Techniques immunologiques par Mme Boumendjel Messarah A. Ann©e 2008/2009 Universit© Badji Mokhtar (Annaba) Cours de techniques immunologiques

  • View
    262

  • Download
    53

Embed Size (px)

Text of Techniques immunologiques par Mme Boumendjel Messarah A. Ann©e 2008/2009 Universit© Badji...

  • Page 1
  • Techniques immunologiques par Mme Boumendjel Messarah A. Anne 2008/2009 Universit Badji Mokhtar (Annaba) Cours de techniques immunologiques
  • Page 2
  • Cytomtrie en flux
  • Page 3
  • Exemple dapplication de la cytomtrie en flux: Etude de lexpression du rcepteur de lIL-27 sur les lymphocytes B
  • Page 4
  • Cellules B splniques CD19+ (naves et mmoires) Cellules B ombilicales naves CD19+CD27- Obtention des Lymphocytes B humains A partir de fragments de rate Par Slection positive (Microbeads, MACS) et tri magntique prparatif (Miltenyi Biotech) A partir du sang de cordon Par Dpltion ngative (Rosettesep, StemCell) Marquage magntique (30 min) Sparation magntique Elution des cellules marques Ajout du cocktail Rosettessep Ac anti-CD2, CD3, CD16, CD36, CD56 et CD66b coupls des anticorps anti-glycophorine A Formation dimmunorosettes Collecte des cellules linterface Plasma/Ficoll
  • Page 5
  • Mise en culture des cellules B naves ou mmoires Anti-CD40 IL-27, IL-21, IL-4 Aprs 4 jours Incorporation de la H3-thymidine Mesure de la radioactivit incorpore par lADN cellulaire Aprs 12 jours Dosage ELISA: - IgE - isotypes dIgG Rcuprer les surnageants de culture Mise en culture dans du milieu YSSEL (10% SVF) 5% CO 2 37C Dtermination de la rponse prolifrativeProduction dIgE et dIgG
  • Page 6
  • Analyse de lexpression de lIL-27R et des diffrents autres marqueurs membranaires Marquage direct ou indirect par immunofluorescence simple, double ou triple En utilisant des Ac coupls aux fluorochromes (FITC, PE ou APC) Passage au cytomtre (FACSCan BD) et/ou Tri cellulaire (FACS Vantage BD) et enfin analyse par le logiciel Cell Quest
  • Page 7
  • Expression des sous units (TCCR et gp130) du rcepteur de lIL-27 sur les cellules B Cellules B naves (CD19+CD27-) du sang de cordon Cellules B naves (CD27-) de la rate Cellules B mmoires (CD27+) de la rate Selon la littrature (Larousserie et al., 2006) : les 2 sous units de lIL-27R sont constitutivement exprimes Sur les Lc B damygdales humains nafs et mmoires

View more >