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TP de Microbiologie

MERLET-BILLON Maryvonne

PALAGI Alexandre

STREK Laura GB4 2011-2012

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Abréviations

ADN : Acide DésoxyriboNucléique

ARN : Acide RiboNucléique

BET : Bromure d’Ethidium

CaCl2 : Chlorure de Calcium

DO : Densité Optique

LB : Lysogeny broth

MgCl2 : Chlorure de Magnésium

NaCl : Chlorure de Sodium

PCR : Polymerase Chain Reaction

PSM : Poste de Sécurité Microbien

U.V : Ultra Violet

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Introduction

Au cours de ce TP nous avons eu à choisir les expériences et établir les protocoles que nous

souhaitions réaliser. Nous avons décidé de suivre le cheminement suivant :

Etablir des courbes de croissance de Bacillus subtilis en présence et en absence de

différents sels

Préparer une expérience de dénombrement sur Bacillus subtilis

Analyser des prélèvements de surface que nous avons effectué sous une semelle de

chaussure et au niveau d’un interrupteur dans les toilettes des hommes

Les prélèvements sont mis en culture de manière à obtenir des colonies isolées

Une coloration de gram est réalisée pour chaque prélèvement

Une PCR est réalisée pour chaque prélèvement

Réaliser une série d’expérience pour identifier une souche inconnue :

Culture pour isolement

PCR

Galerie API

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Protocoles

I. Détermination de courbe de croissance de B. subtilis

Nous avons choisi d’étudier l’effet de trois sels sur la croissance de la souche bactérienne

Bacillus subtilis : le NaCl, le CaCl2 et le MgCl2. Suite à des recherches bibliographiques nous

avons sélectionné les concentrations suivantes :

0,5 et 1,5M pour le NaCl préparées à partir d’une solution mère à 5M

10 et 50mM pour le CaCl2 et le MgCl2 préparées à partir de solutions mères à 2M

10 tubes contenant 4mL de LB ont été préparés selon le tableau suivant :

Numéro du tube et contenant Volume de LB

enlevé

Volume de solution

ajouté

Tube n°1 : contrôle LB pour CaCl2 et MgCl2 à

10mM

20µL 20µL d’eau stérile

Tube n°2 : contrôle LB pour CaCl2 et MgCl2 à

50mM

100µL 100µL d’eau stérile

Tube n°3 : contrôle LB pour NaCl à 0,5M 400µL 400µL d’eau stérile

Tube n°4 : contrôle LB pour NaCl à 1,5M 1,2mL 1,2mL d’eau stérile

Tube n°5 : NaCl à 0,5M 400µL 400µL de NaCl à 5M

Tube n°6 : CaCl2 à 50mM 100µL 100µL de CaCl2 à 2M

Tube n°7 : MgCl2 à 10mM 20µL 20µL de MgCl2 à 2M

Tube n°8 : MgCl2 à 50mM 100µL 100µL de MgCl2 à 2M

Tube n°9 : CaCl2 à 10mM 20µL 20µL de CaCl2 à 2M

Tube n°10 : NaCl à 1,5M 1,2mL 1,2mL de NaCl à 5m

Nous avons ensuite mesuré la turbidité de chaque échantillon en diluant 100µL dans 900µL

de LB et ce toutes les demi-heures pendant 7h30.

Nous avons tracé le graphe représentant la DO en fonction du temps pour chaque condition

ainsi que log(DO) en fonction du temps et calculé µmax (coefficient de la tangente lors de la

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phase exponentielle de croissance) et le temps de génération ln(µmax)/2 à partir de ce dernier

graphe.

II. Détermination du nombre de bactérie d’une solution inconnue

A partir d’une solution mère inconnue nous avons dénombré le nombre de bactérie par la

technique des dilutions en séries :

Nous avons effectué des dilutions en séries au 10ème

à partir de la solution mère, jusqu’à une

dilution finale de 1/106 : 100µl de la solution mère ont été prélevés, puis dilués dans 900µl

d’eau distillée stérile. De cette dilution de 1/10, 100µl ont été de nouveau prélevés et dilués

dans 900µl d’eau distillée stérile, pour une nouvelle solution concentrée au centième de la

solution mère. Cette opération a été répétée jusqu’à obtenir une concentration finale de 1/106.

Pour chacune de ces dilutions, 100µl ont été étalés sur boite de gélose (LB agar), en condition

stérile sous PSM (poste de sécurité microbien). Une fois ensemencées, les boites ont été

placées en incubateur 24 heures. Pour faciliter les calculs, il est aisé de constater que

l’ensemencement correspond à une nouvelle dilution au 10ème

. Un comptage du nombre de

colonie est effectué 24h après incubation, afin d’estimer la quantité de bactérie par ml de la

solution mère.

Le schéma suivant, que nous avons réalisé, récapitule l’expérience :

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III. Prélèvements

Pour réaliser les prélèvements de surface nous avons utilisé des écouvillons stériles. Nous

avons effectué ces prélèvements sur des surfaces équivalentes d’environ 3 à 4 cm2.

Les écouvillons ont ensuite été utilisés pour ensemencer trois boites de pétri successivement

par la techniques des cadrans.

Les boites sont utilisées pour les expériences suivantes après 24h et 48h d’incubation à 37°C.

IV. Coloration de gram sur E. coli, B. subtilis et les prélèvements

Objectif : distinguer et classifier les bactéries à partir des propriétés de leur paroi bactérienne.

Le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques et après ce temps de

coloration, toutes les bactéries sont violettes. Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi, riche

en peptidoglycanes, laisse passer l’acétone qui décolore le cytoplasme alors que, chez les

bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière imperméable et le cytoplasme

demeure coloré en violet.

Etapes à suivre :

- Préparer un frottis fixé : déposer une goutte d’eau stérile sur une lame puis ajouter à

l’anse de platine stérilisée une colonie isolée. Etaler et fixer à l’alcool jusqu’à obtenir

une lame sèche.

- Recouvrir la lame de violet de gentiane et laisser agir pendant 30 secondes. Rejeter le

colorant et rincer à l’eau déminéralisée.

- Mordançage au lugol : recouvrir la lame de lugol et laisser agir pendant 30 secondes.

Rincer à l’eau déminéralisée.

- Décoloration : recouvrir la lame d’acétone et laisser agir 10 secondes. Rincer

rapidement à l’eau déminéralisée.

- Recoloration : recouvrir la lame de safranine et laisser agir pendant 30 secondes.

Rejeter le colorant et rincer légèrement à l’eau déminéralisée. Sécher délicatement la

lame avec du papier.

- Observation au microscope. Ajouter une goutte d’huile à immersion sur la lame pour

l’observation à l’objectif 100.

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V. Galeries API

Objectif : Analyser le métabolisme d’une colonie bactérienne isolée sur boite, afin de vérifier

s’il s’agissait bien, ou non, d’une colonie d’Escherichia coli. Pour cela, nous avons utilisé une

galerie API 20E (Biomérieux) se présentant sous la forme d’une galerie de petits tubes en

plastique contenant chacun un milieu différent déshydraté. Après inoculation et incubation

durant 24H, la coloration des milieux sera révélatrice d’une modification ou non d’un

composé donné par l’organisme étudié. Les résultats obtenus sont ensuite reportés sur une

fiche d’identification, permettant d’obtenir un code propre à la souche étudiée, et

l’identification se fait par consultation du catalogue de références fourni par Biomérieux.

La galerie API 20E est une galerie dédiée à l’identification des entérobactéries, et est

relativement simple à mettre en place, mais nécessitant travailler en condition stérile

puisqu’une seule souche bactérienne ne peut être étudiée à la fois.

Par manque de réactifs révélateurs, nous n’avons pu analyser que la partie « métabolisme »

dans partie des résultats.

Protocole : Les étapes de réalisation d’une galerie API, toutes en conditions stériles via bec

benzène, sont décrites dans le manuel livré avec le kit, et sont résumés ci-dessous.

- Répendre 5ml d’eau distillée sur les alvéoles du fond de la boite d’inoculation, pour

créer une atmosphère humide.

- Prélèvement d’une colonie bactérienne jeune (18/24h) sur boite de gélose, avec une

anse de platine.

- Resuspension de la colonie prélevée dans 5ml d’eau distillée stérile.

- Inoculation de tous les puits à l’aide de la même pipette (et même cône) :

o Pour les tests CIT, VP et GEL, remplissage du tube et de la cupule.

o Pour tous les autres, remplir les tubes mais pas les cupules.

o Pour les tests ADH, LDC, ODC, H2S, URE, remplir la cupule avec de l’huile

de paraffine pour créer une anaérobiose.

- Refermer la boite et incuber à 37°C environ (±2°C) pendant 18 à 24h.

Le lendemain, la lecture de certains résultats passe par différents révélateurs à rajouter à

certains puits, dont nous ne disposions malheureusement pas. D’autres restent néanmoins

directement lisibles : GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA.

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VI. PCR sur colonie

1°) Choix des amorces :

Nous avions 6 amorces à notre disposition :

Amorce 1: CCA GTT TCC AAT GAC CCT CCC C

Amorce 2: AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG

Amorce 3: AGC CCG GGG ATT TCA CAT CTG ACT TA

Amorce 4: CTG CTC CCT CCC GTA G

Amorce 5: AAG TCG AGC GGA CAG ATG G

Amorce 6: GGA AGA AGC TTG CTT CTT TGC TGA C

Pour chaque amorce nous avons lancé un BLAST afin de déterminer quels couples nous

pouvions utiliser et pour quelles souches.

Souche

bactérienne

Gène Amorce

Reverse

Amorce

Forward

Température de

dénaturation

Taille de

l’amplicon

E. Coli 50 16S 3 78°C

544pb E. Coli 50 16S 6 74°C

B. Subtilis JR5-5 16S 1 70°C

645pb B. Subtilis JR5-5 16S 2 60°C

B. Subtilis JR5-5 16S 1 70°C

594pb B. Subtilis JR5-5 16S 5 60°C

Pour mettre en évidence la présence d’E. coli via la technique de PCR sur colonie, nous avons

donc choisi les amorces 3 et 6. En effet, au sein de ce couple nous disposons d’une amorce

forward et d’une amorce reverse codant pour l’ARN 16S de la souche E. coli 50 et amplifiant

un fragment d’ADN de taille adéquate pour la réalisation d’une PCR. En suivant le même

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raisonnement que précédemment, nous avons choisi les couples d’amorce 1 et 2 puis 1 et 5

pour détecter la présence de B. subtilis.

Remarque : l’amorce 4 ne correspondant pas à l’une des souches bactériennes que nous

étudions ici, nous ne l’avons pas utilisée.

2°) PCR

Préparation du milieu réactionnel :

Nous réalisons une PCR sur colonie, l’ADN bactérien n’a donc pas besoin d’être extrait des

bactéries car celles-ci seront lysées thermiquement lors de la réaction de PCR.

Nous avons testé plusieurs conditions :

- Tube 1 (contrôle négatif) : mix + A3/A6



- Tube 4 (contrôle positif) : mix + E. coli + A3/A6

- Tube 5 (contrôle positif) : mix + B. subtilis + A1/A2

- Tube 6 (contrôle positif) : mix + B. subtilis + A1/A5

- Tube 7 : mix + prélèvement 1 + A3/A6






La colonie présente dans le tube 4 appartient à la souche inconnue que nous avons identifiée

comme étant E. coli grâce à la coloration de Gram et à la galerie API. Nous l’utilisons dans un

premier temps pour confirmer par PCR qu’il s’agit bien d’une souche d’E. coli et dans un

second temps pour avoir un contrôle positif de la présence d’E. coli.

Pour chaque condition testée, le volume final de solution est de 25 µl. Nous avons préparé le

mélange suivant :

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Réactifs du mix

PCR

Concentration de

la solution stock

Concentration de

la solution finale

Volume à

prélever (µl)

Volume à prélever

pour 13 tubes (µl)

ThermoPrime

(Taq)

5U/µl 0,625 U 0,125 1,625

Tampon de

réaction

10X 1X 2,5 32,5

dNTP Mix 20 mM 0,2 mM pour

chaque

1 13

MgCl2 25 mM 2 mM (1,5 à 4 mM) 1,5 19,5

Amorce Forward 10 µM 0,5 µM 1,25 16,25

Amorce Reverse 10 µM 0,5 µM 1,25 16,25

Eau - - 17,375 225,875

A ce mélange est ajoutée une colonie bactérienne (E. coli ou B. subtilis selon les conditions).

Remarquons que la Taq est ajoutée en dernier.

Méthode de prélèvement de la colonie : on prélève stérilement avec un cure-dent une

colonie bactérienne et on dépose dans le tube PCR contenant le mélange réactionnel,

puis on mélange.

Cycle de la PCR :

- 94°C 2 minutes (lyse des bactéries et dénaturation initiale) x 1 cycle

- 94°C 20 sec (dénaturation)

- 60°C (B. Sub) 68°C (E. Coli) 40 secondes (hybridation) x 35 cycles

- 72°C 40 secondes (élongation)

- 72°C 5 minutes (élongation finale) x 1 cycle

Pour amplifier l’ADN bactérien d’E. coli, nous avons choisi d’effectuer l’hybridation à 68°C

car les amorces 3 et 6 ont une température de dénaturation élevée (74°C pour la 6 et 78°C

pour la 3) et la température optimale de catalyse de la Taq est de 72°C, il convient donc de

choisir une température relativement élevée.

Pour amplifier l’ADN de B. subtilis, nous avons choisi d’effectuer l’hybridation à 60°C car au

sein de chaque couple nous disposons d’une amorce ayant une température de dénaturation de

50°C et une autre ayant une température de dénaturation de 65°C.

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Analyse par électrophorèse sur gel d’agarose :

Préparation du gel : rajouter 20 µl de BET au fond de la cuve, puis verser l’agarose

liquide, mélanger et placer délicatement le peigne.

Préparation des échantillons : ajouter dans chaque échantillon du tampon de charge

contenant du rouge crésol et du saccharose (volume 0,2 fois en volume final, soit 5 µL

pour 25 µl). Mélanger.

Dépôt des échantillons :

Puits 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Echantillon Marqueur

de taille

1 4 7 10 2 5 8 11 3 6 9 12

Migration puis révélation sous lecteur U.V.

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Résultats et Discussion

I. Courbes de croissance :

Nous avons sélectionné les concentrations après des recherches bibliographiques (Shaheen et al. 2008,

Donnellan et al. 1964, et Adinarayana et al. 2003). Selon ces publications la tolérance de B. subtilis au

NaCl a été démontrée jusqu’à 5M. Nous nous sommes donc placés un peu en dessous à 0,5M et 1,5M

tout en sachant que notre milieu LB contenait entre 0,9M et 0,17M de NaCl.

Nous avons également appris que B. subtilis était normalement cultivé dans un milieu contenant 10mM

de CaCl2 et 0,4mM de MgCl2. Etant limité par le nombre de tubes de culture que nous pouvions utiliser

(10 au total) nous avons donc choisis les mêmes concentrations pour ces deux sels : 10mM et 50mM.

A partir des DO mesurées (Tableau 1) nous avons tracé les courbes de croissance (DO en fonction du

temps) pour chaque condition (Figure 1) puis les graphes Ln(DO) en fonction du temps (Figure 2).

Nous avons finalement calculé la pente de cette dernière droite (µmax) et le temps de génération pour

chaque condition (ln(2)/µmax) (Tableau 2).

a) Croissance de B. subtilis en présence de NaCl

En présence de 0,5M et 1,5M de NaCl la croissance de B. subtilis est altérée par rapport à la condition

contrôle. (Figure 1 A et B). Ceci se traduit par un temps de génération nettement inférieur, (113 minutes

pour 0,5M) en particulier à 1,5M où la croissance est quasiment nulle (866 minutes) (Tableau 2).

Il faut également noter ici que le temps de génération en condition contrôle n’est pas représentatif de celui

observé en général pour B. subtilis dans des conditions normales de culture qui est d’environ 26 minutes.

Ceci peut s’expliquer par la mise au point de l’expérience : nous avons choisi des concentrations élevées

de NaCl et nous disposions d’une solution mère liquide à 5M. Le volume à ajouter dans le milieu de

culture était donc important et nous avons beaucoup dilué nos milieux de culture dans nos conditions

contrôles. Il est fort probable que les bactéries n’aient pas eu assez de nutriments pour croître de manière

optimale.

Pour éviter ce biais il faudrait utiliser du NaCl en poudre et le dissoudre directement dans le milieu.

b) Croissance de B. subtilis en présence de MgCl2

En présence de 10mM et 50mM de MgCl2 la croissance de B. subtilis est légèrement diminuée (Figure 1

C et Figure 2 C et D). Son temps de génération est de 134% en présence de 10mM de MgCl2 et de 192%

en présence de 50mM de MgCl2 (Tableau 2).

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c) Croissance de B. subtilis en présence de CaCl2

Lors de cette expérience nous avons observé l’apparition d’un précipité dans le milieu. Ce phénomène est

à prendre en compte car il augmente la turbidité du milieu. Pour contrebalancer ce biais nous aurions pu

ajouter deux conditions sans bactérie avec les mêmes concentrations de CaCl2.

En présence de 10mM de CaCl2 la croissance de B. subtilis est diminuée (Figure 1 C et 2 C) ce qui se

traduit par un temps de génération de 205% (Tableau2).

B. subtilis est normalement cultivée en présence de CaCl2, nous pouvons supposer que la concentration

dans notre milieu n’était pas suffisante pour permettre une croissance optimale et même diminuer cette

croissance. En effet nous pouvons observer qu’à 50mM de CaCl2 (Figure 1 D et 2 D) la croissance de B.

subtilis est améliorée par rapport au contrôle : le temps de génération est de 71% (Tableau 2).

Bien que nous ayons vu dans les publications que B. subtilis était cultivée en présence de CaCl2 nous

avons utilisé un milieu de culture générique, sur lequel un grand nombre de bactérie sont capables de

croître. Ce milieu n’était pas optimal pour notre souche.

Pour avoir de meilleurs résultats concernant l’effet de ces sels sur B. subtilis il aurait fallu cultiver notre

souche dans un milieu plus spécifique.

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Condition Equation de la droite Coefficient de corrélation

µmax Temps de génération

Contrôle 0,5M y = 0,0084x - 4,1878 R² = 0,9606 0,0084 min-1

82,5 minutes

NaCl 0,5M y = 0,0061x - 4,4599 R² = 0,9191 0,0061 min-1

113 minutes

Contrôle 1,5M y = 0,0077x - 4,2665 R² = 0,8778 0,0077 min-1

90 minutes

NaCl 1,5M y = 0,0008x - 4,3011 R² = 0,0975 0,0008 min-1

866 minutes

Contrôle 10mM y = 0,0211x - 6,1744 R² = 0,9887 0,0211 min-1

32,8 minutes

CaCl2 10mM y = 0,0103x - 5,1483 R² = 0,9762 0,0103 min-1

67,3 minutes

MgCl2 10mM y = 0,0157x - 5,6336 R² = 0,9984 0,0157 min-1

44,15 minutes

Contrôle 50mM y = 0,0215x - 6,2925 R² = 0,9336 0,0215 min-1

32 minutes

CaCl2 50mM y = 0,0301x - 6,3486 R² = 0,9848 0,0301 min-1

23 minutes

MgCl2 50mM y = 0,0113x - 5,1052 R² = 0,9778 0,0113 min-1

61,34 minutes

Tableau 2 : Récapitulatif des données de la figure X2 et calcul du temps de génération de B. subtilis.

II. Prélèvements Nous avons effectué deux prélèvements : l’un sous une semelle de chaussure et l’autre sur

l’interrupteur des toilettes pour homme, puis nous avons cherché à identifier les bactéries

présentes dans ces prélèvements. Pour cela, nous avons tout d’abord réalisé une identification

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bactérienne via une coloration de Gram, puis nous avons poursuivi l’identification à l’aide

d’une PCR sur colonie.

a) Identification bactérienne du prélèvement effectué sous une semelle de chaussure :

La coloration de Gram d’une des colonies bactériennes obtenues après encensement sur boite

de pétri et incubation du prélèvement, a révélé la présence de bacille Gram- (couleur rose) en

forme de petits bâtonnets s’agrégeant en chaîne (figure 3).

Ces bactéries étant des bacilles Gram-, elles peuvent appartenir à plusieurs espèces

différentes. Sachant que pour la PCR nous avions à notre disposition des amorces permettant

d’identifier E. coli ou B. subtilis, cette technique nous aurait permis seulement de dire s’il

s’agissait ou non d’E. coli.

Nous avons donc réalisé une PCR sur colonie à partir des amorces 3 et 6 codant pour l’ARN

16S de la souche E. coli 50. Malheureusement, nous n’avons obtenu aucun résultat. En effet,

nous n’avons pu observer de fluorescence sur le gel, pas même pour le marqueur de taille.

Nous pensons donc que le BET utilisé a été excessivement exposé à la lumière avant que nous

l’utilisions, perdant ainsi son efficacité.

b) Identification bactérienne du prélèvement effectué sur l’interrupteur des toilettes pour

homme :

Dans le cas de ce prélèvement, la coloration de Gram a révélé la présence de coques Gram+ en

amas (Figure 4), pouvant correspondre à des staphylocoques ou des microcoques. Pour

poursuivre l’identification et préciser le genre, il aurait fallu réaliser une galerie API Staph.

En effet, suite à des recherches effectuées sur internet, nous avons constaté une certaine

similarité entre les staphylocoques et nos bactéries.

Figure 3 : Observation au microscope (grossissement x100) d’une coloration de Gram sur

une colonie obtenue à partir du prélèvement effectué sous une semelle de chaussure.

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III. Identification d’une souche inconnue

Pour préparer ce TP nous avions 3 solutions à notre disposition :

Une solution de B. subtilis

Une solution d’E. coli

Un mix des deux souches

Ces solutions étaient numérotées et nous ne savions pas quelle solution contenait quelle

souche. Nous avons donc décidé de réaliser un protocole d’identification et nous avons choisi

la solution n°1. Une partie de cette solution a été mise en culture de manière à obtenir dès 24h

de croissance des colonies isolées.

a) Coloration de Gram

Après coloration de Gram nous avons observé la lame au microscope. Nous avons pu

observer des bactéries Gram-, roses (donc avec une paroi plutôt pauvre en peptidoglycanes) et

en forme de bâtonnets (figure 5). Au vue des solutions dont nous disposions nous avons

supposé qu’il s’agissait d’E. coli. Afin de confirmer cette hypothèse nous avons réalisé une

galerie API.

Figure 5 : Observation au microscope (grossissement x100) d’une coloration de Gram sur des

colonies de la solution 1.

Figure 4 : Observation au microscope (grossissement x100) d’une coloration de Gram sur une colonie obtenue

à partir du prélèvement effectué sur l’interrupteur des toilettes pour homme.

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b) Galeries API

La galerie API 20E a été réalisée selon les recommandations du fournisseur et laissée en

incubateur à 37°C environ 20h. L’identification de notre souche n’a été que partielle car nous

n’avions pas les réactifs nécessaires à l’interprétation de certaines caractéristiques (figure 6

haut et bas, partie de droite). Cependant nous avons pu analyser la partie métabolique de la

galerie API. En comparant nos résultats à ceux prédits par le fournisseur nous pouvons

fortement penser que la souche présente dans la solution 1 est bien E. coli. En effet, bien que

le tube ONPG se révèle négatif dans notre galerie, notre souche est capable de

fermentation/oxydation : les tests concernant le glucose, le mannitol, le sorbitol, le rhamnose,

le melibiose et l’arabinose sont positifs.

Figure 6 : Interprétation de la galerie API 20E, réalisée à partir de la solution 1. Tableau

d’identification du fournisseur (haut), galerie API (bas).

IV. Détermination du nombre de bactérie dans une solution de B.

subtilis

Comme décrit dans le protocole nous avons mis en culture différentes dilutions de B. subtilis.

Après 24h de culture nous avons observé les boîtes de pétri et sélectionné deux d’entre

elles afin de compter les colonies. La première boîte, correspondant à une dilution au 1/106

(figure 7 à droite) comportait 168 colonies. La seconde boîte, correspondant à une dilution au

1/107 (figure 7 à gauche) comportait 10 colonies. Pour ces dilutions ceci nous a ramené à 168

et 10 bactéries pour 100µL. Soit, 1680 et 100 bactéries par mL de chaque dilution et au final

entre 1,68.107

et 107 bactéries dans la solution mère. Nous avions donc en moyenne 1,3.10

7

bactéries dans notre solution mère de B. subtilis

18

Figure 7 : observation de colonies de B. subtilis après 24h de culture.

19

Conclusion

Lors de ce TP nous avons voulu établir des protocoles reflétant une démarche scientifique, par

exemple avec la série d’expériences que nous avons réalisées pour les prélèvements.

Dans nos protocoles il y a cependant des points que nous pourrions améliorer :

Utiliser des poudres de sels que nous diluerions directement dans le milieu de culture

afin d’éviter la dilution des nutriments de notre milieu.

Envisager un contrôle spécifique pour l’ajout de CaCl2 dans le milieu puisque ce sel

augmente la turbidité.

Utiliser un milieu plus spécifique de notre culture bactérienne.

Réaliser une galerie API Staph sur l’un des prélèvements pour avoir une idée plus

précise du genre de la bactérie.

Réaliser des PCR pour confirmer certains résultats

Pouvoir utiliser tous les réactifs nécessaires pour la galerie API

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Bibliographie

Influence of culture conditions on production and activity of proteases frome Bacillus subtilis

BS1. Mussarat Shaheen, Aamer Ali Shah, Abdul Hameed, Fariha Hasan. Pak. J. Bot. 2008

Chemically defined synthetic media for sporulation and for germination and growth of

Bacillus subtilis. Hillel S. Levinson J. Edward Donnellan Jr., Ella H. Nags. Journal of

bacteriology 1964

Purification and partial characterization of thermostable serine alkaline protease form a newly

islated Bacillus subtilis PE-11. Kunamneni Adinarayana, Poluri Ellaiah, and Davuluri Siva

Prasad. AAPS PharmSciTech 2003.

21

Fiche financière

Consommables :

Matériels

consommables

Marque,

fournisseur

Quantité

totale

Quantité

utilisée

Prix total Amortissement

Boîtes de pétri VWR 100 25 89,70€ 22,425€

Milieu LB Grosseron 1L 200 ml 92,18€ 18,436€

Gélose 300 ml

Cônes 1 ml PhysioCare

concept

10 x 1000 200 120€ 2,4€

Cônes 200 µl PhysioCare

concept

10 x 1000 400 104€ 0,416€

Cônes 20 µl PhysioCare

concept

10x384 30 540€ 4,21€

Solution NaCl

5M

VWR 1L 4mL 17,748€ 0,07€

Solution

MgCl2 2M

VWR 500mL 200µL 19,38€ 0,007€

Solution

CaCl2 2M

VWR 500mL 200µL 25,53€ 0,01€

Ethanol 70% Sigma Aldrich 1L 10 ml 27,10€ 0,271€

Kit galerie

API E20

bioMérieux

(ref 20 100)

25 1 204,19€ 8,17€

Kit PCR Quiagen 400

réactions

24 116€ 6,96€

Tubes falcon

25 ml

BD

Biosciences

500 3 139€ 0,834€

Eppendorfs

1,5 ml

Jeulin 100 15 6,80€ 1,02€

Ecouvillon

stérile

Grosseron 300 2 364,5€ 2,43€

22

Huile à

immersion

Gurr

Socimed 100mL 100µL 30,63€ 0,04€

Paraffine Lelaborantin.fr 75m 1m 20€ 0,2€

Total 67,899€

Matériel Commun :

Matériel

Marque/revendeur Prix Durée

de vie

Durée

d’utilisation

Amortissement

Techne TC-4 000

(PCR) Techne chez

Grosseron

4427€ 5 ans 3h 0,30€

Vortex

Grant-bio pv1 167€ 5 ans 1h 0,003€

Bec Bunsen

Sordalab 257€ 10 ans 1h 0,003€

Incubateur

WiseCube 2962€ 10 ans 48h 1,62€

Hotte à flux

laminaire Faster 5644€ 15 ans 72h 3,1€

Spectrophotomètre

WPA Biowave DNA 1961€ 10 ans 12h 0,54€

Autoclave 23L

Quirumed 1424€ 10 ans 72h 1,17€

Microscope cyscope

HP Partec 990€ 10 ans 1h 0,01€

Pippette 100µL-1mL

20-200µL/2µL-20µL Eppendorf 558€ 5 ans 72h 0,91€

Pipette 0,1µL-2,5µL

Eppendorf 267€ 5 ans 24h 0,15€

Lecteur UV

Major science 4706€ 5 ans 24h 2,58€

23

UVDI

Anse de platine Labomoderne (ref

AP40051)

93,89€ 5 ans 72h 0,15€

Total 10,536

Entre le matériel utilisé et le matériel commun notre TP a couté approximativement : 78,5€

24

Fiches de sécurité

Phrases de risques des produits utilisés pour les cultures et la réalisation des

courbes de croissance :

NaCl :

R36 Irritant pour les yeux

R37 Irritant pour les voies respiratoires

R38 Irritant pour la peau

S26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de

l’eau, consulter un spécialiste

S36 Porter un vêtement de protection approprié

CaCl :


S22 Ne pas respirer les poussières

S24 Eviter le contact avec la peau

H319 Provoque une sévère irritation des yeux

P280 Porter des gants de protection/des vêtements de protection/un équipement de

protection des yeux/du visage

MgCl2 :

Si contact avec la peau laver à grandes eaux. Retirer les vêtements contaminés

Si contact avec les yeux : laver à grandes eaux en gardant les paupières soulevées

En cas d’ingestion si malaise recourir à l’assistance d’un médecin

Milieu LB :

Pas de dangers dans les conditions normales d’utilisation

Ethanol à 70%:

R11 inflammable

Peut provoquer une irritation des yeux

25

Phrases de risques des réactifs utilisés pour la coloration de Gram :

Acétone :

R11 Facilement inflammable


R6 L'exposition répétée peut provoquer dessèchement ou gerçures de la peau

R67 L'inhalation de vapeurs peut provoquer somnolence et vertiges

Violet de gentiane :

R22 Nocif en cas d'ingestion

R40 Effet cancérogène suspecté – preuves insuffisantes

R41 Risque de lésions oculaires graves

S26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l'eau

et consulter un spécialiste

Safranine :



Lugol :

Pas de dangers dans les conditions normales d’utilisation

Phrases de risques des réactifs utilisés pour la PCR :

Bromure d’éthidium :

T+ Très toxique

R 22 Nocif en cas d’ingestion

R 26 Très toxique par inhalation

R 68 Possibilités d’effets irréversibles

S 26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de


S37 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de


Bleu de bromophénol :



26

Agarose :



EDTA :


S24 Eviter le contact avec la peau

S26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement

Acide borique :

R 60 Peut altérer la fertilité

R61 Risque pendant la grossesse d'effets néfastes pour l'enfant

S53 Éviter l'exposition - se procurer des instructions spéciales avant l'utilisation

S45 En cas d'accident ou de malaise, consulter immédiatement un médecin

Tris (Hydroxyméthyle) Aminométhane :


R37 les voies respiratoires


S26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement consulter un ophtalmologiste

S36 Porter un vêtement de protection approprié

Documents

TP de Microbiologie - Accueilmaryvonnemerletbillon.com/Microbiologie_2011.pdf · · 2014-02-10fiche d’identification, ... La galerie API 20E est une galerie dédiée à l’identification