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TECHNIQUES DE DÉNOMBREMENT Le but des techniques de dénombrement (ou numération) est de déterminer la concentration en micro-

organismes contenus dans une préparation initiale. On distingue les méthodes directes qui ne nécessitent pas de mise en culture des méthodes indirectes. Elles peuvent être précédées d’une ou plusieurs dilutions décimales (au dixième). Dans le cas d’échantillons liquides sans particules solides pauvres en micro-organismes, une étape de

filtration sur membrane peut précéder la mise en culture. La technique de filtration fera l’objet d’un autre chapitre.

1. Principe des dilutions 1.1. Dilution décimale ou au dixième : 1/10 ou 10-1

1.1.1. Matériel • Un tube de diluant de 9 mL (eau distillée, en général, sauf indication contraire : eau

physiologique, eau peptonée, tryptone-sel,…) • Une pipette stérile en plastique de 1 mL (ou pipette automatique P1000 avec cônes stériles) • Un vortex ou un poignet

1.1.2. Réalisation • Homogénéiser la suspension microbienne à prélever. • Ouvrir le tube. • Prélever 1 mL de suspension à l’aide de la pipette plastique stérile. Ne pas introduire la pipette dans la suspension de plus de 1 cm. • Refermer le tube. • Ouvrir le tube de 9 mL de diluant, y introduire le volume prélevé sur la paroi sans toucher le liquide. • Refermer le tube, jeter la pipette souillée dans la poubelle.

1.2. Dilution d’un aliment Si le produit est solide, on ne peut pas pipeter. L’analyse comprend alors obligatoirement la

réalisation d’une suspension de l’aliment broyé dans un diluant. On s’arrange pour que cette préparation corresponde à une dilution au 1/10ème de l’aliment. Pour cela, on broie, par exemple, 25 g d’aliment (de densité approximée à 1 g/mL : 25 mL

d’aliment a une masse d’environ 25 g) dans 225 mL de diluant (eau peptonée par exemple).

1.3. Dilutions en série ou successives 10-2, 10-3, … Chaque dilution nécessite un tube de diluant de 9 mL et d’une pipette stérile de 1 mL. Ainsi, la réalisation d’une gamme de dilutions jusqu’à 10-5 nécessite : 5 tubes et 5 pipettes. La dilution suivante s’effectue comme la dilution décrite au paragraphe « 1.1.2. Réalisation » mais

en partant du tube de la dilution précédente. Exemple : la dilution 10-5 sera effectuée en prenant 1 mL de la dilution 10-4 préalablement

homogénéisée qui sera introduit dans un tube contenant 9 mL de diluant.

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2. Dénombrements directs par comptage de cellules 2.1. Définition Un hématimètre est un système de comptage constitué d’une lame de verre épaisse creusée de rigoles et

présentant un quadrillage particulier sur une plate-forme centrale légèrement abaissée. Celle-ci est recouverte d’une lamelle posée sur les plates-formes latérales surélevées. Un volume très précis et connu est alors délimité et permet de dénombrer les cellules contenues dans l’échantillon dilué ou non et d’en déterminer une concentration.

2.2. Présentation de l’hématimètre de Malassez

Le quadrillage de l’hématimètre de Malassez est constitué d’un grand rectangle. L’hématimètre de Malassez comporte 100 rectangles possédant des traits verticaux, horizontaux,

des carrés ou rien. Elle mesure 2,5 mm sur 2 mm sur 0,2 mm. Elle délimite donc un volume de 1 µL ou mm3.

Figure 1 : Hématimètre de Malassez

Remarque : il existe un hématimètre à usage unique basé le même principe appelé C-ChipTM. Voir AT2.

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2.3. Mise en hématimètre et comptage direct des cellules observées • Faire adhérer parfaitement la lamelle sur les plates-formes latérales en les humectant légèrement. • Homogénéiser l’échantillon. Prélever un volume quelconque à l’aide d’un pipette. • Appliquer l’extrémité de la pipette légèrement inclinée sur la plate-forme centrale près de la lamelle ;

remplir par capillarité la chambre de l’hématimètre placé sur une surface horizontale. Le remplissage doit être rapide, réalisé en une seule fois, sans débordements dans les rigoles et sans

bulles d’air. • Laisser l’hématimètre bien horizontal pendant la sédimentation des cellules. • Repérer le quadrillage à faible grossissement (objectif 10). • Vérifier la bonne répartition des cellules. Si elle est hétérogène, recommencer la mise en hématimètre. • Passer à l’objectif 40, pour effectuer le dénombrement. • Après utilisation, l’hématimètre est recyclé s’il est en verre ou jeté s’il est en plastique.

3. Dénombrements indirects après mise en culture 3.1. Dénombrements en milieu solide

3.1.1. Principe général Les bactéries à dénombrer présentent dans l’inoculum sont introduites soit à la surface, soit dans la

masse d’un milieu gélosé. Chaque bactérie isolée donne naissance à une colonie ou UFC pour « unité formant colonie ». En effet, plusieurs bactéries peuvent être à l’origine de la formation d’une seule colonie qui ne peut plus être qualifiée de colonie (pas de clone) mais alors d’UFC.

3.1.2. Dénombrement en surface 3.1.3. Dénombrement dans la masse a. Matériel

• Gélose fournie pré-coulée ou à couler à partir de la gélose en surfusion

• Gélose maintenue en surfusion : Les milieux gélosés adéquats sont liquéfiés et maintenus en surfusion à 65 °C. On compte 15 mL pour la 1ère couche et 5 mL pour la 2nde couche (20 mL par boîte).

• Nombre de boîtes : une ou deux boîtes par dilution ( = 1 ou 2 essais par dilution) • Une pipette en plastique stérile de 1 mL : Il ne faut qu’une seule pipette de 1 mL pour ensemencer toutes les boîtes si elles sont ensemencées de la dilution la plus grande à la dilution la plus petite (du plus diluée au plus concentrée). Exemple : 10-3, 10-2 puis 10-1.

b. Ensemencement en surface Le dénombrement en surface s’effectue sur 0,1 mL de dilution. • Homogénéiser la dilution à prélever (la plus grande). • Prélever un volume précis au dixième de millilitre à l’aide d’une pipette stérile de 1 mL et déposer 0,1 mL de la dilution au centre de la surface de la gélose. • Étaler, à l’aide d’un étaleur plastique ou de billes de verre, le volume sur toute la gélose.

b. Ensemencement dans la masse Le dénombrement dans la masse s’effectue sur 1 mL de dilution. • Homogénéiser la dilution à prélever (la plus grande). • Prélever 1 mL et déposer la dilution dans le fond de la boîte en la répartissant en gouttes. • Couler aseptiquement environ 15 mL de milieu gélosé maintenu en surfusion mais légèrement refroidie (à une température pour laquelle le tube peut être tenu dans la main sans se brûler, permettant la survie des micro-organismes et pour laquelle la gélose ne prend pas en masse : environ 45°C). • Homogénéiser en imprimant à la boîte de Pétri fermée des mouvements circulaires (en dessinant des 8 sur la paillasse). • Laisser refroidir la gélose sans la bouger.

3.1.4. Incubation La température d’incubation sera indiquée sur le compte-rendu ou sur un papier placé sur les

boîtes et est variable suivant les micro-organismes à dénombrer (exemple : coliformes totaux à 30°C, coliformes thermotolérants à 44°C).

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3.1.5. Lecture et interprétation Le comptage des UFC ne doit pas être réalisé au hasard. Il est conseillé de délimiter des ensembles au

marqueur sur le fond de la boîte de Pétri toutes les 20 UFC comptées par exemple. Il faut que le nombre d’UFC soit significatif (10 à 15). Il ne faut pas que le nombre d’UFC soit trop important (< 300 ou < 150 en cas d’agent de différenciation

des colonies). Démarche à suivre :

• Description des colonies à compter. • Présence ou non d’un agent de différenciation. • Étude de la cohérence inter-dilutions (on attend un facteur 10). • Étude de la cohérence intra-dilutions. • Choix des boîtes retenues. • Calcul de la concentration en micro-organismes. • Rendu du résultat en écriture scientifique avec deux chiffres significatifs.

3.2. Dénombrements en milieu liquide

3.2.1. Principe général La seule manière de savoir si un micro-organisme est présent ou non dans l’inoculum par les techniques

en milieu liquide sera de le mettre en évidence par un de ses caractères (par exemple : trouble et production de gaz en BLBVB).

Un tube stérile est ensemencé par un volume d’inoculum (produit pur ou dilution). Après incubation, si le caractère recherché est apparu (trouble, gaz), le résultat est positif. Dans le cas

contraire, il est rendu négatif. a. Résultat positif

Rendre : il y a au moins 1 micro-organisme recherché dans le volume initial d’inoculum (produit pur ou dilution).

b. Résultat négatif Rendre : il y a moins de 1 micro-organisme recherché dans le volume initial d’inoculum

(produit pur ou dilution). c. Interprétation dans le cas d’un tube par dilution

* Résultats positifs et négatifs observés

• Au moins 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 10-3. Au moins 103 micro-organismes dans 1 mL de produit pur. • Moins de 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 10-4. Moins de 104 micro-organismes dans 1 mL de produit pur. Conclusion : 103 ≤ [N] < 104 micro-organismes par mL.

* Que des résultats positifs observés

Volume de l’inoculum : 1 mL

Produit pur 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Résultat + + + + - - -

Volume de l’inoculum : 1 mL

Produit pur 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Résultat + + + + + + +

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Au moins 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 10-6. Au moins 106 micro-organismes dans 1 mL de produit pur. Conclusion : [N] ≥ 106 micro-organismes par mL

* Que des résultats négatifs observés

Moins de 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 100. Moins de 1 micro-organisme dans 1 mL de produit pur. Conclusion : [N] < 1 micro-organisme par mL L’utilisation de cette méthode avec un tube par dilution entraîne une forte incertitude que des

méthodes statistiques tentent de pallier par des essais multiples (2 ou 3 tubes par dilution).

3.2.2. Interprétation statistique : méthode du NPP (table de Mac Grady) Chaque essai doit être doublée ou triplée : ensemencement de 2 ou 3 tubes pour chaque dilution. La méthode du Nombre le Plus Probable ou NPP, dérivée des études de MacGrady, consiste à

interpréter les résultats en comparant les trois essais et leurs résultats. Il s’agit d’une interprétation probabiliste.

• Après incubation, noter pour chaque essai si le résultat est positif ou négatif. • Pour chaque dilution, affecter un chiffre égal à la somme des tubes positifs.

Volume de l’inoculum : 1 mL

Produit pur 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Résultat - - - - - - -

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TABLE DE MAC GRADY POUR 2 TUBES PAR DILUTION

TABLE DE MAC GRADY POUR 3 TUBES PAR DILUTION

Nombre de tubes positifs au niveau de

trois taux de dilutions retenus

NPP

Nombre de tubes positifs au niveau de

trois taux de dilutions retenus

NPP

0 0 0 < 0,5 1 2 1 3,0

0 0 1 0,5 2 0 0 2,5

0 1 0 0,5 2 0 1 5,0

0 1 1 0,9 2 1 0 6,0

0 2 0 0,9 2 1 1 13,0

1 0 0 0,6 2 1 2 20,0

1 0 1 1,2 2 2 0 25,0

1 1 0 1,3 2 2 1 70

1 1 1 2,0 2 2 2 > 70

1 2 0 2,0

Nombre de tubes positifs au niveau de

trois taux de dilutions retenus

NPP

Nombre de tubes positifs au niveau de

trois taux de dilutions retenus

NPP

0 0 0 < 0,3 2 2 1 2,8

0 0 1 0,3 2 3 0 2,9

0 1 0 0,3 3 0 0 2,3

0 2 0 0,6 3 0 1 4

1 0 0 0,4 3 0 2 6

1 0 1 0,7 3 1 0 4

1 1 0 0,7 3 1 1 7

1 1 1 1,1 3 1 2 12

1 2 0 1,1 3 2 0 9

1 2 1 1,5 3 2 1 15

1 3 0 1,6 3 2 2 21

2 0 0 0,9 3 2 3 29

2 0 1 1,4 3 3 0 20

2 1 0 1,5 3 3 1 50

2 1 1 2,0 3 3 2 110

2 2 0 2,1 3 3 3 > 110

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EXERCICES D’APPLICATION

1. Dénombrement par comptage en hématimètre 1.1. Détermination d’une leucocyturie

Une étude cytobactériologique des urines a été prescrite chez une femme enceinte de 6 mois. Le flacon contenant l’urine à tester vous est fourni. La leucocyturie a été évaluée grâce à un hématimètre de Malassez (volume de 1mm3 = 1 µL) à partir de l’urine entière. Le résultat du comptage donne 60 leucocytes dans 10 rectangles de l’hématimètre de Malassez.

Déterminer la leucocyturie.

1.2. Numération de cellules sanguines On réalise la numération des leucocytes sur le sang d’un homme adulte. Le sang est dilué en introduisant 25 µL dans un réservoir contenant 0,475 mL de diluant. La numération est réalisée en hématimètre de Malassez.

1.2.1. Calculer le facteur de la dilution réalisée. Après comptage et calcul, on obtient 3,0.109 leucocytes par litre de sang. 1.2.2. Calculer le nombre de leucocytes comptés sur la totalité du quadrillage de l’hématimètre.

2. Dénombrement en milieu solide 2.1. Dénombrement dans la masse en double couche (1 essai par dilution)

Le dénombrement de la flore mésophile totale aérobie s’effectue dans la masse et en double couche à partir de dilutions décimales sur gélose pour dénombrement ou PCA (Plate Count Agar).

Q1. Définir « flore mésophile totale aérobie ». Q2. Schématiser la réalisation d’une dilution décimale. Q3. Lister le matériel nécessaire à la réalisation de toute la manipulation (dilutions + ensemencements). Q4. Indiquer le rôle des constituants du milieu PCA (composition ci-dessous).

Q5. Préciser l’intérêt de la double couche. Le dénombrement donne les résultats suivants :

1 mL de dilution 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Nombre de colonies > 300 > 300 > 300 205 24 3 -

Q6. Déterminer le nombre de micro-organismes totaux par mL.

2.2. Dénombrement en surface (2 essais par dilution)

Volume de l’inoculum : 1 mL

Nombre d’UFC

1ère boîte 2ème boîte

Produit pur : 100 > 300 > 300

Dilution 10-1 304 287

Dilution 10-2 26 38

Dilution 10-3 6 2

Q7. Déterminer le nombre de micro-organismes totaux par mL.

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3. Dénombrement en milieu liquide Q8. Déterminer la concentration en micro-organismes par mL dans les cas suivants :

3.1. Exemples avec 2 tubes par dilution

• Choisir le nombre le plus grand possible et si possible inférieur à 220 (meilleure répartition dans les dilutions).

• Lire le NPP dans la table de Mac Grady pour 2 tubes par dilution. • En déduire la concentration en micro-organismes par mL de produit pur [N] :

𝑁 =𝑁𝑃𝑃

𝑉&'()*+*,×𝐹/

3.1.1. Cas n°1 Dilution 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Résultats + + + + + + + - - - Chiffre attribué à chaque dilution 2 2 2 1 0

Dans le cas de l’exemple, on choisit 210 (car < 220) pour la dilution 10-2. Dans la table de Mac Grady, le NNP correspondant à 210 est 6,0. [N] = 6,0.102 micro-organismes par mL. La concentration est évaluée à 6,0.102 micro-organismes par 1 mL de produit pur. 3.1.2. Cas n°2 Dilution 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Résultats + + + + + + + + + - Chiffre attribué à chaque dilution

3.2. Exemple avec 3 tubes par dilution

• Choisir le nombre le plus grand possible et si possible inférieur à 330 (meilleure répartition dans les dilutions).

• Lire le NPP dans la table de Mac Grady pour 3 tubes par dilution. • En déduire la concentration en micro-organismes par mL de produit pur [N] :

𝑁 =𝑁𝑃𝑃

𝑉&'()*+*,×𝐹/

3.2.1. Cas n°3 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Résultats + + + + + + + + - + - - - - - Chiffre attribué à chaque dilution 3 3 2 1 0

Dans le cas de l’exemple, on choisit 321 (car < 330) pour la dilution 10-1. Dans la table de Mac Grady, le NNP correspondant à 321 est 15.

[N] = 15.101 = 1,5.102 micro-organismes par mL. 3.2.2. Cas n°4 Dilution 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Résultats + + + + + + + - - - - - - - - Chiffre attribué à chaque dilution