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Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2010, 149, 43-56

TRAITEMENT DES MARGINES À PH NEUTRE ET EN CONDITIONS D’AÉROBIE PAR LA

MICROFLORE DU SOL AVANT ÉPANDAGE (*)

Abderrahmane YAAKOUBI (1), Abdelkader CHAHLAOUI (1), Mohammed ELYACHIOUI (2), Abdelaziz CHAOUCH (2)

Les microorganismes du sol sont indispensables à la biodégradation de la matière organique, notamment les composés phénoliques des margines. À pH acide, leur effet est quasiment nul.

Après neutralisation du pH par ajout de carbonate de calcium et en conditions d’aérobie, la demande chimique en oxygène diminue de 51,73 % et les composés phénoliques de 65,71 % au bout de dix jours. Parallèlement, le pH passe de 7,00 à 8,05. Dans ces conditions, les extraits phénoliques présentent par CLHP à 280 nm cinq pics majoritaires qui ne sont présents qu’à l’état de traces après dix jours de traitement.

INTRODUCTION

Le rejet non contrôlé des margines constitue un problème environnemental pour les pays du bassin méditerranéen. L'épandage de ces effluents des huileries d’olive sur les sols agricoles a généralement des

(*) Manuscrit reçu le 01 novembre 2009. (1) Laboratoire de Biochimie et de Pharmacognosie, Département de Biologie,

U.F.R : Qualité et Fonctionnement Hydrobiologique des Systèmes Aquatique, Faculté des Sciences, Université Moulay Ismail BP 11201 Zitoune Meknès Maroc. yaakoubi123@yahoo.fr, elyaakoubia@gmail.com, a_chahlaoui@yahoo.fr

(2) Laboratoire de Biotechnologie, Environnement et Qualité, Faculté des Sciences de Kénitra, BP 133, 14000 Kénitra, Maroc. elyachioui@hotmaill.com, achaouch161@gmail.com

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effets positifs [6,22,30] sur la productivité des cultures, sur les caractéristiques du sol, à cause de la richesse de ces déchets en matière organique [11] et en sels minéraux, notamment en potassium et augmente le nombre et la diversité des microorganismes présents dans le sol [7]. Cependant, les polyphénols sont responsables d’effets phytotoxiques et antimicrobiens [15,28,34].

Ces déchets organiques sont susceptibles d’être dégradés par les microorganismes [4,13-14,17] et minéralisent la matière organique par voie aérobie [3]. Cependant, le temps nécessaire pour une dégradation totale peut être considérable.

Martinez et al. [25] ont observé que la dégradation aérobie des composés phénoliques par Aspergillus terreus sur des margines filtrées, stérilisées et diluées diminue d’autant que les margines sont concentrées. Garrido Hoyos et al. [12] ont obtenu une élimination de 65,77 % de DCO de margines traitées en aérobiose avec la même espèce. Funalia troggi permet d'éliminer 70 % de la DCO et 93 % des phénols, alors que Coriolus versicolor permet une réduction de 63 % de la DCO et 90 % des phénols pour une DCO initiale de 28,20 g d’O2/l [32]. Vinciguerra et al. [29] ont obtenu par traitement aérobie avec Lentinus edodes une réduction de 75 % du carbone organique total, 66 % des phénols totaux et une décoloration de l’ordre de 45 % après 4 jours d’incubation.

Aissam et al. [1] ont montré que quatre souches indigènes, deux champignons (Aspergillus niger et Penicillium sp.) et deux levures (Geotrichum terrestre et Candida boidinii), étaient performantes pour l'assimilation des composés phénoliques et lipidiques. L’adaptation de ces souches à des concentrations croissantes de margines (25, 50, 75 et 100 %) permet d’augmenter leur résistance à la toxicité des composés phénoliques. Ainsi, ces souches ont réduit la DCO de 78,3, 63,1, 48,4 et 40,3 % après un mois de traitement des margines brutes. A. niger a été aussi efficace pour la diminution des composés phénoliques (63,1%). Un traitement aérobie des margines par des souches de Phanerochaete chrysosporium a diminué la DCO de 73 % et les polyphénols de 83 % après 12 jours d’incubation pour une DCO initiale de 50 g d’O2/l [20]. Des réductions de la DCO de 55,0, 52,5 et 62,8 % ont été obtenues en aérobiose avec Geotrichum sp., Aspergillus sp., et Candida tropicalis [10].

Au Maroc, le traitement aérobie des margines à pH neutre par les microorganismes du sol a permis d’éliminer 70 % des composés phénoliques et de réduire 63 % de la demande chimique en oxygène (DCO) initiale [35]. El Hajjouji et al. [9] ont observé après 45 jours des baisses de

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DCO de 21,8 et 4,8 % pour des traitements avec et sans chaux ; la neutralisation du pH par ajout de chaux a permis un abattement de 75,9 % des phénols totaux.

L’augmentation du pH vers des valeurs neutres entraine la transformation des phénols en phénates avec la formation d’ions C6H5O-

[23]. Ces derniers sont bien retenus par les cations du sol tels que les oxydes d’aluminium et de fer, le carbonate de calcium et les silicates.

Les huileries équipées d’un système continu à trois phases rejettent des margines diluées suite au lavage préalable des olives, à l’humidification des pâtes durant le pressage, la troisième phase étant une centrifugation. L’épandage de ces margines de centrifugation est souvent pratiqué.

Dans cette étude, des margines issues du système de centrifugation ont été traitées par une suspension de microorganismes du sol en conditions d’aérobie afin de tester leur effet sur la décomposition de la matière organique et des composés phénoliques.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Échantillonnage

Les échantillons de sol ont été prélevés dans la couche superficielle (10 à 30 cm) d’une parcelle témoin non traitée par les margines de texture argileuse du domaine Mellahi de la région de Meknès (Tableau I). La charge microbienne du sol présente 22.106, 18.106, 12.106 UFC (unités formant colonie) par gramme de sol frais respectivement pour les germes totaux, les champignons et les levures.

Tableau I : Caractéristiques granulométiques du sol du domaine Mellahi de la

région de Meknès [30]. Profondeur

du sol (cm)

Argiles (%)

Limons Sables

Limons fins (%)

Limons grossiers (%)

Sables fins (%)

Sables grossiers (%)

10-30 28,80 22,20 10,25 16,83 21,92

30-60 34,67 25,52 6,65 11,23 21,90

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Les margines utilisées proviennent d’une unité industrielle moderne de trituration d’olives par centrifugation à trois phases, située dans la région de Meknès (Domaine Zouina AGOURAY), pendant la compagne oléicole 2005/2006. Les échantillons ont été prélevés le 15 janvier 2006 à partir du bassin de stockage des margines et transportés dans des flacons de 2 litres pour les dosages physicochimiques, puis ont été conservés à l’abri de la lumière à 4°C pour une utilisation ultérieure.

Caractérisation physicochimique des margines

Le pH est déterminé par un pH-mètre à affichage électronique Jenway préalablement étalonné à pH 4 et 7.

La conductivité électrique a été mesurée par un conductimètre Tacussel. Les résultats sont exprimés en mS/cm à 20°C.

Les matières en suspension (MES) sont déterminées par filtration sur filtres de verre, séchage 4 heures à 105°C, puis pesées (AFNOR NF T90-105).

Deux paramètres indicateurs de la pollution organique ont été estimés.

La demande chimique en oxygène (DCO) est déterminée sur des échantillons de margine brute selon la norme AFNOR NF T90-101, dilués au 1/1000e vu la forte charge en matière organique. Le principe consiste à oxyder la matière organique contenue dans les margines par un excès de bicarbonate de potassium en milieu acide pendant deux heures et en présence de sulfate de potassium comme catalyseur. Le dosage de cet excès est effectué par le sel de Mohr en présence de ferroïne. Pour éviter l’interférence des chlorures avec la matière organique, on les complexe avec le sulfate mercurique.

Pour la demande biologique en oxygène (DBO5) (AFNOR T90-103), les échantillons dilués au 1/200e pour diminuer l’effet toxique des polyphénols sur les microorganismes ont été incubés dans un DBO-mètre qui donne la quantité d’oxygène consommée par les bactéries durant cinq jours à 20°C et à l’obscurité.

Extraction, dosage et chromatographie des composés phénoliques

La technique d’extraction des composés phénoliques de Macheix et al. [23] a été utilisée. À 20 ml de margine préalablement acidifiée par l’acide métaphosphorique (20 %) pour empêcher l’oxydation des composés phénoliques, 20 ml de sulfate d’ammonium à 40 % ont été ajoutés pour augmenter la force ionique du milieu. L’échantillon subit ensuite une délipidation par trois fois 20 ml d’hexane. L’extraction des polyphénols est

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réalisée ensuite par trois fois 4,4 ml d’acétate d’éthyle. L’extrait est évaporé à sec à 35°C et le résidu est récupéré dans 5 ml de méthanol pur.

Pour le dosage des composés phénoliques, 50 µl de l’extrait phénolique sont mélangés à 1,35 ml d’eau distillée et 200 µl de réactif de Folin-Ciocalteu. Après 3 min, 400 µl d’une solution de carbonate de sodium à 20 % est additionnée au mélange. Le tout est placé dans un bain-marie pendant 20 min à 40°C. L’absorbance est mesurée à 760 nm. Les résultats sont exprimés en équivalent acide caféique utilisé dans une gamme étalon.

Les fractions phénoliques des margines ont été identifiées par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) en utilisant un détecteur UV (280 nm) et une colonne C18 (4,6 x 250 mm). 20 μL d’extrait ont été injectés et élués par gradient croissant d’acétonitrile (phases mobiles : H2O + H3PO4 (0,1 %), acétonitrile/eau (7/3), durant 60 min avec un débit de 0,8 ml/min.

Analyse microbiologique du sol

Elle a porté sur les germes totaux, les champignons et les levures.

Pour les germes totaux, à 10 g de sol, on ajoute 90 ml d’eau distillée stérile. Après agitation, cette suspension est soumise à des dilutions jusqu'à 10-5.

20 ml de milieu solide PCA (Plate Count Agar) prêt à l’emploi ont été coulés dans des boites de Petri de 100 mm de diamètre. Chaque dilution (0,1 ml) est ensemencée en surface puis étalée dans trois boites de Petri. Ces dernières ont été incubées 48 h à 25°C, dans une étuve thermostatée. Seules les boites qui contiennent un nombre comptable de colonies séparées ont été prises en compte. Les résultats sont exprimés en unités formant colonies (UFC) par gramme de sol. L’expérience a été répétée trois fois.

Le dénombrement des levures et moisissures a été réalisé sur milieu PDA (Potato Dextrose Agar), après incubation à 30°C trois jours pour les levures et sept pour les moisissures.

Protocole expérimental

Les margines brutes ont été diluées au 1/10e, autoclavées 20 min à 120°C pour éviter toute interférence avec leur propre flore.

100 ml des margines diluées ont été préparées dans 3 erlenmeyers de 500 ml et ensemencées par 10 g du sol. L’incubation en aérobie a été effectuée à 25°C dans une étuve thermostatée. L’aération a été assurée par un flux d’air permanent, assurant une concentration en oxygène dissous de 10 mg/l.

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Afin d’examiner l’influence du pH sur l’activité des microorganismes dans le traitement des margines, deux essais ont été réalisés, l’un au pH initial des margines (4,93) et l’autre en amenant le pH à la neutralité par l’apport de carbonate de calcium (CaCO3). Par ailleurs, un essai témoin a été réalisé à pH 7 avec des margines stériles, aérées et non ensemencées, afin de rechercher le degré d’implication des microorganismes dans la dégradation des composés phénoliques et la matière organique.

Les composés phénoliques, la matière organique exprimée en DCO et le pH ont été suivis tous les deux jours pendant dix jours.

Les moyennes et la déviation standard des résultats analytiques ont été calculées suivant une analyse de variance (ANOVA) des données.

RÉSULTATS

Margines étudiées

Les margines sont caractérisées par un pH acide (Tableau II). Elles sont riches en matière organique exprimée en terme de DCO et DBO5. Leur teneur en composés phénoliques est moyenne.

Tableau II : Caractéristiques physicochimiques des margines brutes du système

continu à trois phases de la campagne oléicole 2005-2006 de l’unité du Domaine Zouina Agouray de la ville de Meknès.

Paramètres pH 4,93 Demande chimique en oxygène DCO (g/l) 78,00

Demande biologique en oxygène à 5 jours DBO5 (g/l) 49,08

Composés phénoliques totaux (g/l) 9,50

Évolution des phénols totaux

À pH initial (pH 4,93) et en présence des microorganismes du sol (Figure 1a), la dégradation des composés phénoliques est négligeable, voire nulle. Il en va de même à pH neutre en l’absence de microorganismes (Figure 1b).

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En revanche, à pH neutre et en présence des microorganismes (Figure 1c), la teneur en composés phénoliques diminue nettement dès le deuxième jour et passe en dix jours de 950,0 à 325,76 mg/l, soit une réduction de 65,71 %. La concentration en composés phénoliques chute essentiellement entre le 2e et le 6e jour. Au-delà, la diminution n’est plus significative.

01002003004005006007008009001000

0 2 4 6 8 10Jours

Phén

ols t

otau

x (m

g/l)

a

b

c

Fig. 1 : Évolution des phénols totaux en fonction du temps dans les

margines ensemencées, à pH acide (a) et neutre (c) et dans les margines non ensemencées et neutralisées (b).

L’extrait phénolique des margines brutes apparait très riche en composés phénoliques par CLHP à 280 nm (Figure 2). Plus de dix pics ont été observés dont cinq majoritaires.

Fig. 2 : CLHP d’extraits phénoliques purifiés des margines brutes (échelle

de 0,1 à 0,9) et traitées par les microorganismes du sol (échelle de 0,1 à 0,05) en conditions aérobie, à pH 7 après dix jours de traitement.

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Après dix jours de traitement, la richesse qualitative en phénols s’estompe. Seuls quelques faibles pics ont été détectés à 280 nm. La plupart d’entre eux ne correspondent pas aux pics initiaux.

Évolution de la matière organique

À pH acide et en présence des microorganismes du sol (Figure 3a), la matière organique exprimée en DCO ne subit pas de dégradation chimique. À pH neutre et en absence de microorganismes, la DCO reste stable (Figure 3b).

Par contre, à pH neutre et en présence des microorganismes (Figure 3c), la DCO passe en dix jours de 7800,00 à 3765,12 mg/l, soit une réduction de 51,73 %. La courbe de dégradation de la matière organique est similaire à celle des composés phénoliques totaux. Une corrélation très significative (r2 = 0,9757, y= 6,9576 + 1461,1) est observée entre l’évolution des phénols totaux et celle de la DCO à pH neutre et en présence de microorganismes.

100020003000400050006000700080009000

0 2 4 6 8 10Jours

DC

O (m

g/l)

a

b

c

Fig. 3 : Évolution de la DCO en fonction du temps dans les margines ensemencées, à pH acide (a) et neutre (c) et dans les margines non

ensemencées à pH neutre (b).

51

Au cours du traitement des margines par les microorganismes du sol, le pH passe de 7 à 8,05 (Figure 4).

1

23

45

6

78

9

0 2 4 6 8 10

Jours

pH

a

b

Fig. 4 : Évolution du pH en fonction du temps dans les margines

neutralisées ensemencées (a) et non ensemencées (b).

DISCUSSION

Les margines présentent une composition moyenne et habituelle par rapport à celle d’autres auteurs [5,24].

La faible dégradation chimique des composés phénoliques pourrait être due à une inhibition de l’activité des microorganismes du sol par le pH acide des margines. Les composés phénoliques à pH acide ont un effet antimicrobien [19,27]. Par ailleurs, l’oxydation des margines entraine la polymérisation des composés phénoliques en tanins [18] plus résistants à la biodégradation.

À pH neutre, les microorganismes du sol biodégradent les composés phénoliques. L’activité microbienne n’est plus inhibée. La biodégradation des composés phénoliques par les bactéries peut être accélérée par une élévation de pH et/ou une amélioration de l’aération [8]. À pH neutre ou légèrement alcalin (7,4 à 7,6), les composés phénoliques passent sous forme de phénates et perdent une grande partie de leur pouvoir antimicrobien [26]. Les microorganismes peuvent alors les utiliser comme nutriments carbonés [4].

Les nouveaux pics à 280 nm observés par CLHP après dix jours pourraient correspondre à de nouveaux composés issus de la dégradation des composés phénoliques de départ [4,34].

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La rapidité de dégradation suggère l’implication d’un métabolisme microbien. Des bactéries des genres Pseudomonas, Achromobacter, Aeromonas et Serratia du sol sont capables de dégrader les composés phénoliques [18,21].

La stabilité de la teneur en composés phénoliques au-delà du 6e jour suggère que certains d’entre eux puissent être impliqués dans la formation de molécules pré-humiques stables portant des groupements phénoliques. En effet, les composés phénoliques sont précurseurs de substances humiques [2,33].

La dégradation de la matière organique comme celle des composés phénoliques par les microorganismes du sol est affectée par le pH acide et probablement par la présence des composés phénoliques qui sont des anti-oxydants naturels.

Pour les margines ensemencées à pH 7, la dégradation rapide de la matière organique suggère également un rôle important des bactéries, tandis que la stabilité de la DCO au-delà du 6e jour peut correspondre à la formation microbienne de composés humiques stables.

Hamdi et al. [16] ont également noté une augmentation du pH (de 7,00 à 8,20) lors de la biodégradation de la matière organique des margines par la microflore du sol. Ceci a vraisemblablement deux causes simultanées, la dégradation de composés organiques portant des groupements -COO- et/ou -OH, qui sont libérés et contribuent à l’élévation du pH et la dégradation microbienne des protéines, abondantes dans les margines, libérant des ions NH4

+ qui sont des bases fortes, d’où une augmentation du pH.

CONCLUSION

Les résultats obtenus montrent que la microflore du sol a le pouvoir de biodégrader dans des conditions d’aérobie et à pH neutre la matière organique exprimée en DCO et en particulier les composés phénoliques. Ce procédé biologique assure une réduction de 51,73 % de la DCO et de 65,71 % des composés phénoliques. Il permet la libération d’ions ammonium et probablement la formation de substances humiques ou pré-humiques naturelles, améliorant la valeur fertilisante des margines.

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ABSTRACT

Treatment of olive waste waters at neutral pH and in aerobic conditions by soil microflora before spreading

Soil micro-organisms were found to be essential for the biodegradation of organic matter, notably phenolic compounds provided by olive mill wastewaters. At acidic pH, their effect was quasi absent.

After neutralization of the pH by addition of calcium carbonate and in aerobic conditions, the COD and polyphenol content were reduced by 51.73 and 65.71% after 10 days, respectively. Moreover, during treatment, the pH rose from 7 to 8.05. In these conditions, HPLC of the phenolic extracts at 280 nm showed five major peaks, while only traces were detected after 10 days of treatment.

Keywords: olive mill wastewater (OMWW), pH, phenolic compounds.

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