Tobravirus et les Nepovirus, ce vecteurpeut être un nématode ectoparasite souterrain.

Les virus du genre Nepovirus font partie de la famille desComoviridae. Ils possèdent un génome bipartite constituéd’ARN simple brin de polarité positive protégé à l’intérieurde particules icosaédriques. Seulement un tiers des népovi-rus est transmis par les nématodes ectoparasites. Bien qu’ilexiste pour plusieurs autres népovirus des évidences detransmission via le sol impliquant des nématodes, le modede transmission naturel des autres népovirus est encore mal

Tirés à part : G. Demangeat

Virologie 2007, 11 (4) : 309-21

doi:

10.1

684/

vir.2

007.

0102

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connu. Cependant, leur dissémination peut être assuréepour certains par le pollen ou la graine.Trois genres très proches de nématodes Longidorous, Para-longidorus et Xiphinema appartenant à la famille desLongidoridae sont responsables de la transmission natu-relle de plante à plante des népovirus. Ils sont transmisselon un mode semi-persistant non circulant et non multi-pliant. Une principale caractéristique de la transmission desnépovirus par nématodes est la spécificité élevée entrel’espèce de nématode vectrice et son virus associé. Cettespécificité est déterminée par la capacité du nématode àretenir le virus au niveau de sites spécifiques (probablementvia un récepteur) dans l’appareil alimentaire du nématode.Cette rétention spécifique s’étend sur des périodes trèslongues.Au cours des dernières années, les contributions scientifi-ques concernant la biologie des népovirus, et en particuliercelle du grapevine fanleaf virus (GFLV), ont été importan-tes [2-5]. Le développement des techniques moléculaires etla connaissance de la biologie des népovirus ont permis dedonner un nouvel élan à l’étude des interactions entre lesnépovirus et leurs vecteurs naturels, les nématodes.Cet article présente les associations vecteurs-népovirusconnues à ce jour et fait le point sur les données récentesacquises en ce qui concerne la biologie de la transmission etles déterminants viraux impliqués dans la transmission desnépovirus par les nématodes avec une attention particulièrepour le GFLV et son vecteur naturel Xiphinema index.

Les nématodes, vecteurs de népovirus

1958, Hewit et al. [6] ouvraient une nouvelle voie derecherche, celle de la transmission de virus de plante par

des nématodes ectoparasites. Ils ont montré que le GFLV,principal agent responsable de la virose la plus gravede la vigne, la maladie du court-noué, était transmis devigne à vigne par un nématode ectoparasite, X. index(figures 1 et 2). Peu après, Jha et Posnette [7] ainsiqu’Harrison et Cadman [8] mettaient également définitive-ment en évidence le rôle de X. diversicaudatum dans lavection de l’Arabis mosaic virus (ArMV), un autre népo-virus très proche du GFLV également responsable de lamaladie du court-noué de la vigne. Depuis cette découverteinitiale, plus de 40 associations virus-vecteur ont été décri-tes. Cependant, de nombreuses associations ont été révo-quées parce que les informations qui les décrivaient ne

A B

Figure 1. A) Aspect général de Xiphinema index , le vecteur naturel du Grapevine fanleaf virus. La barre représente 1 mm. B) Larve deXiphinema en train de muer. La flèche rouge indique la larve néonate et la flèche noire indique la cuticule de mue à laquelle l’odontostyleest resté accroché. La barre représente 0,1 mm.

100 nm

Figure 2. Cliché de microscopie électronique montrant des parti-cules virales de GFLV après purification. La barre représente100 nm.

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Virologie, Vol. 11, n° 4, juillet-août 2007310

remplissaient pas les conditions nécessaires permettantd’établir sans ambiguïté une interaction stricte entre levecteur et le virus [9].Les trois genres Longidorus, Paralongidorus et Xiphinemavecteurs des népovirus appartiennent à l’ordre desDorylaimida, sous-ordre des Dorylaimana, et à la familledes Longidoridae [9-11]. Ils regroupent plus de 400 espè-ces différentes mais un faible nombre parmi ces espèces aété identifié comme vecteur de virus [9]. À ce jour, huitespèces de Longidorus, une espèce de Paralongidorus etneuf espèces de Xiphinema ont été démontrées commeétant les vecteurs naturels de 12 des 32 népovirus connus(tableau 1). Les nématodes de la famille des Longidoridaesont vermiformes à tous les stades de développement. Iln’existe pas de différence morphologique majeure entre lesadultes et chacun des stades de développement si ce n’est la

taille et quelques détails anatomiques peu apparents. Cesont des nématodes ectoparasites qui s’alimentent au ni-veau des racines en croissance. Ils possèdent une gammed’hôtes très large qui s’étend des plantes annuelles auplantes pérennes. Pour 15 des 18 espèces vectrices denépovirus, la reproduction est parthénogénétique et, dansce cas, les mâles sont rares [11]. Les Longidoridae évoluentdu stade œuf vers le stade adulte en passant par 3 ou 4 stadeslarvaires. En conditions naturelles, la majorité des espècesont un cycle de vie très long (plus d’un an) alors que, enserre, en conditions contrôlées, ce cycle de vie peut êtreréduit à quelques semaines [11]. Une caractéristique de labiologie des nématodes est leur capacité de survie trèsimportante qui peut être supérieure à 5 ans. En effet, si lesconditions extérieures sont défavorables, les nématodesentrent dans un cycle de quiescence pendant lequel leurs

Tableau 1. Associations spécifiques entre virus et vecteurs Longidorus, Paralongidorus et Xiphinema

Genres Espèces Népovirus Acronyme

Longidorus apulus Artichoke italian latent virus (isolat italien) AILVarthensis Cherry rosette virus CRVattenuatus Tomato black ring virus (isolat allemand/anglais) TBRVdiadecturus Peach rosette mosaic virus PRMVelongatus Raspberry ringspot virus (isolat écossais) RpRSV

Tomato black ring virus (isolat écossais) TBRVfasciatus Artichoke italian latent virus (isolat grecque) AILVmacrosoma Raspberry ringspot virus (isolat anglais) RpRSVmartini Mulberry ringspot virus MLRV

Paralongidorus maximus Raspberry ringspot virus (isolat vigne allemand) RpRSV

Xiphinema americanum sensu lato Cherry rasp leaf virus CRLVPeach rosette mosaic virus PRMVTobacco ringspot virus TRSVTomato ringspot virus ToRSV

americanum sensu stricto Cherry rasp leaf virus CRLVTobacco ringspot virus TRSVTomato ringspot virus ToRSV

bricolensis Tomato ringspot virus ToRSVcalifornicum Cherry rasp leaf virus CRLV

Tobacco ringspot virus TRSVTomato ringspot virus ToRSV

diversicaudatum Arabis mosaic virus ArMVStrawberry latent ringspot virus * SLRV

index Grapevine fanleaf virus GFLVintermedium Tobacco ringspot virus TRSV

Tomato ringspot virus ToRSVrivesi Cherry rasp leaf virus CRLV

Tobacco ringspot virus TRSVTomato ringspot virus ToRSV

tarjanense Tobacco ringspot virus TRSVTomato ringspot virus ToRSV

* Le SLRV est maintenant assigné au genre Sadwavirus.

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fonctions biologiques sont arrêtées. Dès que des conditionsfavorables sont restaurées, ils terminent alors leur cyclebiologique [10-12].La présence de nématodes dans le sol est corrélée essentiel-lement à deux paramètres qui sont la porosité et l’hygromè-trie du sol [13]. Les Longidorus et les Xiphinema s’accom-modent en général d’une assez grande variété de sols. Ladistribution verticale des nématodes dans le sol dépendavant tout de la disponibilité en racines. Les études les pluscomplètes concernant la distribution verticale des némato-des vecteurs de virus ont été réalisées dans les vignobles.Les nématodes sont très rarement retrouvés dans la couchesuperficielle du sol (0 à 30 cm), couche trop perturbée parles travaux agricoles et les variations climatiques. La majo-rité de la population de nématodes vecteurs de virus seconcentre entre 30 et 80 cm de profondeur correspondantaux horizons les plus fortement colonisés par les racines[14]. Cependant, il est tout à fait possible de retrouver lesnématodes jusqu’à 1,5 m de profondeur (vignoble de Côte-d’Or) et même jusqu’à 3,6 m dans un vignoble californien[11, 15].

Les Longidoridae vecteurs de virus sont essentiellementendémiques en Europe et sur le continent nord-américain, àl’exception de Longidorus martini, vecteur du Mulberryringspot virus, association localisée au Japon (figure 3)[11, 16, 17]. Il est fortement probable que les nématodes etleurs virus associés ont été dispersés depuis l’Europe et lecontinent nord-américain vers l’Amérique du Sud,l’Afrique du Sud, la Chine, l’Asie, l’Australie et laNouvelle-Zélande [17]. Certaines associations virus–nématodes ont une distribution géographique très large. Parexemple X. index et le GFLV sont présents dans la quasitotalité des vignobles du monde [4]. Pour X. index, il estcommunément admis que l’aire d’origine pourrait être leMoyen-Orient, région à partir de laquelle il aurait été dis-séminé en même temps que la vigne dans l’ensemble dubassin méditerranéen par les Phéniciens, les Grecs et enfinles Romains. X. diversicaudatum, vecteur de l’ArMV, estprésent en Europe, en Asie, en Inde, au Canada et dans lespays de l’ex-Union soviétique [11, 17, 18]. Les népovirusnord-américains et leurs nématodes associés sont dissémi-nés sur la totalité du continent nord-américain uniquement

AfriqueXiphinema index

Amérique du Nord

Longidorus diadecturus

bricolensis

intermediumrivesitarjanense

indexXiphinemaamericanum sensulatoamericanum sensustricto

californicum

Amérique du SudXiphinema

californicum

Ex-Union soviétique + Moyen Orient

Longidorus attenuatuselongatusmacrosoma

Asie

Xiphinema index

Longidorus martinidiversicaudatum

Europe

Longidorus apulusarthensisattenuatuselongatusfasciatusmacrosoma

Paralongidorus maximus

index

Xiphinema indexdiversicaudatum

Xiphinemadiversicaudatumindex

Figure 3. Distribution mondiale des nématodes Longidoridae, vecteurs de virus. Xiphinema index, vecteur du grapevine fanleaf virus, estindiqué en rouge pour souligner sa répartition mondiale. D’après Brown et MacFarlane [17].

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[17]. En revanche, pour une grande partie des associationsvirus-vecteur présentes en Europe, cette distribution géo-graphique est plutôt restreinte à un pays, voire une région.Ainsi L. apulus et L. faciatus, tous deux vecteurs de deuxsérotypes d’Artichoke italian latent virus (AILV), ont étérecensés en Italie et en Grèce respectivement [19, 20]. Demême L. arthensis et son virus associé, le Cherry rosettevirus (CRV), ont été mis en évidence localement dans larégion de la Arth, en Suisse [21].X. italiae a également été proposé comme étant un vecteurdu GFLV [22]. Cependant, cette association n’a jamais étéconfirmée par d’autres travaux [11, 16]. Il est donc fort peuprobable qu’il puisse être un vecteur spécifique du GFLV ;par conséquent, X. index est considéré comme étant le seulvecteur naturel du GFLV [11, 16].

Les Nepovirus transmis par nématodes

Les virus appartenant au genre Nepovirus appartiennent àla famille des Comoviridae qui comprend également lesgenres Comovirus et Fabavirus [23]. Les népovirus ont unegamme d’hôtes naturels très large. Cette gamme d’hôtess’étend des plantes sauvages aux plantes cultivées annuel-les ou pérennes. Elle est étroitement liée à celle de leursvecteurs associés. En effet, le seul hôte naturel connu duGFLV est la vigne qui est également le seul hôte naturel deX. index. En revanche, l’ArMV, transmis spécifiquementpar X. diversicaudatum, a une gamme d’hôtes beaucoupplus large (arbres fruitiers, plantes à petits fruits, arbres etarbustes ornementaux, cultures légumières, adventices)parce que le nématode vecteur est beaucoup plus polyphageque X. index. Les népovirus sont également inoculablesmécaniquement à de nombreuses plantes herbacées [2, 23].Les symptômes induits par les népovirus sont très variés.La multiplication du virus se manifeste par l’apparition auniveau des feuilles d’anneaux chlorotiques, de panachuresréticulées, de jaunissements des nervures ou du limbe, demosaïques, de panachures. On peut également observer unrabougrissement de la plante, une déformation des limbes,une réduction de la vigueur [24]. Dans les cas extrêmes, lamultiplication du virus conduit à la mort des plantes infec-tées (figure 4). La quantité et la qualité des récoltes sontégalement affectées. Les pertes économiques engendréespar ces virus peuvent être importantes et atteindre 80 %pour la vigne. [4]. Cette grande variabilité des réponses àl’infection dépend de la nature du virus ou de l’isolat viral,de l’hôte, de l’âge de la plante et des conditions pédo-climatiques de la culture. Au champ, les plantes naturelle-ment infectées par les népovirus sont souvent réparties sousforme de foyers. L’extension d’un foyer se fait en généraltrès lentement parce que la mobilité naturelle des némato-des n’est que de quelques centimètres par an [9, 10].

Les particules virales sont non enveloppées, d’un diamètrevariant de 28 à 30 nm et de forme icosaédrique (figure 2).La capside des népovirus est typiquement composée de60 sous-unités d’un seul polypeptide variant de 52 à 60 kDa[23]. Une structure cristallographique a été obtenue pour lemembre type des népovirus, le tobacco ringspot virus(TRSV) [25]. La résolution du cristal de TRSV suggère quela sous-unité de la capside des népovirus est repliée en troisdomaines identiques adoptant un repliement communé-ment appelé jelly-roll. Les 60 sous-unités sont associéesentre elles pour former une capside selon une organisationpseudo T = 3 [25]. Les particules virales protègent le gé-nome viral qui est constitué de deux ARN, ARN1 et 2,simple brin de polarité positive. L’extrémité 5’ de chaqueARN est liée de manière covalente à une protéine virale, laVpg, et l’extrémité 3’ est polyadenylée. Certains isolats denépovirus possèdent un ARN supplémentaire que l’on ap-pelle ARN satellite [26], qui est encapsidé dans les mêmesparticules virales que les ARN génomiques. Les deux ARNgénomiques sont nécessaires pour déclencher une infectionmais l’ARN1 seul est capable de se répliquer dans lesprotoplastes de plantes [5].Chaque ARN est traduit en une polyprotéine qui est clivéeen protéines fonctionnelles grâce à une protéase codée parl’ARN1. Ce processus de maturation des polyprotéines aété étudié entre autres pour l’ArMV, le tomato black ringvirus (TBRV), le GFLV et le tomato ringspot virus(ToRSV), principalement in vitro [2, 4, 5]. En plus de lasous-unité de la capside, identifiée dans les plantes pour laplupart des népovirus, certains des produits de maturationont été mis en évidence in vivo [2, 4, 5, 27]. Le GFLV, avecle ToRSV, est l’un des népovirus pour lequel les connais-sances sur la structure et l’expression du génome sont les

Figure 4. Parcelle de Chardonnay montrant des symptômes ca-ractéristiques de la maladie du court-noué. La multiplication duvirus induit une dégénérescence progressive des ceps de vignequi conduit, dans certains cas, à la mort des pieds de vigne,comme illustré sur cette photo par les ceps de vigne manquants ausein d’un foyer de court-noué. Les chutes de rendement peuventatteindre 80 %.

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plus avancées [4, 5, 23]. La polyprotéine P1 codée parl’ARN1 du GFLV est clivée en cinq protéines : 1A(46 kDa), 1BHel (88 kDa), 1CVPg (3 kDa), 1DPro (24 kDa) et1EPol (92 kDa) (figure 5). Ces protéines sont libérées par unclivage en cis au niveau de sites peptiques identifiés parl’action de la protéine 1DPro. Les comparaisons de séquen-ces avec des virus très proches du GFLV suggèrent que laprotéine 1A soit un cofacteur de la protéase. La protéine1BHel, qui possède un domaine de fixation des nucléotides,est supposée être une hélicase alors que la présence d’unmotif GDD permet de proposer une fonction polymérasepour la protéine 1EPol. L’étude de l’expression du génomedu GFLV a montré que la protéine 1CVPg est liée de manièrecovalente à l’ARN viral. La maturation des polyprotéines aété attribuée à la protéine 1DPro [4]. Le clivage de lapolyprotéine P2 codée par l’ARN2 est réalisée en trans parla protéase 1DPro. Il conduit à la formation de trois protéi-nes matures : 2AHP (28 kDa) impliquée dans la réplicationde l’ARN2, 2BMP (38 kDa) nécessaire au mouvement duvirus de cellule à cellule et 2CCP qui correspond à lasous-unité de la capside du virus [4].

Il est important de préciser, à ce niveau, que le strawberrylatent virus (SLRV), transmis spécifiquement par X. diver-sicaudatum, a été considéré comme un membre atypique dugenre Nepovirus. Ce virus, qui possède une capside consti-tuée de deux sous-unités de tailles différentes et des homo-logies de séquences avec les virus du genre Cheravirus etceux des familles Sequiviridae, Comoviridae, Picornaviri-dae, est maintenant assigné au genre Sadwavirus. Ce genre,tout comme les Cheravirus, n’est pour le moment rattachéà aucune famille ou ordre [23].

Morphologies, alimentationet transmission

Les Longidorus, Paralongidorus et Xiphinema sont desnématodes de grande dimension car ils mesurent de 2 à12 mm de long au stade adulte. Ils sont vermiformes à tousles stades de leur développement. Pour l’ensemble desLongidoridae, la morphologie de leur appareil alimentaireest semblable (figure 6). Ils ont un long stylet creux de 60 à250 lm au stade adulte qui permet d’atteindre les zonesvasculaires des jeunes racines. Dans sa partie antérieure, lestylet est formé de l’odontostyle, partie la plus rigide dustylet, qui est élaboré par une cellule située dans la paroi del’œsophage. Les larves en possèdent deux : le premierfonctionnel et le second situé plus bas dans la paroi del’œsophage (figure 6). Ce dernier devient fonctionnel lorsde la mue, lorsque le nématode perd son odontostyle enmême temps que sa cuticule (figures 1 et 6). La partiepostérieure du stylet est l’odontophore dont la partie basaleest reliée aux muscles protracteurs qui permettent de fairesortir entièrement l’odontostyle.L’acquisition et la transmission de particules virales sontdeux étapes directement liées au comportement alimentairedes nématodes. Chez les Longidoridae, les nématodes ex-plorent la surface des cellules de racines avec leurs lèvres,afin d’identifier une région propice à la prise alimentaire.La cellule est ensuite pénétrée par une poussée rapide del’odontostyle. Le stylet est entièrement sorti et la racine estpénétrée sur une épaisseur de plusieurs cellules. Après laperforation des cellules, le contenu des glandes salivaires,associées au bulbe œsophagien, est déversé dans la cellule.

ARN2 (3774 nt) / P2 : 112 kDa

1CVpg

(A)n

(A)n

C/A

C/A

C/S G/E R/G/E

R/G

1A

2AHP 2BMP 2CCP

1BHEL 1DPro 1EPol

ARN1 (7342 nt) / P1 : 253 kDa

Figure 5. Organisation génomique et expression des ARN1 et 2 du grapevine fanleaf virus (GFLV) isolat F3. Les deux ARN comportentune longue phase de lecture ouverte représentée par les rectangles ombrés. Les séquences non codantes sont représentées par lesrectangles fins rouges aux extrémités de chaque phase codante. La Vpg est représentée par un cercle noir. Les sites de clivage au niveaudes deux polyprotéines et leurs séquences correspondantes sont indiqués par les triangles pleins et les lettres respectivement. Le nomdes protéines est indiqué à l’intérieur de chaque protéine produite.

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Ces sécrétions permettent de liquéfier le cytoplasme cellu-laire de façon à permettre l’ingestion, les organites cellulai-res ne pouvant pas être assimilés directement [28]. L’inges-tion, qui peut durer plusieurs heures, s’effectue par descontractions du bulbe œsophagien entrecoupées de pério-des d’arrêt de quelques minutes, pendant lesquelles le pro-cessus de salivation est repris. L’odontostyle est finalementretiré et la prise alimentaire s’achève par quelques contrac-tions du bulbe œsophagien. Un nématode peut vider lecontenu d’une quarantaine de cellules par heure. C’est aucours de ces étapes d’alimentation, pendant lesquelles deséchanges entre la plante et le nématode sont réalisés, que sedéroule la transmission des particules virales. Parmi lesdifférentes étapes du processus alimentaire, trois sont pro-prement liées à la transmission des virus [29]. Les particu-les virales sont ingérées par le nématode avec la nourriture,puis retenues spécifiquement au niveau de l’appareil ali-mentaire et, enfin, relâchées lors du flux des sécrétionsproduites par les glandes salivaires. L’efficacité de ces troisétapes, et en particularité celle de l’étape d’adsorption et derelargage des particules virales, détermine la capacité dunématode à être un vecteur efficace ou non des virus [29].

Site de rétention des particules virales

Dans les nématodes vecteurs, les particules virales sontadsorbées en des sites précis probablement en associationavec un récepteur présent au niveau de la cuticule interne del’appareil alimentaire. L’observation de coupes ultra-finesréalisées à partir de nématodes virulifères ont permis demontrer que, chez les Longidorus et sans doute les Para-longidorus, les particules virales sont présentes exclusive-ment entre l’odontostyle et la membrane «guide» (figure 6)[30]. Chez les Xiphinema, les particules virales se répartis-sent sur un segment de l’appareil alimentaire beaucoup pluslong que chez les Longidorus (figure 6). Elles sont adsor-

bées en une monocouche tapissant la cuticule de l’odonto-phore, de l’œsophage et du bulbe œsophagien [11, 30, 31]mais surtout la partie antérieure de l’odontophore [16]. LesLongidorus et les Xiphinema diffèrent par leurs sites derétention des particules virales. Cette différence de locali-sation et de surface de rétention explique probablement ladifférence du temps de conservation des particules viralesentre les deux genres de nématodes. En effet, le temps derétention des particules virales est beaucoup plus importantchez les Xiphinema comparé au Longidorus (cf. infra). Àchaque mue, les particules virales sont éliminées parce quela cuticule qui recouvre le tractus alimentaire et l’odonto-phore est éliminée en même temps que l’odontotostyle(figure 1). Les nématodes ne sont plus virulifères après lamue et doivent se réalimenter sur une plante virosée pourdevenir à nouveau porteurs du virus [11].

L’adsorption des virus est un phénomène sélectif et spéci-fique. L’incapacité des autres nématodes à transmettre desparticules virales reflète probablement l’absence ou unenature différente des sites de rétention des particules vira-les. Ainsi, l’ArMV transmis par X. diversicaudatum n’estpas retrouvé au niveau de l’appareil alimentaire de L. elon-gatus, bien qu’il soit détectable dans son intestin [13]. Parailleurs, X. index ne transmet pas l’ArMV parce quel’ArMV n’est pas retenu par X. index [32]. L’indication del’existence d’un récepteur spécifique a été apportée par uneexpérimentation de génétique classique. Le croisementd’une population écossaise de X. diversicaudatum quitransmet efficacement l’ArMV avec une population ita-lienne qui transmet faiblement l’ArMV génère des indivi-dus F1 dont l’efficacité de transmission est intermédiaire.Cette efficacité de la transmission de l’ArMV augmenteavec la génération F2 mais n’atteint pas celle des parentsécossais de départ [33].

Le récepteur présent au niveau de la cuticule interne del’appareil alimentaire du nématode n’est pas connu. Néan-

Site de rétentionLongidorus

Site de rétentionXiphinema

in bl gs oe osr mr od mp mg os

Figure 6. Partie antérieure des Longidoridae (stade larvaire). in : intestin ; bl : bulbe musculoglandulaire ; gs : glandes salivaires ; oe :œsophage ; osr : odontostyle de remplacement ; mr : muscle rétracteur ; od : odontophore ; mp : muscle protracteur ; mg : membraneguide ; Os : odontostyle. L’accolade noire indique la localisation des particules virales chez les Longidorus et l’accolade rouge celle chezles Xiphinema au niveau de l’appareil alimentaire du nématode.

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moins, chez X. index et X. diversicaudatum, la cuticule del’odontophore et de l’œsophage peut être colorée à l’acidepériodique. Cette coloration indique que ces zones sonttapissées de carbohydrates [34]. Sachant que les particulesvirales ne sont immobilisées que dans ces zones, il a étéproposé que ces carbohydrates pourraient interagir avec desstructures à la surface des particules virales. Cependant, cetype de coloration n’a pas pu être mis en évidence chez lesnématodes du genre Longidorus, ce qui suggère un autremécanisme de rétention des particules virales pour cegenre.

Nepovirus-nématodes :une interaction solide

Une des caractéristiques de l’association virus-vecteur estsa persistance dans le temps qui se traduit au champ par unecontamination des nouvelles plantations quasi perpétuelle,même après de très longues périodes de jachère. Cettelongévité de l’association est étroitement liée à la biologiedes nématodes qui ont des cycles de vie très longs, un faibletaux de reproduction et des possibilités de survie dans desbiotopes où les conditions biotiques et abiotiques sontfluctuantes. Ils peuvent également persister dans des sols enexploitation où la nature des cultures se succède parce quela plupart des Longidoridae sont très polyphages. Deuxexemples peuvent illustrer cette persistance. Une cartogra-phie fine de la distribution des nématodes a été reconduite30 ans après arrachage d’une parcelle de framboisiersfortement infectée par l’ArMV et son vecteur associé, X.diversicaudatum. Cette nouvelle analyse montre une pré-sence et une distribution identique du vecteur et de sonvirus associé à celle qui existait 30 ans auparavant malgré lasuccession de périodes de jachères et de différentes culturesqui, dans certains cas, n’étaient pas des hôtes connus duvecteur et/ou du virus [35]. L’association GFLV-X. indexest également un autre exemple de longévité de l’associa-tion virus-vecteur. Après une période de 6 ans de repos dusol (sans aucune plante) dans une parcelle de vigne totale-ment contaminée par X. index et le GFLV, 6 % des nouvel-les plantes de vigne sont réinfectées par le GFLV [36]. Demême, 5 ans de jachère n’ont pas réussi à éliminer X. indexet GFLV dans une parcelle naturellement infectée [15].Pour espérer une éradication de la totalité de la populationdes X. index virulifères d’une parcelle de vigne, il estrecommandé de laisser le sol en jachère totale pendant unepériode de 7 ans minimum [37, 38].Ces données de persistance observées sur le terrain sontcorroborées par des données expérimentales obtenuesen conditions contrôlées. Ainsi, X. americanum etX. diversicaudatum sont tous deux capables de transmettreleur virus associé, le TRSV et l’ArMV respectivementaprès 9 mois de conservation en conditions contrôlées [39,

40]. Après deux ans de conservation en conditions contrô-lées en l’absence de plante hôte, X. rivesi reste capable detransmettre le ToRSV à des plantes pièges [41]. Des expé-rimentations contrôlées ont également permis de montrer lapersistance de l’association X. index-GFLV. Des échan-tillons de sol provenant d’une parcelle de vigne naturelle-ment contaminée ont été conservés à 20 et 7 °C pendant4 ans en l’absence de plante hôte. Pendant ces 4 années deconservation, la population initiale de X. index diminuesignificativement mais des individus vivants (adultes etlarves) peuvent être isolés pour les deux conditions destockage [37]. Dans ces nématodes vivants, isolés après4 ans de stockage, la présence du GFLV a été clairementmise en évidence [37]. Cette capacité de survie en l’absencede plante hôte ou lors de conditions défavorables corres-pondrait à un arrêt de l’ensemble du métabolisme du néma-tode conduisant à un blocage du développement des néma-todes [12]. Des nématodes appartenant aux genresParalongidorus maximus et Xiphinema pachtaicum ont étéobservés fortement enroulés sur eux-mêmes dans du sol enétat de dessication. Des comportements similaires ont étéobservés dans notre laboratoire à partir d’élevages deX. index laissés en serre sans arrosage pendant de longuespériodes (observations non publiées). Un rétablissementpartiel de l’hygrométrie a restauré une activité de ces néma-todes.Bien que les nématodes du genre Longidorus possèdent lesmêmes capacités de survie que les Xiphinema, ils retiennentles particules virales pendant des périodes bien moins im-portantes puisque cette période n’est que de quelques se-maines [11, 13]. Cette différence de temps de persistancedes particules virales est probablement liée à la différencede localisation des particules virales entre les deux genresde nématode.

Identification et caractérisationmoléculaire des vecteurs et des virus

Les nématodes font partie des espèces animales les plusdifficiles à identifier. La caractérisation de leurs différentesespèces est classiquement fondée sur des mesures trèsprécises des individus et sur des critères morphologiques.Cependant, leurs populations ne sont pas toujours homogè-nes. Elles sont souvent constituées par des individus àdifférents stades de développement ou correspondent à desmélanges d’espèces/genres différents, ce qui est le cas leplus général sur le terrain. De plus, elles partagent entreelles beaucoup de caractéristiques morphologiques com-munes. L’ensemble de ces caractéristiques fait que le tra-vail d’identification des nématodes reste très difficile etréservé à des experts. La difficulté de l’identification desLongidoridae est encore accrue par le fait que ces némato-des sont souvent présents en faible effectif à plusieurs

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stades de développement. La caractérisation des virus dansles nématodes est un défi supplémentaire.

L’essor de la biologie moléculaire et la connaissance dugénome des nématodes ont permis de proposer des appro-ches moléculaires pour identifier certaines espèces deLongidoridae qu’elles soient vectrices ou non de virus.Fondés sur la connaissance des séquences correspondantaux ITS (internal transcribed spacer), des protocolesd’amplification de fragments d’ADN par PCR (polymerasechain reaction) multiplex utilisant des amorces spécifiquesont été développés. Ils permettent de différencierspécifiquement 9 espèces de Xiphinema et 8 espèces deLongidorus qui sont très proches morphologiquement lesunes des autres [42-45]. Ces procédures multiplex sontsuffisamment sensibles pour permettre l’identification d’unseul individu, quel que soit son stade de développement(larves ou adulte) [42-44]. Elles permettent égalementl’identification d’un individu dans un mélange de plusieursespèces et/ou genres. Elles sont particulièrement intéres-santes parce que l’identification classique des espèces (me-sures et caractéristiques morphologiques) est établie prin-cipalement à partir des adultes qui ne sont pas toujoursprésents en nombres suffisants dans les échantillons. Ellessont reproductibles, très sensibles (1 nématode cible dé-tecté en mélange parmi 800 autres) et faciles à mettre enœuvre [44].

Tout comme l’identification des nématodes, la caractérisa-tion de la présence de virus dans les populations de Longi-doridae nématodes est une étape délicate. Cette étape estsouvent nécessaire pour connaître le potentiel infectieuxdes nématodes prélevés sur les terrains ou dans le cadred’études plus fondamentales afin d’étudier la nature desinteractions virus-vecteur. Pendant longtemps, la présencede virus dans les nématodes était évaluée de manière indi-recte en mettant les nématodes isolés en contact avec unhôte sensible au nématode et au virus [11]. Cette procédureest longue, fastidieuse et nécessite des structures importan-tes. L’utilisation de l’immunomicroscopie directe ou indi-recte par fluorescence permet de mettre en évidence laprésence du virus dans un seul nématode [30, 46]. Cepen-dant, elle demande des équipements coûteux et une exper-tise en microscopie. Le test Elisa (enzyme linked immuno-sorbent assay) a été utilisé avec succès pour détecter lesparticules virales, principalement pour rechercher le GFLVdans des populations de X. index [47-49]. Bien que trèsfacile d’utilisation, il nécessite un nombre important denématodes pour permettre une détection efficace du virus[48, 49]. Cette condition n’est pas toujours compatible avecles effectifs isolés à partir des échantillons de sol. Enparallèle au développement des méthodes moléculairespermettant de caractériser les espèces de Longidoridae, desprotocoles sensibles et reproductibles amplifiant une partiedu génome du virus hébergé par les nématodes ont été mis

en œuvre. À partir des ARN totaux extraits de nématodes,des expérimentations RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) amplifiant spécifiquement unepartie du génome du virus (le plus souvent le gène codantpour la sous-unité de la capside) ont été développées [18,50-52]. Ces techniques permettent de détecter efficacementle virus hébergé par un seul nématode [50, 51]. Tout commela caractérisation moléculaire des nématodes, la mise enévidence des virus dans les nématodes est reproductible etsensible. Il est potentiellement envisageable d’identifier unX. index virulifère parmi 3000 nématodes avirulifères [50].De plus, dans le cas du couple X. index-GFLV, le ou lesisolats de virus hébergés par un nématode peuvent êtrecaractérisés par RFLP [50] ou par PCR en temps réel [51].

Nepovirus-nématodes :une interaction spécifique déterminéepar la protéine de capside du virus

Tous les nématodes phytophages qui s’alimentent au ni-veau de plantes infectées ont la possibilité d’acquérir et detransmettre des particules virales. Cependant, sur environ3500 espèces de nématodes phytophages, 18 appartenantau genre Longidorus ; Paralongidorus et Xiphinema sontles vecteurs de 12 des 32 népovirus décrits (tableau 1).Cette situation soulève deux questions : pourquoi si peu denématodes sont-ils capables de transmettre des virus etpourquoi un nombre limité d’espèces virales du genre Ne-povirus ont-elles comme vecteurs naturels les nématodes ?L’une des raisons réside probablement dans le fait qu’ilexiste une interaction très spécifique entre le vecteur et sonvirus associé.

Spécificité d’association

Cette spécificité concerne principalement les Longidoridae,vecteurs présents en Europe. On ne retrouve pas, du moinsà un même niveau, cette spécificité pour le groupe desnépovirus nord-américains et leurs vecteurs associés. Elleest relativement complexe et se situe à différents niveaux(tableau 1). En effet, l’analyse des associations virus-vecteur a mis en évidence que certains népovirus sontassociés à une espèce définie de nématode. C’est le cas deL. apulus qui transmet l’AILV, isolat italien. Cependant,une espèce de nématode peut transmettre plus d’un virus.Ainsi, X. diversicaudatum peut transmettre l’ArMV et leSLRV alors que L. elongatus est le vecteur du raspberryringspot virus (RpRSV) et du TBRV. Les observations deterrain ont également montré que deux népovirus proches

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mais sérologiquement distincts peuvent être transmis pardeux nématodes différents appartenant au même genre.Ainsi, le GFLV et l’ArMV, deux népovirus très proches,sont transmis spécifiquement par X. index et parX. diversicaudatum respectivement. Il en est de même desisolats écossais et anglais du RpRSV qui sont transmisspécifiquement par L. elongatus et L. marcosoma respecti-vement bien qu’ils possèdent des propriétés antigéniquescommunes. Cependant, quand deux variants d’un mêmevirus ne présentent que de très faibles différences sérologi-ques entre eux, ils sont généralement transmis par le mêmevecteur. Ainsi, L. elongatus transmet efficacement la sou-che écossaisse du RpRSV ainsi que deux autres variants dece même virus. L’isolement géographique de certainesassociations conduit quelques fois à un très fort niveau despécificité. Ainsi, un isolat italien du SLRV ne peut êtretransmis que par une population locale de X. diversi-caudatum [11, 33].Sur le continent nord-américain, la principale espèce vec-trice de virus est le groupe des X. americanum (tableau 1)dont la classification dans ce groupe reste encore trèscontroversée. En effet, l’avis général actuel porte à plus de40 le nombre d’espèces appartenant à ce groupe. La totalitédu complexe d’espèces est inclus dans le groupeX. americanum sensu lato dans lequel des différences mor-phologiques entre les espèces sont mineures et peu detaxonomistes sont capables de les différentier. L’une desespèces de ce groupe est X. americanum sensu stricto pourlaquelle il y a une identification claire. Plusieurs espèces deX. americanum transmettent indifféremment deux, trois ouquatre virus différents. Même s’il existe des spécificités detransmission entre certains virus et certaines populations,cela concerne des populations et des isolats très localisés. Ilsemble donc que la spécificité d’association entre les népo-virus américains et leurs vecteurs soit plus complexe quecelle observée pour les vecteurs de virus européens.Pour qualifier la nature des associations entre virus etvecteur, Brown et Weischer [29] ont proposé le conceptd’association « exclusive » et « complémentaire ». D’aprèsce concept, l’exclusivité correspond aux situations où uneespèce de nématode transmet un virus ou une souche viralesérologiquement caractérisée. Réciproquement, ce virus oucette souche virale n’est transmisse que par un seul vecteur.L’exclusivité concerne sept associations virus-vecteurs. Lacomplémentarité, qui concerne le reste des associations, estdéfinie pour les situations où une espèce de nématode peuttransmettre plusieurs virus ou souches de virus sérologi-quement distinctes.

Déterminants viraux impliqués dans la spécificitéde la transmission des népovirus

L’analyse des associations virus-vecteurs suggère unrôle potentiel de la capside dans la spécificité de trans-

mission puisque celle-ci est étroitement liée aux proprié-tés antigéniques des particules virales. Ce rôle potentielde la capside du virus a été renforcé par le travail effectuéen utilisant des isolats pseudo-recombinants obtenusavec deux souches différentes du RpRSV. En effet, lasouche S (écossaise) du RpRSV est transmisse parL. elongatus alors que la souche E (anglaise) est transmisepar L. macrosoma. Différentes combinaisons de pseudo-recombinants ont été réalisées à partir de ces deux soucheset leur transmissibilité par L. elongatus a été évaluée. Cestravaux ont permis de montrer que les pseudo-recombinants contenant l’ARN2 de la souche S sont plusfréquemment transmis que ceux contenant l’ARN2 de lasouche E [53]. Des travaux identiques ont été menés avecdeux souches de TBRV : beet ringspot (transmise parL. elongatus) et potato bouquet (transmise parL. attenuatus). L’étude de la transmissibilité parL. elongatus des isolats pseudo-recombinant a montré quele pseudo-recombinants contenant l’ARN1 du sérotypepotato bouquet et l’ARN2 du sérotype beet ringspot esttransmis par le nématode L. elongatus. L’analyse de latransmissibilité des isolats pseudo-recombinants construitsà partir des souches de RpRSV et du TBRV indique claire-ment que les déterminants viraux impliqués dans la trans-mission sont codés par l’ARN2 [54]. Ces expérimentationsne permettent pas d’attribuer la spécificité à l’un ou à l’autredes trois gènes codés par l’ARN2, mais elles renforcent lerôle de la capside du virus qui est codée par l’ARN2.

La production de transcrits infectieux du GFLV [4] a per-mis de poursuivre ce travail sur l’identification des déter-minants viraux dans la spécificité de transmission des népo-virus. Sur l’idée des travaux effectués avec les pseudo-recombinants, des ARN2 chimériques ont été développésen remplaçant les séquences codantes du GFLV par lesséquences codantes correspondantes de l’ArMV, un népo-virus très proche du GFLV qui est transmis spécifiquementpar X. diversicaudatum mais pas par X. index (figure 7).Après étude des propriétés biologiques des ARN chiméri-ques, la transmissibilité de virus recombinants par X. indexa été étudiée. Les virus chimériques, qui possèdent unecapside de nature GFLV, sont transmis par X. index aussiefficacement que le GFLV. En revanche, les virus chiméri-ques, qui possèdent une capside de nature ArMV, ne sontplus transmis par X. index tout comme l’ArMV (figure 7).L’utilisation des ARN2 chimériques a permis d’exclure dela spécificité de transmission les protéines 2AHP et 2BMP etindique clairement que la 2CCP porte les déterminantsviraux de la spécificité de transmission du GFLV parX. index [32, 55]. Cela constitue la première preuve molé-culaire de l’implication de la capside dans le mécanisme dela transmission.

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Conclusion

Depuis la mise en évidence de l’implication de nématodesectoparasites souterrains dans la transmission de virus deplantes, des connaissances significatives ont été acquisesdans la compréhension des relations qui relient les troispartenaires du pathosystème plante-népovirus-nématode.L’accès à la connaissance du génome des népovirus, etmaintenant de celui des nématodes, aidé par des outilsmoléculaires très performants, ont largement permis defaire évoluer cette discipline de la description des paramè-tres de la biologie de la transmission vers l’élucidation desmécanismes moléculaires de la transmission.Une caractéristique importante de ce pathosystème est laspécificité élevée qui lie le vecteur et le virus. Chaquenépovirus est transmis par un ou plusieurs nématodes bienidentifiés. Les expériences antérieures suggéraient forte-ment le rôle de la capside du virus dans cette spécificité detransmission. La possibilité d’introduire des mutationsdans le génome du GFLV a permis d’apporter la preuvemoléculaire de l’implication de la capside dans la spécifi-cité de transmission du GFLV par son vecteur X. index.Cette approche moléculaire devrait permettre également decaractériser le ou les domaines de la capside du virus eninteraction avec la cuticule de l’appareil alimentaire dunématode. L’ensemble de ces acquis pourrait permettre,par la suite, l’identification du récepteur.Une caractéristique remarquable de ces associations virus-vecteurs est la longévité de l’interaction entre les némato-des du genre Xiphinema et leurs virus associés. X. index estcapable de survivre et de conserver le GFLV en conditionscontrôlées pendant au moins 4 ans en l’absence de touteplante hôte. Cette longévité des interactions Xiphinema-Nepovirus contraste avec celle existante chez les Longido-rus qui n’est que de quelques semaines. À la lumière d’unelocalisation différente des particules virales entre les deuxgenres, cette différence suggère un mécanisme différent dela transmission des népovirus par les Longidorus.Des efforts importants ont également été apportés dans ledéveloppement d’outils moléculaires sensibles et repro-

ductibles permettant de différencier les principales espècesde nématode vecteur de virus parmi des populations nonvectrices de virus. Des outils similaires ont également étédéveloppés pour caractériser la présence de particules vira-les retenues par les nématodes. Ces outils trouvent touteleur application dans les investigations permettant d’éluci-der les mécanismes moléculaires de la transmission etoffrent la possibilité de définir le potentiel infectieux dessols entre deux cultures.L’ensemble des caractéristiques biologiques des associa-tions nématodes-Nepovirus, et plus particulièrement la lon-gue survie des Xiphinema porteurs de virus en l’absence detoute plante hôte, peut expliquer l’inefficacité des méthodesde lutte actuelles contre les principales maladies à virustransmises par nématodes. Nos travaux avec le modèle X.index-GFLV indiquent que des efforts de recherche doiventporter sur de nouvelles stratégies de lutte comme le déve-loppement de plantes résistantes au virus et/ou aux néma-todes. Il semble que seule une approche génétique puisseapporter une solution efficace et durable contre les maladiesà virus transmises par les nématodes.

Remerciements. L’auteur remercie Catherine Reinbold pour laréalisation du cliché de microscopie électronique.

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GFLV ARN2

ArMV ARN2

2AHP 2BMP 2CCP

+

+

+

0

0

TransmissibilitéX. index

Figure 7. Construction des ARN2 chimériques réalisés à partir des ADNc correspondant à l’ARN2 du grapevine fanleaf virus (GFLV)(rectangles rouges) et de l’ArMV (rectangles gris). Les gènes 2AHP, 2BMP et 2CCP du GFLV ont été échangés par leurs équivalents ArMV.La transmissibilité des virus chimériques par X. index a été évaluée et comparée à celle des virus sauvages GFLV et ArMV.

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revue Transmission des Nepovirus par les nématodes Longidoridae