UE2 – Cancérologie

MOOC Semaine 2

Ronéotypeur : Clémence GUYARD/Léa-Sarah FAILLET

Ronéoficheur : Clémence GUYARD/Léa-Sarah FAILLET

Semaine 2 MOOC PARTIE I : Diagnostic

macroscopique et microscopique des tumeurs solides

et hémopathies malignes

Ce cours est divisé en deux parties. On sait que le nombre de pages fait peur mais rappelez-vous que cette ronéo

est l’équivalent d’une semaine de cours. On a fait le maximum pour que ce soit le plus agréable à apprendre. On

vous conseille d’aller voir les vidéos du MOOC par vous-même pour mieux visualiser ce que vous apprenez.

Beaucoup de notions ont déjà été vues et revues, ça allègera le tout mais sachez qu’on a retranscrit l’entièreté de

la semaine 2 (y compris ce qui est dit à l’oral dans les vidéos). Pour finir, on vous conseille de vous lancer dans le

cours partie par partie comme on vous l’a découpé dans le sommaire. Bon courage à vous !

PARTIE I : INTRODUCTION, VISITE GUIDEE DU LABORATOIRE ET DIAGNOSTIC ANATOMO-

PATHOLOGIQUE DES TUMEURS.

I) Introduction

1) Les cellules

2) Les tissus

3) Les organes

4) Cytologie et histologie

II) Visite guidée du laboratoire de pathologie

1) Accueil des tissus et macroscopie à l’état frais 2) Macroscopie après fixation et techniques sur tissus frais

3) Examen au microscope

3) Examen extemporané en ana-path : étapes

4) Prise en charge en biopsie fixée en ana-path : étapes

5) Prise en charge macroscopique d’une pièce opératoire : étapes

III. Diagnostic anatomopathologique des tumeurs

1) Classification des tumeurs

2) Principes du diagnostic anatomo-pathologiques des tumeurs

3) Histoire naturelle des cancers

4) Interface entre anatomie pathologique et les analyses moléculaires

5) Microdissection laser

PARTIE II : DIAGNOSTIC CYTOPATHOLOGIQUE DES TUMEURS ET DIAGNOSTIC DES

HEMOPATHIES

I) Place de la cytologie dans le cancer

II) Examen cytologique extemporané au cours d’une endoscopie pancréatique

III) Hémopathies malignes

1) Les examens d’hématologie cellulaires

2) Hématologie biologique : cytogénétique.

PARTIE I : INTRODUCTION, VISITE GUIDEE DU LABORATOIRE ET DIAGNOSTIC ANATOMO-

PATHOLOGIQUE DES TUMEURS.

I) Introduction

1) Les cellules

La cellule est l’unité biologique de base de tout organisme vivant. Elle contient : un noyau et un nucléole (information

génétique) + cytoplasme (limité par la membrane plasmique) + organites (qui varient selon les fonctions de la cellule).

Ces organites permettent à la cellule de survivre et se diviser afin qu’il y ait un renouvellement continu. Elles forment

les 4 principaux tissus.

2) Les tissus

EPITHELIUM CONJONCTIF MUSCULAIRE NERVEUX

2 types

- Revêtement : à l’extérieur de

l’organisme (peau) ou des

cavités internes

- Glandulaire : fonction

sécrétoire (glande sudorale)

Entre les cellules et autour des

organes, il est ubiquitaire (sauf

dans le SNC) et indispensable.

Multiples fonctions : nutrition,

circulation des cellules

immunitaires…

- Muscles striés

squelettiques :

mouvements

volontaires

N’est pas limité au

SNC mais se trouve

partout dans notre

corps sous forme de

nerfs et plexus (SNP)

On observe des cellules

épithéliales juxtaposées et

jointives, reposant sur une

membrane basale qui les sépare

des vaisseaux.

Beaucoup de renouvellement

donc cible de beaucoup de cancer

Fabriqué par des fibroblastes.

Peut aussi être spécialisé : tissus

adipeux, cartilage, os

- Muscles lisses :

mouvements

autonomes

(ex: contraction des

vaisseaux,

propulsion des

aliments).

3) Les organes

Tous les organes sont composés de ces quatre tissus avec des cellules à la fois commune et des cellules qui leur sont

propres (responsables de leur fonction). De plus ils ont une

organisation qui leur est spécifique.

Exemple de la peau :

La peau est l’organe le plus étendu du corps humain. Elle est

composée de deux tissus principaux : épithélial (revêtement avec

l’épiderme, glandulaire avec la glande sudorale) et conjonctif

(derme et l’hypoderme). On observe aussi des nerfs et des récepteurs

pour la sensibilité correspondant au tissu nerveux périphérique.

Exemple du côlon :

On observe un épithélium de surface simple, avec une seule couche de

cellules, mais contenant des cellules différentes : entérocytes

(absorption des nutriments) cellules à mucus, cellules

neuroendocrines, cellules souches. L’épithélium est étroitement lié au

TC sous jacent qui contient les vaisseaux. On retrouve également deux

tuniques de muscles lisses (propulsion du bol alimentaire) et du tissu

nerveux (contractions permettant la propulsion).

4) Cytologie et histologie

La cytologie correspond à l’étude des cellules, alors que l’histologie est l’étude des tissus. Ces termes sont limités à

l’étude du normal. En cas de recherche dans un but diagnostic on parle respectivement de cytologie pathologique et

d’anatomie pathologique. L’ensemble est regroupé sous le nom de anatomo-cyto-pathologie (anapath).

• Cytobloc

C’est une inclusion en paraffine du culot de centrifugation cellulaire. Ceci n’est réalisable que lorsque le matériel

cellulaire est abondant pour permettre de réaliser un culot suffisamment gros pour être bien visible. Les cellules

doivent d’abord être fixées par un fixateur cytologique ou du formol.

Puis ce culot doit être rendu compact et cohésif pour pouvoir être manipulé facilement. C’est pour cette raison qu’il

est enrobé dans un gel.

Grâce à ce cytobloc, on peut conserver les cellules et réaliser des techniques développées pour l’histologie sur elles.

• Techniques complémentaires

Elles permettent de mettre en évidence des fonctions spécifiques des cellules comme la sécrétion de mucus ou

l’expression de protéines spécifiques du tissu ou de l’organe.

- Immunomarquage : le but est de reconnaître un élément de la cellule ou d'un tissu de façon spécifique. Pour

obtenir une réaction spécifique, on utilise les propriétés des interactions antigène–anticorps. On extrait un antigène

afin de fabriquer un anticorps correspondant. Cet anticorps sera ensuite lié à un marqueur afin qu’on puisse révéler

la réaction, de sorte qu’elle soit visible au microscope.

Par exemple, pour confirmer la nature épithéliale d’une tumeur maligne et confirmer qu’il s’agit bien d’un

carcinome, on peut utiliser des anticorps qui vont reconnaître spécifiquement des filaments des cellules épithéliales

qu’on appelle des cytokératines. Ces cytokératines seront reconnues par un anticorps primaire anti-cytokératine.

L’anticorps primaire est reconnu par un anticorps secondaire, qui sera révélé par une réaction enzymatique donnant

un précipité coloré visible au microscope.

- Hybridation in situ : similaire à l’immunomarquage, seulement ici, on s’intéresse aux acides nucléiques et non

aux protéines. On utilise les propriétés d'interaction entre la séquence d'un brin d'ADN et son brin complémentaire.

Le marqueur qui va permettre de reconnaître la séquence cible (le brin codant) correspond à la « sonde » (séquence

complémentaire au brin codant) marquée soit par des fluorochromes soit par une enzyme.

Par exemple, l’immunomarquage est utilisé pour détecter une amplification du gène HER2 dans les cancers du sein.

II) Visite guidée du laboratoire de pathologie

1) Accueil des tissus et macroscopie à l’état frais

Les prélèvements sont apportés au laboratoire de pathologie, si possible, à l’état

frais. Ils peuvent aussi avoir été traités au formol. On procède à l’enregistrement

pour s’assurer de la conformité de l’échantillon. Le technicien de labo colle un

numéro unique (spécifique du laboratoire) sur le flacon contenant l’échantillon.

On vérifie le nom et le prénom sur le flacon et sur la feuille de demande

d’examen.

On passe à l’examen macroscopique, il est effectué par le médecin pathologiste

et le technicien de laboratoire. Il y a alors une 2ème vérification de l’identité du

patient. Les pièces opératoires sont présentées au médecin, chaque pièce est alors

décrite. Le technicien de laboratoire retranscrit sur une feuille tous les éléments

de l’examen macroscopique.

La pièce opératoire est alors pesée et mesurée, orientée, palpée, analysée (données conservées dans le dossier-

patient). Une fois examinée, la pièce est photographiée. Ces photos seront versées dans le dossier-patient, elles

pourront également figurer dans un compte-rendu. La pièce opératoire passe alors à l’étape de l’encrage.

On utilise de l’encre de Chine. Cela permet de garder l’orientation de la pièce opératoire, les informations restent et

seront vues sur les lames lors de l’examen microscopique.

Après les photos, on coupe la pièce opératoire pour analyser le contenu.

Les échantillons spécifiques des tumeurs peuvent être adressés à des laboratoires spécialisés pour réalisation d’une

cytométrie en flux ou d’un caryotype par exemple. Ils peuvent aussi être envoyés dans des laboratoires de

microbiologie afin de rechercher des agents infectieux. Les échantillons de tumeurs peuvent être congelés afin

d’être enregistrés dans une tumorothèque.

Une tumorothèque est un endroit de stockage de plusieurs (nombre très conséquent) échantillons pouvant servir au

diagnostic,à le compléter, ou pouvant être utilisés pour des actions de recherche.

Une fois que la pièce est ouverte, on peut alors la congeler.

On prend des petits fragments de tumeur qui sont mis dans un petit tube. Il est ensuite plongé dans l’azote liquide

pour être congeler et ensuite être enregistré dans la tumorothèque. Les aspects juridiques concernant les

tumorothèques sont évidemment cruciaux, mais ceux-ci seront détaillés dans un autre cours.

On peut également avoir recours à un examen extemporané pendant une opération, dans le but de savoir si on l’est

bien face à une tumeur ou si les marges d’éxérèse sont saines. Le recours à cet examen est fait pour des lésions bien

précises, qui ont été précédemment explorées par des examens complémentaires.

La lésion est alors soit entière, soit partielle. Le résultat de l’examen peut modifier le déroulé du geste chirurgical

(par exemple, la zone d’éxérèse peut être plus large qu’initialement envisagé).

Les étapes sont les mêmes que pour l’examen standard au laboratoire : pesée, mesure, description. Le médecin

prélève directement un fragment, il est congelé puis coupé au cryostat. Ensuite, l’échantillon est déposé sur une lame

et coloré.

Le cryostat permet de congeler le prélèvement, la coupe fait de 7 à 8µm d’épaisseur, la température dans l’appareil

est de – 20°C.

Deux colorations différentes sont utilisées, le prélèvement peut être parfois cytologique ou être effectué par

apposition ou grattage. Le médecin procède à l’examen microscopique puis appelle le chirurgien pour lui

communiquer les résultats. La réponse doit être rapide : 30 min à partir du départ de la pièce opératoire du bloc.

Après les examens, les prélèvements doivent être plongés dans un liquide fixateur, généralement dans du

formaldéhyde dilué dans une solution tampon ou communément appelé formol. La durée de fixation est adaptée aux

dimensions. On compte 6h pour des biopsies de petite taille et 24h ou plus pour des pièces opératoires entières. Cette

étape est indispensable. Pas de fixation, pas d’examen anatomo-pathologique.

Reprise de l’exemple de la thyroïde : elle est fixée pendant quasiment 24h avant de faire l’examen suivant

(macroscopique).

2) Macroscopie après fixation et techniques sur tissus frais

Après fixation, l’examen macroscopique intervient. Il va servir à choisir les zones qui seront observées au

microscope de celles qui ne le seront pas. Le médecin vérifie une nouvelle fois la feuille de demande d’examen et les

pots. Le technicien de laboratoire écrit les étiquettes des cassettes où les prélèvements seront mis après avoir été

coupés en tranches.

L’intérêt de couper les pièces en tranche est de vérifier l’infiltration ainsi que l’état des marges chirurgicales. Le

technicien retranscrit la description faite par le médecin.

Ex : Avec la thyroïde. Cela permet de

garder les limites chirurgicales, la

capsule thyroïdienne ainsi que la

tumeur (infiltration de la capsule) qui

sont des informations très importantes

pour le diagnostic.

Les prélèvements sont réalisés sur la lésion, à distance ou au niveau des marges chirurgicales. Chaque tranche de

prélèvement mesure 2 à 4cm de long et 4mm d’épaisseur, il est ensuite rangé dans une cassette.

Seuls les prélèvements mis en cassette seront examinés au microscope. Le reste est gardé pendant quelques semaines

puis sera détruit à terme.

Le technicien de laboratoire note les numéros sur les cassettes, le médecin place les prélèvements dans ces

dernières.

La plupart du temps, lors de la réception de grosses pièces, l’examen macroscopique est très minutieux et par

conséquent très important (on ne va pas couper un poumon entier en tranches pour le mettre ensuite dans des cassettes,

sinon adieu le petit apéro de ce soir…).

La cassette est donc fermée, la face exposée vers le haut sera la face examinée au microscope, elles sont ensuite mises

dans un appareil de déshydratation.

Les prélèvements arrivent fixés : ils ont donc subi différents traitements. Du formol à l’alcool (liquides miscibles =

se mélangent), l’alcool est ensuite enlevé par le xylène (miscibles). Toutes ces étapes se font la nuit dans un appareil

appelé VIP.

Le lendemain, on sort les prélèvements pour les inclure en paraffine. Le fragment peut avoir alors une orientation

précise afin d’avoir une coupe avec un angle adapté.

On dégrossit le bloc pour avoir une image optimale et on coupe en ruban avec 2-4µm d’épaisseur au microtome. Les

fines tranches obtenues sont déposées sur les lames. On met par-dessus un mélange d’eau et d’albumine pour

permettre à la coupe de bien adhérer à la lame et de ne pas se décoller. Les coupes en ruban sèchent sur la lame, on

a donc une adhérence parfaite.

Avant la coloration, on enlève la paraffine avec des bains de xylène puis on réhydrate la coupe et on procède à la

coloration (le plus souvent dans des automates).

L’étape finale consiste en l’ajout d’un montage transparent sur lequel on ajoute une lamelle pour que l’examen

microscopique soit optiquement optimal. Les lames d’un même patient sont regroupées par dossier puis posées sur

des plateaux de lames, ils seront transmis au médecin pour interprétation.

3) Examen au microscope

Le microscope photonique est un outil de haute précision permettant de voir la

coupe dans son ensemble à un faible grossissement ou au contraire de zoomer

à x 1000 (maximum) sur des détails.

Sur un plateau de lames, le médecin en choisit une ainsi que la feuille de

demande d’examen correspondante. Un cas peut avoir une ou plusieurs

dizaines de lames selon la complexité de la situation.

La coloration utilisée de façon standard est l’hématoxyline éosine (et oui, la fameuse !). On a un aspect rose/mauve

à l’œil nu. Mais elle colore les noyaux en bleu ; c’est le basophilisme nucléaire, le cytoplasme tire plutôt vers le

rouge ; c’est l’éosinophilisme cytoplasmique.

On peut également avoir recours à des techniques complémentaires comme l’immunohistochimie ou l’hybridation in

situ. Cela permet de préciser le diagnostic de manière accrue ainsi que d’établir le pronostic de la tumeur.

L’examen au microscope permet de se déplacer en X et en Y, de zoomer ou pas. En général, on a une ou plusieurs

régions d’intérêt permettant d’établir le diagnostic.

Petit rappel sur les colorations

MGG ou papanicolaou pour les

cellules, HES (hématéine-eosine-

safran) ou le trichrome de Masson

pour les tissus. Généralement le

noyau est en violet, le cytoplasme en

bleu avec le MGG et rose en HES, le

tissu conjonctif est orange en HES.

Exemple de la thyroïde : On a une

suspicion de malignité, on prend des

photos pour garder des preuves de

l’examen macroscopique. La pièce est

prise en totalité en raison de sa

potentielle malignité (ce qui est

exceptionnel).

Exemple : on voit bien la

délimitation zone

tumorale/zone non tumorale

(moins cruciale à examiner)

Le diagnostic de tumeur maligne se fait sur uniquement avec la coloration standard HE mais parfois on fait d’autres

examens pour affiner le diagnostic (tumeurs rares/pronostic tumeur). Il est aussi possible de redemander des coupes

sur les blocs de paraffine pour réexaminer à des niveaux de profondeur plus importants si les résultats ne sont pas

concluants en surface.

On doit parfois refaire des prélèvements sur la pièce après l’examen macroscopique quand les premiers prélèvements

ne sont pas concluants. Si les éléments ne sont pas ou peu visibles par coloration HE, on peut demander d’utiliser

des techniques complémentaires sur de nouvelles lames.

Exemple : mucus gastrique coloré par bleu d’Alcian dans le cas d’un cancer de l’estomac

Exemple : marquage immunohistochimique, sur cancer du sein, de la protéine HER2.

Certains cas sont plus complexes que d’autres. On peut alors avoir

recours aux ouvrages de référence, réaliser une recherche bibliographique

ou encore faire une concertation avec des collègues sur ce cas. On peut

alors utiliser un microscope multi-têtes dans la situation énoncée

précédemment.

Également, on peut utiliser les technologies numériques et réaliser des lames virtuelles dans le cadre de la

télépathologie. Les lames virtuelles sont faites via numérisation et sont par la suite mises sur une plateforme de

télépathologie. Le praticien reçoit une notification par email et peut alors se connecter pour étudier la lame puis

émettre un diagnostic. La réalisation d’examens extemporanés par télépathologie est d’ailleurs possible.

Le compte-rendu reste dans le dossier patient et servira de base pour la prise en charge ultérieure du patient, c’est un

élément crucial dans l’acte diagnostic. Ce dernier peut être dicté par reconnaissance vocale ou par secrétariat ou fait

dans un formulaire standardisé.

Le pathologiste relit attentivement avant de valider, le compte-rendu est alors envoyé par courrier postal ou par

messagerie sécurisée (de plus en plus utilisée) au médecin qui en a fait la demande.

Après le diagnostic, les archives sont conservées pendant 10 ans dans les laboratoires de pathologie, elles peuvent

être utilisées pour usage ultérieur. Elles sont rangées par boîtes de numéro croissant. Les comptes-rendus, quant à

eux, sont archivés au format papier ou au format numérique.

4) Examen extemporané en ana-path : étapes

Etapes : réceptionner le prélèvement → vérifier l’identité (absence de non-conformité) → noter heure début

examen → enregistrer → appeler le pathologiste → examen macroscopique : décrire → préparer la congélation →

congeler dans un cryostat à – 20°C → dégrossir le tissu → préparer une lame → coupe définitive (épaisseur de

4mm) → étaler la coupe → lame blanche = coloration → mettre une lamelle → examen microscopique →

rédaction d’un compte-rendu → communique résultats (fin examen) → examen de contrôle → décongeler, mise en

cassette pour fixation formolée → inclusion en paraffine.

5) Prise en charge en biopsie fixée en ana-path : étapes

Etapes : réceptionner le prélèvement → vérifier l’identité du patient (absence de non-conformité) → numéroter l’

examen → enregistrer → mettre en cassette → décrire → remettre à fixer avec d’autres prélèvements → imprégner

en paraffine (nuit passe) → récupérer prélèvements → console enrobage en paraffine : paraffine chaude sur plaque

réfrigérée → enrober prélèvements : solidifier sur plaque réfrégirée (quelques minutes plus tard) → démonter →

microtome → dégrossir bloc → coupe définitive (épaisseur à 4mm) → lames blanches : mise en place sur des

plateaux → déparaffiner + colorer (45 min plus tard) → Lames colorées et montées → donner au pathologiste →

examen microscopique → élaborer un compte-rendu = transmission → archiver.

6) Prise en charge macroscopique d’une pièce opératoire : étapes

Etapes : réceptionner le prélèvement → vérifier l’identité (absence de non-conformité) → numéroter examen →

enregistrer → examen macroscopique pièce fraîche → ouvrir la pièce → photographier → fixer au formol (24h

plus tard) → examen macroscopique → décrire → prélever → mettre en cassette → poursuivre fixation formolée

avant inclusion en paraffine → réserve provisoire.

III. Diagnostic anatomopathologique des tumeurs

1) Classification des tumeurs

Le principal enjeu est de déterminer si la

tumeur est maligne ou bénigne. Seul le

pathologiste, par un examen

macroscopique et surtout microscopique

d’un prélèvement cellulaire ou tissulaire,

va pouvoir dire de manière formelle si

une tumeur est bénigne ou maligne.

Il rédigera alors un compte-rendu écrit

qui constituera ce que certains appellent

la « preuve histologique » . Parfois il peut

exister des incertitudes, on parle alors de

tumeur frontière.

Définition d’une tumeur (néoplasme) :

Formation tissulaire issue d’une prolifération cellulaire anormale ressemblant (+/-) au tissu normal, au dépens

duquel elle s’est développée, qui a tendance à persister et à s’accroître. Elle échappe aux règles biologiques de la

croissance et de la différenciation cellulaire.

Tumeur bénigne Tumeur maligne

Evolution Augmentation de volume lente,

développement local

Rapide, développement local puis régional et enfin

systémique. Récidives fréquentes.

Menace vie Faible Forte

Macroscopique Bien délimitée, refoule les tissus de

voisinage sans les détruire.

Mal limitée, infiltre et détruit les tissus de voisinage

Microscopique Aspect proche d’une cellule

normale Très différent de celui d’un tissu normal : noyaux

atypiques et mitoses plus nombreuses. L’architecture de

la tumeur est également souvent fortement modifiée.

Signes cytologiques de malignités:

Anomalies des noyaux :

- Anisocaryose (noyaux de taille variable)

- Augmentation du rapport N/C

- Hyperchromatisme

- Irrégularité des contours nucléaires

- Nucléoles volumineux

Anomalies des mitoses :

- Augmentation du nombre des mitoses visibles

- Mitonécroses (nécrose d’une cellule en mitose)

- Mitoses anormales (mitoses multipolaires)

Anomalies du cytoplasme :

- Anisocytose : cytoplasmes de taille variable

D’une manière générale, une tumeur solide est dénommée en fonction du tissu qui lui a donné naissance et auquel

elle ressemble, et non en fonction de l’organe dans lequel elle se développe.

Cela signifie par exemple qu’il peut y avoir plusieurs types de cancers dans un même organe.

Voici un tableau représentant les différentes dénominations selon les cancers

2) Principes du diagnostic anatomo-pathologiques des tumeurs

• L’examen macroscopique

Voici quelques aspects que peut prendre la tumeur dans un organe creux. L’infiltration est très variable et ne dépend

pas de la présentation en surface :

Voici quelques exemples d’aspects macroscopiques (ATTENTION: aucun diagnostic ne peut être fait sur le

caractère malin de la tumeur à partir d’une observation macroscopique.)

• L’examen microscopique

L’examen microscopique d’une tumeur va étudier les deux

composantes essentielles de toute prolifération tumorale:

- Les cellules tumorales qui prolifèrent: aspect cytologique,

aspect des noyaux, des cytoplasmes, le décompte des mitoses

et leur architecture.

- Le tissu conjonctif de soutien : tous les éléments cellulaires et

les fibres du tissu conjonctif. Dans les tumeurs malignes, il

prend le nom de stroma. Ce qui est important : sa composante

vasculaire (angiogénèse tumorale).

On y retrouve les mêmes types d’éléments que dans le tissu normal, avec une architecture faite de glandes

tumorales, mais ces glandes sont devenues très atypiques, de tailles et de formes variables. De plus les noyaux sont

plus volumineux et irréguliers. (représenté sur la photo au dessus)

Polype du colon Ulcération de

l'oesophage

Lésion du colon Lésion

oesophage

Nodule du rein Nodule du sein

polype= lésion

en saillie à la

surface d’une

muqueuse.

zone arrondie

un peu

déprimée avec

une périphérie

un peu épaissie

en bourrelet

masse

bourgeonnante

et ulcérée avec

+/- hémorragies

en

surface.Masse

circonférentielle

(occupe toute la

périphérie du

colon.)

Elle obstrue la

lumière colique

->une dilatation

en amont (à

gauche sur la

photo)

zone sténosée

(= c’est-à- dire

une zone ou la

lumière de

l’œsophage est

rétrécie) parce

que la paroi

œsophagienne

en regard est

épaissie par une

tumeur

nodule plus ou

moins ovalaire,

jaunatre, assez

bien limité mais

semblant

détruire la

capsule du rein

et faire saillie

dans le tissu

péri-rénal

nodule du sein

mal limité, et se

rapprochant de

la peau en

surface

Il pourrait s’agir

d’un adénome

du colon

probablement

d’un carcinome

épidermoide

Il pourrait s’agir

d’un

adénocarcinome

du colon.

probablement

un carcinome

épidermoide

Possiblement

cancer du rein

Possiblement

cancer du sein,

(adénocarcinome

du sein.)

Exemple d’une muqueuse colique :

• Remaniement de l’architecture dans les tumeurs malignes :

• Différenciation tumorale

Définition : degré de ressemblance d'une tumeur avec un tissu normal.

Le degré de différenciation d'une tumeur maligne doit être précisé dans le but d’établir un

pronostic: bien, moyennement ou peu différenciée. Tumeur indifférenciée (ou parfois anaplasique) : intérêt des techniques complémentaires telles que

l’immunohistochimie et/ou la biologie moléculaire pour en préciser l’origine.

• Grade histopronostique

Le grade d’une tumeur maligne est déterminé par le pathologiste pendant l’examen au microscopique de la tumeur,

en prenant en compte les anomalies cellulaires et architecturales. En fonction de ces anomalies, on définit des tumeurs

de bas grade et de haut grade.

Les tumeurs de bas grade sont en général moins agressives que les tumeurs de haut grade. Cela permet d’adapter les

traitements en fonction du grade tumoral.

Attention : le grade est différent du stade d’une tumeur.

3) Histoire naturelle des cancers

Avant même l’apparition d’une tumeur maligne, certaines lésions ou certains états peuvent prédisposer à l’apparition

d’un cancer, c’est à dire augmenter le risque de survenue d’un cancer par rapport au risque dans la population

générale.

La prédisposition peut être forte comme par exemple avec la polypose adénomateuse familiale. Elle peut aussi être

modérée ou faible.

• 4 Phases d’évolution d’une tumeur maligne

Une tumeur maligne comporte en général plusieurs phases successives dans son évolution. Certaines phases peuvent

être inapparentes : la tumeur peut alors se révéler d’emblée à une phase plus avancée.

Voici les 4 phases présentées avec l’exemple d’un carcinome :

Normale avec des glandes

régulières et parallèles.

Ici dans l’adénocarcinome du côlon

on voit que les glandes

ont des tailles et des formes

beaucoup plus variables.

- LOCALE :

Elle est limitée au tissu d’origine, on parle alors de carcinome in

situ. L’étape initiale du développement d'un carcinome est

strictement intra-épithéliale, il n’y a pas de franchissement de la

lame basale.

Son diagnostic est important pour le pronostic, car encore aucune

métastase ne s’est constituée, le traitement peut être local et limité.

La guérison complète est très fréquente après le traitement.

- INVASION TUMORALE :

La phase loco-régionale est caractérisée par l’invasion des tissus

voisins. L’invasion tumorale se caractérise par l’acquisition de

nouvelles propriétés biologiques par les cellules tumorales telles que:

• La destruction de la membrane basale

• La mobilisation des cellules tumorales qui commencent à

se déplacer.

• Le développement d’une angiogenese tumorale, est capital

pour la survie et développement de la tumeur : les nouveaux

vaisseaux apportent tous les éléments nutritifs. Certains

traitements ciblent ces nouveaux vaisseaux et tendent à

éviter leur prolifération.

• Développement d’un stroma tumoral

- PHASE DE GENERALISATION :

Les cellules tumorales acquièrent la capacité de détruire la paroi des vaisseaux et peuvent alors entrer dans les voies

de la circulation sanguine ou lymphatique. La dissémination se fait principalement par les vaisseaux sanguins et

lymphatiques.

La voie sanguine conduit d’emblée à des métastases systémiques (par exemple : poumons, foie, os, cerveau...).

La voie lymphatique conduit d’abord à des métastases dans les ganglions lymphatiques (par exemple : ganglions du

creux axillaire pour le cancer du sein) puis à des métastases systémiques.

La plupart des cellules tumorales qui arrivent dans les vaisseaux vont mourir grâce au système immunitaire du patient,

mais avec le temps elles s’adaptent et trouvent le moyen de survivre pour arriver dans un organe distant, là elles

doivent de nouveau franchir les parois des vaisseaux avant de s’établir dans l’organe et proliférer.

- DEVELOPPEMENT DES METASTASES A DISTANCE

La capacité des cancers à donner des métastases est très variable selon les tumeurs primitives : certaines tumeurs

cérébrales ne donnent jamais de métastases, mais ont une évolution locale très invasive et sont donc malignes

localement.Par contre, les mélanomes, les cancers bronchiques, et d’autres cancers donnent fréquemment des

métastases.

Les principaux sites métastatiques sont : Ganglions lymphatiques, Foie, Poumon, Os; Cerveau; Surrénales…

Tous les organes peuvent faire l’objet de métastases, en sachant toutefois que certaines tumeurs donnent plus

volontiers des métastases dans certains organes, lié à des mécanismes de signalisation cellulaire complexes. Ainsi, le

cancer de la prostate donne surtout des métastases osseuses.

Les métastases ganglionnaires sont donc fortement liées à la topographie de la tumeur primitive. Plusieurs ganglions

peuvent être atteints successivement, le premier d’entre eux portant alors le nom de ganglion sentinelle. L’examen

du ganglion sentinelle est devenu un moyen fréquent d’évaluer la probabilité d’extension ganglionnaire d’une tumeur.

Le seul moyen d’être totalement sûr qu’il s’agit bien de métastases serait de faire des biopsies sur ces lésions. Mais

on s’en dispense souvent en pratique car cela survient généralement dans un contexte de cancer connu et le diagnostic

est alors quasiment certain.

• Stade d’une tumeur

Le stade est établi au moment du diagnostic initial : « photographie du degré d’extension de la tumeur » établi

collégialement par le clinicien, le radiologue, le pathologiste… contrairement au grade qui n’est évalué que par le

pathologiste. C’est un élément capital pour le pronostic et pour le choix des traitements.

Le stade est estimé par la classification TNM :

T = Tumeur : taille, infiltration…

N = Nœuds ganglionnaires : présence ou absence de métastases ganglionnaires

M = Métastases à distance (non ganglionnaires régionales)

Il est évident qu’un cancer de stade T1N0M0 aura un bien meilleur pronostic qu’un cancer de stade T3N1M1, et

l’attitude thérapeutique sera très différente.

4) Interface entre anatomie pathologique et les analyses moléculaires

• Le rôle du pathologiste

Les médecins anatomo-cyto-pathologistes sont spécialisés dans le diagnostic des maladies par examen

extemporané/macroscopique/microscopique de prélèvements tissulaires ou cellulaires.

Leurs missions sont les suivantes :

- choisir la technique la plus adéquate pour l’anomalie moléculaire à détecter.

- sélectionner l’échantillon tissulaire le plus adéquat pour la technique envisagée (conditionne le résultat obtenu

par la suite).

- évaluer les facteurs pouvant gener la technique moléculaire, (nécrose, pigments, fibrose)

- Controler la préparation technique du matériel envoyé au biologiste moléculaire.

• Evaluation de la cellularité tumorale d’un échantillon tissulaire inclus en paraffine

La coupe tissulaire est très riche en cellules tumorales. Environ 90% des cellules sur la

coupe sont des cellules cancéreuses. Dans ce cas, le pathologiste peut adresser au biologiste

moléculaire des coupes tissulaires entières pour des examens complémentaires.

Cette coupe tissulaire contient les cellules tumorales, cerclées en bleu,

représentant bien moins de 50% de l’ensemble des cellules sur la coupe. Dans ce cas, il faudra

effectuer une étape de macrodissection sur les coupes tissulaires avant l’envoi au biologiste

moléculaire.

La préparation technique des coupes tissulaires pour analyse moléculaire, avec ou sans

macrodissection, se fait au microtome, comme pour les autres techniques de coupe en pathologie.

La particularité tient à des conditions de propreté spécifiques. Le microtome et les lames utilisées sont désinfectées

avant et après chaque mise en place d’échantillon, avec un produit permettant d’éliminer toute trace d’ADN et

d’ARN. Ainsi, l’échantillon envoyé en biologie moléculaire ne sera pas contaminé par l’ADN d’un autre patient. Les

coupes réalisées sont placées dans un tube Eppendorf®.

Le pathologiste est l’un des garants principaux de la qualité de l’analyse moléculaire, de par son rôle dans la phase

pré-analytique.

• Banque de tumeurs humaines

Les banques de tumeurs humaines sont la seule manière d’étudier la biologie des cancers humains « in situ », c’est-

à-dire dans une situation qui est la plus proche de la réalité des malades.

La qualité des tumeurs conservées nécessite de s’assurer que le prélèvement inclut bien la lésion. Ceci est contrôlé

sur le plan microscopique par le pathologiste. La qualité nécessite aussi de contrôler l’absence de contamination,

de ne pas rompre la chaine du froid, et de suivre le devenir des échantillons (= c’est-à-dire pouvoir assurer leur

tracabilité).

Les prélèvements tissulaires doivent etre orientés sur une languette plastique qui est introduite dans un cryotube

résistant aux très basses températures. L’identification du prélèvement est essentielle. Le tube contenant le

prélèvement doit etre congelé très rapidement dans l’azote liquide pour assurer une conservation optimale des

protéines et des acides nucléiques.

Le tube avec le prélèvement congelé est soit conservé dans l’azote liquide à -196°C, soit conservé dans un congélateur

à -80°C.

L’identification du lieu de stockage nécessite d’identifier :

- la place du prélèvement dans une boite cryogénique

- la place de la boîte dans le tiroir du congélateur

- et le numéro du congélateur.

Les collections de tumeurs humaines font l’objet d’une législation dédiée. Elles doivent en France être déclarées à

l’Agence Régionale de Santé, et au ministère de la recherche. En France, la responsabilité de l’utilisation pour la

recherche d’un prélèvement tumoral humain est celle du médecin qui suit le malade.

L’utilisation des échantillons tumoraux pour la recherche ne se fait qu’après que le diagnostic ait été établi, nécessite

un consentement, éclairé et écrit.

La cession des échantillons s’accompagne d’un accord de transfert de matériel biologique, qui indique :

- L’identification des organismes donneur et receveur de l’échantillon.

- La description du matériel transmis.

- Le programme de recherche pour lequel ce matériel tumoral est exclusivement cédé.

5) Microdissection laser

La technique de microdissection : permet de sélectionner des zones cellulaires et des cellules isolées à partir de

coupes tissulaire ou d’étalement cellulaire. Elle est fondamentale pour

étudier l’hétérogénéité de tout échantillon compé de différents types

cellulaires.

Dans le foie, les tissus cancéreux se caractérisent sous le microscope par

une diversité morphologique et une variabilité d’expression de

marqueurs moléculaires ou sont disséminées cellules stromales, cellules

précancéreuses, cellules cancéreuses et cellules normales résiduelles.

La microdissection laser répond ainsi au besoin de s’affranchir de l’hétérogénéité cellulaire qui caractérise

ces tissus.

Elle permet de sélectionner une population ou une région cellulaire d’intérêt sur tous types de prélèvements

tissulaires.

Par exemple ici dans un lymphome hodgkinien, on observe des cellules de Reed-Sternberg (grandes cellules malignes

qui infiltrent les ganglions).

La microdissection laser permet d’enrichir un échantillonnage en cellules de Reed-Sternberg (cerclées en jaune) sans

récupérer d’autres cellules plus petites non souhaitées (cerclées en vert).

- Comparaison des techniques :

D’une façon générale, un microdissecteur laser se caractérise par un microscope (droit ou inversé), couplé à un

faisceau laser de longueur d’onde dans l’infra-rouge ou l’ultra-violet et dont le fonctionnement est sous la commande

d’un programme informatique.

Sous contrôle optique, à différents grossissements, une ou plusieurs cellules caractérisées peuvent être virtuellement

sélectionnées par le pathologiste directement sur l’écran de l’ordinateur à l’aide d’un assistant graphique.

- Microdissection manuelle : initialement les éléments cellulaires tumoraux étaient récupérés par grattage manuel de

la lame à l’aide d’un scalpel, éventuellement aidé d’un micromanipulateur. Cependant c’était fastidieux, manquait

de précision, la quantité était incertaine et potentiellement contaminés par d’autres cellules qui ne nous intéresse pas.

Elle est toujours utilisée quand les zones tumorales à récupérer sont importantes. Ne peut pas s’appliquer aux

éléments isolés sans risque de contaminations.

- Microdissection laser: les éléments cellulaires tumoraux isolés sont sélectionnés avec une grande précision sous

le contrôle du microscope, puis découpés par un faisceau laser avec une précision de l’ordre du micron avant d’être

finalement récupérés dans un tube classique (tube Eppendorf®) ou sur un support particulier (capsule ou tube spécial)

selon le type d’appareil utilisé.

• Exemple d’application

Le génome tumoral reste la principale cible des études utilisant la

technique de microdissection tissulaire.

Ici on s’intéresse à la recherche de pertes d’hétérozygotie dans de

nombreuses tumeurs cancéreuses. La zone tumorale de ce tissu

mammaire est délimitée par des pointillées.

Lors que l’on prend en compte un tissu normal et le tissu tumoral non

microdisséqué, on n’observe pas de différence allélique significative

Cependant, lorsque le tissu est microdisséqué, on observe une nette

augmentation de la sensibilité de détection des LOH (perte

d’hétérozygotie).

Grâce aux progrès de la génomique, en particulier couplant la

microdissection laser à des techniques de nouvelle génération de

séquençage, l’existence d’une hétérogénéité génétique intra-

tumorale a pu être mise en évidence dans tous les cas ou ces

analyses ont été réalisées.

• Systèmes technologiques

- LCM: (laser capture microdissection) Consiste en une membrane thermolabile que l’on fait fondre sur les zones

d’intérêt sous l’action d’impact laser dans l’infrarouge. Les zones sélectionnées sont récupérées par arrachement.

- LMPC : (Laser Microdissection Pressure Catapulting) . Possède la capacité de récupérer les échantillons

sélectionnés par catapultage dans un tube.

- LMD (Laser Micro Dissection) : Possède la capacité de sélectionner les échantillons et de les récupérer dans un

tube sous l’effet de la gravité.

Description du LMD mais c’est globalement pareil pour les autres systèmes.

3 étapes :

1) Sélection des cellules sous microscope

2) Découper par faisceau laser pour récupérer les éléments cellulaires souhaités

3) Récupération par catapulte dans un tube classique par défocalisation du faisceau et

légère augmentation de l’intensité de l’énergie. Cela génère un nuage photonique qui

va catapulter les fragments microdisséqués vers le capuchon d’un tube contant une

solution d’extraction ou de lyse.

:

- Cellcut: les échantillons sont récupéres par adhérence à une membrane après découpe au laser.

Ces technologies s’appliquent aussi bien sur du tissu fraîchement prélevé que sur du tissu déjà

archivé (inclus dans la paraffine, congelé…)

Les coupes histologiques sont déposées sur une lame spéciale entièrement recouverte d’une fine

membrane en plastique appelée MembraneSlide, dont une partie centrale, délimitée ici en

pointillé, qui n’adhère pas à la lame de verre. Et c’est sur cette partie centrale que l’échantillon

biologique va être déposé pour constituer ce que l’on appelle une lame blanche (échantillon sans

coloration).

Cette lame blanche sera déparaffinée lorsqu’il s’agit d’échantillon au préalable fixé et inclus en

paraffine pour être ensuite coloré afin de mieux distinguer les cellules.

Pour des échantillons initialement congelés la coloration intervient directement après la découpe des blocs congelés

faite au cryostat.

PARTIE III : DIAGNOSTIC CYTOPATHOLOGIQUE DES TUMEURS ET DIAGNOSTIC DES

HEMOPATHIES

I) Place de la cytologie dans le cancer

Il existe différents prélèvements cytologiques :

− Liquides spontanément émis (urines)

− Recueil par frottis de cellules desquamant spontanément

− Ponction à l’aiguille de liquide pathologique (épanchement séreuse/kyste)

− Ponction à l’aiguille d’un organe ou d’une tumeur (ganglion, nodule thyroidien)

− Apposition d’un tissu sur lame

Le frottis cervico-utérin nécessite que le col utérin soit exposé (utilisation d’un spéculum), on frotte avec une

brosse en plastique (détachement et recueil des cellules sur la surface du col) puis on immerge la brosse dans un

fixateur cytologique en vue de conserver le prélèvement.

Exemple de récupération des cellules

Ce qu’on voit est normal : on observe des cellules épithéliales de revêtement utérin

associés à quelques cellules inflammatoires habituelles. Il n’y a pas d’anomalie

cytologique pour lésion tumorale ou pré-tumorale, ni même de lésion par HPV.

On illustre l’exemple des liquides spontanément émis avec les urines. Les cellules qui tapissent la vessie se

renouvellent, les plus superficielles se desquament et vont dans les urines. Une analyse est donc possible. Dans

certaines conditions, les hématuries chez le patient fumeur par exemple, fait évoquer un cancer de la vessie. On va

alors rechercher une tumeur des voies urinaires en commençant par l’examen cytologique des urines.

Dans la situation ou il n’y a pas de tumeur, les urines sont claires. Au microscope, les cellules sont peu nombreuses,

la morphologie est normale, elles sont malpighiennes/cylindriques et arrondies. Ce sont des cellules urothéliales.

Dans la situation où il y a une tumeur, les urines sont foncées (hématurie). L’examen cytologique révèle des cellules

suspectes ou tumorales avec des amas tridimensionnels de cellules urothéliales avec de gros noyaux très atypiques ;

L’examen cytologique a aussi une autre indication : celle de l’aide à la prise en charge diagnostique et

thérapeutique.

On prend l’exemple d’un homme jeune avec une altération de l’état général (amaigrissement, asthénie, toux, sueurs

nocturnes). Le diagnostic de lymphome est hautement probable. Une masse médiastinale probablement ganglionnaire

est trouvée. Une cytoponction est effectuée.

Une biopsie diagnostique est un examen cytologique extemporané permettant de confirmer l’hypothèse

diagnostique et de s’assurer de la qualité du matériel (non nécrotique) ainsi

que de la quantité. Le diagnostic est formel, c’est bien un lymphome. Le

traitement sera de la chimiothérapie associée à de la radiothérapie.

Dans certains cas, l’examen cytologique ne suffit pas pour faire le

diagnostic et pour mettre en place le traitement adapté.

On va ici s’attarder sur le liquide d’épanchement.

On est face à un épanchement pleural chez une patiente, ancienne grande fumeuse, avec altération de l’état général :

perte de 7kgs en quelques mois, crachats sanglants depuis quelques jours.

La 1ère hypothèse ici à faire est celle du cancer du poumon. La ponction pleurale met en évidence des cellules

atypiques d’allure cancéreuse.

L’aspect très cohésif des cellules est en faveur d’un adénocarcinome. On fait une mise en évidence par

immunomarquage anti TTF1 (Thyroïd Transcriptor Factor 1) au niveau des noyaux des cellules présentes dans le

liquide pleural. Ces protéines sont spécifiques quand les cellules sont thyroïdiennes ou pulmonaires, elles témoignent

d’une localisation secondaire métastatique d’un carcinome d’origine pulmonaire. Le diagnostic est posé et on

procède à des examens complémentaires, à la recherche de mutations spécifiques. Ce cancer pourrait alors bénéficier

d’un traitement adapté.

Au travers d’un second exemple, on va voir qu’il est possible de faire un diagnostic de récidive à moindre coût (en

termes de gestes et de désagrément pour le patient) avec l’examen cytologique.

Le patient a un antécédent de mélanome de l’œil opéré il y a 10 ans. Il est hospitalisé en urgence pour tamponnade,

le liquide péricardique est drainé (plusieurs centaines de millilitres) et examiné. Il est mis en évidence la présence de

plusieurs cellules tumorales. On note une association avec un pigment noir-brun, qui est plus visible sur

l’immunomarquage à la dystokératine : ce qui est très évocateur de mélanine et permet d’évoquer cytologiquement

une localisation métastatique au niveau du péricarde du mélanome connu.

Le diagnostic est formel par mise en évidence sur les cellules tumorales de marqueurs mélaniques non spécifiques.

L’immunomarquage fait en cytologie (après l’inclusion en paraffine, la réalisation d’un cytobloc à partir du même

liquide) permet la recherche de la mutation du gène BRAF (tellement célèbre qu’on ne le présente plus). Il est muté

dans 30 à 40% des mélanomes. Cette identification permettra d’utiliser un traitement spécifique efficace.

L’identification des cellules cancéreuses se fait sur 2 niveaux. Le 1er niveau consiste en la révélation de la nature

cancéreuse des cellules examinées. On peut s’en rendre compte seulement par leur présence dans un milieu atypique

(ex : présence de cellules épithéliales dans le LCR) ou on peut se baser sur des critères morphologiques par la mise

en évidence d’anomalies cytonucléaires.

Le 2ème niveau consiste en l’identification de l’origine du cancer, ce qui n’est pas toujours aisé en cytologie car les

cellules sont souvent isolées et donc sorties de leur contexte. Les cellules vont alors avoir un aspect particulier, elles

vont avoir une organisation spéciale : cohésives voire polarisées entre elles dans le cas d’un carcinome, si elles

forment des boules, on pourra préciser en identifiant un adénocarcinome. Les différenciations organisationnelles ou

fonctionnelles permettent l’affinage du diagnostic. On peut avoir recours à des techniques complémentaires telles

que l’immunomarquage pour l’identification de marqueurs spécifiques ou la cytochimie pour la mise en évidence de

mucus.

Pour reconnaître la nature tumorale maligne, on analyse le noyau, la taille

et l’aspect de la cellule par rapport à son cytoplasme, c’est le rapport

nucléo-cytoplasmique.

En coloration MGG, la cellule est de grande taille par rapport aux cellules

immunitaires normales. Les noyaux sont volumineux, ils occupent la moitié

voire, le plus souvent, les ¾ de la cellule. Les noyaux sont à contours

irréguliers voire géométriques avec de gros nucléoles, parfois multiples et

en mitose (prolifération très importante) sont les caractéristiques des

cellules cancéreuses. Un peu caricatural d’après la prof dans le diapo.

A gauche : c’est un adénocarcinome. La nature

est glandulaire de par leur organisation, les

cellules sont regroupées en boule, c’est l’aspect

tridimensionnel des glandes. A droite : mise en évidence de la sécrétion de

mucus par la technique PAS montre la coloration

rose fuschia du cytoplasme cellulaire.

Aussi, on peut mettre en évidence l’origine cellulaire en utilisant l’immunomarquage (ex : TTF1 = origine

pulmonaire du cancer).

Les avantages de la cytologie sont les suivants. C’est une technique simple, peu coûteuse, renouvelable assez

facilement, les résultats sont rapides (moins de 24h), les complications liées aux gestes sont exceptionnelles.

L’aiguille étant fine, il n’y a peu ou pas d’hémorragie et peu ou pas d’infection. L’examen est dit non-invasif.

Les limites de la cytologie sont les suivantes. Le diagnostic n’est certain qui si l’examen est positif (a ramené des

cellules tumorales), les cellules sont sorties de leur contexte. Il peut être impossible de déterminer la nature du cancer

(surtout s’il n’y a pas de marqueurs spécifiques). Si le prélèvement se fait sur la tumeur primitive, en cytologie on ne

peut pas dire si c’est un carcinome in situ ou un carcinome invasif. Les cellules très bien différenciées sont donc

d’aspect très proche des cellules normalement présentes dans le tissu : le diagnostic de certitude est donc quasiment

impossible. Le matériel est souvent obtenu en quantité limitée. Le matériel ne se conserve pas, sauf si l’on a assez

de liquide et de cellules pour en faire un cytobloc.

II) Examen cytologique extemporané au cours d’une endoscopie pancréatique

On prend ici l’exemple d’une patiente de 85 ans avec une altération de l’état général, des douleurs épigastriques

depuis 3 mois avec irradiations dans le dos, une perte de poids et d’appétit.

Le scanner abdominal montre une tumeur qui s’est développée au niveau de

la queue du pancréas à proximité des gros vaisseaux artériels (tronc coeliaque

ici).

Le terrain est fragile dans ce cas car la patiente est insuffisante cardiaque,

traitée pour des troubles du rythme et insuffisante rénal d’ou le scanner non injecté. On a donc une mauvaise

délimitation de la tumeur. Pour compléter le bilan d’extension, on fait une écho-endoscopie.

L’endoscope, muni d’une sonde d’échographie, descend dans l’œsophage puis est positionné dans l’estomac. Le

pancréas étant en post-gastrique, cela permet une bonne visualisation et une ponction à travers la paroi stomacale de

la lésion afin de faire un examen cytologique ou cyto-histologique qui confirmera le diagnostic. Il est essentiel pour

la décision thérapeutique.

L’utilisation d’un appareil linéaire permet de faire passer une aiguille à ponction et de la faire sortir à son embout.

On fait ensuite descendre l’endoscope dans l’estomac, fait la ponction de la lésion et ressort l’appareil (pour plus de

détails, allez voir la vidéo).

Le médecin pathologiste répartit le liquide sur 1 ou 2 lames pour les mettre sur les autres afin d’avoir qu’un tout petit

peu de liquide sur les lames. Les lames sont séchées pour que les cellules adhèrent bien. Une lame est sélectionnée

pour être colorée puis examinée au microscope.

On commence avec un faible grossissement pour évaluer la richesse

cellulaire. Ici, il n’y en pas beaucoup et c’est hémorragique, les hématies sont

grisâtres, les cellules isolées et très atypiques. Les noyaux sont énormes avec

1 ou plusieurs nucléoles, ce qui affirme le caractère malin.

On observe des amas : en périphérie on voit les mêmes éléments très

atypiques. Les cellules se sont développées à partir de cellules épithéliales,

c’est donc un carcinome. Elles forment des contours de forme arrondie,

c’est alors probablement un adénocarcinome. Mais ce sera à refaire en

laboratoire car la coloration n’est pas de bonne qualité.

L’examen a donc montré que la lésion est localement avancée, il n’y aura pas de traitement chirurgical. L’examen

cytologique extemporané a permis de raccourcir la procédure car il confirme le diagnostic de cancer. La patiente sera

vite adressée à l’équipe d’oncologie médicale pour sa prise en charge ultérieure.

III) Hémopathies malignes

1) Les examens d’hématologie cellulaires

L’hématopoièse est l’ensemble des mécanismes qui assurent la production des différentes cellules sanguines produite

par la moëlle osseuse. La production est régulée par 2 facteurs. Le premier étant le micro-environnement

médullaire, c’est une structure privilégiant la croissance des cellules hématopoïétiques. Le deuxième est la régulation

par les facteurs de croissance, qui sont produits par les cellules du micro-environnement, la production est extra-

cellulaire. La production est constante :

Elle se fait à partir des cellules souches hématopoïétiques qui possèdent plusieurs propriétés. Celle de l’auto-

renouvellement, dont le but est de maintenir un pool constant de cellules au cours de la vie. Ainsi qu’une grande

capacité proliférative pour donner des progéniteurs qui donneront par la suite les cellules matures.

On explore l’hématopoièse avec des examens du sang périphérique : NFS

+ ou – réticulocytes et des examens de la moëlle osseuse :

myélogramme et biopsie ostéo-médullaire.

La NFS est réalisée à partir de sang total : il s’agit de sang prélevé au pli

du coude puis mis dans un tube contenant de l’anticoagulant (EDTA).

Elle permet une analyse qualitative et quantitative. On a la numération

globulaire qui comprend leucocytes, hématies et plaquettes. La formule

leucocytaire comprend de nombreux éléments des sous-populations

leucocytaires : les PNN, PNE, PNB, les lymphocytes et les monocytes.

Le frottis sanguin permet l’analyse morphologique des hématies, des leucocytes et des plaquettes. La mesure est

faite par un automate. Les paramètres sont mesurés sont : le nombre d’hématies, l’hémoglobine, le VGM (Volume

Globulaire Moyen), le nombre de réticulocytes (sur demande), le nombre de leucocytes et de plaquettes. Les

paramètres calculés sont le TCMH, le CCMH et l’hématocrite.

L’alcool, le tabac, l’ethnie, la grossesse peuvent modifier les

valeurs de l’hémogramme.

La formule leucocytaire est mesurée par un automate, elle

étudie la répartition des 5 sous-populations en pourcentage

et en valeurs absolues (le biologiste étudie que ces dernières).

Il les sépare et les quantifie, cela repose sur la structure et la

fluorescence. Le rose correspond aux lymphocytes (faible

structure en axe des abscisses et faible fluorescence en axe

des ordonnées). Le vert correspond aux monocytes. Le bleu

correspond aux PNN, le rouge aux PNE, les éléments en

blanc qui résistent à la lyse correspondent aux PNB.

Il faut faire un frottis sanguin pour voir s’il n’y a pas de cellules anormales. La réalisation se déroule ainsi : dépôt

d’une fine goutte de sang, étalement sur lame, séchage, coloration au MGG et examen microscopique.

Les NFS pathologiques peuvent résulter d’anomalies

morphologiques, d’ou la réalisation d’un frottis sanguin.

Quand on est présence d’une NFS pathologique, il faut

l’explorer en cherchant une cause réactionnelle ou centrale. Si

on ne trouve rien, on passe à la moëlle : myélogramme et

biopsie ostéo-médullaire.

Les cellules les plus

immatures sont les

hémoblastes.

Etapes de la granulopoïèse : les PNE

et PNB peuvent être étudiés de

manière analogue.

Le myélogramme permet d’avoir les résultats en quelques heures, c’est généralement le 1er examen pratiqué, il est

analysé par le laboratoire d’hématologie. C’est le meilleur examen pour l’étude morphologique des cellules

hématopoiétiques mais il ne permet qu’une appréciation semi-quantitative de la richesse de la moëlle osseuse en

pourcentage des éléments des différentes lignées.

La biopsie ostéo-médullaire est analysée par le labo d’anatomo-pathologie. Elle permet une analyse histologique

mais est un examen invasif et cependant plus complet pour rendre de l’état de la moëlle.

Le myélogramme se fait par une ponction sternale chez les adultes sur le manubrium sternal avec un trocart de 2 à

3cm de longueur ou en ponction iliaque (chez les enfants ou s’il y a une contre-indication de ponction sternale) sur

la crête iliaque postérieure, le trocart est différent. On fait une anesthésie locale à l’aide d’un patch de lidocaine ou

d’une injection de xylocaine (plus profond).

Les étapes du myélogramme sont les suivantes : antisepsie puis ponction

osseuse avec trocart et aspiration de la moëlle osseuse à la seringue.

Quelques gouttes sont déposées sur la lame (même aspect que le sang), de

fins frottis sont obtenus. On retire le trocart, on effectue une compression sur

le point d’aspiration puis mise en place d’un pansement (pendant 24h). On

peut faire (1-2mL) d’autres aspirations pour d’autres examens comme les

examens cytogénétiques.

On effectue une analyse cytologique après coloration au MGG, on procède à

l’examen microscopique : évaluation de la richesse des précurseurs des

plaquettes (mégacaryocytes), compter les différentes lignées myéloïdes en

pourcentage et évaluer leur morphologie. Tout cela est fait à faible

grossissement.

L’étude des précurseurs est faite à faible grossissement, on étudie leur nombre et leur aspect puis on décompte les

éléments myéloïdes et non myéloïdes à plus fort grossissement.

On peur étudier des lignées monocytaires et lymphocytaires mais aussi autres des autres cellules observables, elles

font toutes partie du micro-environnement médullaire : comme les macrophages et les ostéoblastes, ils sont garants

de la bonne qualité du prélèvement.

La réalisation du décompte du myélogramme se fait sur au moins 200 cellules : le biologiste fait la répartition des

lignées, rapporte les éventuelles anomalies morphologiques ainsi que la présence de cellules anormales qui

orienteront vers les hémopathies malignes. Cet examen est très important pour les examens complémentaires et pour

la démarche diagnostique.

On peut faire une analyse en cytométrie de flux. Le principe est le suivant : c’est une technique biologique d’analyse

de cellules en suspension. On détecte des antigènes à la surface ou dans le cytoplasme des cellules grâce à des

anticorps monoclonaux couplés à des fluorochromes.

Erythropoïèse : aboutit à la

production d’hématies qui seront

relâchées dans le sang.

Son indication est celle-ci : préciser l’appartenance aux cellules tumorales et à leur lignée. Elle est indispensable pour

le diagnostic et la classification de certaines pathologies, les hémopathies.

Le principe est le suivant : lavage de la suspension

cellulaire, on l’apporte au cytomètre. Elle est mise dans le

système fluidique : il entraîne 1 par 1 les cellules grâce à

un liquide gaine devant la source laser. Puis il y a

diffraction de la lumière sur ces cellules, ce qui donne des

informations sur la taille, la structure des cellules mais

surtout grâce au système complexe de filtres

optiques/faisceaux lumineux/photodétectecteurs, on peut quantifier l’intensité émise par chaque fluorochrome et

donc quantifier les antigènes et ce, pour chaque cellule à la surface et dans le cytoplasme.

Exemple : immunotypage lymphocytaire sanguin normal. Les 2 premières figures correspondent à l’élimination des

débris et des cellules mortes. On détecte les lymphocytes grâce à l’expression forte de l’antigène CD45, la population

est alors isolée. Puis on va réaliser une étude de la répartition de la population lymphocytaire grâce à

l’immunomarquage des antigènes spécifiques de ces sous-populations. Grâce à ce type de graphique, on peut

détecter les anomalies d’expression de certains marqueurs et donc préciser le diagnostic de certaines pathologies

du système hématopoïétique.

2) Hématologie biologique : cytogénétique.

Une étude cytogénétique est une étude morphologique du matériel chromosomique sous forme de chromosome dans

une cellule. Elle correspond au décompte et l’identification de tous les chromosomes dans les cellules en métaphase,

moment ou ils sont les plus visibles. Cela permet de plus l’identification des anomalies de nombre et de structure.

Les techniques d’étude cytogénétique

- conventionnelle : réalisation d’un caryotype ce qui permet une vision globale des chromosomes.

- moléculaire : technique d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) permet une analyse ciblée sur un gène donné.

Schéma bilan

En pratique : il y a incubation dans un tube de la

suspension de cellules obtenues à partir du sang

total + cocktail d’anticorps monoclonaux. Ils

sont dirigés contre un antigène spécifique et

chacun couplé à un fluorochrome. Plusieurs

anticorps peuvent être utilisés par tube (jusqu’à

10) pour affiner la précision de la combinaison

des anticorps exprimés à l’intérieur ou à

l’extérieur de la cellule. Les signaux peuvent être

différenciés par différents lasers, ce qui est

possible pour les cytomètres modernes.

Conclusion

Les chromosomes sont des molécules constituées d’ADN et de protéines. C’est le support de l’information génétique.

Le nombre de chromosome est spécifique à chaque espèce. Chez les hommes comme les femmes, il y a 46

chromosomes (2 jeux haploïdes de 23 chromosomes).

Chaque chromosome est constitué d’un centromère séparant les bras longs des bras courts. Au bout de chaque bras

on retrouve des télomères. Pour chaque chromatine il y a une molécule d’ADN.

Du fait que les chromosomes soient plus visible en métaphase, toutes les techniques visent à avec un maximum de

cellules bloquées en métaphase.

Les prélèvements hématologiques sont : MO, sang, tissus tumoral/ ganglionnaire.

Comment cultiver les cellules en vue d’obtenir des chromosomes ?

• Dans un milieu stérile (hotte)

• Milieu de culture enrichi en sels minéraux, glucose, acide aminés, antibiotiques et du sérum de veau

fœtal.

• Le temps de culture est variable en fonction des pathologies, type de cellule, et de la quantité de matériel

biologique. Par exemple les pathologies lymphoïdes chroniques ont besoin d’une longue durée de

cultivation et est stimulée par des mitogènes, ce sont des pathologies « non prolifératives » et plutôt

« non apoptotiques ». Pour cette raison on accumule les cellules qui ne font pas de cycle cellulaire, on

utilise alors des mitogènes pour les faire parvenir en métaphase. Alors que les cultures d’hémopathies

malignes myéloïde/lymphoïde sont rapides et ne nécessitent donc pas de mitogènes.

• Pour lancer la culture il faut décompter les cellules. Il en faut une quantité suffisante (10 à 20 millions par

mL). Une fois décomptées elles sont mises en culture, dans des flacons puis dans des étuves.

• Pour obtenir des chromosomes : après quelques heures à 37°C il doit y avoir assez de cellules en

métaphase. On arrête alors la culture avec un agent bloquant le fuseau mitotique puis on effectue un choc

hypotonique (au KCl) pour étaler correctement les chromosomes. Ensuite on procède à une fixation : les

culots de cellules sont fixés avec un mélange de méthanol et d’acide acétique. Le tout est remis en

suspension pour être étalé sur une lame. C’est partie très critique qui doit être faite dans une enceinte

thermostable. Il faut faire tomber 1 à 2 gouttes de suspension cellulaire sur la lame.

• Par la suite il y aura une dénaturation et une coloration afin de faire apparaitre des bandes colorées. Cela

permet de distinguer les chromosomes de manière spécifique et de les classer par taille.

La coloration Giesma + dénaturation thermique à pH

déterminé en milieu salin donne les bandes R.

La coloration Giesma + dénaturation trypsine donne les

bandes G.

Notre espèce possède 22 autosomes et 2 gonosomes.

Ensuite on peut procéder à la visualisation au microscope à lumière transmise. On peut utiliser une caméra afin de

prendre des photos des métaphases d’intérêt et des chromosomes.

Les index centromériques sont : métacentriques (bras court = bras long), submétacentriques (bras C < bras L) et

acrocentrique (bras court quasi inexistant).

Après le marquage on peut reconnaître chaque chromosome. Le nombre et la répartition des bandes sont spécifiques

à chaque chromosome. Une nomenclature internationale (ISCN) est définie pour chaque chromosome des régions

chromosomique qui comporte des bandes et des sous bandes.

Le logiciel donne les bandes à gauche, les

chromosomes en métaphase sont à droite.

L’analyse génomique permet de rendre compte des anomalies de structure et de nombre. Les avantages sont qu’on a

une analyse globale du génome dite « pan-génomique ». Les inconvénients sont que l’on ne peut les observer qu’en

métaphase, et qu’il ne détachement pas les remaniements cryptiques (la limite de la résolution est de 5-10 mégabases).

Pour palier à ce problème on effectue une FISH (cours d’UE1 de P2).

FISH est une technique de biologie moléculaire

d’hybridation in situ utilisant des sondes marquées à

l’aide de marqueurs fluorescents spécifique d’un locus

donné. Elle est utilisée sur les lames étalées de culot de

cytogénétique. L’hybridation dure pendant toute une

nuit. On utilise le fluorochrome DAPI pour faire

ressortir les sondes du locus spécifique. L’analyse se

fait au microscope à fluorescence qui permettra de voir

la sonde déposée à l’endroit attendu pour voir les

éventuels remaniements.

Les anomalies chromosomiques en hématologie sont généralement acquises. Elles apparaissent au cours de la vie et

ne tout qu’un organe. L’intérêt du caryotype en hématologie-cancérologique est de déterminer le diagnostic, le

pronostic et la prise en charge thérapeutique.