SERODIAGNOSTIC DE LA SYPHILIS VDRL-TPHA

H. OUKOUCHOUDINSTITUT NATIONAL D’ HYGIENE

SERODIAGNOSTIC DE LA SYPHILIS

Le diagnostic sérologique repose sur la mise en évidence des anticorps induits par l’infection et retrouvés dans le sérum.

INTRODUCTION

Le sérum est traité pour retirer certaines substances qui peuvent gêner la technique ce qui aboutit à une certaine dilution.

Le patient doit être de préférence à jeun.

Les réactions sérologiques

selon l’origine de l’antigène utilisé

Réaction à antigène tréponémique

Réaction à antigène non tréponémique (Ag cardiologique)

Réaction à antigène non tréponémique :VDRL( veneral disease research laboratory)

Principe:

Réaction d’agglutination passive sur lame en verre.

Antigène utilisé est d’origine cardiolipidique constitué de microcristaux de cholestérol sur lesquels sont adsorbés les molécules de cardiolipide = Haptène de Wasserman.

Des particules de charbon sont piégés dans la combinaison Ac-Ag pour faciliter la lecture.

Résultat du dépistage est rendu positif ou négatif.

Résultat est rendu en titre en cas de dépistage positif.

Matériel et Méthode

Sérum frais. Eau physiologique. Antigène VDRL près à l’emploi. Matériel: Centrifugeuse Micropipettes réglables ( 5-50µL) Plaques en verre Portoir pour tubes à hémolyse Agitateur rotatif de Kline Container de déchets contaminés Eau de Javel

Eléments de la réaction

Mode opératoire:

Réaction qualitative Réaction quantitative

( dépistage) (dépistage positif)

Deux types de réactions

Réaction qualitative

Distribuer 50µL de sérum sur chaque puit de la plaque en verre.

Ajouter 16µL d’Antigène VDRL.

Placer la plaque sur l’agitateur de Kline pendant 8mn.

Lire immédiatement au microscope.

Manipulations pour le test qualitatif de dépistage :

 

 Puits

Témoin  + Témoin  - Témoin  Ag VDRL

Sérum inconnu

Sérum 50 µl de S + 50 µl de S - 50µL d’eau physiologique

50 µl de sérum 

inconnu.

Antigène VDRL

    16µl

   16µl

   16µl

   16µl

 Placer sur un plateau rotatif (agitateur de kline) pendant 8 minutes.

Lecture  +  -  -  

Comment lire les résultats ?

Agglutination : +++             

Agglutination : ++

Agglutination : +

Pas d‘agglutination (Poussière de charbon diluée ) 

Lorsque la réaction qualitative est positive on réalise la même réaction avec une série de dilution du sérum au (1/2, 1/4, 1/8, 1/16,1/32…) avec de l’eau physiologique.

Le titre d’anticorps est exprimé par l’inverse de la dernière dilution donnant une réaction positive nette.

Réaction quantitative

Manipulations pour le test quantitatif  Puits

1 2 3 4 5

Eau physiologique 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl

Dilution   1 / 2 

1 / 4 1 / 8  1 / 16  1 / 32

Sérum à analyser

En µl

50reporter

50reporter

50  reporter

50  reporter

50jeter 50µl dans l’eau de Javel

Ag VDRL  

16µl  

16µl  

16µl  

16µl  

16µl

 agitation pendant 8 minutes.

Lecture          

Réaction à antigène tréponémique :(TPHA:Treponema pallidum hemagglutination assay)

Principe: Réaction d’hemmagglutination passive réalisée sur des

microplaques.

L’Antigène utilisé est un lysat de tréponema pallidum adsorbé sur des hématies.

Le dépistage consiste à tester le serum à la dilution de 1/80.

Des dilutions sont effectuées pour le titre dans le cas du dépistage positif.

Matériel et Méthode

Eléments de la réaction

Sérum frais

Coffret de réactif prêt à l’emploi(TPHA)

Matériel :

Centrifugeuse Micropipette réglable (5 -50 µL),( 50 – 200 µL) Pipette multicanaux Plaque de microtitration à fond en U Cônes pour micropipettes

Portoir pour tubes à hémolyse Container de déchets contaminés Eau de javel

Mode opératoire

Réaction qualitative Réaction quantitative ( dépistage) (dépistage positif)

Deux types de réactions

Réaction qualitative

Distribuer le diluant dans les puits de microtitration comme suit : 1ér, 3ème, et 4ème puits: 25 µl. 2ème puit : 100 µl.

Ajouter 25 µl du sérum à tester dans le puit numéro 1.

Diluer l’échantillon 1/20.

Ajouter 75 µl de la suspension d’HNS au puit 3, et le même volume de suspension d’HS au puit La dilution finale des puits 3 et 4 est 1/80.

Couvrir la microplaque et laisser reposer pendant 45 à 60 min.

Effectuer la lecture à l’œil nu.

Schéma illustrant le mode opératoire du test TPHA

Réaction qualitative

Comment lire les résultats ?

Puit 1 : voile uniforme couvrant tout le puit → Fortement positif.Puit 2 : voile couvrant le 2/3 du puit → Moyennement positif.Puit 3 : voile couvrant le 1/3 du puit → Faiblement positifs.Puit 4 : Anneau très serré à bord nets (absence de voile) → Négatif.

Sérum n° 1

Réaction quantitative

Lorsque la réaction qualitative est positive (1/80) on réalise une série de dilution du sérum (1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280, 1/2560…)

Le titre d’anticorps est exprimé par l’inverse de la plus haute dilution donnant encore une réaction positive

Serum n° 1 :

Cupule

A B C D E F G H

Tampon en  µl

  25 25 25 25 25 25 25

Sérum 1/20  en 

µl25 25 * * * * * * **

HS  en  µl

75 75 75 75 75 75 75 75

Dilution 1 / 80 1 / 160 1 / 320 1 / 640 1 / 1280 1 / 2560 1 / 5120 1 / 10240

Lecture + + + + + - - -

Titre retenu 1280 ( dernière cupule présentant une hémagglutination nette ).                      * :   reporter 25 µl dans la cupule suivante à gauche.                     **:   jeter 25 µl dans l'eau de javel.

INTERPRETATION DES RESULTATS

VDRL TPHADiagnostic probable

Examens complémentaires

- -Syphilis exclue ou contamination très récente

refaire une sérologie dix à quinze jours plus tard

+ +Forte probabilité de syphilis

Situer le stade de l’infection par une sérologie quantitative

- +Syphilis récente traitée ou ancienne (traitée ou non traitée)

Une sérologie quantitative,

+ -Il faut confirmer le TPHA négatif par une autre réaction (FTA)

Si cette réaction est négative, il s’agit d’un faux positif en VDRL

AVANTAGES INCONVENIENTS 

Recherche d'antigènes cardio-lipidiques par agglutination (VDRL)

sensibilité bonne spécificité moyenne

facile et peu coûteux lecture subjective ("à l'œil")

Bon marqueur de suivi de l’ efficacité thérapeutique

Présence de faux négatifs (phénomène de zone) et de faux positifs ( infections virales parasitaires ou bactériennes; grossesse; maladie auto-immune…..)

Dans ce cas le TPHA et le FTA sont généralement négatifs

Tréponema Pallidum Haemaglutination Assay (TPHA) (hématies sensibilisées avec de l'antigène tréponémique)

spécificité excellente Présence de faux négatif en excès d’anticorps ( phénomène de zone )

simplicité de mise en oeuvre Rare faux positifs (positivité faible) notamment chez la femme enceinte ou lors de maladies auto-immunes

Test onéreux, adaptable à de grandes comme à de petites séries

Cinétique de la réaction sérologique dans la syphilis non traitée :

Les anticorps détectables par les réactions d’immunofluorescence FTA-abs et le TPHA sont les premiers à apparaître quelques jours après l’apparition du chancre (25 à 30 après contamination).

Le VDRL se positive les jours suivants (30 à40 jours après contamination)

Les anticorps atteignent les titres les plus élevés, à la fin de la période secondaire après 6 à 18 mois d’évolution.

Un déclin progressif des titres des anticorps un à deux ans après contamination est détectable à la phase latente. Le VDRL peut se négativer alors que les réactions tréponémiques restent positives.

A la phase de syphilis tertiaire, lors des manifestations viscérales ou cutanées tardives, les anticorps tréponémiques sont détectés à des taux variables, avec un VDRL pouvant être négatif dans 50% des cas. La recherche des anticorps au niveau du LCR peut s’imposer.

Evolution des anticorps : syphilis non traitée

Traitement précoce :En cas de traitement dés les premiers jours d’apparition du chancre, la sérologie sera négative et le demeurera.Au stade de syphilis primaire un traitement efficace entraînera une baisse rapide du taux des anticorps et leur disparition dans un délai de 3 à 6 mois.

Traitement au stade secondaire précoce (3 à 6 mois)Une négativation de toutes les réactions est encore possible La première à se négativer sera le VDRL

Traitement au stade secondaire tardive (1 an d’évolution) ou au stade latent :+VDRL peut se négativer (1 cas sur 2)+TPHA et FTA restent positifs.

Traitement au stade tardif symptomatique :Les réactions sérologiques sont peu ou pas influencées par le traitement.

Cinétique de la réaction sérologique dans la syphilis traitée :

Evolution des anticorps selon le moment du traitement

ALGORITHME POUR LE DIGNOSTIC DE LA SYPHILIS

Conclusion

Le dépistage syphilitique repose sur la combinaison VDRL-TPHA en raison de:

La grande efficacité pour la détection de T. Pallidum et l’exclusion de toute autre forme d’infection tréponémique.

la lecture des résultats peut s’effectuer après une durée courte de la réalisation des tests.

Ce sont les meilleurs tests pour effectuer un dépistage de routine

Pour poser le diagnostic, un bilan sérologique complet est conseillé afin

de mieux situer l’ancienté de l’infection, surtout en l’absence de signes cliniques.