THÈSE - thesesupsthesesups.ups-tlse.fr/734/1/Enriquez_Jonathan.pdf · myotome l’abdomen et du diaphragme) sclérotome Notochorde Tube neural Ganglion dorsal Figure 1. Origine des

TTHHÈÈSSEE

En vue de l'obtention du

DDOOCCTTOORRAATT DDEE LL’’UUNNIIVVEERRSSIITTÉÉ DDEE TTOOUULLOOUUSSEE

Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier

Discipline ou spécialité : Biologie moléculaire, cellulaire et du Développement

JURY

Professeur Cathy Soula, Président Dr. Christophe Jagla, rapporteur

Dr. François Schweisguth , rapporteur Dr. Stéphane Zaffran, rapporteur

Dr. Alain Vincent, directeur de thèse

Ecole doctorale : Biologie Santé Biotechnologie

Unité de recherche : Centre de Biologie du Développement, UMR5547 Directeur de Thèse : Dr. Alain Vincent

Présentée et soutenue par Jonathan Enriquez

Le 18 décembre 2009

Contrôle transcriptionnel de l’identité musculaire chez la Drosophile

1

2

Remerciements Je tiens à remercier Michèle Crozatier et Alain Vincent pour m’avoir accueilli dans leur équipe. Alain, t’avoir eu comme directeur de thèse a été un plaisir de chaque jour, merci d’avoir été présent à chaque instant. J’espère garder toute au long de ma carrière la même soif de découverte, insatiable et indéfectible, qui t’anime. J’ai souvent douté de vouloir continuer la recherche, aujourd’hui je ne doute plus et c’est grâce à toi. Mes sincères remerciements à Cathy Soula, Christophe Jagla, François Schweisguth et Stéphane Zaffran pour avoir jugé mes travaux. Merci à Laurence pour m’avoir enseigné de nombreuses techniques et surtout merci pour ton amitié. Merci aux membres de l’équipe, Rami, Joanna, Delphine, Hadi, Mathilde, Justine, Baya et Jean-Louis. Merci pour vos films, que de beaux souvenir passés avec vous dans et hors du labo. Merci aux baleines, Emilie, Alex, Nico et Rami !!!! Rami, comme tu dis il y a des rencontres qu’on n’oublie pas… merci à vous quatre pour tous ces moments. Alex, je t’attends à NY pour continuer… Gaelle espero verte pronto para bailar, una cerveza en la mano! Antoine, à ce soir. Merci à nos voisins, l’équipe Cribbs/Bourbon. Mumu, Coco et Christian, vous allez me manquer, c’est fou comme on s’attache aux gens… Merci à mon tuteur de thèse Bruno, merci pour tes judicieux conseils, ton humour et ton amitié. Merci a tout le CBD !! On a souvent l’habitude de le critiquer, surtout en ce moment… Mais il reste un endroit où il est agréable d’y travailler. Merci Constance pour ton soutien. A mon père, Juan Enriquez.

3

4

Résumé Le patron musculaire qui se met en place au cours du développement embryonnaire permet l’ensemble des mouvements coordonnés propres à chaque espèce animale. Un muscle est formé de fibres musculaires issues de la fusion et de la différenciation de cellules immatures, les myoblastes, un processus appelé myogenèse. Chaque muscle du corps joue un rôle unique, conféré par une «identité» propre: position, forme, taille, sites d’attachement au squelette et innervation. Si le contrôle transcriptionnel de la myogenèse commence à être bien compris, les mécanismes conférant à chaque muscle son identité restent largement inconnus. La majorité de nos connaissances actuelles proviennent d’études réalisées sur la formation des muscles dans l’embryon d’un organisme modèle, la drosophile. L’hypothèse admise est que l’identité musculaire reflète l’expression d’une combinatoire spécifique de facteurs de transcription (FT) dans chaque myoblaste «fondateur» d’un muscle. Notre laboratoire a précédemment montré que le facteur de transcription Collier apparenté aux EBF (Early-B Cell Factor) humains, est exprimé dans un unique myoblaste fondateur, à l’origine d’un des 30 muscles présents dans chaque segment de l’embryon, le muscle DA3, faisant de ce muscle un modèle d’étude de l’identité musculaire. Au cours de ma thèse j’ai contribué à montrer que la formation du muscle DA3 dépend de l’activité combinée de Collier et Nautilus, protéine b-HLH de drosophile apparentée aux facteurs myogéniques mammifères, Myo-D, Myf-5, Myogenin et MRF4. L’analyse de mutants perte-de-fonction nautilus et collier m’a permis de montrer que chacun de ces gènes contrôlent des propriétés différentes du muscle DA3. La mise en évidence d’une régulation croisée entre ces deux gènes montre en outre une expression coordonnée dans le myoblaste fondateur à l’origine du muscle DA3. Ces travaux sur le muscle DA3 sont la première confirmation du contrôle de l’identité musculaire par des combinaisons de facteurs de transcription exprimés dans le myoblaste fondateur, une hypothèse émise il y a presque 20 ans. Dans une deuxième étape, j’ai abordé le rôle des gènes homéotiques (Hox) dans le contrôle de la diversité des muscles le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon. Le muscle DA3 représente un bon modèle d’étude, puisqu’absent dans le premier des trois segments thoraciques et de plus grande taille dans les segments abdominaux. Par des expériences de gain-de-fonction et perte-de-fonction, j’ai montré que les protéines Hox contrôlent l’expression des FT d’identité musculaire dans les cellules progénitrices à l’origine des myoblastes fondateurs. Ce contrôle, spécifique du segment, met en jeu des modules cis-régulateurs du gène collier qui sont activés différentiellement par différentes protéines Hox. J’ai ensuite montré que les protéines Hox régulent aussi le nombre de noyaux incorporés dans la fibre musculaire DA3 et sont donc responsables de la variation de taille de ce muscle, le long de l’axe corps. L’ensemble de mes travaux de thèse m’a permis de proposer un modèle pour l’histoire transcriptionnelle du muscle DA3. Ce modèle met en lumière le rôle décisif des protéines Hox dans la genèse de la diversité des muscles squelettiques de la drosophile et offre de nouvelles perspectives pour l’étude des fonctions des gènes Hox au cours de la myogenèse des Vertébrés.

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8

Sommaire

Introduction

A/ Myogenèse et origine des muscles squelettiques chez les vertébrés. (Page 13) I/ Description Générale (Page 13) 1. Origines des muscles du tronc

2. Origines des muscles des membres 3. Origines des muscles de la tête 4. Régulation moléculaire de la myogenèse

II/ Formation des muscles du tronc (Page 15) 1. Description tissulaire et cellulaire

2. Description moléculaire 2.1 Induction de l’expression des MRF par les tissus environnants

2.1.1 Induction de l’expression des MRFs chez le poulet 2.1.2 Induction des MRFs Chez la souris

• La voie Shh

• La voie Wnt 2.1.3 Inhibiteurs de la myogenèse

2.2 Le cœur transcriptionnel de la myogenèse 2.2.1 Les régulateurs positifs

2.2.2 Les régulateurs négatifs 2.3 Le rôle hiérarchique des MRFs 2.4 Elongation des myocytes 2.5 Description moléculaire de la formation des tendons

III/ Formation des muscles des membres (Page 35) 1. Description tissulaire et cellulaire

2. Description moléculaire 2.1 Délamination 2.2 Migration 2.3 Prolifération et différentiation

IV. Formation des muscles de la face (Page 41)

6

1. Description tissulaire et cellulaire 2. Description moléculaire

B/ Myogenèse des muscles squelettiques chez la Drosophile (Page 43)

I/Description Générale (Page 43) 1. Définition des muscles somatiques

2. Origines des muscles somatiques 3. Régulation moléculaire de la myogenèse

II/ Formation des muscles somatiques : description tissulaire, cellulaire et moléculaire (Page 45) 1. Induction de la myogenèse 2. Le corps transcriptionnel de la myogenèse 3. Les différentes étapes de la formation des muscles somatiques

3.1 Découverte de la cellule fondatrice 3.2 Origine de la cellule fondatrice : le cluster et le progéniteur

musculaire. 3.3 Formation des cellules fondatrices : division asymétrique. 3.4 Fusion des cellules fondatrices avec les myoblastes naïfs

3.4.1 Description générale 3.4.2 Reconnaissance Myoblaste naïf/cellule fondatrice. 3.4.3 Transduction du signal

3.5 Elongation et attachement des fibres musculaire à l’épiderme 3.5.1 Attachement apodème/muscle 3.5.2 Communication apodèmes –muscle

III/ L’identité Musculaire (Page 63) 1. L’identité intra-segmentaire

1.1 Apterous et l’hypothèse de la combinatoire de facteurs de transcription

1.2 Les interactions cross-répressives

• Msh

• Slouch (S59) 1.3 Les facteurs identitaires et la division asymétrique : Krüppel 1.4 La mise en place de la combinatoire : Even skipped 1.5 Les cibles de la combinatoire : Lady Bird

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1.6 Conclusion sur l’identité intra-segmentaire

2. L’identité inter-segmentaire 2.1 Généralités sur les gènes homéotiques 2.2 Organisation génomique 2.3 Les cibles des gènes Hox 2.3.1 Les gènes Hox et la formation des appendices 2.3.2 Les gènes Hox et la commissure maxillaire/labial 2.3.3 Les gènes Hox et le spiracle postérieur 2.4 Les protéines homéotiques et l’identité intra-segmentaire

Résultats A/ L’identité intra-segmentaire du muscle DA3 ; Rôles respectifs des facteurs de transcription Nautilus et Collier (Page 95) Article I: collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity. Laurence Dubois, Jonathan Enriquez, Virginie Daburon, Fabien

Crozet, Gaelle Lebreton, Michèle Crozatier and Alain Vincent. Development 2007

Article II: Specification of muscle identity in Drosophila: Combined activity of the Col/EBF and D-MyoD transcription factors. Jonathan Enriquez, Mathilde de Taffin,

Michèle Crozatier, Alain Vincent and Laurence Dubois. In preparation.

B/ L’identité inter-segmentaire du muscle DA3(3) ; Le rôle des gènes homéotiques (Page 133) Article III: Multi-step Control of Muscle Diversity by Hox Proteins in the Drosophila Embryo. Jonathan Enriquez, Hadi Boukhatmi, Laurence Dubois, Anthony A. Philippakis,

Martha L. Bulyk, Alan M. Michelson, Michèle Crozatier and Alain Vincent1. has been just

accepted to developpement.

Perspectives à court et moyen terme A/ La régulation transcriptionnelle de collier (Page 155)

B/ Les cibles de la combinatoire Col/Nau dans le muscle DA3 (Page 157)

Discussion générale

Somite épithélial

Mésoderme présomitique

syndétome

Dermomyotome épaxial (origine les muscles du dos)

Dermomyotome hypaxial(origine des muscles de l’abdomen et du diaphragme) myotome

sclérotome

Notochorde

Tube

neural

Ganglion dorsal

Figure 1. Origine des muscles, des tendons et des os du tronc chez les vertébrés. (A) coupe transversale d’un embryon de poulet après la formation des somites. (B) Représentation schématique de l’origine du système musculaire axial. Le mésoderme présomitique se segmente en somites épithéliaux qui se subdivisent en quatre compartiments: le dermomyotome (rouge) le myotome (orange), le sclérotome (jaune), le syndétome (vert). Les muscles du tronc sont issus du myotome qui est lui même dérivé du dermomyotome.

A

B

Ectoderme dorsal

Tube neural

SomatopleureSplanchnopleure

Somite CoelomeMésoderme intermédiaire

Developmental Biology Sixth Edition, Scott F. Gilbert

Adapté de Skeletal muscle formation in vertebrates, Margaret Burckingham, 2001.

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Introduction

A/ Myogenèse et origine des muscles squelettiques chez les vertébrés. I/ Description Générale

1. Origines des muscles du tronc Le mésoderme pré-somitique situé de part et d’autre du tube neural se segmente le

long de l’axe antéropostérieur (A/P) en des structures épithéliales appelées somites. Les

somites épithéliaux, premières structures métamérisées du mésoderme para-axial, se

différencient en réponse aux signaux reçus de leur environnement tissulaire en une structure

ventrale, le sclérotome et une structure dorsale, le dermomyotome. Le sclérotome est à

l’origine du squelette du tronc et le dermomyotome est à l’origine du derme et du myotome

qui donne naissance à la musculature du tronc (Christ and Ordahl 1995; Gossler and Hrabe

de Angelis 1998). Récemment, un quatrième compartiment somitique a été décrit comme

étant à l’origine des tendons des muscles du tronc, le syndetome (du grecque syndesis : lié

ensemble). Cette structure dérive du sclérotome et se situe entre deux dermomyotomes

adjacents (Brent, Schweitzer et al. 2003) (Figures 1 et 4).

2. Origines des muscles des membres Les précurseurs musculaires des membres proviennent de la partie hypapaxiale

(partie latéro-ventrale) du dermomyotome et migrent ensuite vers les bourgeons des

membres. En ce qui concerne les os et les tendons des membres, ils ont pour origine le

mésenchyme des membres qui dérive de la somatopleure (feuillet externe des lames

latérales) (Chevallier, Kieny et al. 1977; Kieny, Mauger et al. 1979; Ordahl and Le Douarin

1992) (figures 2 et 4).

3. Origines des muscles de la tête Comme les précurseurs musculaires des membres, les précurseurs musculaires de

la langue et du larynx dérivent de la partie hypaxiale du dermomyotome. Les précurseurs

des autres muscles de la tête sont issus du mésoderme paraxial non segmenté. Ces

13

Figure 2. Origine des muscles, des tendons et des os des membres chez les vertébrés. Représentation schématique de l’origine du système musculaire appendiculaire. Les précurseurs musculaires des membres (rouge), dérivent du dermomyotome hypaxial et migrent vers les bourgeons des membres. Les systèmes osseux et tendineux dérivent de la somatopleure (feuillet externe des lames latérales) (bleu).

syndetome

Dermomyotome épaxial Ganglion dorsal

Dermomyotome hypaxial

SomatopleureSplanchnopleure

Précurseurs musculaire des membres

Précurseurs des tendons

et des os des membres

Notochorde

Tube

neural

Bourgeons des membres

Figure 3. Origine des muscles de la tête chez le poulet. Représentation schématique de l’origine des muscles de la tête qui ont une double origine: les somites et le mésoderme paraxial non segmenté.

Noden, D. M. and P. A. Trainor (2005). "Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations." J Anat 207(5): 575-601.Arcs Branchiaux

Territoire oculaire

Somites Mésoderme paraxial non segmenté

14

précurseurs migrent vers les trois arcs branchiaux, pour former les muscles de la tête et

vers les territoires oculaires pour former les muscles des yeux (Noden 1983; Noden 1983;

Noden 1986; Trainor, McLachlan et al. 1995; Graham, Koentges et al. 1996). Le squelette de

la tête est issu des crêtes neurales et du mésoderme non segmenté et les tendons dérivent

des crêtes neurales (Noden and Trainor 2005; Noden and Schneider 2006) (figures 3 et 4).

4. Régulation moléculaire de la myogenèse La myogenèse des vertébrés est sous le contrôle de quatre facteurs de transcription

dits myogéniques (MRFs : Myogenic Regulatory Factors) et faisant partie de la famille des

facteurs de transcription bHLH (basic Helix-Loop-Helix). Les MRFs sont capables d’induire in

vitro la myogenèse à partir de cellules indifférenciées. Ces facteurs de transcription sont

MyoD, le premier à avoir été découvert (Davis, Weintraub et al. 1987), Myf5 (Braun,

Buschhausen-Denker et al. 1989), Myogénine (Edmondson and Olson 1989) et Mrf4

(Rhodes and Konieczny 1989; Braun, Bober et al. 1990; Miner and Wold 1990). Au niveau

du tronc, la myogenèse des vertébrés est initiée par l’activation de l’expression des MRFs

MyoD et Myf5 en réponse aux signaux issus des tissus environnant. L’ectoderme dorsal et

la partie dorsale du tube neural sécrètent les molécules Wnts (Wingless type) et la plaque du

plancher (partie ventrale du tube neural) sécréte Shh (Sonic Hedgehog). Pour les muscles

des membres, l’induction des MRFs dépend de signaux provenant de l’ectoderme du

bourgeon des membres. Enfin, à ce jour aucune étude n’a été faite sur l’activation de la

myogenèse des muscles de la tête par des tissus environnants.

II/ Formation des muscles du tronc

1. Description tissulaire et cellulaire. La myogenèse prénatale se déroule en deux étapes, embryonnaire (myogenèse

primaire) et fœtale (myogenèse secondaire).

Lors de la myogenèse primaire, les myoblastes délaminent du dermomyotome pour

former le myotome. Les myoblastes qui délaminent de la partie épaxiale du dermomyotome

(partie médio-dorsale) sont à l’origine des muscles du dos, et les myoblastes qui délaminent

de la partie hypaxiale du dermomyotome (partie latéro-dorsale) donnent les muscles de la

ceinture abdominale. La partie hypaxiale du dermomyotome est également à l’origine des

précurseurs musculaires du diaphragme. Après le processus de délamination, les

myoblastes s’étendent selon l’axe A/P sur toute la longueur du somite et forment une fibre

mononucléée, le myocyte ou myotube, qui se lie au squelette axial par l’intermédiaire des

tendons (jour 8.5 chez la souris) (Biressi, Molinaro et al. 2007). Entre les jours 10.5 et 12.5

15

16

Figure 4. Origines des muscles squelettiques, des tendons et des os chez les vertébrés.

Muscles du tronc

et del’abdomen

Tendons du tronc

Osdu tronc

Muscles des

membres

Tendons des

membres

Osdes

membres

Muscles de la tête

Tendons de la tête

Osde la tête

tronc têtemembres

Dermomyotome hypaxial

Dermomyotome épaxial

Myotome hypaxial

Myotome épaxial

Précurseur musculaire

des membres

Mésoderme axial non segmenté

sclérotome syndétome somatopleure

Mésenchyme des membres

Crêtes neurales

Précurseur musculaire

du lanrynx et de la langue

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Figure 5. Les différentes étapes de la formation des muscles. Représentation schématique de la formation des muscles chez les vertébrés. il existe deux vagues myogéniques chez les vertébrés qui son découplées dans le temps. La première vague met en en place les fibres primaires et la seconde vague met en place les fibres secondaires. Les chiffres indiqués au dessus de myogenèse primaire et secondaire représentent les stades de développement chez la souris.

Myoblastes Myocytes Fibres primaires Fibres primaires et secondaires

Myogenèse primaire Myogenèse secondaire

myoblastes myoblastes

9 12 14.5 17.5

Wnt1, Wnt3a

Wnt7a

Shh

Myf5 MyoD

Tube

Neural dorsal

Plaque du plancher Et notochorde

Ectoderme dorsal

Figure 6. Induction de MyoD et Myf5 par Shh et Wnts. Représentation schématique de l’induction de la myogenèse chez les vertébrés. Trois centres organisateurs induisent la myogenèse, le tube neural dorsal, l’ectoderme dorsal et la plaque du plancher. Ces centres organisateurs via leurs morphogènes Wnts ou Shh induisent l’expression de myf5 et de myoD dans le dermomyotome.

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chez la souris des myoblastes embryonnaires vont envahir le myotome et fusionner avec les

myocytes pour former les fibres dites primaires (Kelly and Zacks 1969). Ensuite, entre les

jours 14.5 et 17.5, une seconde vague de myogenèse va débuter, les myoblastes fœtaux

fusionnent entre eux pour donner des fibres dites secondaires (Duxson and Usson 1989;

Duxson, Usson et al. 1989) mais également avec les fibres primaires qui sont

morphologiquement plus grosses (Duxson, Usson et al. 1989), (Dunglison, Scotting et al.

1999), (Evans, Baillie et al. 1994)) (Figure 5). Les fibres primaires forment les muscles lents

et les fibres secondaires forment les muscles rapides (Zhang and McLennan 1998; Wigmore

and Evans 2002) (figure 5). Après la naissance, des cellules appelées cellules satellites

(Mauro 1961), situées sous la lame basale en périphérie des muscles, sont dans un état de

quiescence cellulaire et peuvent être activées pour reconstituer des fibres lors de dommages

musculaires. Ces cellules jouent également un rôle dans la croissance des muscles après la

naissance (Seale and Rudnicki 2000) (Collins, Olsen et al. 2005) (Montarras, Morgan et al.

2005).

2. Description moléculaire

2.1 Induction de l’expression des MRF par les tissus environnants La formation des muscles du tronc des vertébrés commence par l’induction des

MRFs par des signaux positifs en provenance des tissus environnants. L’ectoderme en

surface et la partie dorsale du tube neural sécrètent les molécules Wnts alors que la plaque

du plancher (partie ventral du tube neural) sécrète Shh. Ces deux morphogènes vont induire

l’expression des MRFs entrainant ainsi la délamination, la spécification et la différenciation

des myoblastes (figure 6).

2.1.1 Induction de l’expression des MRFs chez le poulet

L’utilisation de l’embryon de poulet comme outil expérimental a permis d’élucider la

question de l’induction de la myogenèse chez les vertébrés. Il a été montré en 1992 que le

tube neural et la notochorde étaient des inducteurs de la myogenèse des muscles

squelettiques du tronc (Rong, Teillet et al. 1992)

Dans une remarquable étude, A.E Munsterber a montré que les molécules Wnts

pouvaient mimer l’effet inducteur de la partie dorsale du tube neural et que Shh pouvait

mimer l’effet inducteur de la plaque du plancher et de la notochorde (Munsterberg, Kitajewski

et al. 1995; Munsterberg and Lassar 1995). Ces conclusions ont été tirées d’expériences sur

des cultures du Mésoderme Pré-Somique (MPS) sur des gels de collagène. Lorsqu’on

cultive le MPS en présence du tube neural complet et de la notochorde, on induit

l’expression du MRF MyoD et des marqueurs de différenciation comme la Myosine.

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Plaque du plancher

Notochorde


Dermomyotome

hypaxial

PtcSmo

Myf5 MyoD

Gli

A B

Figure 7. Induction de l’expression des MRFs. (A-B) Induction de Myf5 par Shh. (A) représentation schématique de l’induction de la myogenèse par Shh qui est sécrété par la notochorde et la plaque du plancher (Violet). (B) représentation du contrôle direct de l’expression de myf5 par Gli, effecteur de la voix Shh. (C-D) Induction de Myf5 et MyoD par le molécules Wnts. (C) représentation schématique de l’induction de la myogenèse par les molécules Wnts qui sont sécrétées par la partie dorsale du tube neural et l’ectoderme dorsal (bleu). (D) représentation du contrôle direct de l’expression de myf5 par TCF, effecteur de la voie Wnt.

Shh

Shh

Cellule du dermomyotome

Tube

Neural

dorsal

Ectoderme dorsal


Wnt1, Wnt3a

Wnt7a

Dermomyotome

hypaxial

Myf5 MyoD

FzDsh

GSK-3APCB-caténine

B-caténineTCF

Wnt1, Wnt3a

C D

Wnt7a

Fzb

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Lorsqu’on cultive le MPS avec uniquement le tube neural après résection de la plaque du

plancher on n’induit pas l’expression des marqueurs myogéniques. A l’opposé, si dans la

culture on rajoute Shh soluble ou des bactéries exprimant Shh, on induit la myogenèse. De

même lorsque l’on cultive le MSP avec à la fois du Shh soluble et des fibroblastes exprimant

Wnt1, 3 ou 4, on induit l’expression des marqueurs myogéniques. Ces résultats ont montré

chez le poulet que les molécules Wnt1, 3 ou 4 et Shh pouvaient se substituer

respectivement au rôle inducteur de la partie dorsale du tube neural et de la plaque du

plancher+notochorde.

Quelques années plus tard la validation in vivo a été faite. Une diminution de

l’expression de Shh par l’intermédiaire d’ARNs anti-sens a pour conséquence une diminution

de l’expression de myoD (Borycki, Mendham et al. 1998). Des transplantations de cellules

surexprimant wnt1 ou 3 ont montré une augmentation du territoire d’expression de MyoD et

de Pax3 (Paired box), un facteur de transcription dont nous verrons le rôle plus tard dans la

myogenèse (Wagner, Schmidt et al. 2000). Il a également été montré que l’ectoderme dorsal

est aussi un inducteur positif de la myogenèse par l’intermédiaire de la sécrétion de Wnt4.

Ainsi des transplantations de cellules surexprimant Wnt 4, augmentent le territoire

d’expression de MyoD et Pax3 (Wagner, Schmidt et al. 2000).

2.1.2 Induction des MRFs chez la souris Les études génétiques chez la souris ont permis de préciser la zone d’action des

morphogènes Wnts et Shh. Shh sécrété par la plaque du plancher et Wnt1, 3a sécrétés par

le tube neural régulent Myf5. D’autre part, Wnt7a sécrété par l’ectoderme dorsal régule

MyoD (figure 6).

• La voie Shh Dans des souris mutantes pour shh on observe une diminution de l’expression de

Myf5 au niveau épaxial du somite entrainant une perte des muscles épaxiaux, les muscles

hypaxiaux n’étant pas affectés. L’expression de myoD est également affectée dans un

mutant shh. Sachant que MyoD est une cible de Myf5 (Tajbakhsh, Rocancourt et al. 1997),

une étude a été réalisée afin de discerner une régulation directe par Shh d’une régulation par

l’intermédiaire de Myf5. Alors que des molécules de Shh solubles ou des explants de

notochorde induisent l’expression de MyoD dans des explants de MPS issus d’une souris

sauvage, aucun effet sur la régulation de MyoD dans des explants de MPS issus d’une

souris myf5 mutante n’est observé. Ces données montrent que Shh régule myoD par

l’intermédiaire de Myf5 (Borycki, Brunk et al. 1999) (Fig 7A).

Enfin Shh semble réguler directement l’expression de myf5 via ses effecteurs Gli. Un

module régulateur de 651 paires de bases permet l’expression de Myf5 au niveau épaxial

21

22

(promoteur épaxial) (Tajbakhsh, Bober et al. 1996). L’activité de ce module régulateur est

dépendante du signal Shh; dans un mutant nul shh, l’activité de cet enhancer est perdue

(Gustafsson, Pan et al. 2002). Enfin il a été montré que Shh contrôle l’activité de cet

enhancer par une liaison directe de la protéine Gli2 (marcus k. gustafsson 2001) (Fig 7B).

La voi Shh régule donc la formation des muscles épaxiaux en contrôlant notamment

Myf5 de façon directe au niveau épaxial.

• La voie Wnt Des expériences similaires à celles faites chez le poulet ont montré que l’expression

de myf5 était induite par un signal provenant du tube neural et que l’expression de myoD

était induite par un signal provenant l’ectoderme dorsal (Cossu, Kelly et al. 1996). Des

Fibroblastes exprimant les molécules wnts induisent de façon différentielle l’expression de

myoD et myf5 dans des explants de MPS. Les molécules wnt7a, secrétées par l’ectoderme

dorsal d’une part et wnt1/wnt3a sécrétées par la partie dorsale du tube neural d’autre part,

régulent respectivement myoD et myf5 alors que les molécules wnt4a et 5a régulent à la fois

myoD et myf5 ((Tajbakhsh, Borello et al. 1998)) (Fig 7B). Enfin dans les mutant wnt1 et 3a

(sécrétées par tube dorsal) les muscles épaxiaux ne se forment pas dû notamment à une

diminution de l’expression de myf5 (Ikeya and Takada 1998).

Des somites issus d’une souris exprimant le gène rapporteur lacZ sous le contrôle du

promoteur épaxial de myf5 ont été mis en culture et infectés par un lentivirus exprimant une

forme constitutivement active de la B-cat. Le résultat est une très forte activation du gène

rapporteur. Le même résultat est obtenu si des explants de somites sont cultivés avec le

tube neural qui secrète les molécules wnts. Cette action inductrice du tube neural et des

molécules Wnt est par contre abolie lorsque les explants sont mutants pour la B-cat. L’action

des Wnts sécréte par le tube neural passe donc par la voie canonique. Par la suite, les

auteurs ont montré in vivo et in vitro que Lef-1/TCF, facteur de transcription en aval de la

voie Wnt,.régule directement l’enhancer épaxial de myf5. (Fig 7C).

Pour conclure, les études sur la souris ont montré que shh sécrété par la notochorde

et la plaque du plancher et Wnt1 et 3a sécrétés par la partie dorsale du tube neural

contrôlent l’expression de myf5 au niveau épaxial et que leurs effecteurs nucléaires se lient

directement au promoteur de myf. D’autre part, la molécule Wnt7a sécrétée par l’ectoderme

dorsal régule l’expression de myoD et les molécules Wnt4a et 5a régulent myoD et myf5

(Fig 7).

2.1.3 Inhibiteur de la myogenèse Chez la souris, Fzb1 (ou sFRP3) une forme soluble de Fz (Frizzled, recepteur de la

voie Wnt) est exprimé dans le MPS avant la myogenèse. L’ajout de fibroblastes exprimant

23

24

Fzb1 dans des cultures d’explants de MPS ou de somites exprimant myf5-lacZ entraine une

diminution de Myod et de LacZ. In vivo, des cellules exprimant Fzb1 ont été transplantées

dans le placenta. Les cellules restent dans le placenta et ls molécules Fzb diffusant dans

l’embryon via la circulation entrainent une diminution de la myogenèse (perte des marqueurs

MHC, Myod et Myf5) (Borello, Coletta et al. 1999). Chez le poulet, Fzb1 est exprimé dans le

myotome et sert probablement à titrer la signalisation wnt (Ladher, Church et al. 2000).

Les BMPs (Bone morphogenetic proteins) inhibent également la myogenèse

(Hirsinger, Duprez et al. 1997; Marcelle, Stark et al. 1997) et notamment BMP4 sécrété par

les lames latérales. L’activité de BMP4 est elle même antagonisée par Noogin secrétée par

la partie dorsale du tube neural et dont l’expression est induite par Wnt et Shh (Hirsinger,

Duprez et al. 1997) (Marcelle, Stark et al. 1997), (Borycki, Mendham et al. 1998). Alors que

des explants de MPS mis en présences des molécules Wnt et Shh expriment des marqueurs

myogéniques, cette expression est inhibée par BMP4 qui réduit l’expression de la B-cat, lef1

et Fz.

La signalisation Notch joue également un rôle dans l’inhibition de la myogenèse mais

les mécanismes par lesquels Notch agit restent encore à élucider. Il a été montré que Notch

exprimé dans le MPS inhibe la différenciation musculaire (Kopan, Nye et al. 1994), (Lindsell,

Shawber et al. 1995) et que que Notch intracellulaire (NIC) inhibe MyoD et Myf5 (Kopan, Nye

et al. 1994)). Il a également été montré que des allèles hypomorphes de Delta-like I et une

délétion conditionnelle de CLS (CBFI, suppressor of hairless, LagI, RBP-J) pouvait entrainer

une hypotrophie des muscles en raison d’une différentiation prématurée (Schuster-Gossler,

Cordes et al. 2007; Vasyutina, Lenhard et al. 2007). La surexpression d’une cible de Notch

HesI et HeyI (Hairy-related basic helix-loop-helix) inhibe également myoD in vivo en faisant

des hétérodimères inactifs (Sasai, Kageyama et al. 1992; Sun, Kamei et al. 2001). Des

études sur les cellules en culture C2C12 ont montré que Notch bloque la myogenèse

(Buas, Kabak et al. 2009). et que cette répression passe par l’expression de MyoR (un

répresseur de MyoD) (Buas, Kabak et al. 2009).

2.2 Le coeur transcriptionnel de la myogenèse.

2.2.1 Les régulateurs positifs La famille des MRFs (Myogenic Regulatory Factors) forme le cœur transcriptionnel

régulant la myogenèse des vertébrés. Ils sont capables d’induire la myogenèse s lorsqu’ils

sont exprimés dans des culture de cellules indifférenciées. Ils se fixent in vitro sur des

séquences d’ADN appelées E-Box ( CANNTG). Les MRFs forment des hétérodimères actifs

avec les E-proteines qui font également parties de la famille des facteurs de transcription à

domaine bHLH. Les E-protéines, contrairement aux MRFs sont exprimées de façon

25

26

ubiquitaire. Les hétéro-dimères MRFs/E-protéines, formés via leurs domaines HLH

respectifs, interagissent avec l’ADN grâce a leur domaine basique. Les hétérodimères

comme les homodimères se fixent sur la séquence CANNTG mais la spécificité de liaison

avec le cœur de cette séquence varie en fonction du type d’hétérodimére (Blackwell and

Weintraub 1990; Perry and Rudnick 2000; Puri and Sartorelli 2000). On connait actuellement

quatre E-protéines : HEB/HTF4, E2-2/ITF2, E12/ E47 (Murre, McCaw et al. 1989) (Lassar,

Davis et al. 1991) (Conway, Pin et al. 2004).

Au cœur transcriptionnel de la myogenèse constitué par les MRFs, il faut rajouter la

famille des facteurs de transcription Mef2 (Myogenic enhancer factors 2) constituée chez les

vertébrés par quatre protéines (Mef2a-d). Ces protéines qui sont exprimées dans le lignage

musculaire font partie de la famille des facteurs de transcription à domaine MADS

(MCM1,Aganous, Déficiens, Serum reponse factor). Les protéines Mef2 se lient à des

séquencesd’ADN riches en A/T (C/TTA(A/T)4TAG/A) (Black, Molkentin et al. 1998; Black and

Olson 1998). Contrairement aux MRFs, ces protéines ne sont pas capables d’activer la

myogenèse dans des cellules indifférenciées mais potentialisent l’action des MRFs grâce à

une interaction directe entre le domaine HLH et le domaine MADS, formant ainsi un hétéro-

dimère actif qui accroit le pouvoir myogénique des MRFs (Molkentin, Black et al. 1995).

D’autres facteurs de transcription interviennent dans la myogenèse des vertébrés

comme les protéines Pax3 et Pax7 (Paired box domain). Les protéines Pax3 et Pax7 ont des

domaines d’expression similaires au niveau du dermomyotome et du myotome en formation

chez le poulet (Ben-Yair and Kalcheim 2005) et la souris (Relaix, Montarras et al. 2006),

(Kassar-Duchossoy, Giacone et al. 2005)). Il a été montré par des expériences de

surexpression de protéine fonctionnelles et de formes dominante-négatives de Pax3 et Pax7

que ces facteurs de transcription régulent MyoD (Relaix, Montarras et al. 2006) (Maroto

1997). Les protéines Pax3 et 7 sont exprimées dans les myoblastes embryonnaires et

fœtaux ainsi que dans les cellules satellites qui fusionnent avec le muscle en formation. Elles

ont des fonctions redondantes et c’est l’analyse des doubles mutants qui a permis de

comprendre leur rôle dans la myogenèse. Dans les doubles mutants pax3/pax7, la formation

des myocytes (fibres monocluéées) n’est pas affectée mais les myoblastes ne fusionnent

entrainant une létalité tardive au cours du développement avec des muscles atrophiés

(Relaix, Montarras et al. 2006)

D’autres facteurs de transcription participent à la régulation de la myogenèse. Les

facteurs de transcription de la famille Six, Six 1 et 4, qui sont exprimés spécifiquement dans

le lignage musculaire peuvent induire directement l’expression de la myogénine in vitro en se

liant directement sur son promoteur (Spitz, Demignon et al. 1998). In vivo, seul le mutant

six1 donne un défaut de la myogenèse primaire (Laclef, Hamard et al. 2003).

27

Myogenèse primaire

Myogenèse primaire

MyoD

Mrf4

Myogénine

Myf5

9 10.5 12 14.5 16 17.5

Figure 9. Expression des MRFs chez la souris au cours de la myogenèse.

Myf5Mrf4

MyoDMyogénine

Mef2a-c

MyoRMist1TwistId1-4Notch

ShhWnts

BMP4Fzb

Figure 8. les inhibiteurs, les activateurs et les cofacteurs de la myogenèse.

28

2.2.2 Les régulateurs négatifs L’activité des MRFs peut être inhibée par d’autres protéines de type HLH, les

protéines id1-4, Twist, MyoR et Mist1.

Les protéines id1-4 forment des hétérodimères inactifs avec les E-proteines

empêchant leur liaison avec les MRFs. Ces protéines peuvent également se lier aux MRFs

et former des hétérodimères de faible activité ((Benezra, Davis et al. 1990), (Neuhold and

Wold 1993)).

Twist, un facteur de transcription de la famille des bHLH peut, comme les protéines

id, former des hétérodiméres avec les E-protéines empêchant ainsi leur liaison avec les

MRFs (Spicer, Rhee et al. 1996). Ce facteur peut également inhiber la myogenèse par un

autre mécanisme ; le domaine basique de Twist ne permet pas la liaison à l’ADN mais

permet de séquestrer les MRFs empêchant toute interaction de ces facteurs avec l’ADN

(Hamamori, Wu et al. 1997).

MyoR et Mist-1 forment des dimères avec les MRFs qui se lient a l’ADN mais qui sont

inactifs (Lemercier, To et al. 1998), (Lu, Webb et al. 1999).

Le rôle précis des inhibiteurs au cours de la myogenèse reste à établir mais ces

derniers doivent probablement restreindre dans le temps et l’espace le processus

myogénique (Figure 8).

2.3 Le rôle hiérarchique des MRFs. Les deux premiers MRFs exprimés dans le lignage musculaire sont Myf5 et Mrf4 suivi

par l’expression de MyoD et de la Myogenine (Montarras, Chelly et al. 1991). (Sassoon,

Lyons et al. 1989) (Kassar-Duchossoy, Gayraud-Morel et al. 2004)). L’expression de Mrf4

s’arrête au stade 12 et redémarre en fin de myogenèse au stade 16. L’expression de Myf5

s’arrête au stade 14. L’expression de MyoD et de Myogenine est détectable jusqu’a la fin de

l’expression des marqueurs de différenciation tel que la MHC. L’expression des MRFs ne

permet donc pas de distinguer les rôles respectifs des différents MRFs au cours de la

myogenèse, hormis le fait que Myf5 ne semble pas jouer un rôle direct dans la myogenèse

secondaire car il n’ést pas pas exprimé à ce stade (Figure 9).

En revanche l’analyse de mutants a permis de situer le rôle des divers MRFs au

cours de la Myogenèse. Les souris mutantes pour myoD n’ont pas de phénotype en raison

d’une compensation par Myf5 qui est surexprimé dans ces mutants (Rudnicki, Braun et al.

1992). Les mutants myf5 meurent en raison d’un défaut de formation des cotes, mais ne

présentent pas de phénotypes musculaires (Braun, Rudnicki et al. 1992). Le double mutant

myoD/myf5 meurt et n’a pas de muscles car la formation des muscles s’arrête lors de la

myogenèse primaire avant la formation des myocytes (Rudnicki, Schnegelsberg et al. 1993).

Des analyses plus poussées ont montré plus que MyoD agissait en aval de Myf5 et de

29

Figure 10. Rôle hiérarchique des MRFs. Myf5, Mrf4 et MyoD contrôlent l’induction de la myogenèse et myogénine, Mrf4 et MyoD contrôlent la différenciation musculaire.

MyoD

Mrf4Myf5Pax3Myogénine Myod Mrf4

Cellules somitiques Myoblastes Myocytes

détermination Différentiation

30

Pax3 ; dans le simple mutant myf5, l’expression de MyoD est retardée ; dans le double

mutant pax3/myf5, les muscles ne se forment pas car myoD n’est plus activé contrairement

au simple mutant pax3 ou myf5 (Tajbakhsh, Rocancourt et al. 1997). De plus, l’expression

ectopique de Pax3 entraine également une expression ectopique de Myf5 montrant ainsi que

Pax3 régule également myf5. Pax3, Myf5 et MyoD semblent donc intervenir dans la

détermination des myoblastes.

Dans les souris mutantes pour la myogénine les myoblastes se forment mais ne se

différencient pas (Hasty, Bradley et al. 1993; Nabeshima, Hanaoka et al. 1993; Venuti,

Morris et al. 1995). Le mutant mrf4 ne montre aucun phénotype, sauf une sur-expression de

la myogénine qui compense le manque de MRF4 (Braun and Arnold 1995; Patapoutian,

Yoon et al. 1995; Zhang, Behringer et al. 1995). De plus, le phénotype musculaire causé

l’absence de la myogénine peut être sauvé par mrf4 placé sous le contrôle du promoteur de

la myogénine (Zhu and Miller 1997). Ces résultats ont conduit à un premier modèle

relativement simple où MyoD et Myf5 jouent un rôle primordial dans la détermination des

myoblastes alors que Mrf4 et la Myogénine jouent un rôle dans la formation des myocytes.

Ce modèle a ensuite été modifié. En effet il semble que Mrf4 joue un rôle dans la

détermination des myoblastes au même titre que MyoD et Myf5.

L’erreur du premier modèle proposé provient en fait d’un défaut dans la construction

du mutant myf5. En effet, les gènes myf5 et mrf4 étant très proches dans le génome, la

délétion réalisée pour le mutant myf5 comprenait également des régions inter-géniques

contenant des modules régulateurs de mrf4. Le mutant myf5 était donc un double mutant

myf5, mrf4 et le double mutant myod, myf5, était en fait un triple mutant myod, myf5, mrf4.

La construction d’un nouveau mutant myf5 et son analyse phénotypique ont montré

que le retard de l’expression de myoD n’est imputable qu’au double mutant myf5/mrf4 et que

myoD est régulé à la fois par Myf5 et Mrf4. De plus l’analyse du nouveau double mutant

myf5/myoD montre que des muscles se forment dans ce contexte génétique. Seul le triple

mutant myf5/myoD/mrf4 montre une absence totale de muscles (Kassar-Duchossoy,

Gayraud-Morel et al. 2004).

Toutes ces données permettent de conclure que Myf5, MyoD et MRF4 sont

nécessaires à la formation des myoblastes et que Myogénine, MyoD et MRF4 sont requis

pour la différenciation des myoblastes en myocytes (figure 10). La fusion des myoblastes

avec le myocyte dépend comme nous l’avons dit de Pax3 et 7. Il est fort probable que les

MRFs jouent également un rôle durant cette phase, mais leurs fonctions précoces dans la

myogenèse ne donnent pas accès à leur rôle plus tardif.

2.4 Elongation des myocytes L’élongation des myocytes se fait selon l’axe crânio-caudal (Figure 11). On connait

31

Embryon sauvage Ablation du tube neuraltube neural entre

deux somites

Implant de cellules exprimant Wnt11

Figure 11. Rôle du tube neural et de Wnt11 dans l’élongation du tube neural. (A) dans un embryon sauvage, les myocytes s’allongent selon l’axe rostro-caudal. (B) L’ablation du tube neural entraine une élongation anarchique des myocytes. (C) Une implantation d’un fragment de tube neural entre deux somites entraine une réorientation des myocytes selon l’axe du tube neural. (D) l’implantion dans les somites de cellules exprimant Wnt11 entraine une réorientation des myocytes, ils tournent autour de la source de Wnt11.

Ant Post

A B C

D

TN

TN

Figure 12. Formation du syndétome. Les cellules du centre du myotome sécrètent FGF sous le contrôle Myod et Myf5. FGF active les cellules en périphérie du myotome qui expriment le récepteur (FREK). Les cellules en périphérie activées par un signal encore inconnu induisent en retour la formation du syndétome à partir du sclérotome. La formation du syndétome passe en partie par l’inhibition de scleraxis.

Myf5 MyoD

FGF

FGFFREK

FREKScleraxis

Pax1

X

Y

Dermomyotome

myotome

Sclérotome

Syndétome

32

très peu de chose des mécanismes induisant l’élongation. Des données très récentes

montrent que l’élongation des myotubes est controlée par le tube neural et la voie Wnt (Gros,

Serralbo et al. 2009). Des explants de tube neural gréffés perpendiculairement à l’axe du

corps et entre deux somites entrainent un changement d’orientation des myocytes, les fibres

s’orientent selon l’axe de l’implant (Figure 11B-C). le tube neural induit l’expression de wnt

11 dans les somites à leur contact, en raison l’action probable de wnt3a et 1 ((Marcelle,

Stark et al. 1997). L’expression ectopique de wnt11 (Figure 11D) par l’intermédiaire de

cellules implantées a pour conséquence que les fibres tournent autour de l’implant (Gros,

Serralbo et al. 2009). La molécule Wnt11 dont l’expression est induite dans la partie médiale

des somites par le tube neural contrôle donc l’élongation des myosites.

2.5 Description moléculaire de la formation des tendons Scleraxis (Scx), un facteur de transcription de la famille bHLH est chez le poulet et la

souris exprimé dans tout au long du lignage des cellules tendineuses du tronc et des

membres (Schweitzer, Chyung et al. 2001). Un quatrième compartiment somitique appelé

syndétome, intercalé entre les dermomyotomes est à l’ origine des tendons des muscles du

tronc. Des cellules de caille introduites dans le myotome ou le sclérotome ont montré que le

syndétome dérive du sclérotome. La formation du syndétome dépend de la signalisation

FGF (Fibroblast Growth Factor). Le centre du myotome exprime FGF8 et FGF4 ( (Kahane,

Cinnamon et al. 2001) sous le contrôle de Myf5 et MyoD (Fraidenraich, Lang et al. 1998;

Fraidenraich, Iwahori et al. 2000). Les cellules en périphérie du myotome expriment un

récepteur de la voie FGF, FREK (Fibroblast Growth Factor Receptor-like) (Kahane,

Cinnamon et al. 2001). La surexpression des FGFs par l’intermédaire de billes ou de

rétrovirus augmente le domaine d’expression de Scleraxis. Inversement l’expression d’un

dominant négatif de FREK diminue le domaine d’expression de Scleraxis. L’hypothèse est

que les cellules du centre du myotome sécrètent FGF qui se lie sur le récepteur FREK au

niveau des cellules en périphérie du myotome. Ces cellules périphériques envoient alors un

signal encore inconnu vers les cellules du sclérotome qui en retour exprime Scx, délaminent

et forment le syndétome.

Pax1 est également exprimé dans le sclérotome. L’expression d’un dominant négatif

de Pax1 réprime l’expression de Scx. De plus, la surexpression de FGF8 inhibe pax1. Le

signal inducteur des cellules en périphérie du myotome doit donc passer par l’inhibition de

Pax1 et/ou l’activation de Scx (Brent, Schweitzer et al. 2003)) (Figure 12).

33

Primordium tendineux

Primordium tendineux proximal

Primordium tendineux interne

Primordium musculaire


Primordium musculaire de la cuissePrimordium musculaire de la jambe



Primordium musculaire de la cuissePrimordium musculaire de la jambe


Primordium musculaire du pied

Primordium tendineux distal

Tendonproximal

Masse musculaire de

la cuisse

Tendons internes

Masse musculaire

du pied

Tendon distal

Masse musculairede la jambe

Tendons distaux

Figure 13. Formation de la patte chez le poulet. En vert les muscles en formation révélés avec un anticorps contre la Myosine. En rouge les tendons en formation révélés avec un anticorps contre la Tenascine (marqueur tendineux). Remarque: ici on ne voit que la formation des primordia tendineux et musculaires ventraux; la subdivision proximo-distale est la même au niveau dorsal.

Kardon, G. (1998). "Muscle and tendon morphogenesis in the avian hind limb." Development 125(20): 4019-4032.

34

III/ Formation des muscles des membres

1. Description tissulaire et cellulaire. Les muscles squelettiques des membres dérivent de la partie hypaxiale du dermomyotome

tandis que les précurseurs des tendons et du squelette dérivent du mésenchyme des

membres (Chevallier, Kieny et al. 1977; Kieny, Mauger et al. 1979; Ordahl and Le Douarin

1992). Les précurseurs musculaires des membres délaminent du dermomyotome et migrent

vers les territoires des membres. Une fois dans ce territoire, les précurseurs musculaires

vont subir une phase intense de prolifération et former une structure appelée primordium

musculaire. Ce primordium musculaire se divise en deux masses, ventrale et dorsale. Les

masses ventrales et dorsales vont ensuite se subdiviser selon l’axe proximo-distal en trois

primordia musculaires de la cuisse, de la jambe et du pied. Il existe également un

primordium tendineux qui suit les mêmes subdivisions (figure 13).

Une description très belle a été faite chez le poulet par Gabrielle Kardon en 1998 qui

montre les interactions entre masse musculaire et tendon. Le développement des tendons et

des muscles est très lié et montre que ces deux tissus communiquent entre eux au cours du

développement. Si on enlève les primordia des muscles, les primordia tendineux se forment

mais dégénèrent très rapidement. Le seul primordium qui ne dégénère pas et qui se

subdivise en tendons est le primordium distal. Réciproquement, lorsqu’on enlève un

primordium tendineux, le muscle continue sa trajectoire. Le développement des muscles et

des tendons est donc très étroitement lié et fait appel à des communications tissulaires

encore inconnues (Kardon 1998).

2. Description moléculaire

2.1 La délamination Les précurseurs musculaires délaminent de la partie ventro-latérale du

dermomyotome (partie hypaxiale). Les précurseurs musculaires des membres délaminent

avant d’exprimer les MRFs, contrairement aux myoblastes des muscles du tronc. La

délamination dépend d’un récepteur tyrosine kinase appelé C-met (mesenchymal epithelial

factor) et de son ligand SF/HGF (Scatter Factor/Hepatocyte Growth Factor) (Bladt,

Riethmacher et al. 1995; Dietrich, Abou-Rebyeh et al. 1999). C-met est exprimé dans tout le

dermomyotome hypaxial et dans la partie latérale du mésenchyme des membres afin

d’assurer une délamination régionalisée. La transcription de C-met dépend du facteur de

transcription à domaine homéo-paired, Pax3 (Epstein, Shapiro et al. 1996). Dans des souris

mutantes pour SF/HG, c-met ou pax3, les précurseurs musculaires des membres ne

35

1

1 Délamination: Pax3, C-met , SF/HGF

2 Migration: Lbx1, Mox2, Six, Six4, EphA4, Efna5, CXCR4, SDF, C-met

23

3 Prolifération: Mox2, MRFs

4 Détermination et différentiation: MyoD, Mrf4, Myogénine…

Figure 14. Formation des membres. Représentation schématique de la formation des muscles appendiculaires. Les différentes étapes et les molécules contrôlant la myogenèse des membres sont représentés par différentes couleurs et des numéros.

4

36

délaminent jamais (Bladt, Riethmacher et al. 1995) (Tajbakhsh, Rocancourt et al. 1997;

Dietrich, Abou-Rebyeh et al. 1999). Inversement, l’activation ectopique de SF/HGF peut

induire la délamination aberrante du dermomyotome (Brand-Saberi, Muller et al. 1996;

Heymann, Koudrova et al. 1996) (figure 14).

2.2 Migration Après la délamination, les précurseurs musculaires migrent vers les territoires des

membres. Un facteur de transcription à homéo-domaine appelé Lbx1 (Lady bird-like

homeobox) est impliqué dans cette migration. Dans des embryons mutant lbx1, les cellules

délaminent mais ne migrent pas vers les territoires des membres. Il est intéressant

d’observer que les membres postérieurs sont affectés dans leur globalité alors qu’au niveau

des membres antérieurs, les cellules à l’origine des masses musculaires ventrales migrent

normalement contrairement à celles des masses musculaires dorsales.(Jagla, Dolle et al.

1995), (Schafer and Braun 1999), (Gross, Moran-Rivard et al. 2000). Les cibles de Lbx1

restent inconnues. D’autre part les précurseurs des muscles de la face migrent normalement

vers les arcs branchiaux et les précurseurs du diaphragme trouvent également leur

territoire. Lbx1 semble donc être impliqué spécifiquement dans la migration des précurseurs

musculaires des membres.

Fait intéressant, un autre facteur de transcription à homéo-domaine appelé Mox2 et

exprimé dans les précurseurs musculaires en migration, a un effet inverse. Dans un mutant

mox2 les muscles disparaissent au niveau des membres antérieurs alors que l’effet au

niveau des membres inférieurs est mineur, les muscles qui se forment étant de petite taille

(Mankoo, Collins et al. 1999). L’étude précise du rôle de Mox2 dans la formation des

muscles des membres est difficile car dans des souris mutantes pour mox2 on observe des

effets sur l’expression de myf5, pax3 et c-met. Mox2 peut donc jouer un rôle dans la

délamination mais également dans la migration et la différenciation.

Les protéines Six1 et Six4 joueraient un rôle dans la migration et/ou la

prolifération/différenciation. Dans un mutant six1 on observe une réduction des muscles du

tronc et appendiculaires (Laclef, Hamard et al. 2003). Le mutant six4 n’a pas de phénotype

musculaire. Le double mutant six1/six4 montre un défaut de migration très accentué et une

réduction de l’expression de myf5 (Giordani, Bajard et al. 2007).

Chez le poulet, des protéines de surface de type Ephrine sont impliquées dans la

migration correcte des précurseurs musculaires. Le récepteur EphA4 et son ligand ephrin-A5

permettent une migration orientée des précurseurs musculaires des membres. EphA4 est

exprimé dans les précurseurs musculaires et ephrin-A5 dans le mésenchyme des membres.

Le ligand guiderait les précurseurs musculaires par un mécanisme de répulsion (Swartz,

Eberhart et al. 2001).

37

38

Une autre récepteur appelé CXCR4 (Chemokine Receptor 4), récepteur

membranaire couplé aux protéines G et son ligand SDF1 (Stromal Derived Factor 1)

semblent être impliqués dans la migration des précurseurs musculaires des membres. Chez

le poulet et la souris, CXCR4 est exprimé dans les précurseurs musculaires pendant leur

migration et SDF1 dans le mésenchyme des membres (Vasyutina, Stebler et al. 2005; Yusuf,

Rehimi et al. 2005). La transplantation de cellules exprimant SFD1 au niveau des membres

entraine une accumulation des précurseurs autour de ces cellules, cependant un mutant

CXCR4 a peu d’effet sur la migration (Vasyutina and Birchmeier 2006). CXCR4 interagit

génétiquement avec Gab1 une protéine adaptatrice qui relaie le signal C-met (Birchmeier,

Birchmeier et al. 2003). Dans un mutant gab1 on peut observer des problèmes de migration

et d’apoptose qui entrainent une diminution des précurseurs dans les territoires des

membres (Sachs, Brohmann et al. 2000). Dans le double mutant cxcr, gab1 le phénotype de

migration est très accentué (Vasyutina, Stebler et al. 2005). Ces résultats montrent que

CXCR4 est impliqué dans la migration des précurseurs musculaires et que C-met, impliqué

dans la délamination, participe également à la migration des précurseurs musculaires (figure

14).

2.3 Prolifération et différentiation Une fois que les myoblastes ont migré dans le bourgeon des membres, ils

expriment les MRFs et une phase intense de prolifération va suivre. On connait peu de

chose sur cette phase de prolifération. Un facteur de transcription a homéodomaine, Msx1

(Muscle segment homeobox 1), semble être impliqué dans cette phase de prolifération.

Msx1 est exprimé dans les progéniteurs en migration au niveau du membre supérieur. En

culture de cellules, msx1 est exprimé dans les myoblastes en division (Houzelstein, Auda-

Boucher et al. 1999)) et sa surexpression dans des cellules musculaires différenciées cause

un réversion en cellules prolifératives (Odelberg 2000).

Dans les doubles mutants myf5 et myoD (qui sont est en fait un triple mutant, myf5,

myoD, mrf4) les précurseur musculaires migrent correctement mais ne se différencient pas

en muscle (Kablar, Krastel et al. 1997; Kablar, Krastel et al. 1999). Les mécanismes

d’induction des Mrfs dans les précurseurs des membres restent peu étudiés. L’ectoderme

des membres joue ce rôle inducteur. Lorsqu’on on enlève l’ectoderme, les protéines Myf5,

MyoD et Myogénine sont sous exprimées. On peut obtenir un sauvetage partiel du

phénotype ‘perte d’expression de myf5’ en implantant des cellules exprimant Wnt6 ;

cependant l’expression de MyoD n’est pas rétabli montrant ainsi que d’autres molécules

signalisatrices sont impliqués (Geetha-Loganathan, Nimmagadda et al. 2005) (figure 14)..

39

MyoD, Myf5

Pitx2

Tbx1Msc/MyoR

MyoD, Myf5

Pitx2

Tbx1Msc/MyoR

1er Arc Branchial

2eme Arc Branchial

Figure 15. induction des MRFs dans le premier et le deuxième Arcs Branchiaux. Représentation schématique de l’induction de la myogenèse dans les deux premiers arcs Branchiaux. On peut remarquer que l’induction myogénique entre ces deux arcs n’est pas identique malgré la présence des mêmes facteurs de transcription.

Adapté de Shih, H. P., M. K. Gross, et al. (2007). "Cranial muscle defects of Pitx2 mutants result from specification defects in the first branchial arch." Proc Natl Acad Sci U S A 104(14): 5907-5912.

40

IV. Formation des muscles de la face

1. Description tissulaire et cellulaire. Hormis les muscles du larynx et de la langue qui dérivent respectivement des somites

S1-S5 et S1-2, tous les muscles de la tête dérivent du mésoderme non segmenté situé en

position rostrale du territoire somitique. Les précurseurs musculaires migrent vers les trois

arcs branchiaux. Les précurseurs des muscles oculaires dérivent également du mésoderme

non segmenté et migrent vers le premier arc branchial et le territoire oculaire (Noden 1983;

Trainor and Tam 1995; Graham, Koentges et al. 1996). Les précurseurs musculaires ayant

atteint leur territoire respectif vont se lier aux tendons qui dérivent des crêtes neurales. Ces

tendons s’attachent au squelette du crâne dont la partie antérieure dérive des crêtes

neurales et du mésoderme non segmenté (Noden and Trainor 2005; Noden and Francis-

West 2006).

2. Description moléculaire On connaît très peu de choses sur le contrôle moléculaire de la formation des

muscles de tête. La formation des muscles du premier arc branchial est sous le contrôle du

facteur de transcription Pitx2 (bicoid–related homeobox gene) qui est exprimé dans les

précurseurs musculaires avant et pendant la phase d’expression de Myf5, MyoD et

Myogenine (Shih, Gross et al. 2007).Pitx2 contrôle la myogenèse du premier arc branchial

en régulant l’expression de Tbx1, MyoR /Msc et TCF21(capsiline) qui avec Pitx2 contrôlent

l’expression de MyoD et Myf5 (Shih, Gross et al. 2007). Le mutant tbx1 entraine des

malformations des deux premiers arcs branchiaux en raison d’une sous expression de myf5

et myoD. Cependant uniquement quelques muscles issus de ces arcs sont affectés (Kelly,

Jerome-Majewska et al. 2004). Les doubles mutants msc/MyoR et tcf21/capsiline entrainent

un problème de formation du premier arc branchial avec une perte uniquement des muscles

masticateurs consécutive à la réduction de l’expression de myf5 et myoD (Kelly, Jerome-

Majewska et al. 2004).

Ces données montrent que tous les facteurs de transcription étudiés à ce jour

affectent essentiellement le premier arc branchial suggérant que l’induction de la myogenèse

pourrait être régulées différemment dans chaque arc branchial (seul tbx1 affecte le deuxième

arc branchial) (figure 15).

41

Figure 16. Les muscles Somatiques larvaires de Drosophile. (A) Vue latérale d’un embryon sauvage au stade 16 marqué par un anticorps anti-MHC (vert). (B) Représentation schématique du patron musculaire en fonction des segments. (C) représentation schématique du patron musculaire somatique dans un segment abdominal. A droite de cette représentation, les deux nomenclatures des muscles qui sont une numérotation ou un nom définissant la position et l’orientation du muscle.

A1 A8

MHC

VO4(15)

1: Dorsal Acute 12: Dorsal Acute 23: Dorsal Acute 34: Lateral longitudinal 15: Lateral Oblique 16: Ventral Longitudinal 37: Ventral Longitudinal 48: Segment Border Muscle9: Dorsal Oblique 110: Dorsal Oblique 2

11: Dorsal Oblique 312: Ventral Longitudinal 113: Ventral Longitudinal 314.1: Ventral Oblique 114.2: Ventral Oblique 215: Ventral Oblique 4

16: Ventral Oblique 517(A2-A7): Ventral Oblique 318: Dorsal Transverse 119: Dorsal Oblique 420: Dorsal Oblique 521: Lateral Transverse 122: Lateral Transverse 223: Lateral Transverse 324: Lateral Transverse 425(A2-A7):Ventral Transverse126: Ventral Acute 127:Ventral Acute 228:Ventral Oblique 329:Ventral Acute 130: Ventral Oblique 231(A1):Ventral internal 1

23

1

45

8

67

9

10

11

1213

14.1

1516

8

14.2

17

1819

20

21

2223

27

28

24

2526

29

Muscle superficiel

Muscle intermédiaire

Muscle profond

A B

C

42

B/ Myogenèse des muscles squelettiques chez la Drosophile.

I/Description Générale

1. Définition des muscles somatiques Il existe deux vagues de myogenèse chez la drosophile. Une première vague

embryonnaire met en place les muscles de la larve et une deuxième vague lors de la

métamorphose met en place les muscles adultes. Dans cette partie nous ne présenterons

que la myogenèse embryonnaire des muscles somatiques (ou squelettiques) larvaires.

Les muscles somatiques qui constituent la paroi musculaire externe de la larve, lui

servent à se mouvoir dans son milieu. Chacun de ces muscles est constitué d’une seule fibre

mononucléée, contrairement aux muscle des vertébrés, qui comme nous venons de le voir

sont constitués de plusieurs fibres. Chaque segment de la drosophile présente un patron

musculaire constitué d’une trentaine de muscles différents et ce patron varie selon les

segments le long de l’axe A/P. Les segments abdominaux A1-A7 présentent un patron

musculaire similaire qui diffère de celui des segments T1, T2, T3 et A8, chacun de ces

segments ayant un patron spécifique (Bate 1990) (figure 16).

2. Origines des muscles somatiques Les muscles somatiques larvaires sont issus du mésoderme embryonnaire. Chez la

drosophile, ce territoire est spécifié très tôt par l’expression du facteur de transcription Twist,

une protéine à domaine b-HLH (basic Helix-Loop-Helix) qui joue un rôle dans la gastrulation

du mésoderme mais également dans la myogenèse (Mary K.baylies 1996). D’abord uniforme

dans tout le mésoderme, l’expression de Twist se restreint ensuite dans chaque segment en

un domaine de faible expression à l’origine des muscles cardiaques et viscéraux et un

domaine de forte expression à l’origine des muscles somatiques. À partir de cette

spécification du mésoderme somatique, le processus de formation des muscles se déroule

en quatre étapes successives. Ce processus est illustré sur la figure 17 par l’exemple de la

formation des muscles DA3 (Dorsal acute 3) et DO5 (Dorsal oblique 5), qui sont les deux

muscles étudiés dans le laboratoire.

La première étape est la spécification de groupes promusculaires, des groupes de

cellules équipotentes caractérisés par l’expression de la protéine Lethal of scute.

La deuxième étape est la sélection d’une cellule, le progéniteur, à partir de chaque

groupe promusculaire, par un mécanisme d’inhibition latérale mettant en jeu la signalisation

Notch /Delta. Les autres cellules du groupe deviennent des myoblastes dit ‘naïfs’.

La troisième étape est la division asymétrique du progéniteur qui donne naissance à

43

Groupes Promusculaires

Adapted from Baylies et al., 1998

Progéniteur

2

2

3

inhibition latérale par Notch

division asymétrique

DA3

DO5

Muscles somatiques

4

4 Fusion et migration

Cellules Fondatrices

Myoblastes naïfs

3

Notch off

Notch on

1 Formation des clusters de cellules compétentes

1

Figure 17. Formation des muscles somatiques: exemple des muscles DA3(3) et DO5(20). Représentation schématique des quatre étapes de myogenèse chez la drosophile. Chaque muscle est issu d’un groupe promusculaire défini au sein du mésoderme somatique. Parmi ce groupe de cellules, une cellule, le progéniteur est sélectionnée par un processus d’inhibition latérale; les autres cellules deviennent des myoblastes dits « naïfs ». Une division asymétrique du progéniteur donne naissance àdeux cellules fondatrices, chacune fusionne avec un nombre défini de myoblastes naïfs. La fibre multinucléée s’allonge pour s’ancrer à ses sites d’attachement à l’épiderme.

44

deux cellules fondatrices, chacune avec une identité propre.

Enfin, la quatrième étape est la fusion de chaque cellule fondatrice avec un nombre

défini de myoblastes naïfs et la formation d’une fibre musculaire multi-nucléée. Au cours de

ce processus, la fibre musculaire s’allonge et s’attache sur des cellules de l’épiderme

appelées apodèmes (analogues des tendons), qui permettent de faire le lien entre le muscle

et l’exosquelette (cuticule).

3. Régulation moléculaire de la myogenèse.

Le cœur du contrôle transcriptionnel de la myogenèse chez la drosophile présente

des similitudes et des différences avec celui mis en œuvre chez les vertébrés. Il n’existe

qu’un seul orthologue des MRFs, l’homologue de MyoD appelé Nautilus ou D-MyoD.

Cependant, cette protéine n’a pas un rôle central dans la myogenèse comme c’est le cas

pour son orthologue chez les vertébrés (voir après). L’équivalent fonctionnel des MRFs est

Twist. Alors que chez les vertébrés ce facteur est exprimé dans le sclérotome et agit comme

un inhibiteur de la myogenèse, chez la drosophile il est en amont de la cascade myogénique.

Comme chez les vertébrés, le facteur de transcription D-Mef2, orthologue des protéines

Mef2a-d intervient dans la régulation de la myogenèse chez la Drosophile .

II/ Formation des muscles somatiques : description tissulaire, cellulaire et moléculaire.

1. Induction de la myogenèse

Le processus d’activation des MRFs chez les vertébrés est bien connu, comme nous

avons pu le voir dans les paragraphes précédents. Cependant alors que la régionalisation du

mésoderme est bien décrite chez la drosophile, aucun lien direct entre les molécules

permettant cette régionalisation et la régulation de l’expression de twist n’est connu.

Les dérivés du mésoderme au niveau des segments abdominaux sont les muscles

viscéraux, les muscles somatiques, le cœur et le corps gras (équivalent fonctionnel du foie).

La régionalisation du mésoderme est contrôlée par les mêmes classes de molécules qui

régionalisent les compartiments somitiques chez les vertébrés. La molécule Dpp

(Decapentaplegique) qui est apparentée aux BMPs et fait partie de la famille des

morphogènes TGF-B (Transforming Growth Factor-Beta), est sécrétée par l’ectoderme

dorsal pour régionaliser le mésoderme selon l’axe dorso-ventral (Staehling-Hampton,

Hoffmann et al. 1994) (Frasch 1995). Dpp maintient l’expression du facteur de transcription

Tinman (exprimé d’abord de façon uniforme) dans la région dorsale et restreint l’expression

du facteur de transcription Pox Meso dans la région ventrale. Le mésoderme est également

45

Tinman

Pox

Meso

Even-skipped Sloppy paired

Hedgehog

Dpp

Wingless

Mésoderme viscéral

Tube cardiaque

Mésodermesomatique

Corps gras

Twist

Figure 18. Régionalisation du mésoderme au niveau d’un segment abdominal. En rouge le mésoderme, en vert le mésoderme somatique, en bleu l’épiderme. Le mésoderme somatique se forme dans la région d’expression de Sloppy paired (zone sous l’influence de Wg). La formation du mésoderme somatique dorsal est contrôlé par Tinman (zone sous l’influence de Dpp) et la formation du mésoderme somatique ventral est en partie sous le contrôle de Pox Meso.

46

régionalisé selon l’axe A/P par les gènes de segmentation even-skipped (eve) and sloppy

paired (slp) (Azpiazu, Lawrence et al. 1996) (Riechmann, Irion et al. 1997). Slp est exprimé

dans le compartiment antérieur et Eve dans le compartiment postérieur. Cette régionalisation

est maintenue par la signalisation Hedgehog (Hh, orthologue de Shh chez les vertébrés) et

Wingless (Wg, homologues des Wnts chez les vertébrés). Hedgehog sécrété par

l’ectoderme postérieur régule positivement eve alors que Wingless sécrété par l’ectoderme

antérieur régule positivement slp. Ainsi, le mésoderme viscéral (qui donne les muscles

viscéraux) et le mésoderme du corps gras se forment dans le territoire d’expression d’Eve et

Tin (cellules sous l’influence de Dpp et de Hh). Le mésoderme du cœur et le mesoderme

somitique dorsal se forment dans le territoire d’expression de Slp et de tinman (cellules sous

l’influence Dpp et de Wg). Le mésoderme somatique ventral se forme dans le territoire

d’expression de Slp et de Pox meso (cellules sous l’influence de Wg). L’expression de Twist

qui est initialement uniforme dans l’ensemble du mésoderme est ensuite restreinte au

mésoderme somitique (figure 18). Cependant aucun lien direct entre les effecteurs des

morphogènes sécrétés par l’ectoderme et l’expression de twist n’a été trouvé malgré le

formidable outil génétique drosophile.

Le mésoderme somatique exprime les facteurs de transcription Twist et Slp, auxquels

s’ajoutent Tinman dans la partie dorsale et Pox meso dans la partie ventrale. Des mutations

touchant le gène slp (Riechmann, Irion et al. 1997) entrainent un manque d’accumulation du

facteur de transcription twist dans le mésoderme somatique, engendrant ainsi une perte

totale des muscles. Des mutations de tinman affectent les muscle dorsaux (ainsi que les

muscles viscéraux, le cœur et le corps gras) (Bodmer 1993) (Azpiazu and Frasch 1993)

tandis qu’une mutation de Pox meso entraine une perte ou une malformation des muscles

ventraux dont la pénétrance s’accentue selon l’axe D/V (Dorso/Ventral) (Duan, Zhang et al.

2007).

2. Le cœur transcriptionnel de la myogenèse La protéine Twist fait partie de la famille des protéines à domaine bHLH. Comme

tous ces facteurs de transcription Twist se fixe in vitro sur des séquences d’ADN appelées E-

Box ( CANNTG). Cependant la spécificité de liaison de Twist est plus grande quand le cœur

à pour séquence TA ( CATATG) alors que chez les vertébrés l’héterodimère Myod/E-

proteine se lie preférentiellement à la séquence ( CACCTG) (Ip, Park et al. 1992); (Cripps,

Black et al. 1998) (Yin, Xu et al. 1997), (Lee, Park et al. 1997), Kophengnvong 2000).

Twist a d’abord été identifié comme un facteur de transcription nécessaire a la

gastrulation (Simpson 1983; Thisse, Stoetzel et al. 1988). Dans un mutant twist, la

gastrulation se fait de façon anormale, et le mésoderme ne s’invagine jamais, ne donnant

pas ainsi accès à l’analyse des fonctions plus tardives de Twist. Cependant l’analyse d’un

47

Figure 19. Cœur transcriptionnel myogénique chez les Vertébrés et la Drosophile.

D-Twist D-Mef2

Myf5Mrf4

MyoD

Mef2a-c

Mrf4MyoD

Myogénine

Détermination Différenciation

Drosophile

Vertébrés

48

mutant thermosensible a permis de montrer le rôle de Twist dans la myogenèse. En effet

lorsque les fonctions de Twist sont abolies après la formation du mésoderme, le processus

de myogenèse est abortif, entrainant une perte des muscles somatiques. A l’inverse

l’expression ectopique de Twist dans l’épiderme entraine une transformation des cellules

épidermiques en cellules musculaires. Cette transformation est caractérisée par une fusion

des cellules épidermiques entre elles et une expression des marqueurs musculaires comme

la Myosine (Baylies and Bate 1996).

Le Facteur de transcription D-Mef2 est également un facteur de transcription

essentiel à la myogenèse. Comme Twist, il est d’abord exprimé dans l’ensemble du

mésoderme puis son expression diminue pendant la rétraction de la bandelette germinative.

Dans un second temps, Mef2 est très fortement transcrit dans le mésoderme somatique et

viscéral ainsi que dans les cellules précurseurs du cœur. Au niveau du mésoderme

somatique l’expression de Mef2 perdure tout au long de la formation des muscles (Lilly,

Galewsky et al. 1994; Nguyen, Bodmer et al. 1994). Dans un mutant mef2, les muscles

somatiques ( et viscéraux) ne se forment pas, montrant ainsi un rôle clef de Mef2 dans la

myogenèse (Bour, O'Brien et al. 1995). Un analyse plus fine a mis en évidence que les

cellules fondatrices des muscles se forment mais ne fusionnent pas avec les myoblastes

naïfs (Ranganayakulu, Zhao et al. 1995). A l’inverse l’expression ectopique de Mef2 dans

l’épiderme entraine l’activation de nombreux marqueurs musculaires mais n’enclenche pas le

processus de fusion myogénique comme peut le faire Twist (Lin, Bour et al. 1997). Ces

données montrent que Mef2 n’intervient probablement pas dans les étapes de spécification

des cellules fondatrices mais dans les étapes de différenciation.

D-Mef2 agit en aval de Twist. En effet la surexpression de Twist dans le mésoderme

entraine une expression ectopique de Mef2 alors que dans un mutant twist permissif pour la

gastrulation on ne détecte pas d’expression de Mef2 au niveau du mésoderme somatique.

Cette régulation semble être directe puisque la mutation des sites de fixation de Twist sur un

module cis-régulateur contrôlant l’expression d’un gène rapporteur lacZ récapitulant

l’expression de Mef2 dans le mésoderme somatique abolit cette expression (Cripps, Black et

al. 1998) ( Figure 19).

Si les muscles somatiques de la drosophile et les muscles squelettiques chez les

vertébrés présentent une architecture commune au niveau de leur cytosquelette

(sarcomères), la cascade de régulation transcriptionnelle contrôlant la myogenèse est donc

différente. Tout d’abord l’induction de la myogenèse chez la Drosophile est sous le contrôle

de Twist alors que chez les vertébrés elle est induite par MyoD, Myf5 et Mrf4. Les étapes de

différenciation ne sont cependant pas sous le contrôle de Twist dont l’expression n’est pas

maintenue après le stade de cellule fondatrice (cellules à l’ origine des muscles). Les étapes

de différenciation musculaire chez la drosophile sont sous le contrôle de Mef2, alors que

49

50

chez les vertébrés elles sont sous le contrôle des MRFs Myod, Mrf4 et Myogénine avec

lesquels coopèrent Mef2a-c. D’autre part l’homologue de MyoD chez la Drosophile, Nautilus,

n’est exprimé que dans un sous ensemble de muscles. La protéine D-Mef2 joue t-elle un rôle

plus important dans les étapes de différenciation que chez les vertébrés en assurant le rôle

des MRFs MyoD, Mrf4 et Myogénine dans les étapes de différenciation (Figure 19) ?

Des données récentes convergent vers cette hypothèse. Une analyse de

transcriptome d’embryons exprimant des doses décroissantes de Mef2 a été réalisée. Cette

analyse montre que de nombreux marqueurs de différenciation musculaire comme la MHC

sont régulés par Mef2 (Elgar, Han et al. 2008). Une analyse de Chip (Chromatine immuno-

precipitation) confirme ces résultats et montre que Mef2 se fixe sur les régions cis-régulatrice

de nombreux gènes de différenciation (Sandmann, Girardot et al. 2007; Zeitlinger, Zinzen et

al. 2007).

3. Les différentes étapes de la formation des muscles somatiques

3.1 Découverte de la cellule fondatrice En 1990 M. bate décrit la formation et le patron des muscles somatiques et observe

des myoblastes plus gros que les autres et postule l’existence de cellules fondatrices qui

fusionnent avec d’autres myoblastes pour former les muscles (observation similaire à celle

décrite en 1983 par Goodman chez le criquet) (Bate 1990). Plusieurs observations ont

permis de renforcer cette hypothèse. Parmi les myoblastes certains pouvaient notamment

être distingués par l’expression de facteurs de transcription particuliers tels que le facteur

S59 (Slouch) et Apterous (Dohrmann, Azpiazu et al. 1990; Bourgouin, Lundgren et al. 1992)

montrant ainsi une propriété particulière de ces cellules, du moins dans leur configuration

transcriptionnelle. Ces observations, conjuguées à l’analyse du mutant apterous qui affecte

la formation d’un sous ensemble de muscles, on conduit John B. thomas en 1992 à postuler

l’hypothèse que les cellules ‘fondatrices’ possèdent toute l’information nécessaire pour initier

la formation d’un muscle et que chacune de ces cellules expriment une combinatoire de

facteurs de transcription contrôlant l’identité de chaque muscle. C’est en 1995 (Rushton,

Drysdale et al. 1995) par la découverte du mutant de fusion myoblast city que l’hypothèse a

été confirmée. Dans ce mutant, l’absence de fusion des myoblastes n’empêche pas les

cellules fondatrices de former des muscles mononucléés qui s’attachent correctement à

l’épiderme, expriment des marqueurs musculaires comme la myosine et sont capables de se

contracter. Cette observation montre non seulement que les cellules fondatrices contiennent

toutes le programme générique de formation d’un muscle mais également tout le programme

identitaire propre à chaque muscle.

51

Figure 20. Les groupes de cellules compétentes dans le mésoderme exprimant l’sc. Les cercles numérotés représentent chacun un groupe d’équivalence, ou cluster promusculaire. Le nombre de cellules compris dans chaque cluster est écrit entre parenthèse. On peut remarquer que certains clusters s’entrecroisent, ceci est dû au fait que la formation des clusters est un processus dynamique, par exemple le cluster 2 se forme avant le 15.

Carmena, A., M. Bate, et al. (1995). "Lethal of scute, a proneural gene, participates in the specification of muscle progenitors during Drosophila embryogenesis." Genes Dev 9(19): 2373-2383.

Figure 21. Modèle pour la formation des muscles somatiques. Chaque muscle est issu d’un groupe promusculaire défini au sein du mésoderme somatique et visualisable par l’expression de l’sc. Parmi ce groupe de cellules, une cellule, le progéniteur est sélectionné par le processus d’inhibition latérale; la division du progéniteur donne naissance à deux cellules fondatrices; chacune fusionne avec des myoblastes et la fibre multinucléée s’allonge pour s’ancrer à ses sites d’attachement à l’épiderme. L’expression de l’sc s’arrête au stade progéniteur.

Carmena, A., M. Bate, et al. (1995). "Lethal of scute, a proneural gene, participates in the specification of muscle progenitors duringDrosophila embryogenesis." Genes Dev 9(19): 2373-2383.

52

3.2 Origine de la cellule fondatrice : le cluster et le progéniteur musculaire.

C’est en 1995 qu’il a été mis en évidence que les cellules fondatrices dérivaient de la

division d’une cellule progéniteur sélectionnée à partir d’un groupe de cellules compétentes

ou groupe d’équivalente (Carmena, Bate et al. 1995). Les auteurs ont montré qu’au sein du

mésoderme somatique, il existait des groupes de cellules exprimant le gène proneural lethal

of scute (l’sc). Ils ont numéroté ces groupes en fonction de leur position selon l’axe D/V et

ont compté le nombre de cellule par cluster, un nombre compris entre 1 et 6 (figure 20).

L’expression de l’sc est progressivement restreinte à une ou deux cellules par cluster. La

colocalisation de l’sc et S59, postulé à l’époque être un marqueur de certaines cellules

fondatrices, montre que les cellules se divisent une fois pour donner deux cellules à l’origine

de muscles différents. Les auteurs ont donc ainsi montré que les cellules fondatrices des

muscles dérivent de la division d’un progéniteur issu d’un cluster de cellules exprimant L’sc.

L’expression de l’sc s’arrête avant la formation des cellules fondatrices. Les auteurs ont enfin

montré que la restriction de l’sc à la cellule progénitrice était due a l’inhibition latéral medié

par la signalisation Notch. Dans un mutant delta, toutes les cellules du cluster maintiennent

un haut niveau d’expression de S59 et l’sc, indiquant que toutes les cellules du cluster sont

compétentes pour devenir des progéniteurs et que la voie Notch restreint cette compétence

à une seule cellule, la cellule progénitrice (Carmena, Bate et al. 1995; Giebel 1999) (Figure

21).

Les clusters de cellules compétentes ont des coordonnées bien précises qui

préfigurent la future position des muscles. Le positionnement de ces clusters est donc

extrêmement importante afin d’établir le patron musculaire. Une analyse poussée du patron

d’expression de l’sc a permis de proposer un modèle pour la formation de ces clusters.

L’expression de l’sc apparait tout d’abord dans deux grands groupes de cellules, un ventral

et l’autre dorsal, que les auteurs ont dénommé pré-cluster. Ces pré-clusters se subdivisent

en clusters préfigurant le patron musculaire (Halfon, Carmena et al. 2000). Les auteurs se

sont intéressés à la formation du pré-cluster dorsal et à la formation de deux clusters qui en

dérivent, les clusters des muscles DO2 (10) et DA1(1), dont ils ont suivi la formation en

visualisant l’expression du facteur de transcription Eve. Le pré-cluster dorsal se forme juste

en dessous des cellules épidermiques antéro-dorsales secrétant à la fois Wg et Dpp.

L’analyse d’embryons mutants ou surexprimant ces morphogènes montrent qu’ils sont

nécessaires à la formation du pré-cluster dorsal. La surexpression de wg étend le domaine

du pré-cluster antérieurement mais toujours dans la limite du domaine d’expression de Dpp.

La surexpression de Dpp n’affecte pas la position du pré-cluster mais empêche sa division

en clusters. De plus dans les mutants wg ou dpp le pré-cluster ne se forme pas (Halfon,

Carmena et al. 2000) (Figure 22).

53

Figure 22. modèle pour la formation du pré-cluster dorsal et des clusters des muscles DA1 et DO2. La formation du pré-cluster dorsal dépend des morphogènes Dpp et Wg sécrétés par l’épiderme. La formation des clusters et progéniteurs est sous le contrôle de la voie FGF et EGF. L’expression de différents acteurs de cette voie est sous le contrôle de Wg. CC: Cellule cardiaque, CPC: cellule péricardiaque, CF: cellule fondatrice.

Wg

Dpp

Cluster 2

Cluster 15

DER Htl

DER

Voie MAPK

Voie MAPK

CF DO2

CF DA1

Muscle DO2

Muscle DA1

CCCPC

N

N

Pré-cluster dorsal

N

N

L’sc

Eve

54

La formation des clusters dorsaux à partir du pré-cluster dorsal est sous le contrôle

de DER (Drosophila Epidermal growth factor Receptor) et de Htl (Heartless) qui sont des

récepteurs Tyrosine kinase des EGFs (Epidermal Growth Factor) et FGFs (Fibroblast Growth

Factor) respectivement. L’expression de formes dominantes-négatives de ces récepteurs

dans le mésoderme empêche la formation des muscle dorsaux et du tube cardiaque

(Carmena, Gisselbrecht et al. 1998; Michelson, Gisselbrecht et al. 1998); Cependant ces

formes dominante-négatives n’affectent pas la formation des pré-clusters. Les mutants Htl

affectent la formation du cluster du muscle DO2(10) (cluster2) alors que ce cluster n’est pas

affecté dans un mutant DER. Les mutant Htl et DER affectent tous les deux la formation du

cluster du muscle DA1 (cluster 15).

L’activation de la voie MAPK (Mitogen-activated protein kinase) par les récepteurs

EGFs et FGFs est nécessaire à la formation non seulement des clusters mais également à

celle du progéniteur. La voie MAPK est activée dans le cluster puis maintenue dans le

progéniteur. Lorsqu’on active de façon constitutive la voie MAPK par l’expression d’une

protéine RAC constitutivement active, toutes les cellules du cluster 2 expriment fortement

Eve et Lethal of scute, échapant ainsi à l’inhibition latérale médiée par Notch. En d’autres

termes, lorsque la voie MAPK est activée constitutivement, toutes les cellules du cluster

deviennent des progéniteurs avec pour conséquence la formation de muscles ectopiques

exprimant eve. Enfin la voie MAPK agit en aval de Wg car des composants de la voie (Hbr et

rho) sont exprimés de façon ectopique est plus précocement quand la B-caténine est

constitutivement activée (Halfon, Carmena et al. 2000).

En résumé, deux pré-clusters exprimant l’sc se forment, un ventral et un autre dorsal.

En ce qui concerne le pré-cluster dorsal, sa formation requiert l’activité des morphogènes

Dpp et Wg. Ce pré-cluster se subdivise en deux clusters exprimant également L’sc. La

formation de ces clusters dépend de la voie MAPK dont l’expression de composants de cette

voie dépend de la voie Wg. Enfin la voie Notch restreint l’activation de la voie MAPK à une

cellule (Figure 22).

Ce modèle de mise en place des pré-clusters et clusters reste imcomplet. Tout

d’abord, si les voies Wg et Dpp contrôlent la formation du pré-cluster dorsal, il reste à

comprendre comment le pré-cluster ventral se forme? La formation des clusters dorsaux à

l’origine des muscles DA1(1) et DO2(10) illustrée dans le paragraphe précédant est sous le

contrôle de la voie EGF/FGF en aval de la voie Wg. Ces données expliquent comment un

cluster se forme mais pas comment il acquiert des coordonnées précises au sein du

mésoderme. Les Protéines Wg et Dpp doivent probablement jouer un rôle dans la formation

des clusters mais leur fonction précoce dans la formation des pré-clusters ne permet pas

d’accéder à l’analyse de leurs fonctions tardives. Enfin le seul marqueur générique des pré-

clusters et clusters est l’sc ; or dans un mutant l’sc le phénotype musculaire est très mineur.

55

Vésicule de préfusion

Plaque de pré-fusion

Pores de fusion

Figure 23. Fusion des membranes. A gauche, représentation schématique de la fusion musculaire, à droite ultra structures membranaires formées au cours de la fusion et visualisées en microscopie électronique.

Reconnaissance myoblaste naïf/ cellule

fondatrice

Apposition des membranes

Formation de trous dans la membrane

Cellulemultinucléée

56

Depuis 1995 aucune donnée supplémentaire n’a contribué à comprendre le positionnement

extrêmement précis des clusters.

3.3 Formation des cellules fondatrices : division asymétrique.

Le division du progéniteur peut donner naissance soit à deux cellules fondatrices, soit

à une cellule fondatrice et une cellule précurseur d’un muscle adulte qui reste quiescente

jusqu'à la métamorphose (Carmena, Bate et al. 1995). Le progéniteur musculaire peut

également se diviser en un précurseur cardiaque ou péri-cardiaque et une cellule fondatrice,

c’est le cas du progéniteur 15 qui donne naissance à la cellule fondatrice du muscle DA1(1)

et un précurseur péri-cardiaque et du progéniteur 2 qui donne naissance à la cellule

fondatrice du muscle DO2(20) et un précurseur cardiaque (Figure 22). Le mécanisme qui

permet ce choix binaire dans le destin des cellules est la division asymétrique. Numb et

inscuteable sont localisés de façon opposée au niveau du cortex des progéniteurs. A la suite

de la division la voie Notch est inactive dans la cellule où ségrége Numb inhibe et active

dans la cellule où ségrége Inscuteable. Par exemple, dans un embryon mutant pour numb le

progéniteur à l’origine du DA1(1) se divise en deux cellules cardiaques alors que dans un

mutant inscuteable (ou dans la surexpression de numb) le progéniteur donne naissance à

deux cellules fondatrices musculaires identiques à l’origine de deux muscles DA1 (Carmena,

Murugasu-Oei et al. 1998; Speicher, Fischer et al. 2008). La division asymétrique permet

donc un choix binaire dans le destin de cellules issues des progéniteurs permettant ainsi de

créer de la diversité à partir de ces cellules.

3.4 Fusion des cellules fondatrices avec les myoblastes naïfs

3.4.1 Description générale Les cellules fondatrices fusionnent avec les myoblastes dit ‘naifs’ car ils ont la

capacité de fusionner avec n’importe quelle cellule fondatrice. Des expériences de

transplantation chez le criquet ont montré que quelque soit l’endroit où l’on transplante ces

myoblastes naïfs ils sont capables de fusionner avec les cellules fondatrices. Après la

reconnaissance entre myoblastes naïfs et cellules fondatrices, les membranes des deux

types de cellules s’apposent, des vésicules puis des plaques de pré-fusion (dont on ne

connait pas encore la composition) visualisables en microscopie électronique se forment.

Ensuite les membranes sont endocytées et des trous se forment, mettant en continuité les

cytoplasmes (Doberstein, Fetter et al. 1997) (Figure 23). On ne connait cependant presque

rien sur la constitution de ces ultrastuctures observables en microscopie électronique.

57

Figure 24. L’asymétrie des molécules de reconnaissance entre cellules fondatrices et myoblastes naïfs. Représentation schématique de la localisation des protéines de reconnaissance entre cellule fondatrice et myoblaste naïf.

Duf

SNSRst

Rst

Hbr

Duf

Cellule Fondatrice

Myoblaste naif

Hbr

Rst

Figure 25. Transduction du signal de fusion. Au niveau de la cellule fondatrice, Duf recrute Ants qui recrute Mbc ce qui va activer la voie Rac a l’origine du processus de fusion. La localisation de Rac à la membrane dépend de Loner dont la fonction passerait par ARF6. Au niveau des myoblastes naifs, on ne connait toujours pas comment Mbc est activé et recruté au niveau des sites de fusions.

SNS

DufOuRst

AntsMbc RAC

SNS

DufOuRst

Loner

ARF6

ARF6a

RACRACa

Cellule Fondatrice

Myoblaste naïf

Fusion

MbcRAC

RACa

Fusion

?

58

3.4.2 Reconnaissance Myoblaste naif/cellule fondatrice. La première étape de fusion est la reconnaissance entre myoblastes naïfs et cellules

fondatrices. Cette reconnaissance spécifique est rendue possible grâce à l’expression

dissymétrique dans les cellules fondatrices et myoblastes naïfs de protéines de surfaces de

la superfamille des immunoglobulines. Les cellules fondatrices expriment une protéine

membranaire appelé Dumbfounded (Duf) et les myoblastes naïfs une protéine appelée

sticks-and-stones (SNS) (Bour, Chakravarti et al. 2000; Ruiz-Gomez, Coutts et al. 2000).

Ces protéines à domaines immunoglobuline permettent une reconnaissance spécifique

myoblastes naifs/cellules fondatrices. Le mutant sns entraine une absence de fusion

consécutive à l’absence de reconnaissance entre myoblastes naifs et cellules fondatrices

(Bour, Chakravarti et al. 2000). La mutation duf entraine une absence de fusion avec une

faible pénétrance. Pour avoir un défaut de fusion total, il faut également muter le gène

paralogue roughest (rst) qui contrairement à sns est exprimé à la fois dans les myoblastes

naifs et les cellules fondatrices (Strunkelnberg, Bonengel et al. 2001). Enfin une autre

protéine à domaines immunoglobulines, Hybris, est exprimée dans les myoblastes naifs et

est capable d’intéragir avec Duf mais pas avec Rst en culture de cellules S2. Cependant le

mutant hybris ne montre aucun phénotype de fusion ((Artero, Castanon et al. 2001; Dworak,

Charles et al. 2001) (Figure 24).

La reconnaissance spécifique entre myoblastes naïfs et cellules fondatrices se fait

donc grâce à une répartition dissymétrique des protéines membranaires SNS et Duf (figure

21).

3.4.3 Transduction du signal L’activation de la voie RAC semble être essentielle pour le processus de fusion. Il

existe trois protéines Rac chez la Drosophile, RAC1, RAC2 et Mtl dont les activités sont

partiellement redondantes. L’analyse des simples, des doubles et des triples mutants a

montré que RAC1 et 2 étaient essentielles au processus de fusion (Hakeda-Suzuki, Ng et

al. 2002). La voix Rac est connue pour entrainer des remodelages du cytosquelette et de

nombreuses études montrent notamment que le cytosquelette d’actine intervient dans le

processus de fusion. L’activation de la voie Rac se fait par l’intermédiaire de nombreuses

protéines :

Antisocial (Ants/Rols 7) est une protéine adaptatrice exprimée dans les cellules

fondatrices et qui interagit physiquement avec Duf (Chen and Olson 2001; Rau, Buttgereit et

al. 2001). Ants recrute par une interaction directe Myoblast city (Mbc), l’homologue de

DOCK180 chez les vertébrés et de CED-5 chez C. elegans des protéines qui permet

l’activation de la voie RAC (Chen and Olson 2001). Ainsi la protéine Duf recrute Ants qui

recrute à son tour Mbc qui active la voi RAC, induisant ainsi le processus de fusion. La

59

60

protéine Mbc est également présente dans les myoblastes naïfs, mais on ne connait pas les

mécanismes qui permettent son recrutement à la membrane.

Une autre protéine est également impliquée dans l’activation de la voie RAC et dans

le processus de fusion. La protéine Loner qui est exprimée uniquement dans les cellules

fondatrices. Cette protéine se localise au niveau des sites de fusion par l’intermédiaire de

Duf et de Rst, par un mécanisme encore inconnu. Elle a des domaines protéiques classiques

des GEFs et est capable de contrôler l’activité GTPasique de Arf6 (ADP-ribosylation factor 6)

in vitro. Dans les cellules fondatrices loner active Arf6 qui permet un recrutement des

protéines RACs à la membrane enfin qu’elles puissent être activée par Mbc (Chen, Pryce et

al. 2003) (figure 25).

3.5 Elongation et attachement des fibres musculaire à l’épiderme En même temps que le déroulement du processus de fusion, la fibre musculaire

s’allonge vers les apodèmes, ses sites d’attachement à l’épiderme. Cette migration est

bidirectionnelle, c’est à dire que chaque extrémité de la fibre s’allonge vers ses sites

d’attachement en direction opposée (Schnorrer and Dickson 2004)

3.5.1 Attachement apodeme/muscle La formation des apodèmes est sous le contrôle du facteur de transcription Stripe.

Dans un mutant stripe l’expression de la majorité des marqueurs tendineux est réduite

(Frommer, Vorbruggen et al. 1996). Inversement l’expression ectopique de stripe dans le

mésoderme entraine une expression ectopique des marqueurs tendineux (Becker, Pasca et

al. 1997) Vorbruggen 1997). La liaison entre apodèmes et muscles se fait grâce aux

intégrines alpha et Beta-PS. Dans un mutant intégrine la fibre musculaire migre et s’attache

aux apodèmes, mais dés les premières contractions les muscles se détachent (Brown

200,2002).

3.5.2 Communication apodèmes –muscle L’expression de stripe dans les apodèmes débute avant l’expression de Twist et donc

de la formation des muscles. Ces données montrent que la spécification des apodèmes est

indépendante de celle des muscles (Becker, Pasca et al. 1997).

Dans les mutants stripe, les muscles projettent de longs filopodes qui ne trouvent

jamais leur site d’attachements. Inversement, la formation de tendons ectopiques par la

surexpression de stripe entraine une élongation des muscles vers ces nouveaux sites

d’attachement (Vorbruggen and Jackle 1997). Les tendons ont donc deux fonctions, la

première est d attirer les muscles et la seconde est d’arrêter leur élongation.

La détermination des tendons est, comme nous l’avons vu, indépendante de la

61

Stage 14 Stage 15

Stage 14 Stage 15

apterous-/-

Wt

Figure 26. La maturation des tendons dépend de l’interaction muscle/tendon. (A) représentation schématique du patron musculaire, En vert les muscles LT1-3 dont la formation est sous le contrôle de Apterous. (B) formation des Muscle LTs et des tendons (en rouge) dans un embryon sauvage. Au stade 14, de nombreuses cellules expriment Stripe. Au stade 15 seules les apodèmes où les muscles se sont attachés maintiennent l’expression de stripe. (C) Dans un mutant apterous, les muscles LT1-3 ne se forment pas. Dans ce mutant, la formation des tendons au stage 14 n’est pas affectée alors qu’au stade 15 les tendons normalement contactés par le muscles LTs arrêtent d’exprimer Stripe.

A B

C

62

formation des muscles. Cependant la maturation des cellules tendineuses dépend de

l’association muscle-tendon. Par exemple les muscle latéraux LT1(21), LT2(22), LT3(23) se

fixent sur trois tendons dorsaux et trois tendons ventraux (Figure 26A-B). Cependant avant

l’intéraction tendon/muscle on peut observer 14 cellules tendineuses dorsales qui expriment

Stripe. Ensuite les tendons où les muscles ne se seront pas attachés ne maintiennent pas

l’expression de Stripe et seules les trois cellules en contact avec les muscles activent les

facteurs de différenciations tendineux terminaux (Figure 26B). Réciproquement, dans un

mutant apterous où les muscles LT1(21), LT2(22) et LT3(23) sont absents (voir paragraphes

suivant), 14 cellules expriment Stripe transitoirement mais contrairement aux embryons

sauvages, aucune de ces cellules ne maintient cette expression et ne se différencie en

cellule tendineuse (Figure 26C). La différenciation des tendons est dépendante de Vein, un

ligand de la voie EGF (Epidermal Growth Factor) qui est sécrété par les muscles. Dans un

mutant vein l’expression de Stripe est diminuée et les marqueurs de différenciation

terminaux ne sont pas exprimés après l’interaction tendon-muscle. Inversement, une

expression ectopique de Vein entraine une expression ectopique de Stripe et des marqueurs

de différenciation terminaux (Figure 27).

Toutes ces données montrent que la formation des tendons est initialement

indépendante de la formation des muscles. Ensuite les tendons attirent les muscles et

arrêtent leur élongation. Une fois le contacte entres muscles et tendons établi, les muscles

induisent via la sécrétion de Vein, la différenciation terminal des tendons.

III/ L’identité Musculaire L’identité d’un muscle somatique est définie par un ensemble de propriétés: sa

position au sein d’un segment, son nombre de noyaux, son orientation, ses sites

d’attachement à l’épiderme et son innervation spécifique. Notre laboratoire distingue deux

types d’identité : l’identité intra-segmentaire et l’identité inter-segmentaire.

L’identité intra-segmentaire définit l’identité d’un muscle au sein d’un segment et est

sous le contrôle d’une combinatoire de facteur de transcriptions appelés facteurs identitaires

qui sont exprimés de façon différentielle ou spécifique dans chaque chaque cellule

fondatrice.

L’identité inter-segmentaire définit l’identité musculaire en fonction du segment

considéré ; elle est sous le contrôle des protéines homéotiques. Certains muscles peuvent

être présents ou non selon le segment et d’autres peuvent avoir des propriétés qui varient

en fonction des segments. Nous verrons dans une première partie comment les facteurs

identitaires régulent l’identité intra-segmentaire et dans une deuxième partie les quelques

données de la littérature qui soulignent le rôle des gènes homéotiques dans le contrôle de

l’identité inter-segmentaire.

63

64

Figure 27. Interaction muscle-tendon. (A) dans une première phase les tendons dont la détermination est indépendante du muscle attirent ce dernier. (B) le muscle en contact du tendon sécrète Vein qui induit la différenciation terminale des tendons.

Stripe

X

Stripe

Attraction des muscles par un signal encore inconnu et détermination des apodèmes indépendante des muscles.

Stripe

Différenciation des tendons dépendante des muscles

VEINEGFR

A

B

65

Expression d’Apterous

apterous -/- UAS -apterous

Perte des muscles: LT1(21), LT2(22), LT3(23) avec une pénétrance faible. Parfois perte du muscle VA3(29) .

On peut observer avec une pénétrance variable entre 4 et 6 muscles à la place des LT1(21), LT2(22) et LT3(23).

Figure 28. Apterous et l’identité intra-segmentaire. (A) En Bleu, expression d’Apterous dans les muscles. (B) Phénotype musculaire dans un mutant apterous. (C) Phénotype musculaire dans les embryons exprimant ectopiquement Apterous dans tout le mésoderme.

A

B C

De gauche à droite: LT1(21), LT2(22) LT3(23), LT4(24), DT1(18)

VA2(27)

VA3(29)

66

1. L’identité intra-segmentaire Plusieurs facteurs de transcription exprimés de façon différentielle dans les muscles

et contrôlant l’identité intra-segmentaire ont été caractérisés. Des mutations touchant ces

facteurs entrainent des pertes ou des duplications d’un sous ensemble de muscles. Nous

allons voir successivement quels sont ces différents facteurs et les muscles affectés par leur

perte ou surexpression.

1.1 Apterous et l’hypothèse de la combinatoire de facteurs de transcription :

Apterous est un facteur de transcription à homéo- et Lim-domaine. Ce facteur est le

premier gène d’identité musculaire caractérisé (Bourgouin, Lundgren et al. 1992). Les

auteurs ont d’abord montré qu’Apterous est exprimé dans des clusters de myoblastes puis

dans des cellules individuelles et enfin dans un sous ensemble de muscles. A cette époque,

il n’était pas encore établi que les clusters de cellules étaient des groupes d’équivalence

musculaires et que les cellules sélectionnées à partir de ces clusters étaient des

progéniteurs ou des cellules fondatrices. Cependant ils ont postulé que les cellules

exprimant Apterous étaient des ‘précurseurs’ d’un sous ensemble de muscles. Les auteurs

ont ensuite montré que l’expression d’Apterous était maintenue dans plusieurs muscles :

LT1(21), LT2(22) LT3(23), LT4(24), VA2(27), VA3(29) et parfois le muscle DT1(18) (Figure

28A).

La mutation d’apterous entraine la perte des muscules LT1(21), LT2(22), LT3(23)

avec une pénétrance variable. Le muscle VA3(29) est également absent mais de façon plus

sporadique (Figure 28B). Inversement, dans le cas d’embryons sur-exprimant Apterous on

peut observer des duplications des muscles LT1(21), LT2(22) LT3(23) avec une pénétrance

variable : on observe entre 4 et 6 muscles à la place de ces trois muscles dans un embryon

sauvage (bourgouin 1992) (Figure 28C).

Dans cette étude de 1992, les auteurs ont évoqué pour la première fois la notion de

combinatoire de facteurs de transcription contrôlant l’identité musculaire. Ils ont formulé cette

hypothèse car un autre facteur de transcription (S59) est également exprimé dans un sous

ensemble de muscles partiellement recouvrant avec l’ensemble des muscles exprimant

Apterous. Depuis cette analyse de la fonction d’Apterous dans l’identité musculaire, de

nombreux laboratoires ont étudié d’autres facteurs identitaires afin de comprendre les

mécanismes qui contrôlent l’identité musculaire.

67

Une seul muscle à la place des muscle DO1(9) et DO2 (10).Les muscles LT1(21), LT2(22) LT3(23) et LT4(24), sont absents avec une forte pénétrance.Les muscle VA1(26) et VA2(27) sont absents ou mal formés avec une pénétrance faibleMuscles SBM(8) exprimant de novo Lb.

Expression de MSH

msh-/- UAS-MSH

La surexpression entraine une perte ou une malformation des muscles DA3(3), DO5(20), DO3(11), DO4(19), LL1(4) et DT1(18).muscle SBM(8) absent et parfois transformé en LT exprimant Kr.

Figure 29. MSH et l’identité intra-segmentaire. (A) En vert, expression de MSH dans les muscles et en vert clair expression transitoire de msh non maintenue jusqu’à ce stade. (B) Phénotype musculaire dans un mutant MSH. (C) Phénotype musculaire des embryons exprimant ectopiquement MSH dans tout le mésoderme.

Muscles exprimant de novo Lb

Muscle exprimant de novo Kr

A

B C

De gauche a droite: LT1(21), LT2(22) LT3(23), LT4(24)

VA2(27)

DO1 (9)

DO2 (10)

VA1(26)

68

1.2 Les interactions cross répressive

• Msh MSH (Muscle Segment homeobox), un facteur de transcription à homéo-domaine,

orthologue des protéines Msx chez les vertébrés est le deuxième gène d’identité musculaire

à avoir été étudié (Robert, Sassoon et al. 1989), (Lord, Lin et al. 1995) (D'Alessio and Frasch

1996). Msh est exprimé dans des clusters situés dans les régions du mésoderme où se

forment les muscles LT1(21), LT2(22) LT3(23), LT4(24), les muscles VA1(26) et VA2(27),

les muscles DO1 (9) et DO2 (10). MSH est exprimé dans les progéniteurs et/ou les cellules

fondatrices à l’origine de ces muscles. L’expression de Msh persiste uniquement dans les

muscles DO1 (9) et DO2 (10) (Figure 29A).

Dans le mutant msh un seul muscle est présent à la place du muscle DO1 (9) et DO2

(10), les muscles LT1(21), LT2(22) LT3(23) et LT4(24) sont absents avec une fréquence

plus faible et les muscles VA1(26) et VA2(27) sont anormalement formés ou absents. La

surexpression de MSH entraine une perte ou une malformation des muscles DA3(3),

DO5(20), DO3(11), DO4(19), LL1(4) et DT1(18).

En 1999, le laboratoire de K. Jagla a montré que dans un mutant msh la perte des

muscles LT2(22) et LT4(24) qui expriment normalement Krüppel (Kr) était due à leur

transformation en muscle SBM(8) qui exprime Lady bird (Lb) (Kr et Lb étant deux autres

facteurs identitaires). La surexpression de MSH a un effet inverse avec une pénétrance

faible: le muscle SBM(8) est perdu et des muscles LTs surnuméraires exprimant Kr se

forment (Figure 29C)(Lord, Lin et al. 1995; Jagla, Bellard et al. 1999).

Ces données ont pour la première fois suggére qu’un facteur de transcription

identitaire pouvait inhiber l’expression d’un autre. Ainsi dans des embryons mutants pour un

facteur d’identité musculaire il semble qu’une autre combinatoire prend le relais ; au contraire

la surexpression d’un facteur identitaire peut inhiber un autre facteur identitaire et imposer sa

propre fonction. Cette propriété de ‘cross répression mutuelle’ des facteurs identitaires a été

très bien étudiée dans le cas du facteur S59.

• Slouch (S59) S59 est un facteur de transcription à homéo-domaine exprimé dans les progéniteurs

et les cellules fondatrices des muscles LO1(5) VT1(25) VA1(26), VA2(27), VA3(29), DT1(18),

DO3(11) et dans un précurseur musculaire adulte ventral ((Dohrmann, Azpiazu et al. 1990),

(Carmena, Bate et al. 1995). Son expression est maintenue dans les muscles DT1(18),

VT1(25) et VA2(27). S59 et Even-Skipped (Eve), sont les seuls facteurs identitaires dont la

co-localisation avec L’sc dans les clusters et les progéniteurs musculaires a été établie. S59

est exprimé dans le cluster 10 qui donne naissance à deux progéniteurs à l’origine des

muscles VA1(26), VA2(27), VA3(29) et un précurseur musculaire adulte ventral. Les autres

69

Expression de S59

S59-/- UAS-S59

cluster 10 PA

clusters 3

clusters 13

les muscles VA3(29), LO1(5) et VT1(25) sont absents; les muscles VA1(26), VA2(27) ont une mauvaise morphologie, le muscle SBM (8) est dupliqué, à la place des muscles DO3(11) et DT1(18) ont trouve un syncytium musculaire

Perte du muscle 8 et du précurseur adulte latéral du à la perte d’expression de Lb. Tout le patron musculaire est affecté.

Figure 30. S59 et l’identité intra-segmentaire. (A) En violet, expression de S59 dans les muscles; en violet clair, expression de S59 qui n’est pas maintenue après la formation des cellules fondatrices. àgauche de (A) le lignage des muscles exprimant S59. (B) Phénotype musculaire dans un mutant S59. (C) Phénotype musculaire dans les embryons exprimant ectopiquement S59 dans tout le mésoderme; le patron musculaire n’est pas représenté car le phénotype est extrêmement sévère.

A

B C

De gauche à droiteVT1(25) VA1(26), VA2(27), VA3(29),

DT1(18),DO4(11)

LO1(5

70

progéniteurs exprimant S59 sont issus des clusters 3 (muscles LO1(5) et VT1(25) et 13

(muscle DT1(18), et probablement le muscle DO3 (11). [En fait il doit s’agir du muscle

DO4(19), muscle parallèle au DO3 (11) car notre laboratoire a montré que les muscles

DT1(18) et DO4(19) dérivent du même progéniteur]. Pour les clusters 3 et 10, S59 n’est

exprimé qu’au stade progéniteur (Carmena, Bate et al. 1995). De ces observations ont peut

déduire deux choses : tout d’abord l’expression d’un facteur identitaire peut débuter au stade

cluster ou progéniteur selon le muscle; ensuite qu’un même cluster peut donner naissance à

plusieurs progéniteurs (figure 30A).

L’analyse du rôle de S59 dans le contrôle de l’identité musculaire n’a été possible

qu’à la suite de l’obtention d’un mutant EMS (Ethylmethane Sulphonate) en 1999 (Knirr,

Azpiazu et al. 1999). Un marquage des muscles par un anticorps contre la MHC (Myosine

Heavy Chain) a permis de montrer que dans le mutant S59, les muscles VA3(29), LO1(5) et

VT1(25) sont absents, les muscles VA1(26) et VA2(27) ont une morphologie altérée, le

muscle SBM (8) est dupliqué et à la place des muscles DO3(11) et DT1(18) on observe un

seul syncytium musculaire (figure 30B).

Comme pour l’analyse des autres facteurs identitaires la mutation ou la surexpression

de S59 n’affecte qu’un sous ensemble de muscles (figure 30B et C). Cependant les auteurs

ont ensuite cherché à comprendre s’il existait un lien entre la duplication du muscle SBM (8)

et l’absence des muscle LO1(5) et VT1(25). Dans un embryon sauvage S59 est exprimé

dans les progéniteurs à l’origine des muscles LO1(5) et VT1(25) et son expression n’est

maintenue que dans le muscle VT1(25). D’autre part, le progéniteur à l’origine du muscle

SBM (8) et d’un précurseur de muscle adulte (PMA) exprime Ladybird. Dans un mutant

S59, le progéniteur du muscle LO1(5) et VT1(25) exprime de novo Ladybird et cette

expression entraine une transformation de ce progéniteur en progéniteur de type

SBM(8)/PMA, aboutissant à une duplication du muscle 8 et du précurseur musculaire adulte

(Figure 30). Réciproquement la surexpression de S59 dans le progéniteur du muscle

SBM(8)/PMA entraine la perte d’expression de Ladybird dans ce lignage (figure 31).

Ces données montrent que les facteurs identitaires peuvent se réprimer

mutuellement. Cette ‘cross répression’ entres facteurs identitaires participe très

probablement dans un embryon sauvage à la spécificité de la combinatoire exprimée par

chaque cellule fondatrice

1.3 Les facteurs identitaires et la division asymétrique : Krüppel krüppel est un gène de segmentation qui code pour un facteur de transcription à

doigts de zinc C2H2 qui reconnait la séquence consensus AAAAC/GGGGTTAA (Pankratz,

Hoch et al. 1989; Treisman and Desplan 1989). Il joue un rôle essentiel dans la

segmentation de l’embryon en régulant l’expression des gènes de segmentation ‘paire-rules’

71

72

S59 lb S59 Lb

LO1(5) et VT1(25)SBM(8) et PMA SBM(8) et PMA

S59-/-wt

Figure 31. La ‘cross’ répression entre S59 et Lb. (A) Dans un embryon sauvage, S59 réprime l’expression de Lb dans le lignage des muscles LO1(5) et VT1(25). (B) Dans un embryon S59 mutant lb est dé-réprimé, entrainant la formation d’un muscle SBM(8) et d’un Précurseur Musculaire Adulte (PMA) surnuméraire. En jaune expression de Lb, en violet expression de S59.

LO1(5)

VT1(25)

SBM(8)

PMA

A B

SBM(8)

PMA

73

Expression de Krüppel

Krüppel-/- UAS-Krüppel

Muscles dont la morphologie ou l’orientation est affecté: DA1(1), LL1(4), VO2 (14.2) et le muscle VA2(27) .Muscles qui sont absents et qui peuvent être occasionnellement transformé: LT2(22), LT4(24) et VO5(16)

Dans la surexpression, les auteurs n’ont décrit que le muscle VA2(27) qui est dupliqué.

cluster 10

Figure 32. Krüppel et l’identité intra-segmentaire. (A) En orange, expression de Krüppel dans les muscles; En orange clair, expression expression faible de Kr. A gauche de (A), le lignage du muscle VA2(27). (B) Phénotype musculaire dans un mutant Krüppel. (C) Phénotype musculaire dans les embryons exprimant ectopiquement Krüppel dans tout le mésoderme.

A

B C

DO1(9)

LL1(4)

DA1(1)

De gauche à droite:LT1(21), LT2(22), LT4(24), DT1(18)

VA2(27)VO5(16)

De haut en bas VL2(13), VL3(6), VL4(7) et VO2(14.2).

74

(Howard 1990). krüppel intervient également dans le développement du système nerveux

(Schmucker, Taubert et al. 1992), du système nerveux central (Romani, Jimenez et al.

1996), des analogues des tubes de Malpighi et du système nerveux stomo-gastrique (Gaul

and Weigel 1990).

Krüppel est exprimé dans différents progéniteurs musculaires mais son expression

est toujours perdue dans une des cellules fondatrices issues du progéniteur Kr+ avant la

fusion, et est maintenue a un degré variable selon les muscles. L’identification des

précurseurs musculaires exprimant Krüppel a été faite d’après leur morphologie. Krüppel est

exprimé dans les muscles DA1(1) DO1(9), LL1(4), LT2(22), LT4(24), VL2(13), VL3(6),

VL4(7), VO5(16), VA2(27) et VO2 (14.2). L’expression s’arrête au stade 14 dans les muscles

VL2(13) et VL4(7) et à la fin du stade 15 pour tous les autres. On détecte une expression

faible pour les muscles LT1(21) et DT1(18) (Figure 32A).

La fonction de Krüppel dans l’identité musculaire a été établie par l’analyse d’un

mutant après sauvetage des fonctions de segmentation (Ruiz-Gomez, Romani et al. 1997).

Les auteurs ont montré que le phénotype musculaire est variable selon les muscles et ont

distingués trois classes phénotypiques. La première classe regroupe les muscles non

affectés par la mutation de krüppel , les muscles DO1(9) et VL3(6). La seconde classe

regroupe les muscles dont la morphologie ou l’orientation est affectée dans un mutant

krüppel , les muscles DA1(1), LL1(4), VO2 (14.2) et VA2(27). La troisième classe regroupe

les muscles qui sont absents ou occasionnellement transformés, les muscles LT2(22),

LT4(24) et VO5(16) (Figure 32B).

Les auteurs ont ensuite analysé de façon précise le lignage du muscle VA2 qui

exprime à la fois Kr et S59. Ces deux facteurs sont exprimés dans le progéniteur donnant

naissance aux muscles VA1(26) et VA2(27) mais cette expression est uniquement

maintenue dans la cellule fondatrice et le muscle VA2(27) (Figure 33B). Dans un mutant kr

l’expression de S59 correspondant au muscle VA2(27) est perdue et le muscle VA1(26) est

dupliqué (Figure 33A). A l’inverse, la surexpression de Kr dans tout le mésoderme entraine

la duplication du muscle VA2 exprimant S59 (Figure 33C). Les auteurs ont donc postulé que

Kr est nécessaire à l’identité VA2(27) versus VA1(26) et que sa fonction passe notamment

par le maintien de l’expression de S59 (Ruiz-Gomez, Romani et al. 1997).

Les mêmes auteurs ont également montré qu’au cours de la division asymétrique du

progéniteur VA2(27)/VA1(26), la protéine Numb ségrége dans la cellule fondatrice VA2(27)

inhibant ainsi la voie Notch (Figure 33E). Dans un mutant numb, le muscle VA1(26) est

dupliqué comme dans le mutant krüppel (Figure 33D). A l’inverse une surexpression de

Numb entraine une duplication du VA2(27) comme observé après surexpression de Krüppel

(Figure 33F) (Ruiz Gomez and Bate 1997). La surexpression des d’un facteur identitaire

peux donc contourner l’effet de la voie Notch.

75

76

Kr S59

VA2(27)VA1(26)

KrS59

VA2(27)VA2(27)VA2(27)VA1(26)

Kr S59

VA1(26) VA2(27)VA3(29)AP

wtKr/-- UAS-Kr

wtnumb/-- UAS-numb

Figure 33. Krüppel peut contourner la signalisation Notch. (A-B) Formation des muscles VA1(26) et VA2(27) dans un embryon sauvage (B), mutant pour kr (A), exprimant ectopiquement Kr dans tout le mésoderme (C). (B) Dans un sauvage Kr contrôle positivement l’expression de S59. (A) Dans un mutant kr, s59 n’est plus exprimé et le muscle VA2(27) se transforme en muscle VA1(26). (C) Dans la surexpression de Kr, S59 est exprimé ectopiquement dans le muscle VA1(26) qui se transforme en muscle VA2(27). (D-F) Formation des muscles VA1(26) et VA2(27) dans un embryon sauvage (E), mutant pour numb (D), exprimant ectopiquement Numb dans tout le mésoderme (F). (B) Dans un sauvage Numb ségrége dans le VA2(27) où il inhibe la signalisation Notch. (E) Dans un mutant numb, Notch n’est plus réprimé dans les muscle VA2(27) entrainant une répression de Kr et S59 qui transforme le VA2(27) en VA1(26). (C) Dans la surexpression de Numb, Notch est réprimé dans le muscle VA1(26), Kr et S59 sont alors dé-réprimés dans le muscle VA1(26) qui se transforme en muscle VA2(27). Remarque: la voie Notch peut être contourné par la surexpression de Kr dans le muscle VA1(C).

A B C

D E F

77

Expression de Eve

eve-/-

Figure 34. Eve et l’identité intra-segmentaire. (A) En rouge, expression de Eve dans les muscles; àgauche de (A) le lignage des muscles exprimant Eve . (B) Phénotype musculaire dans un mutant eve. CC: Cellule Cardiaque, CPC: Cellule Péri-Cardiaque

A

B

Muscles DA1(1) et DO2(10) absents

Cluster 2

Cluster 15

CC

CPC DO2(20)

DA1(1)

78

L’ensemble de ces données a permis de montrer que la division asymétrique génère

la diversité musculaire par l’inhibition sélective de certains facteurs identitaires dans les

cellules fondatrices.

1.4 La mise en place de la combinatoire : Even skipped Even skipped (Eve) est un gène de segmentation de type ‘pair rule’ (Nusslein-

Volhard and Wieschaus 1980; Frasch, Hoey et al. 1987). Le patron d’expression d’Eve dans

les lignages cardiaques et musculaires a été sujet à de nombreuses versions et vient juste

d’être établi de façon définitive. La protéine Eve est exprimée dans deux clusters dorsaux qui

se forment séquentiellement. Dans un premier temps un cluster de 4 cellules se forme

(cluster 2), d’où un progéniteur est sélectionné qui se divise pour donner la cellule fondatrice

du DO2(20) et un précurseur de cellule péricardiaque qui va lui-même se diviser en deux

cellules péricardiaques. L’expression de eve dans ce lignage s’arrête après le stade

progéniteur. Ensuite un deuxième cluster de deux cellules (cluster 15) se forme d’où est issu

le progéniteur du DA1(1) et le précurseur de deux cellules cardiaques (Carmena,

Gisselbrecht et al. 1998), (Carmena, Buff et al. 2002), (Speicher, Fischer et al. 2008) (Figure

34A et 22). Dans un embryon mutant eve où les fonctions pair rule sont sauvées, les

muscles DA1 et DO2 ne se forment pas (Figure 34B) (Fujioka et al. 2009).

Nous avons vu dans les paragraphes précédents que les clusters de cellules

exprimant l’sc ont des coordonnées bien précises au sein du mésoderme. A ce jour aucune

donnée n’explique l’acquisition de ces coordonnées. Cependant l’analyse d’un module cis

régulateur contrôlant l’expression d’eve dans les clusters 2 et 15 montre une intégration

directe d’une information tissulaire et de position en provenance de l’ectoderme. En effet ce

module cis régulateur est sous le contrôle des facteurs mésodermiques Twist et Tinman. Il

intègre également une information de position ; les protéines Wg et Dpp sécrétées par

l’ectoderme vont contrôler directement, via leurs effecteurs D-TCF et MAD, l’expression

d’eve au sein des clusters 2 et 15. Enfin ce module cis régulateur est régulé par Pointed, qui

est l’effecteur des voix EGF et FGF qui nous l’avons vu sont essentielles à la formation des

clusters dorsaux (Halfon, Carmena et al. 2000).

1.5 Les cibles de la combinatoire : Lady Bird

Deux gènes appelés lady bird early and late et situés au même locus chromosomique

codent pour deux protéines homologues regroupé sous le nom de Lady bird. Ces protéines

sont des facteurs de transcription à homéo-domaine qui sont les orthologues de lbx1 chez

les vertébrés (Jagla, Stanceva et al. 1994). Lb est exprimé dans un seul cluster musculaire

dont est issu un progéniteur qui se divise pour donner la cellule fondatrice du muscle

SBM(8) et un progéniteur qui se divise à nouveau pour former deux cellules précurseurs des

79

Expression de Ladybird

clusters 3

AP AP

SBM(8)

Ladybird-/- UAS-Ladybird

Figure 35. Ladybird et l’identité intra-segmentaire. (A) En jaune, expression de LadyBird dans les muscles; à gauche de (A) le lignage des muscles exprimant Ladybird . (B) Phénotype musculaire dans un mutant ladyBird. (C) Phénotype musculaire dans les embryons exprimant ectopiquement Ladybirddans tout le mésoderme.

Muscle SBM(8) absent Muscle SBM(8) dupliqué

A

B C

80

muscles adultes (Figure 35A).

Des mutations touchant lb entrainent avec un pénétrance d’environ 50% des cas une

perte du muscle 8 et des précurseurs musculaires adultes. Dans les 50% restant le muscle

SBM(8) présente des problèmes d’attachement, d’orientation et/ou de fusion (Figure 35B).

La surexpression de Lb entraine une duplication du muscle SBM(8) et une augmentation du

nombre de précurseurs adultes, accompagnées d’une disparition des muscles latéraux qui

expriment normalement Kr. Ces données de surexpression montrent que Lb change

probablement le destin de ces muscles latéraux en destin SBM(8) (Jagla, Bellard et al. 1998)

(Figure 35C).

Lady bird est le seul facteur identitaire dont les cibles transcriptionnelles ont été

systématiquement recherchées. Les transcriptomes d’embryons sur-exprimant Lb ou un

ARN interférent contre lb sous le contrôle d’un pilote mésodermique ont été analysés

(Junion, Bataille et al. 2007). Les auteurs ont identifié 1931 gènes dont l’expression variait

dans ces conditions. Ladybird étant également exprimé dans les cellules cardiaques qui

dérivent du mésoderme, les cibles de lb spécifiques du muscle SBM(8) restent à préciser.

Parmi les cibles putatives, les auteurs ont trouvé des facteurs de transcription identitaires

comme Nautilus et S59 dont l’expression diminue en condition de surexpression de Lb,

confirmant qu’un gène identitaire peut inhiber l’expression d’autres gènes identitaires. Des

gènes de la matrice extracellulaire comme vkg dont l’expression augmente en condition de

surexpression ont également été trouvés parmi les cibles de Lb ainsi que des gènes codant

pour des protéines remodelant le cytosquelette d’actine comme Msp300 ou Mp20. La

poursuite de cette étude a été l’analyse des phénotypes engendrés par des mutations dans

ces gènes cibles et leur comparaison avec le phénotype mutant lb. Le phénotype du muscle

SBM(8) provoqué par l’expression d’un ARNi lb montre des problèmes de fusion, de

migration et d’attachement. Des embryons exprimant des ARNi msp300, mp20 ou vkg

montrent des phénotypes similaires. La perte de fonction partielle de msp300 entraine un

problème de migration du muscle SBM(8), celle de mp20 un problème de fusion et celle de

vkd, un problème d’attachement. Il faut cependant noter que ces 3 gènes sont exprimés

dans tous les muscles et que les mutations pertes de fonction de ces gènes entrainent des

phénotypes musculaires généraux. Ces données ont montré que Lb peut spécifiquement

réguler dans un muscle unique (SBM(8)) des gènes qui sont par ailleurs probablement

régulés par d’autres facteurs dans d’autres muscles (figure 36). Ces analyses de

transcriptome n’ont donc pas complètement répondu à la question : quels sont les gènes

conférant au muscle SBM(8) son identité propre ?

Les auteurs ont ensuite réalisé des expériences de ChIP (Chromatine Immuno-

Pécipitation) à partir d’embryons entiers, couplées à un analyse bioinformatique basée sur

l’enrichissement en sites de fixation pour Lb (qui a été défini par SELEX) et Mef2, et en E-

81

Figure 36. les pertes de fonctions des cibles de Lb miment le phénotype lb mutant. (A-H) embryon immuno-marqué contre la MHC en vert et Lb en rouge. Le génotype des embryons est notésur chaque figure et le phénotype à droite des figures. Entre les deux colonnes de figures, un schéma des différents phénotypes.

Junion, G., L. Bataille, et al. (2007). "Genome-wide view of cell fatespecification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors." Genes Dev 21(23): 3163-3180.

82

Box (site où notamment Twist peut se fixer). L’analyse a permis de sélectionner 8 gènes

candidats dont cinq ont une expression qui varie en condition de surexpression ou mutante

pour lb. Sur ces cinq gènes un mutant a été analysé, celui touchant le gène CG8698/UNC93.

L’analyse montre un problème de contraction musculaire générale dans ce mutant. La même

équipe a montré par une autre approche qu’if, un gène codant pour une intégrine Alpha-

BPS, était directement régulé par Lb. Nous avons vu que les intégrines sont essentielles à

l’attachement musculaire. Un module cis régulateur contrôle l’expression d’if dans un sous

ensemble de muscles incluant le muscle SBM(8). Or If est exprimé dans tous les muscles et

est contrôlé notamment par Mef2. Ces données confirment que lb peut contrôler des gènes

exprimés dans tous les muscles en coopération avec des facteurs mésodermiques

musculaires.

1.6 Conclusion sur l’identité intra-segmentaire Que retenir de l’analyse de la combinatoire de facteurs de transcription régulant

l’identité intra- et inter-segmentaire ?

Des surexpressions ou des mutations des facteurs d’identité peuvent entrainer des

transformations musculaires dans un sous ensemble de muscles. Ces transformations

musculaires ont mis en évidence un mécanisme de ‘cross-répression’ des facteurs

identitaires à l’origine de différents lignages. Un facteur de transcription peut donc conférer

une identité particulière à un muscle, au moins en partie par la répression d’une autre

combinatoire. On a en quelque sorte des combinatoires ‘dormantes’ qui, dans un mutant

identitaire, peuvent être dé-réprimées et entrainer des transformations identitaires. Le

mécanisme de cross-répression peut être à la base de l’établissement de deux lignages

musculaires définis à partir du même progéniteur. Par exemple, Krüppel est exprimé dans le

progéniteur du VA1(26) / VA2(27) mais n’est maintenu que dans le VA2(2) suite à la

répression par Notch. Dans un mutant kr, deux muscles VA1(26) se forment, montrant ainsi

que Kr inhibe la combinatoire identitaire du VA1(26) dans un embryon sauvage.

Inversement, la surexpression de Kr entraine la formation de deux VA2(2). On observe

exactement les mêmes phénotypes en cas de surexpression ou de perte de fonction de

numb. En d’autre terme la signalisation Notch « exploite » le mécanisme de ‘cross-

répression’ pour créer de la diversité musculaire.

La mise en place d’une combinatoire spécifique au sein des cellules fondatrices en

fonction de leur position dans le mésoderme est essentielle afin d’assurer un patron

musculaire correct. Comment cette combinatoire est-elle établie ? A ce jour, on ne connait

qu’un seul exemple bien caractérisé, celui de l’expression d’eve dans le muscle DA1 (1). Le

contrôle de l’expression d’eve dans deux clusters prédétermine donc son expression dans

deux cellules fondatrices musculaires. Cependant on ne connait presque rien sur les

83

A

B

Figure 37. Expression et organisation génomique des gènes homéotiques. (A) A gauche, expression des gènes homéotiques dans l’épiderme d’un embryon de Drosophile; à droite, expression dans un embryon de souris au niveau de la tête et du tronc. Le code couleur correspond au code couleur en B. (B) Organisation génomique des gènes homéotiques chez Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Mus. musculus.

Pearson, J. C., D. Lemons, et al. (2005). "Modulating Hox gene functions during animal body patterning." Nat Rev Genet 6(12): 893-904.

complexe Bithopraxcomplexe Antennapedia

84

mécanismes de contrôle de l’expression des facteurs de transcription dans les clusters.

Enfin, de nombreux facteurs de transcription et leur rôle dans le contrôle de l’identité

intra-segmentaire ont été étudiés. Cependant on ne connait pas encore les effecteurs de

cette combinatoire.

La majorité des études sur le rôle des facteurs d’identité musculaire ont été

restreintes aux segments abdominaux. Dans les paragraphes suivants, sont présentés la

variation du parton musculaire en fonction des segments et le rôle majeur des gènes

homéotiques dans la mise en place de ce patron.

2. L’identité inter-segmentaire 2.1 Généralités sur les gènes homéotiques Les gènes homéotiques initialement identifié chez la Drosophile sont les régulateurs

majeurs de la diversité des formes des bilatériens. Ces gènes sont exprimés de façon

différentielle selon l’axe antéropostérieur et sont des gènes paralogues organisés en clusters

dans le génome (Figure 37A-B). Chez la drosophile, leur position 5’-3’ dans les clusters

reflète leur expression selon l’axe antéropostérieur. Des mutations ou des surexpressions

des gènes homéotiques entrainent des transformations tissilaires dite ‘transformations

homéotique’ (Lewis 1978; Kaufman, Seeger et al. 1990). Je ne citerai que les deux

transformations homéotiques les plus connues. La première est la transformation antenne

en patte (Struhl 1981) qui est due à l’expression ectopique d’un gène homéotique appelé

Antennapedia dans le territoire des antennes (Figure 38A-B). Antennapedia est exprimé et

spécifie dans le disque imaginal de patte dans le segment T2. Le disque imaginal à l’origine

de l’antenne est spécifié dans une drosophile sauvage par l’expression du gène homéotique

Dfd (segment antérieur à T2). Une expression ectopique d’Antenapedia entraine une

transformation de ce disque en disque de patte et par voie de conséquence une

transformation homéotique antenne>patte (Struhl 1981; Scott and Weiner 1984; Schneuwly,

Klemenz et al. 1987). Le deuxième exemple que je citerai est la transformation altère en aile

qui est due à une perte de fonction du gène homéotique Ultrabithorax (Ubx) (Lewis 1978) .

Cette transformation est engendrée par la dérépression d’Antennapedia dans le disque

d’altère du segment T3. Antennapedia qui spécifie normalement le disque d’aile dans le

segment T2 transforme le disque d’altère en disque d’aile entrainant l’apparition de deux

paires d’ailes chez la mouche adulte (figure 39) (Lewis 1978; Bender, Akam et al. 1983).

Ces expériences ont aussi révélé la notion de prévalence postérieure : des mutations

homéotiques entrainent souvent des transformations d’un segment d’identité postérieure en

un segment d’identité plus antérieure. Inversement la surexpression d’un gène homéotique

transforme l’identité des segments antérieurs vers une identité postérieure.

85

86

Figure 38. transformation homéotique antenne>patte. (A-B) Têtes de Drosophile vues de face en microscopie électronique à balayage. (A) Tête d’une drosophile sauvage où les antennes se forment correctement (flèches jaunes). (B) Tête d’une drosophile surexprimant Antp dans le territoire de formation des antennes. Cette surexpression entraine une transformation des antennes>pattes.

A B

Struhl, G. (1981). "A homoeotic mutation transforming leg to antenna in Drosophila." Nature 292(5824): 635-638.

Figure 39. Transformation homéotique altère-aile. (A-B) Drosophiles vues de dos en microscopie optique. (A) Drosophile sauvage où les altères se forment correctement (flèches noires). (B) Drosophile où la fonction de Ultrabithorax est abolie dans le disque imaginal d’altère, entrainant une transformation altères>ailes.

A B

Lewis, E. B. (1978). "A gene complex controlling segmentation in Drosophila." Nature 276(5688): 565-570.

87

Figure 40. Sites de fixation des protéines homéotiques in vivo et in vitro. La colonne de gauche repésente les sites de fixation consensus des protéines Hox in vitro, déterminée par la méthode de simple hybride chez la bactérie ( Bacterial 1 Hybride:B1H). La colonne de droite représente les sites de fixation consensus in vivo recensés dans la littérature. En ordonnée de chaque diagramme, la fréquence; en abscisse, la position des nucléotides dans les séquences consensus. La taille de chaque nucléotide est proportionnelle à la fréquence à cette position.

88

2.2 Organisation génomique Les gènes Hox sont au nombre de huit chez la drosophile et répartis en deux

complexes sur le chromosome 3. La répartition de leurs orthologues chez la souris et le

nématodes est représenté sur la figure 37 (Pearson, Lemons et al. 2005). Les gènes Hox

codent pour des facteurs de transcription ayant un motif de liaison à l’ADN appelé

homéodomaine. Ils reconnaissent des séquences d’ADN appelés homéobox et la spécificité

de liaison de chaque Hox est representée sur la figure 40.

Le premier complexe est nommé ‘complexe Bithorax’ (BX-C) (Lewis 1978) et contient

les gènes Ultrabithorax (Ubx), abdominal-A (abd-A) et Abdominal-B (abd-B). Ces gènes

spécifient les segments abdominaux de la larve et les segments abdominaux et les

segments thoraciques postérieurs de la drosophile adulte (Scott and Weiner 1984) (Figure

37B)

Le deuxième complexe est nommé ‘complexe Antennapedia’ (Antp-C) (Scott and

Weiner 1984; Kaufman, Seeger et al. 1990) et contient cinq gènes : labial (lb), proboscipedia

(pb), Deformed (Dfd), Sex combs reduced (Scr) et Antennapedia (Antp). Ces gènes

spécifient les segments céphaliques et thoraciques de la larve et de la mouche adulte

(Figure 37B).

2.3 Les cibles des gènes Hox Il existe moins de 40 cibles connues régulées in vivo directement par le protéines

Hox, tout organisme confondu, et dont la majorité ont été découvertes chez la drosophile.

Elles correspondent pour la plupart des cas à des facteurs de transcription (richard 2009).

Les exemples les mieux documentés de la fonction des gènes homéotique dans

spécification de l’identité antéro-postérieure sont décrits chez la drosophile :

2.3.1 Les gènes Hox et la formation des appendices Distal-less (Dll) est un facteur de transcription contrôlant la formation des appendices

chez la mouche. Les protéines Hox Ubx, Abd-A et Abd-B répriment dll dans les segments

postérieurs enfin d’éviter la formation d’appendices dans l’abdomen (Vachon, Cohen et al.

1992). Par ailleur en présence d’Homothorax (Hth) qui est un cofacteur des protéines Hox,

Dll induit la formation d’antennes alors qu’il induit la formation des patte en absence de Hth

(Percival-Smith, Teft et al. 2005). Antp réprime Hth dans les disques imaginaux de pattes

permettant la formation de pattes et non d’antennes. Ces données montrent que les gènes

homéotiques peuvent réguler des facteurs de trancription très en amont de la cascade de

formation d’un organe (Figure 41A).

89

Figure 41. Exemple de gènes régulés par les protéines Hox et impliqués dans la morphogenèse. (A) Régulation de distaless (dll) et formation des appendices. Dans les segments abdominaux, Ubx(vert) Abd-A (bleu clair) et Abd-B (Bleu foncé) répriment dll empêchant la formation d’appendices dans ces segments. Dans les segments thoraciques Antp, (vert) réprime hth permettant ainsi la formation des pattes; dans les segments plus antérieurs Dll et Hth régulent la formation des antennes. (B) régulation de rpr et formation de la commissure maxillaire/labiale. Dans le segment maxillaire, Dfd (orange) régule directement rpr ce qui conduit, par un mécanisme d’apoptose, à la formation de la commissure maxillaire/labiale. (C) Abd-B et la régulation de cascade moléculaire régulant la formation du spiracle postérieur. Abd-B régule l’expression des facteurs de transcritption Cut , Empty, Spiracle, Spalt et d’un ligand de la voie JAK/Stat, Upd. Tous ces facteurs régulent a leur tour de nombreux effecteurs responsables de la formation du spiracle postérieur.

Hueber, S. D. and I. Lohmann (2008). "Shaping segments: Hox gene function in the genomic age." Bioessays 30(10): 965-979.

90

2.3.2 Les Gènes Hox et la commissure maxillaire/labial Les protéines homéotiques peuvent également réguler des protéines intervenant

directement dans le modelage des formes des segments. reaper (rpr) est un gène pro-

apoptotique qui, en induisant l’apoptose permet à la commissure séparant le segment

maxillaire du segment mandibulaire de se former. L’expression de rpr dans le segment

maxillaire qui est nécessaire à la formation de cette commissure est dépendante de la

protéine homéotique Dfd. Dans un mutant Dfd la commissure maxilaire/mandibulaire ne se

forme pas. Le phénotype d’absence de commissure dans un mutant dfd peut être sauvé en

exprimant rpr dans le segment maxillaire. Les auteurs ont également montré que Dfd

contrôle directement l’expression de rpr (Lohmann, McGinnis et al. 2002). Les protéines

homéotique peuvent donc controler l’expression de protéines intervenant directement dans

le modelage des formes (figure 41B).

2.3.3 Les Gènes Hox et le spiracle postérieur Les protéines homéotiques peuvent avoir des cibles multiples afin d’induire la

formation d’un organe. C’est le cas d’AbdB qui controle la formation du spiracle postérieur,

structure reliant la trachée à l’extérieur. AbdB induit la formation de cet organe dans la partie

postérieure de la larve en régulant l’expression des facteurs de transcription Cut , Empty,

Spiracle, Spalt et de Upd, un ligand de la voie JAK/Stat. Ces protéines à leur tour activent

l’expression d’une cascade de gènes responsables de la réalisation du spiracle (Hu and

Castelli-Gair 1999; Lovegrove, Simoes et al. 2006).

2.4 Les protéines homéotiques et l’identité intra-segmentaire Il existe très peu d’études sur le rôle des gènes homéotique dans la modulation du

patron des muscles somatiques. Les gènes homéotiques Antp, Ubx, abdA , et AbdB

contrôlent la formation des muscles somatiques par une fonction autonome dans le

mésoderme (Michelson 1994; Roy, Shashidhara et al. 1997). En effet, lorsqu’on surexprime

ces gènes dans le mésoderme de segments plus antérieurs à leur domaine d’expression

normal, on observe une transformation du patron musculaire vers une identité plus

postérieure. Cependant on ne sait pas quand et ou dans le mésoderme les gènes

homéotiques contrôlent la mise en place du patron musculaire selon l’axe A/P.

91

92

Résultats

De nombreux aspects de la combinatoire des facteurs identitaires restent peu

étudiés, une limite ayant été l’étude d’un facteur à la fois. Dans ce contexte, j’ai utilisé

comme modèle le muscle DA3(3) qui exprime deux facteurs identitaires Collier et Nautilus.

Au cours de ma thèse, j’ai procédé à l’analyse comparée des phénotypes causés par des

pertes de fonction de ces facteurs. Nous verrons ci-dessous les conclusions de cette analyse

et les relations d’épistasie entre ces deux facteurs.

Il n’existe qu’une seule étude appronfondie de la mise en place de la combinatoire, le

contrôle de l’expression d’Eve. Je me suis attaché à étayer ce modèle en l’élargissant à un

autre facteur identitaire, Collier. Nous verrons que, comme Eve, l’expression de Collier est

sous le contrôle d’une information tissulaire et de position, mais également sous le contrôle

d’une information homéotique.

Un des enjeux majeur pour la compréhension de la combinatoire est d’en trouver les

cibles. Malheureusement je n’ai pas eu le temps d’aborder cette question au cours de ma

thèse. Cependant nous verrons dans la partie discussion les approches possibles.

Enfin la majorité des études réalisées sur le rôle des facteurs d’identité musculaire

ont été restreintes aux segments abdominaux, sans tenir compte de la variation inter-

segmentaire du patron musculaire. Le rôle des gènes homéotiques dans le contrôle de la

diversité du patron musculaire en fonction des segments a donc constitué l’axe principal de

mes travaux de thèse. Cette section en décrit les résultats principaux. Elle est articulée autour de 3 articles

dont un en cours de rédaction. On peut distinguer deux parties.

1/ l’étude de l’identité intra-segmentaire du muscle DA3. Cette partie se subdivisera

en deux sous parties: la propagation de l’identité musculaire de la cellule fondatrice aux

autres noyaux de la fibre et les rôles respectifs de Collier et Nautilus dans l’identité du

muscle DA3 (3) (articles I et II).

2/ l’étude du rôle des gènes homéotiques dans le contrôle de l’identité du muscle

DA3(3) entre segments et des liens entre l’identité intra- et inter-segmentaire (article III).

93

94

A/ L’identité intra-segmentaire du muscle DA3 ; Rôles respectifs des facteurs de transcription Nautilus et Collier.

Article I: collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity. Laurence Dubois, Jonathan Enriquez, Virginie Daburon, Fabien

Crozet, Gaelle Lebreton, Michèle Crozatier and Alain Vincent. Development 2007

L’article de Dubois et al., publié en 2007 décrit l’expression de collier et nautilus au

cours du développement d’un muscle, le muscle DA3 et les relations transcriptionnelles entre

ces deux facteurs de transcription.

Ma contribution principale à cette article a été de définir précisément la fenêtre

d’expression de chacun de ces deux gènes en utilisant des sondes introniques permettant

de détecter les transcrits naissants des gènes collier et nautilus. Mes expériences de double

hybridation in situ couplées à une immuno-coloration de Collier permettant de visualiser les

noyaux du muscle DA3 en formation ont montré que, suite à la division du progéniteur

DA3/DO5, la cellule fondatrice DA3(3) continue de transcrire col tandis que cette

transcription est réprimée dans la cellule fondatrice DO5(20). Un travail antérieur de l’équipe

avait montré que la voie Notch était responsable de cette répression. Cependant la stabilité

de la protéine Collier n’avait pas permis d’établir la cinétique de cette répression. Grâce à

l’utilisation de sondes introniques nous avons pu montrer que la transcription de collier

cesse immédiatement après la division du progéniteur et que la répression médiée par Notch

est donc un processus extrêmement rapide. Contrairement à collier, l’expression de nautilus

n’est pas soumise à la répression par Notch et est maintenue dans les cellules fondatrices

DA3(3) et DO5(20). La formation de fibres musculaires nécessite la fusion de chaque cellule

fondatrice avec des myoblastes naïfs. La visualisation des transcrits primaires m’a permis de

montrer que les noyaux des premiers myoblastes intégrés à la fibre DA3(3) transcrivent de

novo collier et nautilus. Après 2 ou 3 cycles de fusion, l’expression de nautilus cesse alors

que la transcription de collier est activée dans chaque myoblaste intégré à la fibre

musculaire. Ces données ont montré pour la première fois que l’identité transcriptionnelle de

la cellule fondatrice est propagée aux noyaux des myoblastes naïfs qui fusionnent avec cette

cellule et que tous les noyaux d’une même fibre musculaire expriment le même programme

identitaire. Des expériences basées sur l’utilisation de transgènes rapporteurs nous a ensuite

permis de montrer que l’activation de l’expression de collier dans les noyaux « naïfs » de la

fibre DA3 nécessite l’activité de Nautilus et Collier lui-même. Dans une première étape, les

noyaux nouvellement incorporés dans la fibre importent la protéine Collier. Cet import permet

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l’auto-activation de la transcription de col. Nous avons également montré que cette auto-

régulation est directe. Un module cis-régulateur (CRM) a été localisé en amont du site

d’initiation de la transcription de collier, qui permet l’expression d’un gène rapporteur dans le

progéniteur DA3/DO5, puis la cellule fondatrice DA3 et les noyaux qui fusionnent avec cette

cellule fondatrice au cours de la formation de la fibre musculaire. Des mutations des sites de

fixations de Nautilus et Collier prédits par bio-informatique et présents dans ce CRM

empêchent l’activation de l’expression du gène rapporteur aux noyaux des myoblastes naïfs.

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4347RESEARCH ARTICLE

INTRODUCTIONDrosophila Collier (Col; also known as Knot) belongs to the COE(Col/Olf1/EBF) family of transcription factors, which contains asingle member in metazoans, except for vertebrates, in which fourgenes have been identified (Dubois and Vincent, 2001; Liberg et al.,2002; Pang et al., 2004). col was initially characterised for itsexpression and function in a specific region of the embryonic headthat corresponds to both a mitotic domain (MD2) and a gnathalparasegment (PS0) (Crozatier et al., 1996). col is also expressed in,and required for the formation of, a single somatic muscle, theembryonic Dorsal/Acute 3 (DA3) muscle (Crozatier and Vincent,1999), thereby providing a unique entry site for studying thetranscriptional control of muscle identity.

The embryonic musculature of Drosophila melanogaster ishighly stereotyped, with a standard arrangement of around 30somatic muscles in each trunk hemisegment. Each muscle fibre isan individual syncitium that can be distinguished by its position,shape, epidermal attachment sites and innervation (Bate, 1993;Baylies et al., 1998). Muscle fibres are seeded by founder cells(FCs), which are themselves generated from progenitor cells singledout from promuscular clusters by Notch-mediated lateral inhibition(Carmena et al., 1995; Ruiz Gomez and Bate, 1997). FCs undergomultiple rounds of fusion with fusion competent myoblasts (FCMs)to form a myofibre. The current view is that ‘muscle identity’transcription factors (TFs) endow FCs with the capacity to executethe fusion and differentiation programme specific to each musclefibre (Baylies and Michelson, 2001; Frasch and Leptin, 2000). The‘identity TF code’, at least in part, reflects the initial position of the

promuscular cluster and derived progenitor cell. Pioneering work onthe control of expression of the homeodomain transcription factorEven-Skipped (Eve) in dorsal muscle progenitors showed that itinvolved the combinatorial activity of TFs functioning downstreamof Wingless (Wg), Decapentaplegic (Dpp) and receptor tyrosinekinase (RTK) signalling, [dTCF (Pan – FlyBase), Mothers againstDpp (Mad) and Pointed (Pnt), respectively]. Integration of thispositional information and tissue-specific (mesodermal) informationat the level of the eve promoter was responsible for activating Eve-expression in promuscular clusters (equivalence groups) from whichEve progenitors were selected by Notch (N) signalling (Carmena etal., 2002; Carmena et al., 1998; Halfon et al., 2000; Halfon et al.,2002). Large-scale analyses of gene expression in conditions ofperturbation of components of Eve regulation suggested that relatedtranscriptional codes could be responsible for different patterns ofprogenitor gene expression (Estrada et al., 2006; Philippakis et al.,2006; Sandmann et al., 2006). The eve enhancer reproducing Eveexpression in muscle progenitors was not active, however, inrecruited FCM nuclei (Halfon et al., 2000), indicating that differentcis-regulatory elements (and TFs) could be required for specifyingpromuscular clusters and maintaining a TF identity code.

Here we used Col expression as both a determinant and read-out ofDA3 muscle identity to ask how positional information that definespromuscular clusters is relayed into the FC identity and extended tofused FCM nuclei. We first identified the cis-regulatory regionscontrolling col transcription at several steps during formation of theDA3 muscle and defined a DA3-muscle-specific cis-regulatorymodule (CRM). Detailed analysis of this CRM revealed the existenceof three separate steps: Col activation in promuscular clusters,upregulation in the selected progenitor and DA3 FC and activation inthe nuclei of FCM incorporated in the growing DA3 myofibre duringthe muscle fusion process. Comparison of the DA3 muscle CRMbetween several Drosophila species identified a set of conservedsequence motifs with functional significance supported by theexpression patterns of reporter genes containing the D. virilis (D. vir)

collier transcription in a single Drosophila muscle lineage:the combinatorial control of muscle identityLaurence Dubois, Jonathan Enriquez, Virginie Daburon, Fabien Crozet, Gaelle Lebreton, Michèle Crozatier andAlain Vincent*

Specification of muscle identity in Drosophila is a multistep process: early positional information defines competence groupstermed promuscular clusters, from which muscle progenitors are selected, followed by asymmetric division of progenitors intomuscle founder cells (FCs). Each FC seeds the formation of an individual muscle with morphological and functional properties thathave been proposed to reflect the combination of transcription factors expressed by its founder. However, it is still unclear howearly patterning and muscle-specific differentiation are linked. We addressed this question, using Collier (Col; also known as Knot)expression as both a determinant and read-out of DA3 muscle identity. Characterization of the col upstream region driving DA3muscle specific expression revealed the existence of three separate phases of cis-regulation, correlating with conserved binding sitesfor different mesodermal transcription factors. Examination of col transcription in col and nautilus (nau) loss-of-function and gain-of-function conditions showed that both factors are required for col activation in the ‘naïve’ myoblasts that fuse with the DA3 FC,thereby ensuring that all DA3 myofibre nuclei express the same identity programme. Together, these results indicate that separatesets of cis-regulatory elements control the expression of identity factors in muscle progenitors and myofibre nuclei and directlysupport the concept of combinatorial control of muscle identity.

KEY WORDS: Cis-regulatory modules, collier (knot), nautilus (MyoD), Drosophila, Muscle identity

Development 134, 4347-4355 (2007) doi:10.1242/dev.008409

Centre de Biologie du Développement, UMR 5547 CNRS/UPS, IFR 109, Institutd’Exploration Fonctionnelle des Génomes, 118 route de Narbonne, 31062 Toulousecedex 9, France.

*Author for correspondence (e-mail: [email protected])

Accepted 14 September 2007 DEVELO

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DNA. Conserved binding sites for the mesodermal TFs Twist (Twi),Nautilus (Nau, the Drosophila orthologue of MyoD) and Mef2(Andres et al., 1995; Huang et al., 1996; Ip et al., 1992;Kophengnavong et al., 2000) and a putative Col-binding sitenecessary for positive autoregulation were present in differentsubdomains of the DA3 muscle CRM, correlating with the separatephases of col regulation. We show that col auto-regulation is crucialfor a reiterative, two-step activation of col transcription in each ‘naïve’FCM incorporated into the DA3 muscle. Nau, which was previouslyreported to be required for DA3 muscle formation (Keller et al., 1998),is also required for col transcription in the DA3 muscle, beyond theFC stage. Pan-FC expression of either Col, Nau or both proteinsresulted in ectopic col transcription in different sets of muscles.Together, our results show that separate sets of cis-regulatory elementsensure col activation in the DA3/D05 promuscular cluster, progenitorand DA3 myofibre. Nau and Col act together in ensuring that all nucleiwithin the DA3 myofibre activate Col and express the samedifferentiation programme, thereby directly supporting the concept ofcombinatorial control of muscle identity.

MATERIALS AND METHODSDrosophila strainsThe following strains were used: w1118 as a wild-type (wt) reference and forP element transformation using standard procedures (Rubin and Spradling,1982); rp298-Gal4 (Menon and Chia, 2001); col1 (Crozatier et al., 1999) andnau188 (Balagopalan et al., 2001) EMS-induced loss-of-function alleles;vg83b27-R, a �-ray induced amorphic allele; UAS-col (Vervoort et al., 1999);hs-col (Crozatier and Vincent, 1999); UAS-nau (Keller et al., 1997); UAS-lacZ (Bloomington Stock Center, Indiana, USA). UAS-mcd8::GFP(Grueber et al., 2003).

Plasmid constructions and transgenic linesThe P5cl construct was described in Crozatier and Vincent (Crozatier andVincent, 1999). Other Pcl constructs were generated by cloning differentfragments of col upstream DNA (for the restriction sites used, see Fig. S2 inthe supplementary material) into pCaSpeR�-gal or pPTGal4 (Sharma et al.,2002). Mutagenesis of the putative Nau- and Col-binding sites in P2.6cl wasdone by PCR. The D. vir constructs were generated by restriction digestionof genomic DNA isolated from a � phage library (J. Tamkun, University ofCalifornia, Santa Cruz, CA).

Immunohistochemical staining and in situ hybridisationEmbryos were fixed and processed for antibody staining and/or in situhybridisation as described (Crozatier et al., 1996). The nau intronic probecovers all three nau introns and the two corresponding exons. The followingprimary antibodies were used: rabbit anti-Col (1/400); mouse anti-Col (1/100);rabbit anti-MHC (1/500; D. Kiehart, Duke University, Durham, NC); mouseanti-�-gal (1/1000, Promega); rabbit anti-GFP (1/1000 Torrey Pines Biolabs);Secondary antibodies were Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugatedgoat anti-rabbit, Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse (MolecularProbes 1/300); Rhodamin RedX conjugated donkey anti-mouse (JacksonLaboratory 1/300); biotinylated goat anti-mouse (Vector Laboratory, 1/1000).For double fluorescent in situ hybridisation/immunostaining, we usedbiotinylated col and digoxygenin-labelled nau intronic probes and the ABCkit from Vector Laboratory, followed by fluorescent tyramide staining (Alexafluor 555 or 488 conjugated tyramide from Molecular Probes) and Fast Red.Primary antibodies against Col, GFP or MHC were used at five times the usualconcentration. Monoclonal Col antibodies were generated in collaborationwith Jeannine Boyes and Georges Delsol, U 563 INSERM, Toulouse Purpan.

Sequence alignments and transcription factor binding sitesPairwise sequence alignments of col upstream sequences from variousDrosophila species (http://flybase.bio.indiana.edu/static_pages/news/articles/2007_03/genomes_papers3.html) were done using NCBI-BLAST(bl2seq), Genome Browser (UC Santa Cruz) and Evoprinter (NINDS, NIH,Bethesda) and manually edited following eye-inspection. Search forindividual binding sites for transcription factors made use of Genomatix

Matinspector, Possum (http://zlab.bu.edu/~mfrith/possum/), cis-analyst(http://rana.lbl.gov/cis-analyst/cgi/viewer.php) and FlyEnhancer(http://genomeenhancer.org/fly; M. Markstein) and manual inspection basedon the literature. Access to the Mef2 and Twi in vivo binding sites(Sandmann et al., 2007; Sandmann et al., 2006) was via the E. Furlong’s labsite (http://furlonglab.embl.de/data/).

RESULTSModular organisation of the col cis-regulatoryregioncol belongs to the class of Drosophila regulatory genes withnumerous introns, large amounts of flanking sequence and multipleexpression sites (Crozatier and Vincent, 1999; Nelson et al., 2004;Philippakis et al., 2006). During embryogenesis, col is expressed inthe MD2/PS0 head region, the somatic DA3 muscle, precursor cellsof the lymph gland, a small set of multidendritic (md) neurons of theperipheral nervous system and specific neurons of the centralnervous system (CNS) (Baumgardt et al., 2007; Crozatier et al.,2004; Crozatier et al., 1999; Crozatier and Vincent, 1999; Orgogozoand Schweisguth, 2004). We previously generated a lacZ reportertransgene (P{5col::lacZ}, abbreviated P5cl, Fig. 1A) containing 5kb of col upstream DNA, which faithfully reproduced coltranscription both in the MD2/PS0 and the DA3 muscle, starting atthe progenitor stage and not in promuscular cluster(s) (Crozatier andVincent, 1999). To identify the missing cis-regulatory information,we tested a longer construct containing the entire 9 kb regionseparating col from CG10200, the next predicted upstream gene(http://flybase.bio.indiana.edu/; P9cl, Fig. 1A). In addition to thehead and DA3 muscle, P9cl expression reproduced col expressionin md neurons and a subset of neurons in the CNS. A DNA fragmentlocated further upstream, between CG10200 and the next predictedgene CG10202, was independently shown to drive col expression inthe anteroposterior organiser of the wing imaginal disc (Hersh andCarroll, 2005). However, neither this construct nor P9cl reproducedCol expression in promuscular clusters (Fig. 1D). The coltranscription unit is immediately flanked at its 3� end by anothergene, BEAF32 (Fig. 1A), making rather unlikely the presence of cis-regulatory elements within this region. However, it contains tendifferent introns, of total length around 30 kb, the cis-regulatorycontent of which remains to be assessed (see Discussion).

To delineate more precisely the CRM driving col expression inthe DA3 muscle, we tested a series of constructs containing 2.6,2.3, 1.6 and 0.9 kb of DNA upstream of the col transcription startsite, respectively (Fig. 1A). P2.6cl retained the informationnecessary for col expression in MD2/PS0 and the DA3 progenitorand muscle (Fig. 1C), although we noted that P2.6cl expressionin muscle progenitors was less robust than P9cl. P2.3cl was alsoactivated in MD2/PS0 at stage 6 and the DA3 muscle. However,unlike P9cl or P2.6cl, P2.3cl was not activated in the DA3/DO5progenitor but only at the FC stage (Fig. 1C; ectopic lacZexpression was observed in clusters of neuroectodermal cells atembryonic stage 11). This difference indicated that cis-regulatoryelements required for col expression in the DA3/DO5 progenitorreside between positions –2.6 and –2.3 and act separately fromthose required for expression in the DA3 FC and muscle. P1.6clwas only active in MD2/PS0, whereas no expression at all couldbe detected with P0.9cl (data not shown). Together, expressiondata from this series of reporter constructs allowed the mappingof the CRM required for col-specific expression in the DA3/DO5muscle progenitor and DA3 FC/myofibre to a DNA fragmentbetween positions –2.6 and –1.6 upstream of the col transcriptionstart (Fig. 1E).

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Conserved motifs and TF-binding sites in the colupstream regionWe took advantage of the recently available genome sequences ofseveral Drosophila species to search for conserved motifs in the colupstream DNA, as it has often proven to be effective to identifyfunctionally important cis-regulatory elements (Wasserman et al.,2000; Yuh et al., 2002). Among these species, D. virilis (D. vir) is themost distant from D. melanogaster (D. mel) (Tamura et al., 2004). Wefirst verified that Col expression in D. vir was similar to that in D. melembryos (Fig. 2A and see Fig. S1 in the supplementary material) andcould infer from this that the regulatory information controlling coltranscription in the DA3 muscle lineage has been conserved.Sequence comparison of 9 kb of the col upstream region betweenD. mel, D. vir and four other Drosophila species, D. yakuba, D.ananassae, D. pseudoobscura and D. mojavensis revealed numerousstretches of high sequence conservation, of sizes up to 100 bp (see Fig.S1 in the supplementary material). Ten conserved motifs of size >20bp, numbered 1 to 10 from 5� to 3�, were found in the same order andat the same relative position between position –2.6 and the start oftranscription in all six Drosophila species (Fig. 2B and see Fig. S2 inthe supplementary material). To test the relevance of this conservation,we generated lacZ reporter constructs containing either D. vir or D.mel DNA (Fig. 2B). P.3.4clvir corresponds to D. mel P2.6cl, whereas

P3.4-1.3clvir and P2.6-0.9cl are truncated versions covering motifs 1to 10. All four reporter genes showed expression in the DA3 muscle,starting at the progenitor stage, confirming the evolutionaryconservation of a DA3-muscle-specific CRM (Fig. 2A). A Gal4 driverline containing only the –2.6 to –1.6 region (P2.6-1.6cG), harbouringonly motifs 1 to 7 (Fig. 2B), was also specifically expressed in theDA3 muscle (Fig. 2A). This confirmed that the DA3 muscle CRM islocated between positions –2.6 and – 1.6. We noticed, however, thatexpression of P2.6-1.6cG was weaker and more sporadic than P2.6-0.9cl, suggesting the existence of cis-regulatory element(s) betweenpositions –1.6 and –0.9 contributing to robust DA3 muscle expression.We then searched within the conserved motifs 1 to 10 for consensusbinding sites of known TFs that could account for col activation in theDA3 muscle. This identified a binding site for the mesodermal basichelix-loop-helix (bHLH) protein Twi (Ip et al., 1992; Kophengnavonget al., 2000) (within motif 2 Fig. 2B), correlating well with the positionof the muscle progenitor cis-element (Fig. 1E) and a potentialEBF/Col-binding site (Travis et al., 1993) within motif 7. Furthervisual inspection of the sequence alignments identified otherconserved TF-binding sites, including one Mef2-binding site (Andreset al., 1995) within the –1.6 to –0.9 fragment and one consensusbinding site for Nau (Huang et al., 1996; Kophengnavong et al., 2000).On the one hand, the position of the Mef2 site correlated well with the

4349RESEARCH ARTICLECombinatorial control of muscle identity

Fig. 1. Mapping of the col DA3 muscle CRM in Drosophila. (A). Schematic representation of the col genomic region. Coding exons and the 5�and 3� untranslated regions are indicated by black and white boxes, respectively. The positions of the immediately upstream and downstreampredicted genes (http://flybase.bio.indiana.edu/), CG10200 and BEAF-32, are indicated by grey boxes and their direction of transcription by arrows.The extent of col upstream region present in each lacZ reporter gene, P9cl to P0.9cl is indicated by a black line. (B) Diagrammatic, colour-codedrepresentation of the different col expression sites in stage 11 and 14 embryos. (C) In situ hybridisation showing expression of P2.6cl, P2.3cl andP1.6cl, compared to endogenous col, at embryonic stages 6, 11, 12 and 14. (D) Close-up view of the DA3 promuscular cluster and progenitor inthe T2 and T3 segments of a P9cl embryo at stage 11, stained for Col (green) and �-gal (red). Unlike Col, lacZ expression is restricted to theprogenitor cell. (E) Schematic representation of the modular organisation of the col cis-regulatory region, underlining the position of the DA3muscle CRM.

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requirement of the –1.6 to –0.9 fragment for robust DA3 muscleexpression (Fig. 2A). On the other hand, the presence of a Nau-binding site was particularly intriguing as Nau is required for DA3muscle formation (Keller et al., 1998). Potential binding sites for otherTFs (Bergman et al., 2005; Vlieghe et al., 2006) could be found in theDA3 CRM, but we limited here our annotation to the conserved sites(see Fig. S2 in the supplementary material). The relative paucity ofknown TF-binding sites in the conserved sequence motifs found in theDA3 muscle CRM leaves largely open the question of the roles ofthese motifs in col regulation.

Ectopic activation of col transcription reveals amuscle TF codeHeat-shock-driven, ubiquitous expression of the Col proteinactivated endogenous col transcription in a few muscles other thanDA3, mainly the VL1 and, more sporadically, the DA2 muscle(Crozatier and Vincent, 1999). By using different col-lacZ reportergenes, we mapped the cis-regulatory element(s) responsible for this

muscle-specific activation to the DA3 muscle CRM (Fig. 2B-D anddata not shown). As it is restricted to the DA3 and VL1 (and possiblyDA2) muscles, we reasoned that col auto-activation was dependentupon a specific combination of TF expressed in these muscles. Ofthe known TFs expressed in somatic muscles, only Vestigial (Vg)and Nau are expressed in DA3 and VL1 (Bate et al., 1993;Dohrmann et al., 1990; Keller et al., 1998; Paterson et al., 1991). naumutant embryos lack a subset of muscle fibres, with DA3 being themost severely affected (Balagopalan et al., 2001; Keller et al., 1998).By contrast, no muscle phenotype has yet been described for vg loss-of-function mutations. vg mutants show reduced wings and severeflight muscle defects but are viable and fertile, allowing the study oftheir maternal plus zygotic phenotype. We did not observe abnormalCol expression or abnormal DA3 muscle formation in vg mutantembryos, indicating that Vg is not required for formation of thismuscle (data not shown).

col activation in nuclei of fused myoblasts: areiterative process endowing all nuclei of the DA3myofibre with the same transcriptionalprogrammeIn situ hybridisation with a col intronic probe that labels nascenttranscripts revealed that col transcription is activated in the nuclei ofthose FCMs that are recruited to form the DA3 muscle (Crozatierand Vincent, 1999). To further investigate the mechanisms behindthis observation, we compared the patterns of Col accumulation andcol transcription during the process of DA3 muscle formation (Fig.3A-C). We found that, throughout the FC/FCM fusion phase (stage12-15), each DA3 muscle syncitium contains on average one or twonuclei, which stain positive for Col but do not transcribe col (see alsoFig. 4). Close-up analysis of fusion events in stage 13 embryosfurther revealed that only nuclei containing high levels of Colprotein activated col transcription (Fig. 3A). This strongly suggestedthat Col accumulation is a prerequisite for auto-activation in newlyfused FCM nuclei. In support of this interpretation, all the DA3muscle nuclei transcribe col after completion of the muscle fusionprocess (Fig. 3B), although this uniform expression phase is onlytransient, as col transcription declines abruptly during stage 16 tobecome undetectable (Fig. 3C). From these observations, weconclude that activation of col transcription occurs through areiterative two-step mechanism, ensuring the same transcriptionalprogramme to all nuclei of the DA3 myofibre. In a first step, nucleifrom FCMs newly incorporated into the growing syncitium importsome of the Col protein present in the muscle precursor (inset in Fig.3A). In a second step, col transcription is turned on in these nuclei.

Col and Nau are required for col transcriptionduring DA3 muscle fusionFirst evidence for col autoregulation during DA3 muscle formationcame from the observation that col transcription is not maintainedin the DA3 FC in col mutant embryos (Crozatier and Vincent, 1999).In order to investigate this phenotype in more detail, we constructeda P9col-Gal4 driver (P9cG), allowing us to express a membrane-bound form of GFP in the DA3 muscle progenitor and to specificallyfollow the fate of this progenitor in col mutant embryos (UAS-mcd8GFP/P9cg; Fig. 3D). In wt embryos, mCD8GFP remainsexpressed and is detected both intracellularly and at the plasmamembrane of the DA3 myofibre. In col mutant embryos, mCD8GFPexpression is lost early but stability of the protein at the plasmamembrane allows the detection of the mutant DA3 fibres. Thisexperimental set-up confirmed that fusion of FCMs with the DA3FC is drastically impaired in col mutant embryos and that col


Fig. 2. Conserved cis-regulatory elements and TF-binding sites inthe DA3 muscle CRM. (A) Col expression in a stage 14 D. vir embryo(top left) and in situ hybridisation to lacZ transcripts showing expressionof different D. vir and D. mel col reporter genes, as indicated in eachpanel. Note that P2.6-1.6cG is a Gal4/UAS-lacZ line. (B) Diagrammaticrepresentation of the relative positions of conserved motifs, numberedfrom 1 to 10 and potential binding sites for Twi, Nau, Col and Mef2 inthe DA3 muscle CRM (for details, see Fig. S2 in the supplementarymaterial). (C,D) Ubiquitous hs-col driven Col expression specificallyactivates col-lacZ reporter genes in the VL1 muscle (white arrow), asshown here for P2.6cl (C). This is mediated by conserved cis-regulatoryelements in the DA3 muscle CRM (D).

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transcription is neither maintained in the DA3 FC nor activated inthe nuclei of FCM, which sometimes fuse to form an abortive DA3muscle precursor (Fig. 3E). These data establish that col auto-regulation and the muscle DA3 identity programme are intimatelyconnected.

Nau activity is also required for formation of the DA3 muscle,although the described DA3 nau mutant phenotype is not as severeas for col (Keller et al., 1998). The presence of a consensus Nau-binding site in the col DA3 muscle CRM raised the possibility thatone Nau function could be to regulate col transcription. To addressthis possibility, we first compared nau and col transcription in wtDA3 muscles, using in situ hybridisation to primary transcripts andCol immunostaining. This revealed that col and nau are transcribedtogether in the DA3 progenitor, FC and muscle precursor up to earlystage 13 (Fig. 4A-C). Subsequently, only col transcription persistsin the DA3 muscle (Fig. 4D). We then looked at col transcription inembryos homozygous for the null allele nau188 (Balagopalan et al.,2001; Wei et al., 2007). Based on Col and Myosin heavy chain(MHC) antibody staining (Fig. 4E,F and data not shown) the DA3muscle was completely absent in around 5% of segments, abnormal

in orientation in 45% and rather normal-looking in about 50% ofsegments, consistent with previous reports (Keller et al., 1998). Lowamounts of Col protein were observed in nuclei of the ‘normal-looking’ DA3 muscles (Fig. 4E,F), allowing us to look at coltranscription in these nuclei. In wt embryos at stage 15, each DA3muscle syncitium contains on average nine nuclei, which are allstrongly stained with Col antibodies, and seven to eight are positivefor col transcription (Fig. 4E; see also Fig. 3B). The DA3 fibrespresent in nau188 embryos contained only seven nuclei on average,with most showing a low level of Col protein. However, at most twoor three of those transcribed col (Fig. 4F). This result indicated thatNau activity is required, in addition to Col, for activation of coltranscription in the FCM nuclei that are recruited by the DA3 FC.The Col protein that is detected in nau mutant embryos probablyderives from earlier, Nau-independent col transcription. Supportingthis conclusion, one nucleus, probably the FC nucleus, shows highlevels of col transcripts in nau mutant embryos at late stage 12, whenDA3 muscle precursors contain two or three nuclei (Fig. 4G,H). Insummary, nau and col are expressed in the DA3 FC and both Nauand Col are required for col activation in the nuclei of newlyrecruited FCM, thereby ensuring that all nuclei within the DA3myofibre acquire the same identity.

The combinatorial activity of Nau and Col controlscol expressionTo further test the hypothesis of a combinatorial role of Nau and Colin conferring the DA3 muscle its identity, we examined theactivation pattern of P2.6cl at stage 15 after either Nau alone, Colalone or Nau+Col were ectopically expressed in all muscle FCs(rp298Gal4 driver) (Menon and Chia, 2001). rp298Gal4-driven Colexpression resulted in ectopic P2.6cl expression in several musclesother than DA3, including DA2, DT1 and VL2, although thisexpression was most robust in VL1, as seen in hs-col experiments(Fig. 5A,B), without major phenotypic effects, at least at the level ofmuscle fibre morphology (data not shown). By contrast, rp298Gal4-driven Nau expression, while altering the pattern of muscle fibres,as previously documented with a heat-shock construct (Keller et al.,


Fig. 3. col activation in FCM nuclei incorporated in the DA3myofibre in Drosophila. (A-C) col transcription in wt DA3 muscleprecursors, visualised by in situ hybridisation to col primary transcripts(red dots), immunostaining for Col (green) and nuclear staining (blue).(A�-C�) Blue and red channels; (A�-C�) green channel. (A) Stage 14embryo. The DA3 muscle precursor contains several nuclei; the twodistalmost have already accumulated a high level of Col protein andactivated col transcription. One central nucleus starts accumulating Colprotein (lower inset) but does not yet transcribe col. Two other FCMhave probably fused but not started to import Col protein (surroundedby a dashed line in A�, upper inset). Another FCM has started engagingin the fusion process, (dashed notch in A�). (B) Stage 15 embryo. At thisstage, each DA3 muscle nucleus contains high levels of Col protein andtranscribes col. (C) Stage 16 embryo. All the DA3 muscle nuclei stillcontain high levels of Col protein but col transcription has almostcompletely ceased. (D,E) In situ hybridisation to col primary transcripts(red dots) in (D) wt and (E) col1 mutant embryos (two segments areshown). A membrane-targeted form of GFP expressed under control ofthe col promoter (P9cg construct) allows the visualisation of the DA3muscle (green). Note the complete absence of col transcription in colmutant embryos (E). The white arrowhead points to a dorsal mdneuron expressing Col. Scale bar: 5 �m.

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1997), provoked ectopic expression of P2.6cl only in a singlemuscle, the DA2 muscle (Fig. 5C). These data confirmed that,despite a more general role than Col in somatic myogenesis (Kelleret al., 1997; Wei et al., 2007), Nau is generally unable by itself toectopically activate col transcription. When Col and Nau wereexpressed together, P2.6cl was activated in the same muscles as withCol alone, but much more strongly (compare Fig. 5B with D),confirming that Nau potentiates the ability of Col to activate its owntranscription. Interestingly, P2.6cl was activated by Nau+Col in afew muscles, including the SBM muscles, which did not respond tothe presence of Col alone, indicating that Nau and Col may actsynergistically. Still, many muscles remained refractory to thiscombination and did not express P2.6cl, suggesting that othercompetence factors are lacking or that negative regulation exertedby Notch and/or other factors may be dominant in these muscles.

The control of col transcription by Nau+Col isprobably directThe evolutionary conservation of a Nau-binding site and a potentialEBF-binding site within the DA3 muscle CRM (Fig. 2B and see Fig.S2 in the supplementary material) suggested that regulation of coltranscription by Nau and Col could be direct. We independentlymutated the putative Nau- and EBF-binding sites within the P2.6clconstruct, giving rise to P2.6clnau and P2.6clcol, respectively (Fig.6F). P2.6clnau expression was either lost from the DA3 muscle ormuch reduced compared with P2.6cl (Fig. 6A,C), suggesting thatNau directly regulates col transcription. Unlike the case with P2.6cl,however, ectopic P2.6clnau expression was observed, indicating thatthe mutated E-box in the Nau site could also mediate binding ofrepressing factor(s) in absence of Nau. Col binds in vitro to the EBFconsensus binding site (TTCT/CNNGGGAA) (Travis et al., 1993),consistent with sequence conservation of the COE DNA-bindingdomain (Dubois and Vincent, 2001) (V.D., unpublished). The closestmatch to the consensus EBF recognition site found within the DA3CRM is the sequence ATGTCTGGGGAT, which is part of theconserved motif 7 (Fig. 6F and see Fig. S2 in the supplementarymaterial). Gel-shift assays and immunoprecipitation of DNA-proteincomplexes formed by co-incubation of Col with syntheticoligonucleotides overlapping this predicted EBF-binding site failedto reveal strong binding in vitro (V.D., unpublished). Nevertheless,DA3-specific expression of P2.6clcol in vivo was almostundetectable when this site was mutated (Fig. 6B,F), suggesting thatit mediates col auto-regulation. To provide a different test of this invivo function, we looked at P2.6clcol activation in conditions ofectopic Col expression. Unlike P2.6cl (Fig. 6D), P2.6clcol

expression was activated very weakly, if at all, in the VL1 (and DA2)


Fig. 4. Nau-dependent col transcription during the DA3 musclefusion process in Drosophila. (A-D) Double in situ hybridisation withintronic probes for col (green) and nau (red) nascent transcripts and Colimmunostaining (blue) show that nau and col are co-expressed in (A)the DA3/DO5 progenitor cell, (B) the DA3 FC (outlined by a plain line)and (C), the DA3 muscle precursor when it contains two to three nuclei(outlined). nau remains transcribed in the DO5 FC (dashed outline in B),whereas col transcription is rapidly turned down. (E-H) col transcription(green dots) in (E,G) wt and (F,H) nau188 mutant embryos (twosegments are shown); the DA3 muscle is visualised by immunostainingfor Col (red) and MHC (blue in E,F). In stage 15 nau188 mutant embryos(F), the DA3 muscle is reduced, compared to wt (E) and most nuclei donot transcribe col. At stage 12, col expression in the DA3 muscleprecursor (asterisk) when it contains two to three nuclei is similar in (H)nau188 and (G) wt embryos, although only one nucleus, probably theFC nucleus, expresses high levels of col transcripts in nau188 embryos.Arrowheads indicate col transcription in a dorsal multidendritic neuron.Scale bars: 5 �m.

Fig. 5. Nau and Col separately and synergistically activate ectopiccol transcription in specific subsets of muscles. (A) P2.6clexpression in the DA3 muscle in stage 15 wt embryos, visualised by �-gal antibody staining. (B) rp298Gal4-driven Col expression of in all FCsactivates P2.6cl in a subset of somatic muscles cells, activation beingmost robust in the VL1 muscle. Nau expression (C) is unable to activateectopic P2.6cl expression, except for, sporadically, the DA2 muscle.(D) Together, Col and Nau activate P2.6cl expression in a large numberof somatic muscles in addition to VL1. A schematic representation ofthe abdominal muscle pattern is shown of the right side of each panelto indicate the P2.6cl expressing muscles. The DA3, DA2 and VL1muscles are designated by an arrowhead, a dot and an arrow,respectively.

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muscles (Fig. 6E). These results reinforce the conclusion that thepredicted EBF/Col-binding site present within the conserved motif7 is required for positive col autoregulation.

DISCUSSIONThe stereotyped pattern of Drosophila body wall muscles reliesupon the specification of FCs that seed the formation of individualmuscles at specific positions in the somatic mesoderm (Baylies etal., 1998; Rushton et al., 1995). The current view is that theproperties specific to each muscle result from the selectiveexpression, in each FC, of distinct combinations of ‘muscle identity’TFs. However, experimental evidence for such a combinatorial code

has remained sparse. We addressed here this question, using as aparadigm Col expression as both a determinant and read-out of DA3muscle identity.

Three separate steps in the transcriptional controlof muscle identityFunctional dissection of the DA3 muscle CRM present in the colupstream region showed that col expression in the DA3 FC can beseparated from its expression in the DA3/D05 progenitor and thepromuscular cluster. It thus revealed the existence of three steps in thetranscriptional control of muscle identity (Fig. 7). That col expressionin the DA3/D05 progenitor could be uncoupled from that in


Fig. 6. col transcription in the DA3 muscleprecursor depends upon a Nau and apotential Col-binding site in the DA3muscle CRM. (A) Col and P2.6cl expression inwt Drosophila embryos at stage 15, visualisedby Col (red) and �-gal (green in the right andwhite in the left panel) antibody staining.(B,C) P2.6cl expression is lost when either theputative EBF/Col- (B) or Nau- (C) binding sitepresent in the DA3 muscle CRM is mutated.Red dots in A and C correspond to Colexpression in md neurons. (D) Col expressionin all FCs (rp298-Gal4/ UAS-col) inducesectopic P2.6cl expression in the VL1 (arrow)and DA2 (dot) muscles, as visualised by �-galimmunostaining; the arrowhead points to theDA3 muscle. (E) Ectopic expression of P2.6cl isnot observed when the EBF/Col-binding site ismutated. (F) The consensus EBF- and MyoD-(Nau) binding sites (Huang et al., 1996; Traviset al., 1993) are represented above thepredicted sites found within the DA3 muscleCRM. The mutated positions introduced inP2.6clcol and P2.6clnau are shown in red.

Fig. 7. A model for the combinatorial coding of DA3 muscleidentity in Drosophila. (A) Col is activated in one (T1-T3 segments)and two (A1-A2 segments) promuscular clusters (Crozatier and Vincent,1999), in response to positional and mesodermal cues. This first step isprobably mediated by clusters of relevant TF-binding sites [light orangeboxes (Philippakis et al., 2006)], including Twi-binding sites (+)(Sandmann et al., 2007) that are located within the col upstream regionand introns. Col expression subsequently becomes restricted to theDA3/DO5 progenitor (orange cell) by lateral inhibition (Crozatier andVincent, 1999). We postulate that positive inputs from TFs binding tothe –2.6 to –2.3 fragment, including Twi, are sufficient to allow P2.6clactivation in the selected DA3/DO5 progenitor, upon relief of Nrepression. (B) Following division of the progenitor, restriction of Colexpression to the DA3 FC involves positive auto-regulation in this FCand negative regulation by N in the sibling DO5 FC. From this stage, acombination of Nau and Col activity is required for col transcriptionalactivation in the FCM nuclei, which are recruited by the DA3 FC to forma myofibre, thereby ensuring that all nuclei in the DA3 muscle expressthe same identity programme.

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promuscular clusters was in apparent contradiction with the previousconclusion from pioneering studies on Eve expression in dorsalmuscle progenitors that this expression issued from Eve activation inpromuscular clusters. Restriction of Eve expression to progenitors wasconsidered a secondary step, mediated by N-signalling duringprogenitor selection by lateral inhibition (Carmena et al., 1998; Halfonet al., 2000). To reconcile our data and this model, we propose that themuscle DA3 CRM is only active in the DA3/D05 progenitor becauseit lacks some positively acting cis-elements necessary to counteractN-mediated repression of col transcription (Fig. 7A). We have indeedpreviously shown that col transcription is repressed by N during theprogenitor selection process (Crozatier and Vincent, 1999). We alsonoted that a Twi-binding site is present in the ‘progenitor’ subdomainof the DA3 CRM (Fig. 2B and Fig. 7A). The functional importanceof this site is supported by its in vivo occupancy in 4- to 6-hour-oldembryos when selection of the DA3/DO5 progenitor takes place(Sandmann et al., 2007). Together, Twi in vivo binding and thecol/P2.6cl/P2.3cl expression data suggest that Twi activity contributesto col expression in the DA3/DO5 progenitor but may not be sufficientto override N repression of col transcription before progenitorselection. Additional binding sites for Twi present in the col upstreamregion, between positions –8.7 and –8.3, are also bound by Twi in vivo(Sandmann et al., 2007) and probably contribute to the robustness ofP9cl expression in progenitor cells, but the question of which cis-regulatory elements mediate col activation in promuscular clustersremains open. From their Eve expression studies, Michelson andcolleagues developed a computational framework to identify otherFC-specific genes (Estrada et al., 2006; Philippakis et al., 2006). Thisframework, named Codefinder, integrates transcriptome data andclustering of combinations of binding sites for five different TFs (Pnt,dTCF, Mad, Twi and Tin). col/kn was selected by Codefinder owingto the presence of five clusters of binding sites, four of which arelocated within introns (Philippakis et al., 2006). It remains to bedetermined which of these could be responsible for col activation inpromuscular clusters, but it is interesting to note that another in vivoTwi-binding site in 4-6-hour-old embryos correlates with the 3�-mostcluster (Sandmann et al., 2007). In addition to Twi, conserved bindingsites for Nau and Mef2 are found within the DA3 CRM. The Mef2binding site is located in a region required for robust DA3-muscleexpression of a reporter gene (Fig. 2B, Fig. 7B; and see Fig. S2 in thesupplementary material). A direct control of col transcription by Mef2during the muscle fusion process is further supported by the recentfinding that Mef2 binds in vivo to the col upstream region between 6and 8 hours of embryonic development (Sandmann et al., 2006).

Propagation of transcriptional identity from thefounder cell to fusion-competent myoblastsDetailed analysis of col auto-activation revealed a reiterative, two-step process: import of pre-existing Col protein in the FCM nucleithat incorporate into the growing DA3 myofibre precedes activationof col transcription (Fig. 3). This process ensures that allincorporated FCM nuclei acquire the same identity. Nau is requiredfor maintaining col transcription in the DA3 muscle precursor andthis control is probably direct. The presence of a putative EBF-binding site in the DA3 muscle CRM also correlates with the Colrequirement for maintaining its own transcription beyond the FCstage (Crozatier and Vincent, 1999). Thus, despite the failure of ourassays to detect strong Col binding to this site in vitro, it appears tobe essential for col auto-regulation in vivo. This suggests that in vivobinding is potentiated by one or more specific co-factor(s) presentin the DA3 muscle. One co-factor is probably Nau, as the ability ofCol to activate its own transcription in newly recruited FCM is

dependent upon Nau activity (Fig. 7B). Nau is not sufficient,however, as many muscles containing both Nau and Col proteins donot activate col transcription (Fig. 5). Interestingly, mouse EBF (alsoknown as Ebf1 and Olf1 – Mouse Genome Informatics) and E2A(Tcfe2a – Mouse Genome Informatics), a bHLH protein of the samesubgroup as MyoD (Simionato et al., 2007), have been shown to acton the same target promoter and synergistically upregulatetranscription of B-lymphocyte-specific genes, although no directphysical interaction between EBF and E2A could be found in vitro.This suggested that functional interaction of EBF and E2A, similarto Col and Nau, requires yet another factor (O’Riordan andGrosschedl, 1999). Taking into account the restricted pattern ofectopic col activation in hs-col conditions, we hypothesised that Vgcould be another component of the DA3 combinatorial identity(Bate, 1993; Frasch, 1999). However, we found that Vg is notrequired for DA3 muscle specification, leaving open the question ofwhich factor may bridge Col and Nau functions.

Temporal and combinatorial control of muscleidentityUnlike col or P2.6cl, P2.3cl is expressed in the DA3 FC and muscleprecursor but not the DA3/DO5 progenitor, showing that coltranscription in the progenitor and muscle precursor is underseparate control. These two phases of col regulation are intimatelylinked, however, as Col is required for activating its owntranscription in the nuclei of FCM recruited by the DA3 FC. Thisregulatory cascade may explain how pre-patterning of the somaticmesoderm and muscle identity are transcriptionally linked in theDrosophila embryo. As discussed above, the ability of Col to auto-regulate depends upon the presence of Nau, another muscle identityTF. Col and Nau act as obligatory co-factors for maintenance/activation of Col expression in all nuclei of the DA3 muscle, thusbringing to light a clear case of combinatorial coding of muscleidentity.

We thank the Bloomington Stock Center, S. Menon and S. Abmayr for flystocks, D. Kiehart for antibodies, A.M. Michelson for sharing unpublishedresults, M. Markstein for access to Fly Enhancer version 2, J. Boyes and G.Delsol for help with generating Col antibodies and S. Plaza and D. Cribbs fordiscussion. We acknowledge the help of the Toulouse RIO Imaging platformand B. Ronsin for confocal microscopy. This work was supported by CNRS,Ministère de la Recherche et de la Technologie, Université Paul Sabatier (grantto G. Delsol, Inserm U563 and A. Vincent) and Association Française contre lesMyopathies. J.E. was supported by a fellowship from MRT.

Supplementary materialSupplementary material for this article is available athttp://dev.biologists.org/cgi/content/full/134/24/4347/DC1

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Article II: Specification of muscle identity in Drosophila: Combined activity of the Col/EBF and D-MyoD transcription factors. Jonathan Enriquez, Mathilde de Taffin,

Michèle Crozatier, Alain Vincent and Laurence Dubois. In preparation

Ce deuxième article, en cours de rédaction, décrit et compare les phénotypes

mutants collier et nautilus. Pour éviter au lecteur une impression de déjà lu, j’ai

volontairement réduit l’introduction à quelques phrases pour me concentrer sur les résultats.

J’ai aussi volontairement limité cette présentation aux résultats confirmés, un certain nombre

d’autres restant à confirmer. Les résultats déjà acquis me permettent de proposer un modèle

pour le contrôle génétique de l’identité du muscle DA3.

Dans cet article, nous avons poursuivi une analyse détaillée des phénotypes

musculaires causés par l’absence des fonctions collier ou nautilus. Une analyse antérieure

du phénotype musculaire des embryons mutants collier avait suggéré qu’en absence de

collier, le muscle DA3 ne se formait pas (Crozatier and Vincent, 1999). Cependant la cellule

fondatrice du muscle était présente et dans certains cas un muscle contenant un ou deux

noyaux était observé, d’où la conclusion à cette époque que collier était plus spécifiquement

requis dans la muscle DA3 pour le processus de fusion. J’ai repris cette analyse avec de

nouveaux transgènes rapporteurs et de nouvelles combinaisons d’allèles mutants col

hypomorphes. J’ai pu observer que le muscle DA3(3) n’est pas absent dans les embryons

mutants pour collier mais présent à une position plus dorsale et orienté comme le muscle

DA2. Une analyse détaillée montre un changement des sites d’attachement à l’épiderme.

Le phénotype musculaire causé par l’absence de Nautilus a également été analysé

préalablement à mon étude, par deux équipes indépendantes. Ces deux équipes sont

cependant parvenues à des conclusions radicalement différentes. La première équipe,

dirigée par Bruce M. Paterson, a conclu à un rôle central de Nautilus dans la myogenèse et

la formation de l’ensemble des muscles, un rôle assez similaire au rôle des MRFs chez les

vertébrés (Misquitta and Paterson 1999; Wei, Marchler et al. 2000). La deuxième équipe,

dirigée par Susan A. Abmayr a conclu que Nautilus est un facteur d’identité musculaire

(Keller, Erickson et al. 1997; Keller, Grill et al. 1998). Cette équipe a en effet montré que seul

un petit nombre des 30 muscles présents par segment est affecté par l’absence de nautilus.

Parmi ces muscles, le muscle le plus affecté est le muscle DA3(3) : dans un mutant nautilus

le muscle DA3(3) était absent dans 70% des segments en raison d’une re-orientation du

muscle DA3(3) en muscle parallèle à DA2(2). Au vu des différences d’interprétation des

phénotypes nau mutants par les équipes Paterson et Abmayr, nous avons repris l’analyse en

utilisant les allèles mutants générés par ces 2 équipes. Nos observations ont confirmé que la

majorité des muscles ne sont pas affectés. Le muscle DA3 est présent dans 50% des

segments ; dans 30% des segments il est orienté parallèlement au muscle DO5(20) ; dans

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6% des segments, il présente une double orientation DO5(20) et DA3(3) ; enfin, dans

seulement 2% des cas il présente une orientation parallèle au muscle DA2(2). Les autres

10% sont un mélange de phénotypes non considérés plus avant. Mon analyse a également

montré que la re-introduction d’un fort niveau d’expression de Collier dans des mutants

nautilus pouvait compenser l’absence de Nautilus, confirmant ainsi le rôle majeur de Collier

dans l’identité du muscle DA3(3) et une relation d’épistasie fonctionnelle entre ces deux

facteurs en accord avec l’épistasie d’expression décrite dans notre article précédent.

119

120

MANUSCRIT EN COURS DE REDACTION Specification of muscle identity in Drosophila: Sequential and Combined activity of the Col/EBF and D- MyoD transcription factors. Jonathan Enriquez, Mathilde de Taffin, Alain Vincent and Laurence Dubois. Centre de Biologie du Développement ; UMR 5547 Université de Toulouse/CNRS 118 route de Narbonne, F-31062 Toulouse, France.

Each Drosophila muscle can be described by its specific position and orientation,

size, sites of attachment on the epidermis and innervation We and others have previously

shown that formation of the Dorsal/Achute (DA3) muscle requires the activity of two different

identity transcription factors, Nautilus (Nau) and Collier(Col). How the combined activity of

these two factors specifies the DA3 muscle-specific traits (identity) remains an open

question. It could either be the sum of separate activities of each of these TFs or reflect

synergistic aspects, or a combination of the two. As a first step to address this question, we

decided to compare in detail the single col, or nau and double col, nau mutant muscle

phenotypes phenotypes of the DA3 muscle. We looked at both the DA3 and it sibling DO5

muscle, paying particular attention to two specific morphological traits: muscle

orientation,and size which reflect the choice of muscle attachment sites and number of

fusions with FCM, respectively.

The respective attachment sites and size of the DA3 and DO5 muscles.

The DA3 and DO5 muscles derive from the only dorsal progenitor cell which

expresses both Col and Nau in all segments from T2 to A7 (Enriquez et al., 2009). Following

asymmetric division of this DA3/DO5 progenitor, col transcription is only maintained in the

DA3 FC and developing muscle fibre (ref and fig. 1A1). Nau expression is detected in the

DA3 FC and muscle precursor during the initial 2-3 fusion events while it remains on in the

DO5 muscle fibre until myogenesis is completed (Enriquez et al. 2009). In order to visualise

the final shape of the DA3 or DO5 muscles in wt or mutant embryos, we expressed a

membrane-bound form of GFP (mcd8::GFP) using a colGal4 driver (Attb9-Gal4) containing 9

kbp of col upstream DNA (Dubois et al., 2007 and Fig 1A2). Due to transient col expression

in a second dorsal progenitor in A segments, the DT1 and DO4 muscles are also weakly

labelled in these conditions (fig 1A2 and A4). Double labelling for GFP and Stripe, a marker

121

Col GFP StrGFP StrCol

attb10-Gal4, UASmcd8::GFP

A1 A2 A3 A4

GFP Mef2

DO5(20)

DA3(3)B

DNumber of nuclei in the DA3 and DO5

0

2

4

6

8

10

12

14

DA3 DO5

num

bero

f nuc

lei

DA3(3)

DO5(20)

C

Figure 1. Attachment sites and size of the DA3 and DO5 muscles. (A1-B) stage 15 embryos expressing mcd8::GFP under the control of the 10_0.9-Gal4. (A) The abdominal segments A1-A4 are shown. Staining for Col (blue) identifies the DA3 muscle, GFP (green) the DA3 and DO5 muscles and sometimes the DT1 and DO4 muscles and Stripe B (red), the epidermal tendon cells. (B) staining for GFP (green), and Mef-2 (red) which labels the nuclei of all myoblasts. (C) Histogram showing the relative numbers of nuclei of the DA3 an DO5 muscles. (D) Schematic representation of the DA3 (blue) and DO5 (green) muscles and their attachment sites to the epidermis (blue). The muscle nuclei are represented by black dots. In this and subsequent figures, embryos are oriented anterior to the left and dorsal up.

122

of tendon cells shows that the DA3 and DO5 muscles attach anteriorly at very close but not

overlapping sites. The DA3 attaches to tendon cells disposed along the A segmental border

while the DO5 muscle attaches to intrasegmental tendon cells located at the same D/V

position but slightly posterior to the segmental border (fig 1A3 and A4). This possibly

correlates with the relative A/P position of the DA3 and DO5 FC following division of the

DA3/DO5 progenitor. Posteriorly, the DA3 and D05 muscles attach to tendon cells along the

segmental border. The DA3 and D05 posterior attachment sites are dorsal and ventral,

respectively, relative to their anterior attachment sites, resulting in an acute orientation of the

DA3 muscle and oblique orientation of the DO5 muscle (Fig1A and D). At stage 15, the DA3

muscle contains 9 nuclei on average while the DO5 muscle is much smaller and contains

only 3 nuclei (fig B-D). In summary, whereas the DA3 and DO5 FC are issued from the same

progenitor, the DA3 and DO5 muscles show different orientations and sizes. How the specific

properties or these two muscles could be linked to their differential expression of nau and col

accumulation is the next question.

Nau is required for the choice of attachment sites and proper orientation of muscle DA3. The nau mutant phenotype is highly variable, with some nau-expressing muscles

being more often and severely affected than others (Abmayr). We have previously shown

that Nau is required in the developing DA3 muscle for robust activation of col transcription in

newly fused FCM nuclei (Dubois et al. 2007). The nau-independent accumulation of col

mRNA and protein in the DA3 FC is, however, sufficient to visualise the shape and size of

the DA3 muscle in nau mutant embryos, based on Col immunostatining. In 50% of segments,

the DA3 muscle shows normal orientation and attachment sites to the epidermis (Fig2A, B),

(Fig2C, F) and contains the same number of nuclei than in wt (Fig 2G-J). In 30% of

segments, the DA3 orientation and posterior attachment site look like the DO5 site (Fig 2A,

B, C, E). The anterior attachment site is also sometimes affected with the abnormal DA3

muscles attaching to both external and intra-segmental tendon cells (see Fig1 and Fig 2E).

When oriented like a DO5, the nau DA3 muscle contains around 6 nuclei, which is less than

a wt DA3 and more than a wt DO5 (Fig 2J). In 6% of cases, the DA3 nau mutant muscle

extends posterior branches in both ventral and dorsal directions towards both the DA3 and

DO5 attachment sites, forming a kind of “bifida” fibre. In this case, the total number of nuclei

is similar to wt (fig2D, J). Finally in 2% of segments analysed, the muscle DA3 is attached to

its normal posterior site and an anterior site dorsal to the normal position, resulting in an

orientation similar to that of the DA2 muscle (not shown). The different nau mutant DA3

muscle phenotypes were confirmed by scanning EM of flat preparations of wt and nau

mutant embryos (Fig. 4 and data not shown). In summary, in absence of nau activity, the

123

124

Col MHC

nauck188wt

0

2

4

6

8

10

12

WT 1

nucl

einu

mbe

r

nauc

k188

nauc

k188

nauc

k188

wt

A B C D

E

C

F

nauck188 nauck188

nauck188wt

I HI

Col StrB

Col mef2

2 3

1 2 3

nauck188wt

G H

Figure 2. Nau is required for proper epidermal attachment and orientation of the DA3 muscle. (A,C,G) wt and (B, D-F, H) nau mutant embryos at stage 15 stained for Col (red) and MHC (green) (A-B), Col (green) and (red) Stripe (C-F) or Mef2 (G,H). Two abdominal segments are shown in A-B, one in (C-F) and three in G-H. (I) Histogram showing the variation in the number of nuclei in the DA3 muscle in wt and nau mutant embryo. The number under each bar of the histogram corresponds to the phenotypes shown and numbered in (D-F) and (H).

1

2 3

125

attb10-Gal4 UAS-mCD8::GFP, nau188-/-

attb10-Gal4 UAS-mCD8::GFP

A1 B1A2 B2

Figure 3. The DO5 muscle forms normally in nau mutant embryos. Stage 16 wt (A) and nau mutant embryos (B) expressing mcd8::GFP under the control of 10_0.9-Gal4 (green) and stained for Col (red). The abdominal segment A1 is shown. The DO5 muscle is not affected in nau mutant embryos.

DA3

DO5

DA3

DO5

126

posterior attachment site of the DA3 muscle is nearly randomised between the wt DA3 and

DO5 position (nearly 50% in each case), while the choice of anterior attachment site and final

number of nuclei of the fibre are only weakly affected. These observations suggest that that

the main function of nau in the DA3 muscle is to orient the choice of its attachment site and

ensure its proper orientation.

To analyse the DO5 muscle phenotype in nau mutant embryos, we needed to

distinguish the DO5 from the mis-oriented DA3. We again resorted to p9gal4 driven

expression of GFP since the D05 is expected to be GFP positive and col negative and DA3

to be both col and GFP positive. To our surprise since nau is expressed longer in the DO5

than DA3 muscle, the muscle DO5 appears not to be affected in nau mutant embryos. It

attachs normally and has the full complement of nuclei (Figure3 and data not shown). These

observations where also confirmed by scanning EM of flat preparations of embryos (data not

shown).

Col is required for the acute orientation of the DA3 muscle. col is the only known marker specific for the DA3 muscle at late stages of

embryogenesis Since Col is required for its own expression past the founder cell stage, it

makes difficult to analyse the DA3 phenotype in col1 mutant embryos, (Crozatier et al 1999,

Dubois et al. 2007). To circumvent this problem, we decided to analyse the DA3 muscle by

following GFP expression in col85GAL4xUASG-GFP embryos. col85Gal4 is a P-insertion in

the col upstream region which reproduces most of the col endogenous expression sites and

behaves as a strong hypomorphic allele (Krzemien et al. 2007). No severe defect of the DA3

muscle could be observed in Col85Gal4 heterozygous embryos, except for attachment to a

dorsal anterior site in addition to the normal ventral site in about X% of segments (fig 4 A). In

homozygous embryos, 5% of segments analysed show ectopic anterior attachment of the

DA3 muscle to this dorsal site, resulting in a muscle oriented parallel to DA2 (Fig4 B, D).

Trans-heterozygous embryos for col85Gal4 and the null allele col1, show reorientation of the

DA3 muscle in 40% of segments (Fig4 C, D). In many other segments, this re-orientation is

not complete and the mis-oriented DA3 still sends a thin process towards its normal anterior

attachment site (Fig 4C arrow). The analysis of strong col hypomorphs thus suggests that,

unlike our previous conclusion (Crozatier et al 1999), the col mutant DA3 muscle phenotype

is not loss of the DA3 fibre, but mis-specification to a DA2-like identity. To confirm this

phenotype, we analysed the embryonic musculature of col1 mutant embryos by SEM on flat

preparations (Fig 4E, F). It indeed confirmed that the DA3 muscle is present but oriented like

a DA2 muscle (Fig 4E, F). It also revealed that the LT1 muscle which does not express Col,

is affected in col mutant embryos since, most of the time, it occupies the position –

orientation and attachment sites- of the muscle DA3 in wt embryos (fig 4G).

127

DA2 like transformation

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

Pcol/+, GFP// Pcol/Pcol, GFP// Pcol/col1, GFP//pe

r ce

nt D

A2

like

tran

sfor

mat

ion

Pcol85>GFP/GFP

Pcol85>GFP/Pcol85>GFP

Pcol85>GFP/Col1,GFP

A

B

C

D

DA3(3)

GFE

DO2(10)DA2(2)

DO1(9)

DA1(1)

Col1//wt

Figure 4. Col controls the anterior attachment site of muscle DA3. (A-C) Stage 15 embryos expressing mcd8::GFP under the control of col cis-regulatory sequences (Pcol85-Gal4) in different col hypomorphic mutant conditions indicated in each panel. (D) Histogram representing the fraction of segments where the DA3 muscle shows a DA2-like orientation in different allelic combinations. (E) schematic representation of the somatic muscle pattern of A segments. (F-G) EM-scanning views of the abdominal musculature in wt (F) and (G) colmutant embryos. The internal face of one segment is shown.

Stage 16

Stage 16

Stage 16

128

A previous study of the col mutant muscle phenotype concluded that col activity was

specifically required in the DA3 lineage for the muscle fusion process (Crozatier and

Vincent, 1999). This conclusion was based on staining of col mutant embryos for Myosin

Heavy Chain, a general muscle marker. In some segments, the DA3 muscle was detected as

a thin fibre containing only 2 or 3 nuclei, suggesting a fusion problem. However, thin fibres

that were observed likely correspond to mis-oriented DT1 muscles occupying the position

normally occupied by the DA3 in wt embryos while the DA3 has shifted to a more dorsal,

DA2 like identity.

Col rescues the DA3 muscle phenotype of nau mutant embryos. We have previously reported that nau activity is required to maintain high level col

transcription in nuclei of myoblasts newly incorporated in the elongating DA3 fibre. This

raised the question of the contribution of impaired col expression to the nau DA3 phenotype.

To address this question, we restored high level col expression in nau mutant embryos,

using the pcolgal4 driver line (col85Gal4xUAS-col). nau mutant embryos carrying one copy

of the pcolgal4 hypomorphic allele display a phenotype almost identical to nau mutant

embryos, that is, reorientation of the DA3 muscle into a DO5 orientation (fig5A). We noticed,

however, an increased number of segments showing DA3 muscles with a DA2-like

morphology, reminiscent of the col loss-of-function phenotype. Strikingly, nau

col85Gal4xUAS-col embryos show a completely normal orientation and attachment sites of

the DA3 muscle, indicating that restoring col expression in the DA3 lineage completely

bypasses the need for nau activity in this lineage.

A model for the coding of DA3 muscle identity. Together, the col expression data (Dubois et al.., 2007) and rescue experiments

indicat that nau acts upstream col in implementing the DA3 differentaition program.

However, the difference between the nau and col phenotypes is not consistent with a simple

nau> col epistatic relationship. Therefore how to explain the nau mutant phenotype which is

a moderately penetrating DA3 to DO5 transformation phenotype (in 30% of embryos) while

the col mutant phenotype is a highly penetrating shift from DA3 to DA2-like identity. Our

current model (Fig. 6) is that col is required in the DA3/DO5 progenitor for initiating the DA3

muscle identity program. In absence of col, the DA2-like differentiation program substitutes

for the DA3 program. Whether Col activity represses the DA2 identity at the same time than

promotes DA3 identity remains an open question. Past the DA3 commitment step,

implementing the DA3 muscle differentiation process requires nau activity. In absence of

nau, the DA3 FC gives rise to either a DA3 muscle, a DO5 like muscle or a muscle with a

129

Pcol85>GFP/+ ; nauck188 Pcol85>GFP /UAS-Col::HA; nauck188

Figure 5. Col expression rescues the nau DA3 muscle phenotype in abdominal but not thoracic segments. Stage 16 nau embryos expressing mcd8::GFP (A, B) and Col::HA(B) under the control of Pcol85-Gal4. Staining for GFP shows complete rescue of the nauphenotype in A segments.

A B

130

composite morphology, suggesting that nau is not strictly required for the DA3 muscle

program but for its robustness. The full rescue of the DA3 nau phenotype by col expression

further indicates that the major, if not only role of nau in the DA3/DO5 lineage is to positively

regulate col expression during the early phase of muscle fusion. In absence of nau, the DA3

muscle does not adopt a DA2-like identity, strengthening the conclusion that, unlike col, nau

is not required for commitment to the DA3 lineage, and consistent with nau expression in

both the DA2 and DA3 progenitors Finally, nau does not appear to be necessary for DO5,

suggesting that DO5 formation is controlled by a third factor designated X, which segregates

to the DO5 founder cell during the DA3/DO5 assymetric division and represses the DA3 fate.

Consistent with this hypothesis, ectopic Col expression in both the DA3 and DO5 founder by

using the (24BGAL4>UASCol) is not sufficient to convert the DO5 into a DA3 muscle while

forced N activity results in the formation of two DO5 muscles and interfering with N signalling

results in the formation of two DA3 muscles. In summary, our results lead us to propose that

Col and Nau act both sequentially and in combination to implement DA3 muscle identity (Fig.

6). This model implies that nau is required at a very precise step in the DA3 lineage to

ensure high level of col expression. Whether Nau acts similarly upstream of other muscle

identity factros, in other muscle lineages, is now an interesting question which could bring

interesting new parallels between Nau function in Drosophila and the general myogenic

function of MyoD in vertebrates.

131

DA2/ Y, Nau?

DA3/DO5 Col Y X, Nau

Col Nau

xCol

Naux

N

DA3

DO5

DA2Y, Nau?

YX, Nau

NauYx

Naux

N

DA2

DO5

DA3/DO5 Col Y X

Col x Col

x

N

DA3, D05DA3+DO5

DO5

Col Y X

Naux

N

DO5

Colx DA3

DO5

DA3

DA2

wt

nauck188

col1

nauck188, UAS-col

DO5

DA3 >DA2

DA2

DA3

DO5

DA3 >D05

DA2

DO5

DA3

DA2

A

DC

B

Figure 6. A model for the coding of DA3 muscle identity. (A) In wt embryos,the DA3/DO5 progenitor inherits Col and Nau activity, allowing propagation of col expression to the DA3 FC/fiber and formation of a DA3 muscle. The DA3/DO5 progenitor also inherits a DO5 identity factor designated as X. Repression of col expression by N signaling in the DO5 FC results in a low Col/X ratio, leading to D05 identity. Col activity represses DA2 identity, designated here as factor Y. (B) In absence (col1 ) or decreased (col85) Col activity in the progenitor, the DA3 FC expresses Y, leading to a DA3 to DA2 identity shift. In nauck188 mutant embryos, the DA3 progenitor and FC express normal levels of Col activity, leading to repression of the DA2 fate. However, decreased level of col expression during the muscle differentiation process results in a lower Col/X ratio, resulting a stochastic choice between a DO5 and DA3 fate. Complete rescue of the nauphenotype can be achieved by increasing Col expression in the DA3/DO5 progenitor (UAS-Col x col85gal4). 132

B/ L’identité inter-segmentaire du muscle DA3(3) ; Le rôle des gènes homéotiques. Article III: Multi-step Control of Muscle Diversity by Hox Proteins in the Drosophila Embryo. Jonathan Enriquez, Hadi Boukhatmi, Laurence Dubois, Anthony A. Philippakis,

Martha L. Bulyk, Alan M. Michelson, Michèle Crozatier and Alain Vincent1. has been just

accepted to developpement

Dans cet article, nous avons montré que la formation du groupe d’équivalence qui

exprime Collier au sein du mésoderme somatique et est à l’origine du muscle DA3/DO5 est

indépendante des gènes homéotiques. A l’opposé, la sélection du progéniteur DA3/DO5 à

partir de ce groupe d’équivalence (groupe promusculaire) est un processus Hox-dépendant.

La sélection de ce progéniteur par inhibition latérale est initiée dans tous les segments y

compris dans le segment T1 où le muscle DA3 ne se forme pas. Cependant le maintien de

l’expression des gènes d’identité collier et nautilus indicatif de l’aboutissement du processus

n’est observé que dans les segments T2 à A7. Nous avons montré ce maintien dépend des

gènes Hox antp, Ubx et abdA. Nous avons identifié le module cis-régulateur de collier actif

au stade progéniteur et contrôlé par les protéines homéotiques Antp, Ubx et Abd-A et montre

qu’un autre module cis-régulateur contrôle l’activation de collier dans le groupe

promusculaire. Ce CRM intègre une information tissulaire et une information de position,

d’une manière similaire au CRM responsable de l’activation d’eve dans le groupe

promusculaire à l’origine des muscles DA1 et DO2. L’activité de ce module cis-régulateur,

comme la formation du groupe de cellules compétentes exprimant Collier, est indépendante

d’une information homéotique.

En résumé, ces résultats ont montré que l’activité des gènes homéotiques crée la

diversité des patrons musculaires selon les segments, en permettant la poursuite du

programme de myogenèse via la régulation de l’expression des facteurs identitaires intra-

segmentaires.

En plus de créer de la diversité musculaire en agissant comme un interrupteur dans

la formation des muscles, les gènes homéotiques modulent les propriétés de chaque

muscle en fonction du segment. Par exemple, le muscle DA3 montre une taille différente en

fonction des segments; Il est plus petit dans les segments T2-T3 que dans les segments A1-

A7. La taille d’un muscle est directement liée au nombre de noyaux qu’il renferme. Le muscle

DA3 comporte en moyenne 6 noyaux dans les segments thoracique T2 et T3 et 8 noyaux

dans les segments abdominaux. J’ai montré que la variation du nombre de noyaux en

fonction des segments était contrôlée par l’activité des gènes homéotiques dans les cellules

fondatrices.

133

134

457RESEARCH ARTICLE

INTRODUCTIONAnatomy drawings illustrate the stereotyped patterns of skeletalmuscles that are essential for coordinated movements. Each musclehas its own name/identity, reflecting its specific properties andfunction. The genetic and molecular bases of muscle identityremain, however, largely unknown. The rather simple pattern ofDrosophila embryonic/larval skeletal muscles makes it an idealmodel with which to study this process (Bate 1990; Bate 1993).Every (hemi)segment of the Drosophila larva contains ~30 differentsomatic muscles, each composed of a single multinucleate fiber.Whereas all muscles express the same myogenic program (e.g. ofsarcomeric proteins), each has its own identity characterized by itsspecific position and orientation with respect to the dorsoventral(D/V) and anteroposterior (A/P) axes, size, sites of attachment onthe epidermis and innervation (Bate 1993; Baylies et al., 1998; Knirret al., 1999). Each syncytial muscle fiber is seeded by a ‘founder’myoblast (founder cell, FC). FCs possess the unique property ofbeing able to undergo multiple rounds of fusion with fusion-competent myoblasts (FCMs). The current view is that muscleidentity reflects the expression by each FC of a specific combinationof ‘identity’ transcription factors (iTFs), with Apterous, Collier (Col;Knot), Even-skipped (Eve), Krüppel, Ladybird, Nautilus (Nau) andSlouch (Slou; S59) being among the best characterized (Bourgouin

et al., 1992; Ruiz-Gomez et al., 1997; Jagla et al., 1998; Crozatierand Vincent, 1999; Knirr et al., 1999; Balagopalan et al., 2001;Fujioka et al., 2005; Dubois et al., 2007). FCs originate from theasymmetric division of progenitor cells, which are themselvessingled out from promuscular clusters (equivalence groups) byNotch (N)-mediated lateral inhibition (Carmena et al., 1995; RuizGomez and Bate, 1997). Each muscle progenitor/FC is specified ata specific A/P and D/V position within the somatic mesoderm. Thisposition determines the final location of the muscle(s) issued fromthis progenitor.

The abdominal A2-A7 segments present the same final musclepattern. The patterns of the thoracic T2-T3 and abdominal A1segments are variations on this pattern, whereas the first thoracicsegment (T1) and eighth abdominal segment (A8) present fewer andmore diversified muscles (Bate and Rushton, 1993). Although it iswell established that the Hox transcription factors are majorregulators for patterning of the animal body, our understanding ofhow each Hox protein specifies distinct morphological features andcellular identities within each body part is still fragmentary (Hueberand Lohmann, 2008; Mann et al., 2009). The segment-specificaspects of the Drosophila musculature represent an interestingparadigm with which to address this question (Greig and Akam,1993; Michelson, 1994). Based on the expression pattern of Nau,which is the Drosophila ortholog of the mammalian bHLHmyogenic factor MyoD, in different Hox conditions, Michelson(Michelson, 1994) suggested that segmental differences in thesomatic muscle pattern reflect the regulation of muscle iTFs by Hoxproteins. Subsequent studies of apterous expression in thoraciclateral muscles supported this notion and suggested that Hox activitycould control the segment-specific variation in the number ofmyoblasts allocated to a specific group of muscles (Capovilla et al.,2001). As a whole, however, when and how homeotic genes actduring the muscle-specification program remain to be established.

Development 137, 457-466 (2010) doi:10.1242/dev.045286© 2010. Published by The Company of Biologists Ltd

1Centre de Biologie du Développement, UMR 5547 CNRS/UPS, IFR 109 Institutd’Exploration Fonctionnelle des Génomes, 118 route de Narbonne, 31062 Toulousecedex 9, France. 2Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School,Boston, MA 02115, USA. 3Laboratory of Developmental Systems Biology, NationalHeart, Lung and Blood Institute National Institutes of Health, 31 Center Drive,Bethesda, MD 20892, USA.

*Author for correspondence ([email protected])

Accepted 24 November 2009

SUMMARYHox transcription factors control many aspects of animal morphogenetic diversity. The segmental pattern of Drosophila larvalmuscles shows stereotyped variations along the anteroposterior body axis. Each muscle is seeded by a founder cell and theproperties specific to each muscle reflect the expression by each founder cell of a specific combination of ‘identity’ transcriptionfactors. Founder cells originate from asymmetric division of progenitor cells specified at fixed positions. Using the dorsal DA3muscle lineage as a paradigm, we show here that Hox proteins play a decisive role in establishing the pattern of Drosophila musclesby controlling the expression of identity transcription factors, such as Nautilus and Collier (Col), at the progenitor stage. High-resolution analysis, using newly designed intron-containing reporter genes to detect primary transcripts, shows that the progenitorstage is the key step at which segment-specific information carried by Hox proteins is superimposed on intrasegmental positionalinformation. Differential control of col transcription by the Antennapedia and Ultrabithorax/Abdominal-A paralogs is mediated byseparate cis-regulatory modules (CRMs). Hox proteins also control the segment-specific number of myoblasts allocated to the DA3muscle. We conclude that Hox proteins both regulate and contribute to the combinatorial code of transcription factors that specifymuscle identity and act at several steps during the muscle-specification process to generate muscle diversity.

KEY WORDS: Hox proteins, Cis-regulatory modules, Collier (Knot)/EBF, Nautilus/MyoD, Myogenesis, Drosophila

Multi-step control of muscle diversity by Hox proteins in theDrosophila embryoJonathan Enriquez1, Hadi Boukhatmi1, Laurence Dubois1, Anthony A. Philippakis2, Martha L. Bulyk2,Alan M. Michelson3, Michèle Crozatier1 and Alain Vincent1,*

DEVELO

PMENT

Development ePress online publication date 7 January 2010

135

136

458

Here, we addressed this question, focusing on the dorsal acuteDA3 muscle lineage, which depends upon the combinatorial activityof Nau and Col, which is the Drosophila ortholog of mammalianearly B-cell factors (EBFs) (Michelson et al., 1990; Keller et al.,1997; Balagopalan et al., 2001). Our data show that Hox activity issuperimposed on mesoderm-specific and positional information atthe progenitor stage to establish the pattern of somatic muscles andacts at several independent steps during the muscle-specificationprocess. Very few studies have addressed the role of Hox genes incontrolling the fate of skeletal muscle precursors in vertebrates(Alvares et al., 2003). Our data provide a new framework forstudying the integration of Hox information into the generic processof myogenesis and the generation of muscle diversity.

MATERIALS AND METHODSDrosophila geneticsThe strains used were w118 as wild-type (wt) reference (Bloomington StockCenter, IN, USA), Antp1 (Abbott and Kaufman, 1986), Ubx1 (BloomingtonStock Center), Antp25; Ubx1 (Ernesto Sanchez-Herrero, Madrid, Spain),rP298-lacZ (Nose et al., 1998), UAS-Antp (Heuer et al., 1995), UAS-Ubx,UAS-abdA (Michelson, 1994), UAS-col (Vervoort et al., 1999), UAS-nau(Keller et al., 1997), 24B-Gal4 (Brand and Perrimon, 1993), rP298-Gal4(Menon and Chia, 2001) and sns-Gal4 (Kocherlakota et al., 2008). Themutant strains were balanced over marked (TM3 twist-lacZ) chromosomes.All Gal4-UAS crosses were performed at 25°C.

Plasmid constructions and transgenic linesA BamHI-NaeI DNA fragment containing the attB site from the pUASTattBvector (Bischof et al., 2007) was substituted for the P-element-containingNsiI-AvrII fragment in the H-Pelican lacZ transformation vector (Barolo etal., 2000) (GenBank AF242361.2) to generate attB-inslacZ, in which lacZis under the control of the minimal hsp70 promoter and flanked by gypsyinsulator sequences. The 4_0.9, 2.6_0.9 and CRM276 col genomicfragments were inserted into the attB-inslacZ and/or attB-inslacZi vectors.Each attB construct was inserted at position 49D on the second chromosomeby injection into nosC31NLS; Zh8 embryos (Bischof et al., 2007).

Construction of an intron-containing lacZi reporter geneThe unique intron of the D. virilis -tubulin56D (tub56D) gene(Dvir\GJ20466; FlyBase ID FBgn0207606) was inserted into the lacZcoding region between Asp119 and Val120 by standard PCR-based cloning.The 5� to 3� sequences of the created splice junctions are as follows: 5�-CGTGAGGT – AGGTCTCG-3�; the intron sequence is underlined. Thisresulted in a single C-to-G nucleotide change (bold) in the lacZ codingsequence, resulting in an Asp235-to-Glu substitution. The resulting intron-containing lacZ gene, denoted lacZi, was used to generate attB-inslacZi fromattB-inslacZ. Mutagenesis of the consensus AbdA/Ubx binding siteTAATTA (Ekker et al., 1994) to TGGGGA was by PCR.

Immunohistochemical staining and in situ hybridizationEmbryos were fixed and processed for antibody staining and/or in situhybridization as described (Crozatier et al., 1996). Primary antibodies were:mouse anti-Col (1/100) (Dubois et al., 2007); rabbit anti-Mef2 and anti-Nau(1/100) (provided by Eileen Furlong, Heidelberg, Germany and BrucePaterson, Bethesda, MD, USA, respectively); mouse anti--galactosidase(Promega, 1/1000); and mouse anti-Ubx and anti-Antp (1/100,Developmental Studies Hybridoma Bank, IA, USA). Secondary antibodieswere: Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit and goat anti-mouse;Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit and goat anti-mouse; AlexaFluor 647-conjugated goat anti-mouse (all Molecular Probes, 1/300); andbiotinylated goat anti-mouse (Vector Laboratories, 1/1000). Doublefluorescence in situ hybridization and immunostaining using intronic probesand Col antibodies were as described (Dubois, 2007).

Sequence alignments and transcription factor binding sitesPairwise sequence alignments of col upstream and CRM276 sequences fromvarious Drosophila species (http://flybase.org/cgi-bin/gbrowse/) wereperformed using NCBI-BLAST (bl2seq), Genome Browser (University of

California, Santa Cruz, CA, USA) and Evoprinter (NINDS, NIH, Bethesda,MD, USA) and manually edited by eye. The search for individual bindingsites for transcription factors made use of Cis Analyst (http://rana.lbl.gov/cis-analyst/) and FlyEnhancer (http://opengenomics.org/) and manualinspection based on the matrices for binding sites of Twi, Tin, dTCF, Madand Pnt (Philippakis et al., 2006). Access to the Tin and Twi in vivo bindingsites (Sandmann et al., 2006; Sandmann et al., 2007; Zinzen et al., 2009) wasvia the E. Furlong lab site (http://furlonglab.embl.de/data/).

RESULTSSegment-specific properties of the DA3 muscleCol expression in stage 15 embryos showed that the DA3 muscleforms in the thoracic (T) T2-T3 segments and abdominal (A) A1-A7 segments, but not in the T1 segment and was thinner in T2-T3than in A1-A7 (Fig. 1A). Since the size of Drosophila larval musclescorrelates with their number of nuclei (Demontis and Perrimon,2009), we counted the number of nuclei in the DA3 muscle. Fewernuclei were present in T2 and T3 (six on average) than in A1-A7(eight on average) (Fig. 1B), showing that this number is segmentspecific. Col expression in the somatic mesoderm is first detected atembryonic stage 10, in a cluster of cells at the same dorsal positionin all trunk segments, including T1 (Fig. 1C). This cluster gives riseto the DA3/DO5 progenitor in T2 and T3 and to the DA3/DO5 andDO4/DT1 progenitors in A1-A7 (Fig. 1D). Following asymmetricdivision of the DA3/DO5 progenitor, col transcription is maintainedin the DA3 FC but is repressed in the sibling DO5 FC, a repressionmediated by N; it is also not maintained in the DO4 and DT1 FCs(Crozatier and Vincent, 1999). Nau is expressed in the sameprogenitors as Col (Fig. 1C,D). However, Nau and Col co-expression is only transient. col transcription is maintained in theDA3 FC and is activated in the nucleus of each FCM incorporatedinto the growing DA3 myofiber, whereas nau is transientlytranscribed in the DA3 lineage and is activated in FCM nucleiincorporated into the DO5 myofiber (Dubois et al., 2007). This leadsto a specific accumulation of Col and Nau in the DA3 and DO5muscles, respectively (Fig. 1E). Thus, the progenitor/FC stage is thespecific step in the DA3/D05 lineage at which Nau and Col areexpressed together. One Col- and Nau-expressing progenitor isfound in T2 and T3, two progenitors in A1-A7 and none in T1,correlating with the final muscle pattern (Bate and Rushton, 1993;Crozatier and Vincent, 1999). Transient co-transcription of col andnau was nevertheless observed in a cell issued from the Col-expressing cluster in T1, although at a very low level compared withother segments (Fig. 1F). This indicates that a positive input requiredto upregulate the expression of these two iTFs in progenitor cells ismissing in T1. In summary, transient expression of Nau and Col atthe progenitor stage is segment specific and foreshadows thesegment-specific formation of DA3/DO5 and DO4/DT1 muscles(Fig. 1G).

Two independent cis-regulatory modules (CRMs)control the different phases of col transcription inthe DA3 muscleA lacZ reporter gene containing 4 kb of the col upstream cis-regulatory region (4_0.9-lacZ; Fig. 2A) reproduces col expressionin the DA3 FC and muscle, but not in promuscular clusters (Duboiset al., 2007). An enhancer that drives Eve expression in dorsalpromuscular clusters at the origin of the DA1 and DO2 muscles (seeFig. S1 in the supplementary material) has been described (Halfonet al., 2000; Knirr and Frasch, 2001; Speicher et al., 2008). Thisenhancer integrates positional information issued from the ectodermwith mesoderm-intrinsic information via the binding of five different


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transcription factors: Mothers against dpp (Mad), dTCF (Pangolin),Pointed (Pnt), Twist (Twi) and Tinman (Tin) (Carmena et al., 1998;Halfon et al., 2000; Knirr and Frasch, 2001). Mad and dTCF are the

downstream effectors of Decapentaplegic (Dpp) and Wingless (Wg)signaling, respectively, with these ectodermal signals defining apositional grid within each segment. Pnt is an effector of theRas/MAPK pathway that contributes to the specification ofequivalence groups within the mesoderm. Twi and Tin aremesoderm-specific transcription factors (Halfon et al., 2000).

By comparing gene expression profiles for myoblasts of differentgenotypes representing perturbations of the Wg, Dpp, Ras and Npathways, Estrada et al. identified ~160 genes that were possiblyregulated similarly to eve in the mesoderm, including col (Estradaet al., 2006). Using an in silico search, with the ModuleFinderprotocol (Philippakis et al., 2006), we identified five non-codingsequences that were selectively enriched for combinations of Tin,Twi, Pnt, Mad and dTCF binding sites within the col gene. Each wasindividually tested by transgenic reporter analysis (data not shown).The intron-located sequence with the highest prediction score,despite the absence of a conserved Mad binding site (see Fig. S2 inthe supplementary material), which is referred to below as CRM276(Fig. 2A), drove lacZ expression in promuscular clusters. Doublestaining of stage 10-11 embryos showed a precise overlap betweenCRM276-lacZ and Col expression (data not shown).

The stability of lacZ mRNA and -gal protein prevents, however,a precise determination of temporal aspects of the activity of CRMs,a central aspect of our study. To circumvent this problem, weintroduced the Drosophila virilis tub56D intron into the lacZcoding region (lacZi, see Materials and methods) and generatedreporters in which lacZi is placed under control of the CRM276 and4_0.9 col fragments (4_0.9-lacZi and CRM276_lacZi, respectively;Fig. 2B,C). The patterns of lacZ expression were identical whendriven by intron-devoid (not shown) and intron-containingtransgenes (Fig. 2B,C), demonstrating that the intron is efficientlyspliced. In situ hybridization with a mixture of col and lacZi intronicprobes confirmed at the primary transcript level that CRM276precisely reproduces col activation and integrates the same A/P andD/V positional information (Fig. 2D). CRM276-lacZi transcriptionwas subsequently restricted to the DA3/DO5 progenitor, identical toendogenous col, indicating that it is subject to repression by N (Fig.2E). Unlike col, however, CRM276-lacZi transcription was veryweak in progenitors and was not detected beyond that stage (Fig.2F,G). Thus, CRM276 is an early mesodermal enhancer that impartspositional and mesodermal information to col activation in a specificpromuscular cluster. Conversely, the 4_0.9 CRM was only activefrom the progenitor stage and was activated in the nuclei of FCMsthat have fused with the DA3 FC (Fig. 2H-K). CRM276 and 4_0.9CRM together account for all aspects of col transcription, includingits repression by N signaling, during the successive steps of selectionand asymmetric division of the DA3/D05 progenitor (Fig. 2I).

The precise determination of temporal windows of activityestablished that the activity of the position-specific CRM276 istransient and is relayed by another 4_0.9 CRM in progenitor cells.As it does not operate in T1, this relay is segment specific, providingevidence that it is at the progenitor stage that segment-specificinformation superimposes on positional information provided bysegmentation and D/V patterning genes (Fig. 2L).

Hox proteins are required for DA3 musclespecification and allocate its number of nucleiThe register of mesodermal expression of the thoracic Hoxproteins Sex combs reduced (Scr), Antennapedia (Antp),Ultrabithorax (Ubx) and Abdominal-A (AbdA) is schematized inFig. 3A (Bate, 1993) (see Fig. S3 in the supplementary material;data not shown) (Bate and Rushton, 1993). Comparison between

459RESEARCH ARTICLEHox control of muscle identity

Fig. 1. Segment-specific formation and properties of the DA3muscle. (A)Mef2 (red) and Col (green) expression in a stage (st.) 16Drosophila embryo, showing the entire muscle pattern and DA3muscle, respectively. The arrow indicates the absence of DA3 muscle inthe T1 segment. The inset shows an enlarged view of the T2, T3 andA1 segments. Note that the DA3 muscle is smaller in T than in Asegments. (B)The segment-specific number of nuclei in the DA3 muscle(number of segments counted30). The mesodermal domain ofexpression of Antp is in green, Ubx in blue and AbdA in red (Bate,1993)(see Fig. S3 in the supplementary material). (C-E)Comparison ofexpression of Col (red) and Nau (green) in stage 10 (C), late stage 11(st.l11) (D) and stage 15 (E) embryos. Insets in D show the Col-expressing cluster in T1 (arrowhead), the DA3/DO5 progenitor in T2,and DA3/DO5 (arrowhead) and the DT1/DO4 progenitors (arrow) in A1.The inset in E is an enlarged view of the abdominal DA3 (circled) andDO5 (dotted circle) muscles that express Col and Nau, respectively.(F)Double in situ hybridization for col (green) and nau (red) primarytranscripts and immunostaining for Col (blue). The T1 and T2 segmentsof an early stage 11 embryo are shown. Two dots per nucleus reflectthe two alleles. All embryos are oriented anterior to the left and dorsalto the top. (G)Col (red) and Nau (green) expression during the processof DA3 muscle formation in different trunk segments, highlighting thesegment-specific aspects. PC, progenitor; FC, founder cell.

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4_0.9-lacZ and either Scr, Antp or Ubx expression in stage 11embryos (see Fig. S3A,B in the supplementary material; data notshown) confirmed that the Col-expressing progenitor in T2 and T3expresses Antp and that the two col-positive progenitors in A1-A7express Ubx. Overlapping expression with the FC-specific marker,rP298-lacZ (Nose et al., 1998), in late stage 11 embryos showedthat Antp and Ubx expression is maintained in T2-T3 and A1-A7FCs, respectively (see Fig. S3C,D in the supplementary material).We looked at the effect of overexpressing either Antp or Ubx (Fig.3B,C) or AbdA (not shown) throughout the mesoderm on thespecification of the DA3 muscle. Pan-mesodermal expression ofeither Hox protein (Brand and Perrimon, 1993; Michelson, 1994)resulted in the formation of an ectopic Col-expressing muscle inT1, at the same position as in other segments (Fig. 3B,C). Thus,providing Antp, Ubx or AbdA activity is sufficient to convert theCol-expressing promuscular cluster in T1 into a DA3 muscle. Weobserved, however, that the size of this ectopic DA3 muscle varieddepending on which Hox protein was expressed. When Antp wasoverexpressed, the number of nuclei in this muscle was identicalto that in wild-type (wt) T2 and T3 (Fig. 3D). However, wheneither Ubx or AbdA was overexpressed, this number was

converted to that in wt A segments (Fig. 3E and data not shown),a clear example of posterior prevalence (Duboule and Morata,1994). These data show that Antp, Ubx and AbdA activities in themesoderm control the formation of the DA3 muscle and regulateits number of nuclei.

Hox proteins control the number of muscleprogenitors expressing Col and NauWe then looked at when during the muscle-specification processexpression of Col and Nau was modified by pan-mesodermalexpression of Antp or Ubx. In stage 11 embryos, residualCol expression was detected in all segments in cells that do notbecome progenitors; high levels of Col and Nau co-localized inthe DA3/DO5 progenitor in T2-T3 and in the DA3/DO5 andDO4/DT1 progenitors in A1-A7 (Fig. 1D,G; Fig. 4A). Pan-mesodermal expression of Antp resulted in high-level expressionof Col and Nau in one dorsal progenitor in T1 (Fig. 4B), a patternnormally restricted to T2 and T3 (Fig. 4A). Pan-mesodermalexpression of Ubx resulted in high-level expression of Col andNau in two progenitors in all three T segments (Fig. 4C), a patterntypical of wt A1-A7 segments (see Fig. 1D). We conclude that


Fig. 2. Two separate CRMs control coltranscription at different steps duringDA3 muscle specification. (A)TheDrosophila col genomic region. Codingexons are in green. The transcription startsite is indicated by an arrow. Gray boxesrepresent the muscle CRMs 4_0.9 and 276.(B,C)The 4_0.9-lacZi and CRM276-lacZi

transgenes, in which the lacZ codingsequence (red) is split by the Drosophilavirilis tub56D intron. The transcriptionstart site is indicated by an arrow. Beneathare shown (B) stage 11 4_0.9-lacZi and (C)stage 10 CRM276-lacZi embryosimmunostained for Col (green) and -galactosidase (red, LacZ), or both, asindicated. (D-K)Double in situ hybridizationfor col (green) and lacZ (red) primarytranscripts and Col immunostaining (blue)on (D-G) CRM276-lacZi and (H-K) 4_0.9-lacZi embryos. Developmental stages areindicated in each panel. The T2 and T3segments are shown. Insets show only lacZi

or col transcripts. Note that the red andgreen dots corresponding to lacZi and col,respectively, do not always overlap becausethe two genes are located at separatechromosomal positions, with two dots pergene per nucleus reflecting the two alleles.The asterisk (F,G,J,K) indicates a Col-expressing multidendritic (md) neuron.CRM276-lacZi transcription is only active inpromuscular clusters and in thecorresponding progenitor (D,E). 4_0.9-lacZi

transcription starts in the DA3/DO5progenitor (I) and is active in DA3 nucleiuntil stage 15 (J,K). (L)The temporalwindows of activity of CRM276 and 4_0.9,which specifically overlap at the progenitorstage (gray).

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Hox activity in the mesoderm controls the segment-specificnumber of progenitors expressing Col and Nau that emerge froma pre-defined promuscular cluster.

In order to complement the Hox gain-of-function data, wefollowed Col expression and the DA3 muscle lineage in Hox loss-of-function mutant embryos, using null alleles (Fig. 4D-I). No DA3muscle formed in T2 and T3 in Antp mutant embryos (Fig. 4E). InUbx mutant embryos, the DA3 muscle pattern was similar to that ofthe wt (not shown), presumably owing to the derepression of Antpexpression in the A1 and A2 segments (Hooper, 1986). Accordingly,we observed that Antp, Ubx double-mutant embryos lacked a DA3muscle in all T and A1-A2 segments (Fig. 4F). Close examinationof stage 11 Antp mutant embryos showed that one cell in eachthoracic segment transiently accumulated more Col protein than theother cells of the cluster, similar to T1 in wt embryos. This transient,low-level Col accumulation confirms that the process of progenitorselection is initiated and prematurely aborts in the absence of Antpinput (Fig. 4H). In Antp, Ubx double mutants, Col upregulation inprogenitors was only observed in A3-A7 (Fig. 4I), furtherconfirming that Hox-dependent upregulation and the final musclepattern are linked (Fig. 4J).

Antp and Ubx/AbdA control col expression inmuscle progenitors via distinct cis-regulatoryelementsThe loss of col expression in Hox mutant embryos and the patternof 4_0.9-lacZ expression together indicated that the 4_0.9 CRMmediates col regulation by Hox proteins (Figs 2 and 4; Fig. 5A). Theobservation that a reporter construct containing only 2.6 kb of colupstream DNA (2.6_0.9-lacZ) was only active in A progenitors (Fig.5B,C) further raised the possibility that differential control by theAntp and Ubx/AbdA paralogs could involve different cis elements.To investigate this, we compared 2.6_0.9-lacZ and 4_0.9-lacZexpression in stage 11 embryos when either Antp or Ubx wasexpressed throughout the entire mesoderm. Unlike col, 2.6_0.9-lacZwas not activated by Antp in T1, consistent with the fact that it is notexpressed in T2 and T3 in wt embryos (Fig. 5E; see also Fig. 4). Bycontrast, 2.6_0.9-lacZ was activated by Ubx (or AbdA, not shown)in two progenitors in each segment, including all three T segments,thereby reproducing the pattern of col expression under theseconditions (Fig. 5F). These results showed that upregulation of colexpression by Ubx/AbdA, and not Antp, involves cis elementspresent within the 2.6_0.9 col upstream region. Conversely, 4_0.9-

lacZ expression was upregulated by Antp in one progenitor in T1,therefore reproducing Col expression under the same conditions(Fig. 5D; Fig. 4B). These data show that Antp and Ubx/AbdAcontrol col expression in muscle progenitors via distinct cis-regulatory elements (Fig. 5C).

Ubx/AbdA regulation of col transcription inmuscle progenitors is directSince 2.6_0.9-lacZ is only expressed in A segments, we askedwhether its regulation by Ubx/AbdA is direct. An in silico search forhigh-affinity Hox binding sites [TAATTA (Ekker et al., 1994;Affolter et al., 2008)] within the 2.6_0.9 CRM identified two sitesthat are conserved at the same relative position in several Drosophilaspecies (Fig. 5C and see Fig. S4 in the supplementary material).Each of these sites, named Hox1 and Hox2, was individuallymutated (TAAT to GGGG) within the 2.6_0.9-lacZ construct, givingrise to the 2.6_0.9Hox1-lacZ and 2.6_0.9Hox2-lacZ transgenes.2.6_0.9Hox2-lacZ expression was no longer detected in progenitors(Fig. 5G), whereas the Hox1 mutation had little if any effect.Mutation of both Hox1 and Hox2 sites had no additional effect overthe Hox2 mutation alone (data not shown), indicating that Hox2 isrequired for col regulation by Ubx/AbdA in abdominal muscleprogenitors. Expression of 2.6_0.9Hox2-lacZ recovered later duringDA3 muscle development (Fig. 5H), consistent with our previousfinding that cis elements responsible for col activation in the DA3-recruited FCM are all contained within the 2.3_1.6 interval, whichdoes not cover the Hox2 site (Dubois et al., 2007). We conclude thata single Hox binding site mediates the specific upregulation of colexpression by Ubx/AbdA in A progenitors (Fig. 5C).

Forced expression of Nau plus Col bypasses theneed for Hox activity in forming a DA3 muscle,but not in allocating its nuclei numberOur finding that Hox activity is required in progenitors for prolongedexpression of Nau and Col and for implementation of the muscledifferentiation process suggested that forced expression of these iTFsin progenitor cells might bypass the need for Hox activity. Wetherefore repeated the 24B-Gal4�UAS-overexpression experiments,but using both Col and Nau in place of a Hox protein. To visualize theDA3 muscle, we used the 2.6_0.9-lacZ reporter (Fig. 6A). Aspreviously shown (Dubois et al., 2007), 24B-Gal4-driven expressionof Nau alone does not affect 2.6_0.9-lacZ expression, whereasexpression of Col results in strong activation in the DA2 and VL1-2


Fig. 3. Hox proteins are required for the formationof the DA3 muscle and allocate its number ofnuclei. (A)A color-coded representation of Scr, Antp,Ubx and AbdA expression in the Drosophila trunksegments. (B,C)Col (red) and Mef2 (green) expressionin stage 16 embryos expressing Antp (B) or Ubx (C) inall mesodermal cells (24B-Gal4 driver). Col stainingalone is shown on the left. The arrow points to theDA3-like muscle that forms in T1. (D,E)The number ofnuclei per DA3 muscle in each T1 to A7 segment. Thegenotypes are shown at the top, with the Hox colorcode as in Fig. 1. The gray bars show wild-type (wt)nuclei numbers. Number of segments counted30.

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muscles in T2 to A7, in DT1 in A segments, plus, more sporadically,in a few other muscles (Fig. 6B,C) (Dubois et al., 2007). The samepattern was observed upon expression of Col plus Nau, with thenotable exception of additional activation in a muscle in T1. Thisectopic muscle is at the same position and shows the same orientationand attachment sites as the ectopic DA3 muscle induced by Hoxproteins (see Fig. 3). We infer from this observation that high levelsof Nau plus Col can bypass the need for a Hox protein inimplementing the DA3 muscle formation process. It strengthens ourconclusion that the upregulation of expression of a combination ofiTFs by Hox proteins plays a decisive role in converting positionalinformation within the mesoderm into a specific muscle pattern.

However, the ectopic DA3 muscle that formed in T1 upon forcedexpression of Col and Nau displayed very few nuclei (two to three),indicating that Hox activity is essential for allocating this muscle anormal number of nuclei. To better define in which myoblasts Hoxwas acting, we repeated the Ubx-overexpression experiments usingtwo different drivers, rP298-Gal4 and sns-Gal4, which are specificfor FCs and muscle precursors and for FCMs, respectively (Menon

and Chia, 2001; Kocherlakota et al., 2008). We found that thenumber of nuclei in the T2 and T3 segments was converted to thatin A segments upon Ubx expression in FCs (Fig. 6E,F) but not inFCMs. These results show that Hox factors act to regulate the sizeof each muscle. Ubx expression in FCs did not, however, promotethe formation of an ectopic DA3 muscle in T1 (Fig. 6E),strengthening our conclusion that Hox activity is required at theprogenitor stage to implement the muscle differentiation process.

A model for the transcriptional history of aDrosophila muscleSegment-specific upregulation of col and nau expression by Hoxproteins suggests the following model for the transcriptional historyof the DA3 muscle (Fig. 7). The first step is the activation of coltranscription in a cluster of mesodermal cells in all T and Asegments. This is controlled by the early-acting CRM276 enhancer,which integrates positional information issued from the ectoderm,mesoderm-intrinsic cues and repression by N signaling in non-progenitor cells. In a second step, maintenance of Col and Nau


Fig. 4. Hox proteins control the number ofmuscle progenitors expressing Col and Nau.(A-C)Col (red) and Nau (green) expression in Tsegments of late stage 11 Drosophila embryos.Overlap (yellow) is shown on the right. (A)Oneprogenitor expressing high levels of Col and Nauis found in wt T2 (arrowhead) and T3 and in T1upon expression of Antp (B) or Ubx (C). (C)Ubxinduces a second progenitor (arrow) to expresshigh levels of Col and Nau in all three Tsegments, similar to wt A segments (see Fig. 1D).The asterisk indicates another muscle progenitorthat expresses Nau, but not Col, in wt Tsegments and sometimes low levels of Col uponHox overexpression. (D-I)Col expression in stage15 (D-F) and 11 (G-I) embryos. The DA3 muscle islacking in T2-T3 and T2-A2 in Antp (E) and Antp;Ubx (F) mutants, respectively, correlating with theabsence of high-level Col-expressing progenitors(H,I). The remaining Col-positive nucleuscorresponds to that of an md neuron, as shownby its expression of pickpocket (Crozatier andVincent, 2008). Enlarged views of the Col-expressing cluster/progenitor in T2 (G,H) and A1(I) show that Col upregulation in progenitor cellsdoes not occur in the absence of Hox protein.Residual Col protein indicates the position of theCol-expressing cluster. (J)Col (red) and Nau(green) expression in muscle progenitors indifferent trunk segments in Hox mutants andHox-overexpression conditions.

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expression in the DA3/DO5 progenitor relies upon Hox factors andis mediated by another CRM, the 4_0.9 CRM, which containsseparate elements for regulation by Antp and Ubx/AbdA. The 4_0.9CRM is also subject to repression by N, leading to restriction of coltranscription to the DA3 FC. In a third step, implementation of theDA3 muscle differentiation process requires positive and direct Colautoregulation, which converts all of the DA3 muscle nuclei to thesame transcriptional program (Dubois et al., 2007). In essence, Colaccumulation in the DA3/DO5 progenitor is required to maintain itsown expression in the DA3 FC and muscle precursor, thusrepresenting a case of forward autoregulation. Finally, Hox proteinscollaborate with iTFs to control the number of myoblasts assignedto the DA3 muscle. Central to our model is the switch in regulationfrom the early to late muscle CRM that occurs at the progenitor stageand requires Hox activity, thereby linking positional informationalong the A/P axis to muscle diversity.

DISCUSSIONCis-reading of positional information: intersectingcomputational predictions and ChIP-on-chip dataEve expression in the DA1 muscle lineage provided the first paradigmfor studying the early steps of muscle specification. Detailedcharacterization of an eve muscle CRM showed that positional andtissue-specific information were directly integrated at the level of

CRMs via the binding of multiple transcription factors, includingdTCF, Mad, Pnt, Tin and Twi (Carmena et al., 1998; Halfon et al.,2000; Knirr and Frasch, 2001). Based on this transcription factor codeand using the ModuleFinder computational approach (Philippakis etal., 2006), we have identified a CRM, CRM276, that preciselyreproduces the early phase of col transcription. This CRM also droveexpression in cells of the lymph gland, another organ that is issuedfrom the dorsal mesoderm where col is expressed (Crozatier et al.,2004). Parallel to our study, two col genomic fragments wereselectively retrieved in chromatin immunoprecipitation (ChIP-on-chip) experiments designed to identify in vivo binding sites for Twi,Tin or Mef2 in early embryos (Sandmann et al., 2007; Liu et al., 2009).One fragment overlaps with CRM276. Based on this overlap andinterspecies sequence conservation, we tested a 1.4 kb subfragment ofCRM276 that retained most of the transcription factor binding sitesidentified by ModuleFinder and found that it specifically reproducedpromuscular col expression (M. de Taffin, personal communication).This in vivo validation shows that intersecting computationalpredictions and ChIP-on-chip data should provide a very efficientapproach to identify functional CRMs on a genome-wide scale(Zinzen et al., 2009).

The eve and col early mesodermal CRMs are activated at distinctA/P and D/V positions. We are now in a position to undertake acomparison of these two CRMs, in terms of the number and relative


Fig. 5. Hox regulation of col transcriptionat the progenitor stage is modular.(A,B,D-H) Lateral views of stage 11Drosophila embryos expressing lacZ in theDA3/DO5 (A, arrowhead) and DT1/DO4 (A,arrow) progenitors under control of either the4_0.9 or 2.6_0.9 CRM. (A,B)lacZ expressionin T2 and T3 (horizontal bar) in wt embryosrequires the 4_2.6 CRM. (D-F)2.6_0.9-lacZexpression is induced in T2 and T3 by Ubx butnot by Antp; 4_0.9-lacZ expression is inducedby Antp in all segments, including in T1(asterisk in D). (G) Mutation of the Hox2 siteabolishes 2.6_0.9-lacZ expression inprogenitors. (H)lacZ expression in the DA3muscle at stage 15 is independent of the4_2.6 CRM and Hox2. (C)Schematic of astage 11 embryo with the Col-expressingprogenitors shown as red dots and domainsof mesodermal Antp and Ubx/AbdAexpression as green and blue lines,respectively. Beneath are the 4_0.9-lacZ and2.6_0.9-lacZ constructs showing the Antp-and Ubx-responsive elements in green andblue, respectively. Position of the Hox1 andHox2 sites is indicated (see Fig. S4 in thesupplementary material).

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spacing of common activator and repressor sites and their expandedcombinatorial code, in order to understand how differentmesodermal cis elements perform a specific interpretation ofpositional information.

The Hox code relays positional information in asegment-specific mannerA progenitor is selected from the Col promuscular cluster in T2 andT3 but not T1. One cell issued from the Col-expressing promuscularcluster in T1 nevertheless shows transiently enhanced Col

expression, suggesting that the generic process of progenitorselection is correctly initiated in T1. This process aborts, however,in the absence of a Hox input, as shown by the loss of progenitor Colexpression and DA3 muscle in specific segments in Hox mutants.The similar changes in Nau and Col expression observed under Hoxgain-of-function conditions allow us to conclude that the expressionof iTFs is regulated by Hox factors at the progenitor stage. Thesuperimposition of Hox information onto the intrasegmentalinformation thereby implements the iTF code in a segment-specificmanner and establishes the final muscle pattern. Unlike DA3, a


Fig. 6. Expression of Nau and Col can bypassthe Hox requirement for DA3 musclespecification. (A-D)lacZ expression in stage 162.6_0.9-lacZ Drosophila embryos upon pan-mesodermal expression of Nau (B), Col (C), Colplus Nau (D) or neither protein (A). Only co-expression of Col plus Nau results in the formationof a DA3-like muscle in T1 (arrow). This ectopicmuscle has only two nuclei (inset in D). (E)Doubleimmunostaining of stage 15 embryos for Mef2(green) and Col (red) showing Col expressionupon expression of Ubx in all FCs. (F)The numberof nuclei per DA3 muscle in each segment ofrP298>Ubx embryos is in blue. Wt values are ingray. Number of segments counted30.

Fig. 7. Transcriptional control of Drosophila muscle identity:the central role of Hox proteins. Expression of Col (red) and Nau(green) in the DA3 muscle lineage is shown on the left, with thecorresponding cis control of col expression represented on the right.col transcription is activated in one promuscular cluster per trunksegment under control of the early-acting CRM276, whichintegrates A/P and D/V positional information, mesoderm-intrinsiccues and repression by N signaling. This results in Col expression inone (T segments) or two (A1-A7 segments) dorsal progenitors.Upregulation of col (red) and nau (green) transcription in theDA3/DO5 progenitor at stage 11 is controlled by Antp andUbx/AbdA and is mediated by two separate elements of the 4_0.9CRM. This is the key step, when segment-specific variations areimposed on the segmental muscle pattern. Following progenitordivision, restriction of col transcription to the DA3 FC requirespositive regulation by Col and Nau and repression by N. From thisstage on, Col is required for activating its own transcription in allFCM nuclei incorporated into the DA3 myofiber. Hox activity in FCscontrols the number of myoblasts allocated to the DA3 muscle,independently of the control of nau and col. The key regulatorysteps are shaded and centered: early positional information isrelayed by segment-specific Hox information at the progenitorstage. The active and inactive CRMs are indicated by gray and whiteboxes, respectively. Binding of mesodermal transcription factors (M),such as Twi and Mef2, to CRM 276 and 4_0.9 is suggested byphylogenomic footprinting (see Figs S3 and S4 in thesupplementary material) and ChIP-on-chip data (Sandmann et al.,2006; Sandmann et al., 2007). D

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number of specific muscles are found in both T1 and T2-A7 (Bateand Rushton, 1993), such as the Eve-expressing DA1 muscle; othermuscles form in either abdominal or thoracic segments, as illustratedby the pattern of Nau expression in stage 16 embryos (Michelson,1994) (Fig. 1E). This diversity in segment-specific patterns indicatesthat Hox regulation of iTF expression is iTF and/or progenitorspecific.

Modular cis regulation of col transcription by HoxproteinsAs early as 1994, Hox proteins were proposed to regulate thesegment-specific expression of iTFs. Seven years later, Capovilla etal. characterized an apterous mesodermal enhancer (apME680)active in the LT1-4 muscles and proposed that regulation by Antpwas direct (Capovilla et al., 2001). However, mutation of thepredicted Antp binding sites present in apME680 abolished itsactivity also in A segments, suggesting that some of the same siteswere bound by Ubx/AbdA. We now have evidence that theregulation of col expression by Ubx/AbdA in muscle progenitors isdirect and involves a single Hox binding site. However, regulationby Antp does require other cis elements. It remains to be seenwhether regulation by Antp is also direct. Since Antp, Ubx andAbdA display indistinguishable DNA-binding preferences in vitro(Ekker, 1994), the modular regulation of col expression by differentHox paralogs suggests that other cis elements and/or Hoxcollaborators contribute to Hox specificity (Mann et al., 2009).Direct regulation of col by Ubx has previously been documented inanother cellular context, that of the larval imaginal haltere disc, viaa wing-specific enhancer (Hersh and Carroll, 2005). In this case,Ubx directly represses col expression by binding to several sites,contrasting with col-positive regulation via a single site in muscleprogenitors. This is the second example, in addition to CG13222regulation in the haltere disc, of direct positive regulation by Ubxvia a single binding site (Hersh et al., 2007). Hox ‘selector’ proteinscollaborate on some cis elements with ‘effector’ transcription factorsthat are downstream of cell-cell signaling pathways (Grienenbergeret al., 2003; Walsh and Carroll, 2007; Mann et al., 2009). In the DA3lineage, it seems that Dpp, Wg and Ras signaling act on one col ciselement and the Hox proteins on others. The regulation of colexpression by Hox proteins in different tissues via different CRMsprovides a new paradigm to decipher how different Hox paralogscooperate and/or collaborate with tissue- and lineage-specific factorsto specify cellular identity (Brodu et al., 2004; Gebelein et al., 2004;Walsh and Carroll, 2007; Stobe et al., 2009).

Hox proteins control the number of myoblastsallocated to each muscleThe DA3 muscle displays fewer nuclei in T2 and T3 than in A1-A7, an opposite situation to that described for an aggregate of thefour LT1-4 muscles. Capovilla et al. proposed that the variationin the number of LT1-4 nuclei was controlled by Hox proteins(Capovilla et al., 2001). Our studies of the DA3 muscle extendthis conclusion by showing that the variations due to Hox controlare specific to each muscle and are exerted at the level of FCs.Since the number of nuclei is both muscle- and segment-specific,Hox proteins must cooperate and/or collaborate with various iTFsto differentially regulate the nucleus-counting process. As such,Hox proteins contribute to the combinatorial code of muscleidentity. Identifying the nature of the cellular events and genesthat act downstream of the iTF/Hox combinatorial code and thatare involved in the nucleus-counting process represents a newchallenge.

AcknowledgementsWe thank the Bloomington Stock Center, S. Abmayr, S. Menon, E. Sanchez-Herrero and F. Karch for fly stocks; B. Patterson and E. Furlong for antibodies;F. Karch and members of our laboratory for critical reading of the manuscript;and E. Furlong for communicating unpublished data. We acknowledge thehelp of the Toulouse RIO Imaging Platform and B. Ronsin and A. Leru forconfocal microscopy. This work was supported by CNRS and Ministère de laRecherche et de la Technologie (MRT), Université Paul Sabatier, AssociationFrançaise contre les Myopathies (AFM) and the US National Institutes ofHealth. J.E. was supported by fellowships from MRT and AFM and H.B. by afellowship from MRT. Deposited in PMC for release after 12 months.

Competing interests statementThe authors declare no competing financial interests.

Supplementary materialSupplementary material for this article is available athttp://dev.biologists.org/lookup/suppl/doi:10.1242/dev.045286/-/DC1

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Perspectives à court et moyen terme

A/ La régulation transcriptionnelle de collier L’analyse des modules cis régulateurs (CRM) contrôlant l’expression collier au cours

de la formation du muscle DA3(3) a montré deux étapes clef de cette régulation : Un CRM

« précoce » active l’expression de collier dans le groupe promusculaire à l’origine du muscle

DA3 (et d’autres muscles). Un deuxième CRM « tardif » contrôle l’expression de collier à

partir du stade progéniteur (article III).

Le CRM précoce a été identifié via une recherche bio-informatique basée sur la

structure du seul CRM caractérisé jusqu’alors, le CRM régulant l’expression d’eve dans les

muscles dorsaux DA1 et DO2. Le CRM d’eve intègre des informations de position médiées

par les effecteurs des voies de signalisation Wnt, Dpp et Ras et une information tissulaire

médiée par les facteurs de transcription mésodermiques Twist et Tinman.

Le CRM tardif est actif à partir du stade progéniteur (article I). C’est à ce stade de

développement que la transcription de collier devient dépendante d’une information

homéotique (Article III, Figure 7).

Ensemble, les CRM précoce et tardif reproduisent fidèlement l’expression de collier

endogène. Le CRM précoce intègre une information mésodermique, une information de

position issue de l’ectoderme et la répression par Notch au cours du processus d’inhibition

latérale sélectionnant les progéniteurs dans tous les segments du tronc. Le CRM tardif

intègre l’information homéotique spécifique à chaque segment ou groupe de segments, la

répression par Notch au cours du processus de division asymétrique et l’information

identitaire via la liaison de Nautilus et Collier. L’auto-régulation positive par Collier est

nécessaire à la propagation de l’identité de la cellule fondatrice à l’ensemble des noyaux de

la fibre DA3.

De nombreuses questions restent cependant en suspens :

L’activation de la transcription du gène col dans les cellules du groupe promusculaire

à l’origine du muscle DA3 répond à une information de position issue de l’ectoderme et

mettant en jeu les voies de signalisation Wingless (Wg) (axe Antéro-Postérieur) et

Decapentaplegic (Dpp) /TGFB� (axe Dorso-Ventral). Notre hypothèse est que la lecture

différentielle de cette information par différents CRM permet de positionner précisément

l’expression des différents FT identitaires au sein du mésoderme mais les bases

mécanistiques de cette lecture restent à définir. Un objectif immédiat est donc de mieux

caractériser le CRM précoce de collier.

Pour cela, 2 approches complémentaires seront poursuivies par Mathilde de Taffin,

étudiante de thèse que j’ai eu la chance d’encadrer pendant son stage M2R.

155

156

(i) La substitution du CRM de D. melanogaster par les régions correspondantes

amplifiées à partir des génomes de D. pseudobscura et de D. virilis (environ 60M

années d’évolution). Le nombre et les positions relatives des sites de fixation

prédits pour les FT Twi, Tin, Mad, dTCF et Pnt au sein du ECRM montre des

différences entre ces espèces. La comparaison précise de l’expression des ECRM

« hétérologues » sera donc extrêmement informative et permettra d’évaluer le

rôle des sites conservés et non conservés et le niveau de précision de la lecture

de l’information de position.

(ii) La mutation individuelle ou groupée des sites prédits de fixation des FT Twi, Tin, et

Mad afin d’évaluer leur contribution à la position du groupe promusculaire

exprimant Col.

Ces deux approches seront testées par l’intermédiaire de transgènes rapporteurs. La

transgénèse par recombinaison site-spécifique (Bischof, Maeda et al. 2007) que nous avons

déjà utilisé pour l’analyse des mutations des sites Hox permet la caractérisation de

nombreux variants de CRM tous insérés au même site chromosomique.

Le profil d’expression de Col au cours de la myogenèse joint à des données de ChiP-

CHIP suggère que Twi et Tin se lient simultanément aux CRM précoce et tardif. Ceci

suggère la possibilité qu’une interaction physique entre ces 2 CRMs soit nécessaire dans la

cellule progéniteur pour favoriser la liaison des protéines homéotiques et assurer le maintien

de l’expression de Col au cours de cette phase de transition. Cependant, si l’analyse de

transgènes rapporteurs permet de disséquer des séquences cis-régulatrices avec une

grande précision, elle ne permet pas d’étudier la fonction des CRM dans leur contexte

génomique normal. Afin de tester cette fonction, le projet est de modifier le CRM précoce

dans son contexte génomique normal. Pour cela le laboratoire peut disposer de clones

P[acman] ou FlyFos022589 contenant l’intégralité du gène col et de ses séquences

régulatrices connues. L’idée est, par recombineering chez E. Coli, de modifier le CRM

précoce ou tardif et d’étiqueter la protéine Col avant de réintroduire le gène modifié dans le

génome. Les P[acman] et FlyFos comportent une séquence AttB permettant leur insertion

par recombinaison site-spécifique.

B/ Les cibles de la combinatoire Col/Nau dans le muscle DA3 Nous avons maintenant montré que Collier et Nautilus était deux facteurs identitaires

du muscle DA3(3) et qu’en absence de l’un ou l’autre de ces facteurs, le muscle DA3

change d’identité. Un enjeu majeur du laboratoire est donc de définir les gènes effecteurs de

157

158

cette identité musculaire.

Collier étant un acteur majeur de l’identité du muscle DA3 et uniquement nécessaire

à ce muscle, la priorité est d’identifier ses gènes cibles directs en utilisant la méthode de

ChIP (immunoprécipitation de la chromatine). Une stratégie de ChIP-seq est actuellement

développée au sein du laboratoire, basée sur l’expression ciblée dans le muscle DA3 d’une

protéine Col « biotinylable » suivie d’une chromatographie d’affinité pour isoler les fragments

liés in vivo par cette protéine modifiée (projet de Hadi Boukhatmi avec la participation de

Justine Oyallon, post-doc). Des expériences de ChIP-seq « classiques » sur embryons

entiers seront aussi réalisées (Mathilde de Taffin). L’objectif est ici d’identifier les gènes

cibles de Col dans le muscle DA3 en croisant les données expérimentales de ChiP-SEQ et

les cibles directes de facteurs mésodermiques généraux tels que Twist, Tinman et Mef2

(Sandmann, Girardot et al. 2007).

En parallèle un crible génétique systématique a été entrepris par Laurence Dubois

pour rechercher de nouveaux gènes nécessaires à la formation du muscle DA3. La

comparaison des résultats de ce crible et des données de Chip-SEQ et de transcriptome

permettront d’avoir une vue d’ensemble sur la réalisation du programme identitaire du

muscle DA3(3).

Discussion générale

Le problème des cribles envisagés ci-dessus est qu’ils se limitent essentiellement à

l’étude d’un muscle. Peut-on comprendre la combinatoire en se focalisant sur l’identité d’un

seul muscle ? Il faudrait avoir une approche similaire avec tous les gènes identitaires afin de

pouvoir comparer leurs phénotypes et cibles. Mais cela représente un travail colossal.

Pourquoi alors ne pas raisonner dans le sens inverse. Pourquoi ne pas partir des cibles et

les relier à la combinatoire?

On peut faire trois hypothèses sur les cibles de la combinatoire : la première est que

les facteurs identitaires régulent tous les mêmes cibles mais de façon différentielle; la

deuxième est que chaque facteur d’identité régule un groupe de cibles plus ou moins

spécifiques d’un sous ensemble de muscles. Enfin, les facteurs identitaires pourraient

réguler à la fois des cibles communes et des cibles spécifiques. Quelques données montrent

que la troisième hypothèse est la plus plausible. L’étude des cibles de Lb montre que ce

facteur semble réguler directement des gènes exprimés dans d’autres muscles, comme

l’intégrine alpha BPS-2, via un module cis-régulateur spécifique. D’un autre coté, il existe des

exemples de protéines qui ne sont pas des facteurs de transcription et qui sont exprimées

dans un sous ensemble de muscles, suggérant une régulation et une fonction spécifique

d’un muscle ou groupe de muscles. Prenons l’exemple de la connectine qui est exprimée

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160

dans les muscles LT1(21), LT2(22) LT3(23), LT4(24), VA2(27), VA3(29) et DT1(18). La

connectine est une protéine d’adhésion cellule-cellule. La mutation du gène connectine

affecte uniquement les muscles LTs, provoquant leur détachement alors qu’ils sont groupés

dans les embryons sauvages. L’expression et la fonction de la connectine dans un sous

ensemble de muscles suggère que son expression est régulée de façon spécifique par une

ou des combinatoires de facteurs de transcription. Ces quelques exemples montrent que les

gènes cibles de la combinatoire de facteurs identitaires doivent comporter à la fois des

gènes musculaires « génériques » régulés différentiellement et des gènes muscle(s)-

spécifiques. Je reformule donc ma question de départ : De quelle manière relier les gènes

exprimés au cours de la myogenèse à une combinatoire de FT?

Pour identifier les gènes musculaires « génériques » qui sont contrôlés

différentiellement par différentes combinatoires, on pourrait prendre les régions régulatrices

de gènes génériques connus et tester l’hypothèse d’une régulation modulaire plutôt que

générique. Ceci n’est pas une idée complètement farfelue. Les régions régulatrices du

gène duf ont été découpées et chaque fragment testé par gène rapporteur LacZ, ce qui a

révélé une régulation modulaire du gène Lacz, c'est-à-dire une expression dans des sous

ensemble de muscles différents selon le fragment (module) testé. Il faudrait ensuite

caractériser l’expression de chaque rapporteur dans un contexte d’expression dans tout le

mésoderme, de chaque facteur identitaire connu. Une expression élargie du rapporteur LacZ

indiquerait un contrôle par le facteur identitaire sur-exprimé. Ensuite il faudrait rechercher

des sites de fixation potentiels de ce facteur dans le module testé et les muter afin de

déterminer si il s’agit d’une régulation directe. Si une régulation modulaire directe peut être

montrée pour plusieurs gènes musculaires génériques, on pourra conclure que les gènes

identitaires modulent l’expression de gènes myogénique généraux. Dans ce cas, les gènes

identitaires feraient partie intégrale du programme myogénique général.

Ensuite, comment trouver des gènes régulés spécifiquement dans tel ou tel muscle

par une combinatoire de facteur de transcription. Deux possibilités : en criblant les banques

d’expression déjà établies (banques d’hybridation in situ et enhancer trap) et en regardant la

littérature. Plusieurs gènes sont déjà connus pour affecter l’identité de muscles spécifiques,

par exemple Robo et slit des gènes initialement identifiés pour leur rôle dans le guidage

axonal par un mécanisme d’attraction/répulsion, ou encore D-Grip (Glutamate interacting

protein). Prenons à nouveau l’exemple du gène connectine. La comparaison de son patron

d’expression et des patrons d’expression des FT identitaires connus suggère un contrôle par

Apterous. En accord avec cette possibilité, la mutation connectine affecte les mêmes

muscles que la mutation apterous, c'est-à-dire les muscles LTs. Certes dans le mutant

apterous les muscles LTs sont absents alors que dans le mutant connectine ils sont

seulement mal disposés, mais il est difficile d’imaginer que la phénotype causé par la

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mutation d’une seul cible puisse récapituler le phénotype d’un facteur identitaire. La

corrélation entre patron d’expression, facteur identitaire et mutation observée pour connectin

est la preuve de principe qu’une identification de gènes cibles des FT identitaires par

criblage des patrons d’expression est possible.

Enfin on peut très bien comprendre que les facteurs de transcription identitaires

régulent des gènes cibles spécifiques, afin que chaque muscle possède des propriétés

(identité) qui lui soient propres mais pourquoi donner de l’importance à une régulation de

gènes génériques exprimés dans tous les muscles ? Il faut imaginer que la régulation

différentielle –niveau, fenêtre temporelle- de gènes génériques pourrait participer à la

réalisation de l’identité musculaire.

Conclusion : La Drosophile, les Vertèbres et l’identité musculaire.

Il existe une pathologie anthropocentrique très répandue dans le monde de la

Drosophile, c’est de toujours vouloir relier ce modèle à un modèle Vertébré, souvent

l’homme, que ce soit dans une présentation orale, dans des demandes de financement ou

lors de l’écriture d’un papier. J’entends des étudiants en thèse, parfois des chercheurs dire

en regardant un projet sur la Drosophile: à quoi sert ce travail? Parfois je me demande si on

écrit «orthologue» pour comparer deux modèles ou pour justifier son travail. J’ai effectué

mon magistère de génétique à Paris, magistère rattaché à une école doctorale qui avait pour

nom : logique du vivant. J’ai toujours trouvé ce nom un peu pédant. Je comprends

aujourd’hui son sens. La biologie c’est analyser le monde vivant dans son ensemble, dans

ses généralités mais aussi dans ses exceptions, ses ’inattendus’, autrement dit, comprendre

le monde vivant dans sa globalité.

Regardons le modèle drosophile et les modèles vertébrés dans leur processus

myogénique. Ces deux modèles sont très différents, cependant la logique de développement

est très similaire. Si certains de mes professeurs lisaient cela ils seraient atterrés par mes

mots. Reprenons du début : La drosophile et les vertébrés sont des organismes

métamérisés. Si on se focalise sur le mésoderme du tronc, le mésoderme pré-somitique

chez les vertébrés se segmente en métamères appelés les somites; chez la drosophile le

mésoderme se segmente en métamères appelés segments. Ensuite dans chaque métamère

le territoire myogénique va être défini. A la fin du processus de métamérisation on ne

distingue que très peu de différences morphologiques entre segments. Chez la Drosophile

un programme identitaire dont la base moléculaire est une combinatoire de facteurs de

transcription contrôle l’identité de chaque muscle dans un métamère et l’identité musculaire

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de chaque métamère est sous le contrôle des gènes homéotiques. Nous avons montré que

les gènes homéotiques contrôlent l’identité inter-segmentaire en modulant l’identité intra-

segmentaire via et en parallèle des gènes identitaires. Cette logique de développement est

elle réutilisée chez les vertébrés?

Évidemment, les gènes homéotiques qui sont conservés au cours de l’évolution

doivent aussi contrôler l’identité des muscles vertébrés selon l’axe rostro-caudal du corps.

Un article montre que les somites ont des identités différentes en fonction de leur position

rostro-caudale et que cette identité reflète probablement une fonction autonome de gènes

homéotiques dans les somites. Cependant la métamérisation n’est plus observable chez

l’adulte, les principaux vestiges métamèriques étant les vertèbres, chacune ayant une

identité propre le long de l’axe rostro-caudal. En ce qui concerne les muscles, la

métamérisation embryonnaire s’est estompée. Si on s’intéresse aux muscles du tronc chez

l’homme, il en existe environ une trentaine, soit autant que dans un seul segment de

Drosophile. Prenons l’exemple du muscle grand dorsal : il s’étend de la vertèbre thoracique

T7 jusqu'à la cinquième vertèbre lombaire (L5), puis du bas de la crête sacrale médiane il

remonte sur le bord latéral du sacrum et sur le tiers dorsal de la lèvre externe de la crête

iliaque ; enfin, toutes les fibres musculaires du grand dorsal convergent sur la partie

supérieure de l’humérus. On peut très bien concevoir qu’une combinatoire de facteurs

transcription contrôle l’identité d’un muscle qui s’étend sur autant de métamères mais

comment intégrer la fonction des protéines homéotiques dans ce contrôle ? J’aimerais faire

l’hypothèse que chaque fibre du grand dorsal est sous le contrôle d’une combinatoire de

gènes homéotiques différents. De ce point de vue, chaque muscle de mammifères serait

donc un composite de fibres musculaires d’identités différentes, y compris homéotiques.

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166

Summary

The complex muscle patterns laid during development of complex animals allow coordinated,

stereotyped movements such as those we all make during our daily life. Each muscle

develops through the fusion and differentiation of myoblasts to form syncitial myofibres.

Myofibres then connect to the skeleton via specific tendon cells. Once formed, each

muscle of the body can be uniquely identified by its position, shape, size and skeletal

attachments, properties grouped under the term “identity”. While the transcriptional

control of myogenesis has been extensively studied, the control of muscle identity

remains largely unknown. Most of our present knowledge comes from studies on the

Drosophila embryonic musculature, where it has been proposed that muscle identity was

reflecting the expression of specific combinations of Transcription Factors (TF) in

muscle founder myoblasts. Several years ago, our laboratory showed that the TF Collier

(Col), the Drosophila ortholog of mammalian Early-B Cell Factor (EBF), was expressed and

required in a single somatic muscle, the DA3 (Dorsal Acute 3) muscle, making this muscle

a paradigm for investigating the genetic and cellular bases of muscle identity.

During the first part of my thesis work, I contributed to show that formation of the DA3

muscle was dependent upon the combinatorial activity of Col and another muscle identity

TF, Nautilus/D-MyoD. D-MyoD is the single Drosophila ortholog of the MyoD family of

vertebrate b-HLH muscle regulatory factors (MRFs), Myo-D, Myf-5, Myogenin and MRF4. My

results showing that D-MyoD and Col each control specific properties of the DA3 muscle

represent a first experimental confirmation of the combinatorial control of muscle

identity by TFs expressed in founder myoblasts, an hypothesis formulated almost 20 years

ago.

In the second part of my thesis work, I studied the role of homeotic (Hox) genes in

generating the diversity of muscles along the anterior-posterior axis of the body. I

showed that Hox proteins control the expression of muscle identity TF such as Coland

D-MyoD in muscle progenitors, the cells which give rise to founder myoblasts. This

control is segment-specific and involves differential activation of different

cis-regulatory modules by different Hox proteins. I have then shown that Hox proteins

also control the number of nuclei allocated to in the DA3 muscle and are thus responsible

for the variation in size of this muscle in different body segments. Together, the data

acquired during my PhD project led me to propose a model for the transcriptional history

of the DA3 muscle. This model brings to light the multi-step, critical role of Hox

proteins in generating the muscle diversity and provides a new framework for

investigating the role of Hox proteins during vertebrate myogenesis.

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Jonathan ENRIQUEZ

Contrôle transcriptionnel de l’identité musculaire chez la

Drosophile

Sous la direction d’Alain Vincent Soutenue à Toulouse, le 18 décembre 2009

Résumé Le patron musculaire qui se met en place au cours du développement embryonnaire permet l’ensemble des mouvements coordonnés propres à chaque espèce animale. Un muscle est formé de fibres musculaires issues de la fusion et de la différenciation de cellules immatures, les myoblastes, un processus appelé myogenèse. Chaque muscle du corps joue un rôle unique, conféré par une «identité» propre: position, forme, taille, sites d’attachement au squelette et innervation. Si le contrôle transcriptionnel de la myogenèse commence à être bien compris, les mécanismes conférant à chaque muscle son identité restent largement inconnus. La majorité de nos connaissances actuelles proviennent d’études réalisées sur la formation des muscles dans l’embryon d’un organisme modèle, la drosophile. L’hypothèse admise est que l’identité musculaire reflète l’expression d’une combinatoire spécifique de facteurs de transcription (FT) dans chaque myoblaste «fondateur» d’un muscle. Notre laboratoire a précédemment montré que le facteur de transcription Collier apparenté aux EBF (Early-B Cell Factor) humains, est exprimé dans un unique myoblaste fondateur, à l’origine d’un des 30 muscles présents dans chaque segment de l’embryon, le muscle DA3, faisant de ce muscle un modèle d’étude de l’identité musculaire. Au cours de ma thèse j’ai contribué à montrer que la formation du muscle DA3 dépend de l’activité combinée de Collier et Nautilus, protéine b-HLH de drosophile apparentée aux facteurs myogéniques mammifères, Myo-D, Myf-5, Myogenin et MRF4. L’analyse de mutants perte-de-fonction nautilus et collier m’a permis de montrer que chacun de ces gènes contrôlent des propriétés différentes du muscle DA3. La mise en évidence d’une régulation croisée entre ces deux gènes montre en outre une expression coordonnée dans le myoblaste fondateur à l’origine du muscle DA3. Ces travaux sur le muscle DA3 sont la première confirmation du contrôle de l’identité musculaire par des combinaisons de facteurs de transcription exprimés dans le myoblaste fondateur, une hypothèse émise il y a presque 20 ans. Dans une deuxième étape, j’ai abordé le rôle des gènes homéotiques (Hox) dans le contrôle de la diversité des muscles le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon. Le muscle DA3 représente un bon modèle d’étude, puisqu’absent dans le premier des trois segments thoraciques et de plus grande taille dans les segments abdominaux. Par des expériences de gain-de-fonction et perte-de-fonction, j’ai montré que les protéines Hox contrôlent l’expression des FT d’identité musculaire dans les cellules progénitrices à l’origine des myoblastes fondateurs. Ce contrôle, spécifique du segment, met en jeu des modules cis-régulateurs du gène collier qui sont activés différentiellement par différentes protéines Hox. J’ai ensuite montré que les protéines Hox régulent aussi le nombre de noyaux incorporés dans la fibre musculaire DA3 et sont donc responsables de la variation de taille de ce muscle, le long de l’axe corps. L’ensemble de mes travaux de thèse m’a permis de proposer un modèle pour l’histoire transcriptionnelle du muscle DA3. Ce modèle met en lumière le rôle décisif des protéines Hox dans la genèse de la diversité des muscles squelettiques de la drosophile et offre de nouvelles perspectives pour l’étude des fonctions des gènes Hox au cours de la myogenèse des Vertébrés. Mots clefs : Drosophile, muscle somatique, gène homéotique, facteur de transcription, réseaux de régulation génique. Discipline : Biologie Moléculaire et du Développement

Centre de Biologie du Développement

Université Paul Sabatier, Toulouse III-CNRS UMR 5547 Bât 4RIII- 118 Route de Narbonne- 31062 Toulouse France

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