Techniques Techniques immunologiquesimmunologiques

par Mme Boumendjel Messarah A.par Mme Boumendjel Messarah A.Année 2008/2009Année 2008/2009

Université Badji Mokhtar (Annaba)Université Badji Mokhtar (Annaba)Cours de techniques immunologiquesCours de techniques immunologiques

Cytométrie en fluxCytométrie en flux

Exemple d’application de la Exemple d’application de la cytométrie en flux: Etude de cytométrie en flux: Etude de l’expression du récepteur de l’expression du récepteur de l’IL-27 sur les lymphocytes Bl’IL-27 sur les lymphocytes B

BBBB

Cellules B spléniques CD19+ (naïves et mémoires)Cellules B ombilicales naïves

CD19+CD27-

Obtention des Lymphocytes B humains

A partir de fragments de ratePar Sélection positive (Microbeads, MACS)

et tri magnétique préparatif (Miltenyi Biotech)

A partir du sang de cordon Par Déplétion négative (Rosettesep, StemCell)

Marquage magnétique (30 min)

Séparation magnétique

Elution des cellules marquées

Ajout du cocktail RosettessepAc anti-CD2, CD3, CD16, CD36, CD56 et CD66b

couplés à des anticorps anti-glycophorine A

Formation d’immunorosettes

Collecte des cellules à l’interface Plasma/Ficoll

Mise en culture des cellules B naïves ou mémoires

BBBB

BBBB Anti-CD40

IL-27, IL-21, IL-4

Après 4 jours

Incorporation de la H3-thymidine

Mesure de la radioactivité incorporée par l’ADN cellulaire

Après 12 jours

Dosage ELISA: - IgE

- isotypes d’IgG

Récupérer les surnageants de culture

Mise en culture dans du milieu YSSEL

(10% SVF)

BB

BB BBBB BBBB BB

5% CO2 à 37°C

Détermination de la réponse proliférative Production d’IgE et d’IgG

Analyse de l’expression de l’IL-27R et des différents autres marqueurs membranaires

BB

Marquage direct ou indirect par immunofluorescence simple, double ou triple

En utilisant des Ac couplés aux fluorochromes (FITC, PE ou APC)

Passage au cytomètre (FACSCan BD) et/ou Tri cellulaire (FACS Vantage BD)

et enfin analyse par le logiciel Cell Quest

BB

BBBB

Expression des sous unités (TCCR et gp130) du récepteur de l’IL-27 sur les cellules B

Cellules B naïves (CD19+CD27-) du sang de cordon

Cellules B naïves (CD27-) de la rate

Cellules B mémoires (CD27+) de la rate

Selon la littérature (Larousserie et al., 2006) :les 2 sous unités de l’IL-27R sont constitutivement exprimées

Sur les Lc B d’amygdales humains naïfs et mémoires