Thermo Fisher Scientific • 3-9 Moriya-cho, Kanagawa-ku • Yokohama, Kanagawa 221-0022 • www.thermofisher.com TRADEMARKS/LICENSING © 2018 Thermo Fisher Scientific Inc. 無断複写・転写を禁じます。ここに記載されている会社名、製品名は各社の商標または登録商標です。山本五秋サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社クロマトグラフィー＆MS事業部 CMSアプリケーション部 TraceFinder 4.1とCompound Discoverer 2.1を組み合わせた GC Orbitrapシステムのための探索的解析ワークフロー INTRODUCTION Thermo Scientific TM GC Orbitrap TM システムにより取得したデータについて、解析ソフトウェアThermo Scientific TraceFinder TM 4.1 と Thermo Scientific Compound Discoverer TM 2.1 を組み合わせた探索的解析ワークフローを適用し、食品関連サンプルの差分解析を行った事例をご紹介します。 Thermo Scientific Q Exactive ™ GC 最大分解能120,000 （FWHM @ m/z 200）質量精度 <1 ppm（内標準法） EI/CI、フルスキャン、Timed-SIM MS/MS 機能搭載 C-TRAP HCD Cell AQT Quadrupole Orbitrap Mass Analyzer Bent Flatapole ExtractaBrite™ Ion Source 真空解除せずに・イオン源メンテナンス・イオン化法切り替え（ EI⇔CI ）・カラム交換が可能解析ソフトウェア TraceFinder 4.1 with Deconvolution Plug-in --- フルスケールに対して98%高さ（一例） RT: 12.192 - 12.308 SM: 7G 12.20 12.21 12.22 12.23 12.24 12.25 12.26 12.27 12.28 12.29 12.30 Time (min) 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 5000000 5500000 6000000 6500000 7000000 7500000 8000000 8500000 NL: 8.63E6 m/z= 258.03201- 258.03253 MS 170127_test_0 04 NL: 8.63E6 m/z= 174.95847- 174.95881 MS 170127_test_0 04 NL: 8.63E6 m/z= 149.04468- 149.04498 MS 170127_test_0 04 NL: 8.63E6 m/z= 302.02166- 302.02226 MS 170127_test_0 04 NL: 8.63E6 m/z= 213.09084- 213.09126 MS 170127_test_0 04 オーバーラップウィンドウ × × XICピークの任意の高さのピーク幅（オーバーラップウィンドウ）の中にピークトップが存在しているm/zのスペクトルを同じコンポーネントのスペクトルとして関連付けデコンボリューションにより複雑なマトリックスの干渉を最小限に抑え、微小なコンポーネントの抽出やクリーンなEIスペクトルのライブラリサーチが可能になります。これにより得られたピークリストはMass ListとしてCompound Discoverer 2.1にインポートされ、Mass list searchでターゲットリストとして用いられます。サーチ Library 測定 FS HR/AM • 高感度 • 高分解能／高質量精度 • ダイナミックレンジ精査 Deconvolution • コンポーネントの抽出 • クリーンなスペクトルの取得 • スペクトルライブラリによる検索 • 高質量精度を利用したスコアリング（HRF Score） C8H8Cl2O2 Subset formulae ∑ (No. of m/z) ∑ (No. of m/z) 観測 HRF Score = x 100% Candidate Compounds SIとHRFを総合してTotal scoreを算出 Kwiecien NW, Bailey DJ, Rush MJ, Cole JS, Ulbrich A, Hebert AS, Westphall MS, and Coon JJ. Anal Chem. 2015, 87, 8328-35 候補化合物の組成から組み合わせ可能な組成を確認解析ソフトウェア Compound Discoverer 2.1 Compound Discoverer 2.1は、MSによる低分子構造解析のための次世代プラットフォームです。大量の測定データから必要な情報を抽出するためのさまざまな特徴があります。 ① フレキシブルなデータ解析を可能にする“ワークフロー” ② 複雑な多検体サンプル構成の解析をサポートする“Study Factor” ③ データ解釈をサポートする視覚的なデータ表示（ヒートマップ表示、多変量解析、さまざまなグラフビューなど） ④ Mass ListやMS 2 スペクトルなどからの化合物同定 Compound Discoverer 2.1 ・Mass List Search ・多変量解析サンプル分析と解析結果例①：野菜ジュースのメタボローム測定と差分解析二種類の市販野菜ジュースを遠心分離後、10 uLを2 mLバイアルに分取しました。乾固後、メトキシム－TMS誘導体化をThermo Scientific TriPlus RSH TM オートサンプラーにより実施してシーケンシャルに測定しました。図10. GABA 3TMSの検出例（高分解能／高質量精度の効果）分解能 60000 シミュレーション分解能 10000 例②：乾燥茶葉の揮発性成分測定と差分解析五種類の乾燥茶葉2 gを20 mLバイアルに採取してThermo Scientific SPME Arrowにて抽出、Q Exactive GCにて測定しました。図11. Compound Discoverer 2.1のPCAスコアプロットとVolcano プロットサンプル4で検出量が多かったコンポーネントの多くでC 8 H 9 N 2 、C 8 H 11 N 2 などのフラグメントイオンが観測されており、これらはピラジン誘導体とアノーテーションされていました。また、アノーテーションされていないコンポーネントにおいても同様のフラグメントイオンを持ち、ピーク強度が同様の増減をしているものが多数確認されました。 TraceFinder 4.1からのMass List をインポート危険率5%、Log2 Fold Change >4 Sample A GABA 多 Sample B GABA 少赤：±0.5 Da 黒：±5 ppm 赤：±0.5 Da 黒：±5 ppm ✓ × XIC m/z 174.11292 XIC m/z 174.11292 Sample B GABA 少 Matrix GABA 図8. Compound Discverer 2.1による差分解析結果図9. TraceFinder 4.1のデコンボリューションとライブラリサーチ結果（GABA 3TMSの例）サンプル4、5 拡大 Mass toleranceを5 ppmにすることで、ユニットマス分解能では干渉を受けるような場合でも信頼性の高い類縁体探索が可能となります。まとめ TraceFinder 4.1のデコンボリューション機能により、ピーク検出－デコンボリューション－ライブラリサーチをセミオートで実施することができます。 TraceFinder 4.1により得られたピークリストをCompound Discoverer 2.1 にインポートし、ピークピッキングから多変量解析まで実施することで、効率的な差分解析が可能です。 Orbitrapの高分解能／高質量精度のスペクトルにより、マトリックスの影響が最小限に抑えられた解析結果が得られます。図1. Q Exactive GC システムの特長図2. TraceFinder 4.1 with Deconvolution Plug-inによるデコンボリューション／ライブラリサーチの流れ図3. TraceFinder 4.1 with Deconvolution Plug-inによるデコンボリューション図4. TraceFinder 4.1 with Deconvolution Plug-inによるHigh Resolution Filtering Scoring 図5. デコンボリューション／ライブラリサーチ結果の例 SI（スペクトル類似度）、HRFスコアといったマススペクトル情報だけでなく Retention Indexによる評価も可能です。図6. Compound Discoverer 2.1を用いた解析の流れ図7. TriPlus RSH（左側写真）によるシーケンシャル誘導体化のスケジュール画面図13. C 8 H 9 N 2 のフラグメント（m/z 133. 07660）のXIC比較上段：Mass tolerance ±5 ppm、下段：Mass tolerance ±500 mmu 図12. 差分解析により抽出されたピラジン類とそのXIC 分解能 60000で測定することでマトリックス干渉を完全に回避できました。 PCAにて分離不十分なサンプル4と5についてVolcanoプロットで詳細に差分解析しました。

TraceFinder 4.1とCompound Discoverer 2.1を組み合わせた ......Mass tolerance を5 ppm にすることで、ユニットマス分解能では干渉を受けるような場合でも信頼性の高い類縁体探索が可能となります。まとめ

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d:\tracefinderdata\...\180608_veg_006 06/08/18 22:02:32 vege, 21TG5SilMS, 30m x 0.25mm, df0.25um, prepcycle sequential derivatization

RT: 11.982 - 12.429

12.00 12.05 12.10 12.15 12.20 12.25 12.30 12.35 12.40Time (min)

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NL:1.00E10m/z= 174.11205-174.11379 MS 180608_veg_010NL:1.00E10m/z= 173.61292-174.61292 MS 180608_veg_010

RT: 11.982 - 12.429

12.00 12.05 12.10 12.15 12.20 12.25 12.30 12.35 12.40Time (min)

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NL:1.00E9m/z= 174.11205-174.11379 MS 180608_veg_006NL:1.00E9m/z= 173.61292-174.61292 MS 180608_veg_006

174.04 174.05 174.06 174.07 174.08 174.09 174.10 174.11 174.12 174.13 174.14 174.15 174.16 174.17m/z

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174.09440

174.11243

174.10105

NL:2.75E8180608_veg_006#3287-3304 RT: 12.190-12.240 AV: 18 T: FTMS + p EI Ful l ms [50.0000-700.0000]

NL:2.04E4

c7 h 20 n 1si 2 *0.60 + c7 h 16 o 2 n 1si 1*1.00: p (gss, s/p:40) Chrg 1R: 10000 Res.Pwr . @FWHM

Thermo Fisher Scientific • 3-9 Moriya-cho, Kanagawa-ku • Yokohama, Kanagawa 221-0022 • www.thermofisher.com

TRADEMARKS/LICENSING© 2018 Thermo Fisher Scientific Inc. 無断複写・転写を禁じます。ここに記載されている会社名、製品名は各社の商標または登録商標です。

山本五秋サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社クロマトグラフィー＆MS事業部 CMSアプリケーション部

TraceFinder 4.1とCompound Discoverer 2.1を組み合わせたGC Orbitrapシステムのための探索的解析ワークフロー

INTRODUCTIONThermo ScientificTM GC OrbitrapTMシステムにより取得したデータについて、解析ソフトウェアThermo Scientific TraceFinderTM 4.1 とThermo Scientific Compound DiscovererTM 2.1 を組み合わせた探索的解析ワークフローを適用し、食品関連サンプルの差分解析を行った事例をご紹介します。

Thermo Scientific Q Exactive™ GC

最大分解能 120,000 （FWHM @ m/z 200）

質量精度 4

Sample AGABA 多

Sample BGABA 少

赤：±0.5 Da黒：±5 ppm

赤：±0.5 Da黒：±5 ppm

✓ ×XICm/z 174.11292

XICm/z 174.11292

Sample BGABA 少

Matrix GABA

図8. Compound Discverer 2.1による差分解析結果

図9. TraceFinder 4.1のデコンボリューションとライブラリサーチ結果（GABA 3TMSの例）

サンプル4、5

拡大

180621_tea_arrow_006 06/22/18 00:34:09 tea 4TG-WaxMS, 30m x 0.25mm,df0.25um

RT: 11.000 - 14.000 SM: 5G

11.0 11.2 11.4 11.6 11.8 12.0 12.2 12.4 12.6 12.8 13.0 13.2 13.4 13.6 13.8 14.0Time (min)

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e Ab

unda

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NL:6.49E7m/z= 132.57660-133.57660 MS 180621_tea_arrow_006

Mass toleranceを5 ppmにすることで、ユニットマス分解能では干渉を受けるような場合でも信頼性の高い類縁体探索が可能となります。

まとめ TraceFinder 4.1のデコンボリューション機能により、ピーク検出－デコンボ

リューション－ライブラリサーチをセミオートで実施することができます。

TraceFinder 4.1により得られたピークリストをCompound Discoverer 2.1にインポートし、ピークピッキングから多変量解析まで実施することで、効率的な差分解析が可能です。

Orbitrapの高分解能／高質量精度のスペクトルにより、マトリックスの影響が最小限に抑えられた解析結果が得られます。

図1. Q Exactive GC システムの特長

図2. TraceFinder 4.1 with Deconvolution Plug-inによるデコンボリューション／ライブラリサーチの流れ

図3. TraceFinder 4.1 with Deconvolution Plug-inによるデコンボリューション

図4. TraceFinder 4.1 with Deconvolution Plug-inによるHigh Resolution Filtering Scoring

図5. デコンボリューション／ライブラリサーチ結果の例

SI（スペクトル類似度）、HRFスコアといったマススペクトル情報だけでなくRetention Indexによる評価も可能です。

図6. Compound Discoverer 2.1を用いた解析の流れ

図7. TriPlus RSH（左側写真）によるシーケンシャル誘導体化のスケジュール画面

図13. C8H9N2のフラグメント（m/z 133. 07660）のXIC比較上段：Mass tolerance ±5 ppm、下段：Mass tolerance ±500 mmu

図12. 差分解析により抽出されたピラジン類とそのXIC

分解能 60000で測定することでマトリックス干渉を完全に回避できました。

PCAにて分離不十分なサンプル4と5についてVolcanoプロットで詳細に差分解析しました。