Devoir No 1 Partie I : Dilutions et Concentrations (3 ...mysite.science.uottawa.ca/jbasso/moleculaire/devoirs_2018.pdf · Quelle est la molarité finale de « B » dans la solution?

1

Devoir No 1

Partie I : Dilutions et Concentrations (3 points/question pour un total de 60 points)

Lorsque vous faites vos calculs, arrondir vos chiffres intermédiaires à deux chiffres significatifs

après la décimale. (Par exemple 2.135 = 2.14 ou 2.134 = 2.13). Vos réponses doivent être soumises

à deux chiffres significatifs après la décimale. Par exemple, 2.00, 0.020, ou 0.0020. Ne pas utiliser

la virgule pour indiquer la décimale, utiliser plutôt un point.

Utilisez l’information suivante pour répondre aux questions 1-8

Vous préparez une solution en ajoutant les ingrédients suivants dans l’ordre indiqué : 600 mL H2O,

125 mL 1.6 M de « A », 50 mL 20 % (m/v) « B », et 25 mL 10g/L « C ». Les propriétés de chacun

des ingrédients sont les suivantes:

A: MM 200g/mole, densité 1.2g/mL, densité de soln. de 1.6 M 1.05g/mL

B: MM 150g/mole, densité 1.3g/mL, densité de soln. de 20% 1.1g/mL

C: MM 35g/mole, densité 1.15g/mL, densité de soln. de 10g/L 1.03g/mL

Densité de la solution finale: 1.25g/mL

1. Quelle est la molarité finale de « B » dans la solution?

2. Quel est le volume, en millilitres, d’une partie? (Indiquer le chiffre entier le plus petit)

3. Quel est le pourcentage (m/m) de « C » dans la solution finale?

4. Quel est le pourcentage (m/v) de « A » dans la solution finale?

5. Quel est le nombre de parties de solvant dans la solution finale? (Indiquer le chiffre entier le

plus petit) 6. Quel est le pourcentage de solutés totaux (m/v) dans la solution finale?

7. Quel est le rapport volume entre chaque ingrédient incluant l’eau?

8. Quel est le rapport masse entre chaque ingrédient incluant l’eau?

9. Vous commencez avec 2.5L d'une solution mère de KNO3 et désirez préparer 10.0 L de 1.5 M

KNO3. De quel pourcentage (m/v) est-ce que la solution mère de nitrate de potassium devrait-

elle être si vous utilisez la totalité? (MM de KNO3: 101g/mole)

10. Vous avez des solutions mères de 5.0 M sulfate de cuivre et de 2 M NaCl. Vous désirez

préparer une solution avec une concentration finale de 0.25 M NaCl et 0.25 M de sulfate de

cuivre et 330 mL d’eau en tant que solvant. Combien de millilitres de la solution mère de NaCl

est-ce que la solution contiendrait?

11. 40.0 mL de 2.0 M Fe(NO3)3 est mélangé avec 2 mL de 5 M Fe(NO3)3 et 48 mL d'eau. Quelle

est la concentration molaire finale d’ions de NO3-?

12. Vous ajoutez 3.5 L d'une solution de HCl de concentration inconnue à 2.0 L de 0.5 M HCl et

4.5 L d’eau. La concentration finale de HCl est 1.5 M. Quelle était la concentration inconnue

de la solution initiale de HCl?

13. Vous préparez une solution de 20% NaCl (m/v) (Densité de NaCl : 2.16 g/mL). Combien de

millilitre d’eau sont dans 1L de cette solution?

14. Quelle est la concentration molaire d'ions de chlorure dans une solution préparée en

mélangeant 100.0 mL de 2.0 M KCl avec 50.0 mL d'une solution de 1.50 M CaCl2?

2

15. L'A260nm d’une solution d’ADN est 0.15. Combien de cette solution d'ADN et d'un tampon de

chargement de 5.5X devrait être ajouté à 20 µL d'eau pour obtenir un échantillon qui contient

75 ng d'ADN dans du tampon de chargement de 0.5X? (A260nm de 1.0 = 50 µg/mL ADN)

16. Solution A contient 1.20 mg de protéines par mL. Solution B contient 3.10 mg de protéines

par mL. Si vous combinez 34 mL de la solution A avec 19 mL de la solution B, quelle serait

la concentration de protéines dans la solution finale?

17. Vous avez une solution de glycine de 0.35M (MM: 70g/mole). Par quel facteur est-ce que cette

solution doit être diluée pour obtenir une concentration finale de 0.49% (m/v)?

18. Un échantillon d'eau a une concentration en PO4-3 de 6.8 μM. Exprimer ceci en μg/L de PO4

-

3. (PM de PO4-3: 95g / mole)

19. Combien y a-t-il de grammes de K+ et de PO4-3 dans 100 mL d'une solution de K2HPO4 de

0.5M? (PM de K2HPO4: 174g/mole, K+: 39g/mole, et PO4-3: 95g/mole)

20. Vous avez trois solutions, "A", "B" et "C". Chacune doit être dilué par les facteurs de dilution

suivants: 4X, 10X et 50X respectivement. Quel serait le volume final d'une solution préparée

en ajoutant chacun des ingrédients à 100 mL de solvant?

Partie II: Performance en labo et analyse de données (5 points/question pour un

total de 40 points)

1.2 Préparation de solutions :

1. Indiquer les lectures d’absorbances obtenues pour chacune des solutions que vous avez

préparées dans l’exercice de labo no1.

a. Une solution de 0.2mM du composé “A”.

b. Une solution de 0.72% (m/v) du composé “B”.

c. Une solution de 5% (v/v) de la solution I.

d. Une solution qui contient 0.1mg du composé “A” et 0.1% (v/v) du composé “B”.

e. Une solution avec le rapport suivant : solution I : solution II : eau : 2 : 1 : 247

1.3 Utilisation des micropipetteurs

2. Générer une courbe étalon à partir des données obtenues pour les volumes allant de 50-200

µL (ABS Vs Vol.). Déterminer le coefficient R2. (Suivre les directives pour les figures et les

graphique disponible sur la page web de ce cours)

3. D’après votre courbe étalon, quels sont les volumes moyens pour les puits G1-3 ou H1-3 et

les puits G4-6 ou H4-6?

1.4: Essai colorimétrique pour déterminer la concentration de phosphate

4. Générer une courbe étalon. (ABS Vs µmoles de phosphate par puits) Ajouter une ligne qui

présente la meilleure tendance. Déterminer le coefficient R2. (Suivre les directives pour les

figures et les graphiques disponibles sur la page web de ce cours)

2.3 : Électrophorèse sur gel d’agarose

5. Soumettre une figure de votre gel d’agarose qui inclut une légende appropriée (suivre les

directives pour les graphiques et les figures sur la page Web de ce cours).

3

2.4 : Quantification spectrophotométrique de l’ADN (Pg. 28)

6. Soumettre un graphique qui représente les lectures A260 Vs. les concentrations standards

d'ADN. Inclure le coefficient R2 sur le graphique.

7. D’après votre graphique quelle était la concentration initiale non-diluée de la solution d'ADN

inconnue fournie?

8. Soumettre les informations suivantes pour votre isolation d’ADN génomique de levure.

ABS260

ABS280

Rapport ABS260/ABS280

Concentration en µg/µL de la préparation non diluée

Rendement total en µg

4

Devoir No 2

Partie I : Digestions par enzymes de restriction et cartographie (2 points/question

pour un total de 50 points)

1. La nomenclature des enzymes de restriction peut fournir des informations utiles concernant la

source de l'enzyme. Par exemple, EcoRI indique que cette enzyme était la première enzyme

isolée à partir d'une souche d’Escherichia coli "R". De quel genre bactérien est-ce que BglII a

été isolée?

2. Définir les termes suivants: isoschizomère, neoschizomer et isocaudomer.

3. Parmi les enzymes énumérées ci-dessous lesquelles, s’il y en a, génèrent des extrémités

compatibles les unes aux autres? (Ex. A et B)

Enzyme Séquence reconnue

A AccI GT/CGAC

B ClaI AT/CGAT

C EagI C/GGCCG

D TaqI T/CGA

E NsiI ATGCA/T

F NotI GC/GGCCGC

G PstI 5CTGC/AG

4. Les séquences partielles reconnues par deux enzymes de restrictions “A” et “B” sont indiquées

ci-dessous. Complétez les séquences de telle façon à ce que des palindromes soient générés

pour chacun des sites. Indiquez sur les palindromes quel lien phospodiestere devrait être clivé

pour que des extrémités protubérantes de l’enzyme “A” soient compatibles à des extrémités

protubérantes de l’enzyme “B”. Ex. CT/GCAG

Enzyme “A”: 5’CTAA― ― ― ― 3’

Enzyme “B”: 5’AAA ― ― ― 3’

5. Considérez votre réponse à la question précédente. Un fragment d’ADN généré avec l’enzyme

“A” a été ligué à un fragment d’ADN généré avec l’enzyme “B” tel qu’illustré ci-dessous.

Quelle (s) enzyme (s), A, B, A & B, ou ni A ou B couperait l’ADN ligué?

A/B

5

6. Cette image représente une électrophorèse sur gel d’agarose de digestions de restriction du

plasmide pBR322. (ce fichier peut être obtenu du site Web de ce cours sous la rubrique

Données>pBR322).

L: Échelle de poids moléculaire U : pBR322 non-digéré H : pBR322 digéré avec HincII P: pBR322 digéré avec PvuII H+P: pBR322 digéré avec HincII et PvuII

Répondre aux questions suivantes d’après les résultats obtenus :

a. Combien de fois est-ce que PvuII coupe dans le plasmide?

b. Combien de fois est-ce que HincII coupe dans le plasmide?

c. Combien de fois est-ce que HincII coupe dans le fragment PvuII?

d. Combien de différents fragments de différentes tailles pourraient être générés si la

digestion PvuII + HincII était partielle?

7. Un fragment d’ADN linéaire de 12 Kpb, illustré ci-dessous, possède des sites de clivages pour

BamHI et EcoRI. Les nombres indiquent les distances en kilobases. Indiquer quelles tailles de

fragments seraient observées sur un gel d’agarose après des digestions avec BamHI, EcoRI et

BamHI + EcoRI. Notez, si différents fragments de mêmes tailles sont générés, la taille devrait

être indiquée qu'une seule fois. (Par exemple, ne pas indiquer 2Kbp et 2Kbp)

8. Des fragments de quelles tailles seraient générés après une digestion partielle par BamHI?

Seulement indiquer les tailles de fragments intermédiaires qui ne seraient pas obtenues après

une digestion complète. (Des fragments dans lesquels un ou plusieurs sites BamHI demeurent

non digéré)

9. Il a été déterminé que l'enzyme XhoI coupe à 2.0Kbp sur la carte ci-dessus. Quel fragment

BamHI serait coupé par XhoI?

10. Une digestion complète avec EcoRI + BamHI de 12µg du fragment ci-dessus a été fait.

Indiquez la quantité en µg qui serait obtenue du fragment de 4 Kpb.

L U H P H+P

1 4 6 10

B E B E

6

Le tableau ci-dessous présente les résultats de différentes digestions d'un plasmide. Toutes les

tailles sont en paires de base.

BamHI 13199, 8572, 4627

KpnI 13199

NheI 13199

BamHI +KpnI 12126, 9645, 8572, 3554, 1073

BamHI + NheI 10701, 9645, 8572, 2498, 2129

NheI + KpnI 11774, 1425

11. Une des enzymes utilisées à digérée l’ADN partiellement. De quelle enzyme s’agit-il?

12. Indiquer la taille d’un des produits intermédiaires parmi les digestions doubles qui représente

un fragment d’ADN digéré de façon incomplète.

13. Quelle est la taille totale du plasmide?

14. Quelle sont les distances entre les sites de restrictions KpnI et NheI?

15. Quelle sont les distances entre les sites de restrictions BamHI et NheI?

16. Quelle sont les distances entre les sites de restrictions KpnI et BamHI?

Le tableau ci-dessous présente les résultats de différentes digestions complètes d’un fragment

d’ADN linéaire. Toutes les tailles sont en paires de base.

NcoI 5023, 1295

NruI 4229, 2089

XbaI 3242, 2374, 702

NcoI + NruI 2934, 2089, 1295

NcoI + XbaI 3242, 1295, 1079, 702

NruI + XbaI 2374, 1855, 1387, 702

17. Parmi les fragments obtenus après la digestion avec XbaI, lequel possède des extrémités

protubérantes XbaI aux deux extrémités? Indiquer la taille du fragment.

18. Des fragments de quelles tailles seraient générés après une digestion du fragment indiqué à la

question 17 avec NruI?

19. Parmi les fragments générés après la digestion avec NcoI + NruI, lequel pourrait être ligué et

cloné dans un vecteur digéré avec NcoI + NruI ? Indiquer la taille du fragment.

20. Quelle est la distance entre les sites NcoI et NruI?

21. L'enzyme de restriction ApoI clive la séquence R/AATTY (R= A ou G et Y = C ou T). Combien

de différents palindromes est-ce que ApoI reconnaît?

22. Quelle serait la taille moyenne qui serait attendue après une digestion d’ADN génomique avec

ApoI? Présumez une distribution égale de A, G, C et T.

23. Vrai ou faux, une extrémité protubérante générée après une digestion d’un palindrome reconnu

par ApoI serait nécessairement compatible avec tout autre palindrome clivé par ApoI?

7

24. L’enzyme PspN41 clive la séquence GGN/NCC (N= n’importe laquelle des quatre bases).

Combien de fois vous attendriez vous a ce que PspN41 digérerait un génome de 30 kb.

Arrondir au chiffre entier le plus proche.

25. La séquence A, qui contient deux sites BstBI (TT/CGAA), a été digérée avec BstBI. Le

fragment obtenu a ensuite été ligué dans le site de restriction unique TaqI (T/CGA) dans le

vecteur B.

Séquence A: CAG TT/CGAA TTC • • • • • • • • • • • • • • • • GGC TT/CGAA AAG

Vecteur B: TGG T/CGA CAC

Quelle (s) enzyme (s) pourrait (ent) être utilisée (s) pour relâcher le fragment d’ADN cloné du

vecteur B recombinant? BstBI, TaqI , les deux ou aucune des deux.

Partie II : Cartographie de restriction (4 points/question pour un total de 40 points)

Ci-dessous est illustrée l’électrophorèse d’ADN prédigéré tel que vous avez fait dans le labo. (Ce

fichier peut être obtenu du site Web de ce cours sous la rubrique Données>prédigéré).

1. Soumettre une courbe étalon de l'échelle de poids moléculaire. (Distance de migration Vs.

Tailles en pb) (Inclure le coefficient R2)

2. Soumettre un tableau des digestions du plasmide recombinant qui inclut les informations

suivantes: Enzyme utilisée, Nombre de coupures totales, Nombre de coupures dans l’insertion,

Nombre de coupures dans le vecteur, et Tailles des fragments observées. Dans une légende

qui accompagne le tableau, indiquez la taille totale du plasmide, la taille du vecteur, la taille

de l'insertion et le (les) site(s) de restriction dans lequel (lesquels) l'insertion a été introduite

dans le vecteur.

L: Échelle de poids moléculaire de 1 kb U: ADN recombinant du plasmide pUC9 non-digéré 1 : Plasmide recombinant de pUC9 digéré avec BamHI 2: Plasmide recombinant de pUC9 digéré avec EcoRI 3: Plasmide recombinant de pUC9 digéré avec HindIII 4: Plasmide recombinant de pUC9 digéré avec EcoRI + HindIII 5: Plasmide recombinant de pUC9 digéré avec PstI 6: Vecteur pUC9 digéré avec BamHI

L U 1 2 3 4 5 6

8

3. Soumettre une figure qui représente une carte de restriction possible de l'insertion dans le site

de clonage multiple de pUC9. Votre carte doit être linéaire, à l’échelle et seulement inclure

l'insertion dans le site de clonage multiple. (Voir les directives sur la page web de ce cours

sous la rubrique graphiques et figures)

Ci-dessous est présentée l’électrophorèse des digestions des plasmides recombinants inconnus de

pUC19 (A : orientation 1; B : orientation 2) tel que vous avez fait dans le labo. (Ce fichier peut

être obtenu du site Web de ce cours sous la rubrique Données>pUC19 recombinant).

4. Soumettre un tableau d’analyse des digestions de l’inconnu qui vous a été fourni. Votre tableau

doit inclure les données suivantes : Enzyme (s) utilisée (s), Nombre de coupures totales,

Nombre de coupures dans le vecteur, Nombre de coupures dans l'insertion et les Tailles des

fragments générés.

5. Soumettre une figure de la carte de restriction de l’insertion d'ADN du plasmide recombinant

qui vous a été fourni. Votre carte doit être linéaire, inclure le site de clonage multiple, indiquer

le site d'insertion, la taille de l'insertion et les positions dans le site de clonage multiple ou dans

l'insertion de toutes les enzymes testées. Votre figure doit être à l'échelle. Suivre les directives

pour générer de telles figures sous la rubrique Graphiques/Figures sur la page web de ce cours.

6. Soumettre une figure de votre propre électrophorèse sur gel d'agarose du recombinant pUC

prédigéré et le calibrage d'une enzyme de restriction. Assurez-vous d'inclure une légende

appropriée. Suivez les directives pour les figures sur la page Web de ce cours et pour inclure

toutes les informations requises dans la légende pour la compréhension et l'interprétation de la

figure.

1. mol. wt. marker

2. A uncut

3. A Bam HI

4. A Hin DIII

5. A Pst I

6. A Xba I

7. A Hin DIII + Pst I

8. A Hin DIII + Xba I

9. A Pst I + Xba I

10. pUC19 Bam HI

11. mol. wt. marker

12. B uncut

13. B Bam HI

14. B Hin DIII

15. B Pst I

16. B Xba I

17. B Hin DIII + Pst I

18. B Hin DIII + Xba I

19. B Pst I + Xba I

20. pUC19 Bam HI

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

9

7. Selon l'expérience présentée à la question 6, quel était l'échantillon le plus dilué qui présentait

une digestion complète (indiquer la dilution)? Sur la base de cette information, quelle était la

concentration enzymatique non diluée approximative en unités / μL? Montrez comment vous

êtes arrivé à cette conclusion.

8. Soumettre une figure de votre propre électrophorèse sur gel d'agarose des digestions de

restriction du plasmide pUC recombinant que vous avez reçu. Assurez-vous d'inclure une

légende appropriée. Suivez les directives pour les figures sur la page Web de ce cours et pour

inclure toutes les informations requises dans la légende pour la compréhension et

l'interprétation de la figure.

Ci-dessous est l’électrophorèse sur gel d’agarose des digestions d’ADN génomique des levures

Saccharomyces cerevisiae et Saccharomyces pombe tel que vous avez faits en labo (Panneau A).

Après la migration, le gel a été transféré et sondé avec une partie d’un gène de Saccharomyces

cerevisiae (Panneau B). (Ce fichier peut être obtenu du site Web de ce cours sous la rubrique

Données>southern)

9. Combien de fois est-ce que les enzymes BamHI et EcoRI coupent dans la région du génome

de S. cerevisiae recouverte par la sonde?

10. Dessiner une carte de restriction possible de cette région du génome de S. cerevisiae. Indiquer

sur votre carte la région potentielle recouverte par la sonde. Votre figure doit être à l'échelle.

Suivre les directives pour générer de telles figures sous la rubrique Graphiques/Figures sur la

page web de ce cours.

A B

10

Bioinformatique 1-2 (1.25 points/question pour un total de 10 points)

1. Quel est le numéro d’accession protéique du premier fichier pour l’enzyme BamHI obtenu

après une recherche générale?

2. Est-ce que le fichier avec le numéro d’accession D28878 correspond à un fichier nucléotidique

ou protéique?

3. Quelle est le nom du gène qui correspond au fichier avec le numéro d’accession D28878?

4. Soumettre les informations suivantes en ce qui a trait à chacun des gènes inconnus du premier

exercice de bio-informatique.

Le numéro d'accession

Coverage

Ident.

E value

La définition

L’organisme duquel cette séquence a été obtenue

Le nom du gène

Le nom du produit du gène

Le numéro d’accession de la protéine

5. Présenter les cartes théoriques des 5 gènes inconnus disponibles sur la page Web de ce cours.

Inclure sous chaque carte le nom du gène et la liste d’enzymes qui ne coupent pas.

6. Comparez les cartes théoriques générées ci-dessus à la carte expérimentale de l'insertion

inconnue que vous avez analysée dans le labo. (« Cartographie de restriction d’un plasmide

recombinant » (Pg 25-31)). L'insertion inconnue correspond à quel gène?

7. Fournir une carte de restriction montrant les positions des sites de restriction PstI, ScaI, NcoI

et XbaI dans la région entre les positions 2046-3948 de la séquence « séquence inconnue »

disponible sur la page Web de ce cours. Indiquez sous la carte la définition du gène et les

enzymes qui ne coupent pas.

8. Selon la carte que vous avez soumise pour la question 7, quelles tailles de fragments seraient

générées à la suite d'une double digestion ScaI-XbaI du fragment linéaire entre les positions

2046-3948?

11

Devoir No 3

Partie I: Clonage et transformations (2.5 points/question pour un total de 50 points)

L’anémie falciforme est due à une mutation dans le gène de la β-globine humaine. Les trois

génotypes possibles sont homozygotes pour la β-globine normale, porteur hétérozygote (ayant à

la fois la version normale et la version mutante) et homozygote pour l'anémie falciforme. La

technologie de l'ADN recombinant a été utilisée comme base pour le diagnostic prénatal de

l'anémie falciforme. Dans un pourcentage très élevé des cas observés, le gène normal de la β-

globine humaine se retrouve sur un fragment de restriction Hpal de 7600 pb, tandis que le gène

mutant se retrouve sur un fragment HpaI de 13000 pb.

À votre disposition sont :

Un échantillon étiqueté d’ADN recombinant d’un vecteur plasmidique bactérien (4000 pb)

avec une insertion HpaI de 7600 pb qui contient le gène normal humain.

Un échantillon d’ADN génomique de chaque membre d’un couple qui pourrait être des

porteurs du trait de l’anémie falciforme et qui attendant leur premier enfant.

Un échantillon d’ADN génomique obtenu des cellules fœtales dans le fluide amniotique

de l’utérus de la femme enceinte.

1. Vous faites un Southern sur l’ADN digéré avec HpaI en utilisant le plasmide recombinant

comme sonde. Quelle (s) taille (s) de bande (s) vous attendez-vous d’observer dans chacun des

cas suivants?

Mère porteuse hétérozygote

Mère homozygote normale

Fétus homozygote pour l’anémie falciforme

L’ADN génomique combiné d’une mère porteuse hétérozygote et d’un père homozygote

normal

2. Vous avez la séquence partielle du gène psy2 de la levure illustré ci-dessous. Vous décidez

d’utiliser la PCR pour amplifier la séquence de psy2 d’après les séquences bordantes illustrées.

Quelle(s) paire (s) d’amorces utiliseriez-vous pour amplifier la séquence complète de psy2?

Set 1: Set 2: Set 3:

5’ AGGCCG 3’ 5’ TCCGGA 3’ 5’ TTCCAA 3’

5’ TCGACG 3’ 5’ GCCGGA 3’ 5’ GGAGTC 3’

12

Considérez l’information suivante pour répondre aux questions 3-5:

Vous avez amplifié la séquence psy2 et souhaitez cloner le fragment de PCR dans le vecteur 2

pour l’exprimer chez la levure. Les sites de clonage disponible sur le vecteur sont illustrés ci-

dessous.

StuI: 5’- AGG/CCT-3’ SalI: 5’-G/TCGAC-3’ EcoRI: 5’-G/AATTC-3’ BamHI: G/GATCC

Il y a deux façons d’insérer la séquence amplifiée de psy2 dans le vecteur 2. Indiquez la (les)

enzyme (s) de que vous pourriez utiliser pour couper le vecteur et la séquence psy2 pour chacun.

3. Clonage directionnel:

Couper le vecteur et psy2 avec:

4. Clonage non directionnel:

Couper le vecteur et psy2 avec:

5. Quelle (s) enzyme (s) pourriez-vous utiliser pour vérifier la présence et l’orientation de

l’insertion?


Plusieurs groups de labo ont fait des étapes de ligatures/transformations semblables à celles que

vous avez faites en labo afin d’introduire la GFP dans le SCM du vecteur pUC digéré et traité à la

phosphatase. Le vecteur et la séquence GF Pont été tout deux digéré avec la même enzyme unique.

Les résultats obtenus par chaque groupe sont présentés ci-dessous:

No de colonies sur plaques LB-Amp

Transformation dans XL-1 Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3 Groupe 4

a) pUC digéré + insertion GFP 0 529 2 1125

b) pUC digéré 0 2 5 930

c) GFP seul 0 0 0 890

e) 10μl pUC non digérés (0.5 ng/μL) 0 975 975 975

f) Pas d’ADN 0 0 0 925

5’GTCGACGGAATTCAGGCCT

3’CAGCTGCCTTAAGTCCGGA

CGTCGACTCCGGC3’

GCAGCTGAGGCCG5’ Psy2

EcoRI Start

13

6. Quel groupe a obtenu le patron de résultats attendus/désirés?

7. Quel groupe aurait le pourcentage le plus élevé de colonies bleues sur des plaques X-Gal avec

le mélange de transformation "a"?

8. Quel mélange de transformation serait attend de donner la proportion la plus élevée de

ligatures intramoléculaires?

9. Quelle était l’efficacité de transformation des cellules compétentes XL-1? Indiquer le nombre

de transformants attendu par microgramme d’ADN non-digéré.


Vous désirez faire le clonage directionnel du gène de la protéine de choc thermique du maïs (2 kb)

dans le vecteur pGAL. Vous devez choisir les sites de restriction que vous incluraient dans vos

amorces de PCR et que vous utiliserez pour digérer le vecteur pGAL (5 kb). Ci-dessous sont les

cartes du SCM de pGAL et la séquence qui code pour la protéine de choc thermique du maïs.

10. Quel site de restriction ajouteriez-vous à votre amorce « forward »?

11. Quel site de restriction ajouteriez-vous à votre amorce « reverse »?

12. Vous isolé le plasmide d’une colonie que vous croyez possède l’insertion d’intérêt. Pour

vérifier votre assomption, vous digérez le plasmide recombinant avec XbaI. Des fragments

de quelles tailles sont attendus?

13. Pour vérifier l’orientation de l’insertion dans le vecteur pGAL, vous faites une digestion du

recombinant positif avec SspI. Des fragments de quelles tailles vous attendez vous d’obtenir

dans chacune des deux orientations?

0.1 0.2 0.7 0.25 0.25 0.5 kb X

14


Vous clonez un fragment d'ADN généré par une digestion EcoRI dans un site unique EcoRI d'un

vecteur. Vous identifiez un vecteur recombinant que vous croyez possède l'ADN d'intérêt. Pour

générer une carte de restriction du plasmide recombinant, vous prenez trois échantillons de

plasmide et les digérez avec EcoRI, HindIII, et EcoRI + HindIII. Vous faites ensuite migrer l'ADN

digéré sur un gel d'agarose pour voir les fragments. Le gel est ensuite soumis à une hybridation de

type Southern en utilisant l’insertion EcoRI comme sonde. Présumez que l’insertion est plus petite

que le vecteur.

14. Quel (s) fragment (s) sur le gel s’hybriderait (ent) à la sonde représentant l’insertion?

15. Quel (s) fragment (s) sur le gel s’hybriderait (ent) à une sonde représentant la bande de 5.3 kb

observée dans la voie EcoRI?

16. Quel (s) fragment (s) dans la voie EcoRI s’hybriderait (ent) à une sonde représentant la bande

de 4.1 kb observés dans la voie HindIII?

17. Quels nouveaux fragments seraient observés après une hybridation avec le fragment de 1.5 kb

d’un recombinant qui possède l’insertion dans l’orientation opposée?

Vous avez cloné une insertion d’approximativement 3 kb dans un site de restriction unique dans

le site de clonage multiple d’un vecteur. Les séquences partielles bordantes du site de clonage

multiple (indiqué en caractères gras et soulignés) et la séquence de l’insertion dans l’orientation

voulue (in italique) sont indiquées ci-dessous. Vous souhaitez utiliser la PCR de colonies sur divers

clones pour identifier ceux qui possèdent l’insertion dans la bonne orientation (tel qu’indiquée ci-

dessous).

18. Quelles deux amorces pourriez-vous utiliser pour identifier les clones qui possèdent des

plasmides recombinants avec l’insertion dans la bonne orientation?

Amorces: (toutes les séquences sont écrites de 5’ à 3’)

A. CGTTGCACAT D. ATGTGCAACG G. GCAACGTGTA

B. AGCTCTGTGA E. AGTGTCTCGA H. TCACAGAGCT

C. AAATGGATTC F. TATGCCCATT

5.3

4.1 2.7

1.5

0.4

1.1

2.3

3.0

EcoRI HindIII EcoRI + HindIII

3’- CGTTGCACAT TTAAGGCCACGTGC• • • • • • •CTTTACCTAAGTGCGAATGGGCATAACTGACCGAT • • • • • • AATGTTCCAT AGAGCTCTGTGA -5’

1 1500 3 000 │ │ │

Insertion

15

19. Vous avez découvert un nouveau virus qui possède un génome double brin de 10 kb

consistant en 65% A / T. Combien de fois prévoyez-vous que l'enzyme HaeIII (GG / CC)

couperait ce génome? Arrondir au chiffre entier le plus proche.

20. Ci-dessous sont des schémas de molécules d'ADN double brin donc certain possèdent des

mésappariements ("P" représente un groupement 5’ phosphate) et des cassures simples

brin. Indiquez si l'ADN ligase pourrait fermer les cassures simples brin de façon efficace.

Partie II: Clonage (5 points/ question pour un total de 25 points)

1. Soumettre une figure de votre PCR du gène GFP. Inclure une légende qui inclut la taille

observée de l’amplicon.

2. Soumettre un tableau qui inclut les informations suivantes pour chacune des ligatures des

différentes séquences de GFP obtenues avec les trois différentes amorces « forward » ainsi

que la ligature faites en absence d’insertion. Indiquez le nombre de transformants obtenu en

tant que nombre de colonies /mL.

Amorce « Reverse » utilisée pour l’amplification et la mutagenèse

Nombre total de colonies observé

Nombre de colonies blanches

Nombre de colonies bleues

Nombre de colonies vertes fluorescentes

3. Quelle était l’efficacité de transformation des cellules XL-1 fournie? Montrer votre calcul.

4. Soumettre une figure de votre analyse PCR de vos recombinants plasmidiques. Indiquez dans

votre légende de la figure la taille de l'amplicon observé. Expliquez brièvement si les tailles

obtenues sont celles attendues et si les résultats indiquent que l'amplicon a été cloné dans la

bonne orientation.

5. Soumettre une figure de votre électrophorèse sur gel d'agarose enzyme de restriction de votre

recombinant plasmide. Indiquez dans votre légende de la figure la taille des fragments

observés. Expliquez brièvement si les tailles obtenues sont celles attendues et si les résultats

indiquent que l'amplicon a été cloné dans la bonne orientation.

..T-C-A-T-G-T-G-G-A-C-T-A G-T-C-C-T-G-G-G-A-C..

..A-G-T-A-C-A-C-C-T-G-A-T-C-A-G-G-A-C-C-C-T-G..

OH P

5’

5’

..T-C-A-T-G-T-G-G-A-C-T G-T-C-C-T-G-G-G-A-C..


OH P 5’

5’

..T-C-A-T-G-T-G-G-A-C-T-A A-T-C-C-T-G-G-G-A-C..


OH

5’

5’

P

..T-C-A-T-G-T-G-G-A-C-T-A G-T-C-C-T-G-G-G-A-C..


OH OH

5’

5’

A B

C D

16

Partie III: Bioinformatique 3 (2.5 points/ question pour un total de 25 points)

1.

Étape 1 : Obtenir la séquence inverse de la séquence avec le numéro d’accession AB439840.

Étape 2 : Obtenir la séquence complémentaire de la séquence obtenue à l’étape 1.

Étape 3 : Obtenir la séquence inverse du complément de la de séquence obtenue à l’étape 2.

Étape 4 : Obtenir la séquence inverse de la séquence obtenue à l’étape 3.

Étape 5 : Obtenir la séquence complémentaire de la séquence obtenue à l’étape 4.

Indiquer les premières 20 bases de la séquence finale. Assurez-vous d’indiquer vos extrémités 5’

et 3’.

2. Quelle serait la séquence du complément inverse de la séquence suivante? Indiquer les extrémités

5’ et 3’.

5’-GATCGGATCCCATCTTATC-3’

3. Les amorces suivantes ont été utilisées dans l’exercice 3 de labo afin d’amplifier et de faire la

mutagenèse du gène GFP en utilisant pGFPuv en tant que matrice (la séquence de pGFPuv

peut être obtenue sur le site Web de ce cours):

GFPfor-1: CGCCAAGCTTTGCATGCCTGCAGGTCG

GFPfor-2: CGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCG

GFPfor-3: CGCCAAGCTTTGaCATGCCTGCAGGTCG

GFPrev: CCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAG

Soumettre les informations suivantes pour chacune des amorces:

Sont-elles “+” ou “-”

Positions sur la matrice des extrémités 5’ et 3’

Les séquences des amorces alignées à celle de la matrice indiquant tout mésappariement

Ex. (1) THATSEQUENCE(12)(+ Amorce)

|| |||||||

(56)THISSEQUENCI(67)(Matrice)

4. Quelle est la taille prédite de l’amplicon GFP?


Dans l’exercice 5, la PCR de colonies sera utilisée pour le criblage d’amplicons potentiels de

GFP en utilisant les amorces suivantes:

GFPSc-F1: AGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC

GFPSc-R1: GTAGCGACCGGCGCTCAGTTGG

GFPSc-F1: AGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC

GFPSc-R2: CCAACTGAGCGCCGGTCGCTAC

17

5. Quelle (s) paire (s) d'amorces devrait (ent) donner un produit d'amplification si vous avez

cloné avec succès la séquence GFP dans la bonne orientation?

6. Quelle est la taille prédite de l'amplicon, si le recombinant choisi a l'insert désiré?

7. Quelle est la taille prédite de l'amplicon, si le recombinant choisi ne possède pas d'insert?

8. Cartographier les positions d’alignements de chacune des amorces suivantes sur la

séquence de pUC19. Vous pouvez obtenir la séquence de pUC19 sur le site Web de ce

cours.

A. TGCGGTGTGAAATACCCT

B. GCCATTCAGGCTGCGCAA

C. GGGTTATTGTCTCATGAG

D. GAGACAATAACCCTGATA

Utiliser un schéma tel que ci-dessous pour indiquer les positions d’appariement de chacune

des amorces. Chaque amorce devrait être indiquée par une flèche, où la tête de la flèche

représente l’extrémité 3' et la queue de la flèche représente l’extrémité 5'. La direction de la

flèche devrait indiquer si l’amorce est « Forward » (→) ou « Reverse » (←). Les chiffres

associés avec les flèches devraient représenter les positions sur la matrice qui correspondent

aux extrémités 5' des amorces.

9. Quelles amorces indiquées dans la question précédente, s’il y en a, donneraient un produit

d’amplification d’au moins 200 pb?

10. Vous souhaitez cloner et exprimer la séquence codante complète de l'insuline humaine (d'ATG

en TAG) dans le site de clonage multiple d'un vecteur d'expression:

En utilisant les compétences que vous avez acquises en bioinformatique, concevez une paire

d'amorces qui vous permettraient d'amplifier la séquence codante de l'insuline (en commençant

par l'ATG et en terminant par le codon d'arrêt TAG). Vos amorces doivent également inclure la

séquence de sites de restriction appropriés pour le clonage directionnel et l'expression de

l'amplicon. Vos amorces doivent avoir une longueur de 15 bases incluant les sites de restriction.

Fournissez les informations suivantes:

Séquence d'amorce forward et site de restriction ajouté.

Séquence d'amorce inverse et site de restriction ajouté.

Taille attendue de l'amplicon.

pUC19

56 908 2351

814 1514

Promoteur SCM

Pvu

II

Sph

I

Eco

RI

18

Devoir No 4

Partie I (2 points/ question pour un total de 30 points) 1. On vous a demandé d’amplifier par PCR une séquence spécifique à partir d'ADNc qui a été

synthétisé de l'ARNm isolé de tissu cérébral. Après avoir migré votre réaction de PCR sur un

gel contenant du bromure d'éthidium, vous n’observez pas de bandes la lumière ultraviolette.

Pourquoi est-ce que ceci pourrait-il être le cas? Choisir toutes les réponses possibles.

A. Le gène qui vous intéresse n’est pas exprimé dans le tissu cérébral.

B. Un oligo dT plutôt qu’un oligo dA a été utilisé pour la synthèse du premier brin d’ADNc.

C. Une amorce spécifique dont la séquence est celle du brin non codant du gène a été utilisée

pour amorcer la synthèse du premier brin d’ADNc.

D. Vous avez utilisé la transcriptase inverse plutôt que la polymérase Taq pour la synthèse du

premier brin d’ADNc.

2. À partir d'une seule molécule d'ARNm et d’une quantité suffisante d'amorces, une enzyme et

tous les autres cofacteurs pour la réussite d'un RT-PCR gène spécifique, combien de cycles de

PCR sont requis pour obtenir 8 molécules de produits ayant des extrémités définies par les

deux amorces? C.A.D. que vous comptez seulement les molécules double brin qui commence

et finissent aux sites de liaison des amorces, mais qui ne possèdent pas tout autre séquence.

3. Un brin du très petit gène Liliputien est indiqué ci-dessous avec le codon d’initiation et d’arrêt

souligné. Ceci représente-t-il le brin matrice ou le brin complémentaire à la matrice?

5’-TGAGGCATCATCGGTATGGCACCCTTAATGGGCATTGCACCCATAGTACGATAAGCATGTCCTGAA-3’

4. Je désire utiliser le RT-PCR pour faire une copie du gène Liliputian entier. Indiquer la séquence

d’une amorce de 6 nucléotides qui pourrait être utilisée pour la synthèse du premier brin

d’ADNc.

19


Le gène lilliputien est réprimé par un facteur de 5 lorsque les cellules sont cultivées dans le glucose

comparativement à la croissance dans le glycérol. Pour étudier l'expression de ce gène, une analyse

northern a été réalisée sur une souche de type sauvage et divers mutant. Les membranes ont été

simultanément sondées pour le gène ci-dessus, ainsi qu'un gène domestique; GAPDH. Une analyse

densitométrique a ensuite été réalisée. Les valeurs obtenues pour la souche sauvage cultivée en

glucose étaient 500 pour l’ARNm lilliputien et l'ARNm de GAPDH. Indiquez les valeurs

densitométriques attendues pour l’ARNm lilliputien dans chacun des cas suivants:

5. Souche sauvage cultive dans du glycérol (Valeur de GAPDH = 100)

6. Souche mutante avec une mutation qui augmente l’activité du promoteur par un facteur de 2

cultivé dans du glycérol (Valeur de GAPDH = 500)

7. Souche mutante avec une mutation qui change le codon ATG à CTG cultivé dans du glycérol

(Valeur de GAPDH = 250)

8. Souche avec une mutation qui réprime l’activité du promoteur par un facteur de 5 cultivé dans

du glucose (Valeur de GAPDH = 500)


La RT-PCR est une méthode de diagnostic couramment utilisé utilisée pour la détection des

infections par le VIH, causées par un virus à ARN. En bref, après une infection, le génome de

l'ARN viral est converti en un ADN double brin qui s’intègre dans le génome. Après l'intégration,

le virus peut rester en dormance pendant plusieurs années. Après son activation, l'ADN viral est

transcrit et initie le cycle réplicatif; se propageant de cellule à cellule. La figure suivante illustre

des réactions de RT-PCR effectuées sur le sang de différents individus. Les réactions ont été

réalisées en présence et en l'absence de transcriptase inverse dans le mélange réactionnel (+ RT et

-RT, respectivement). Des réactions RT simultanées ont été effectuées sur le gène domestique;

GAPDH.

9. Quel (s) individu(s) est (sont) VIH positif?

10. Quel (s) individu(s) est (sont) VIH négatif?

11. Quel (s) individu(s) réplique (ent) activement le VIH?

12. Quel (s) individu(s) possède (ent) plus de copies du VIH intégrées dans leur génome?

-RT +RT -RT +RT -RT +RT -RT +RT

GAPDH

VIH

A B C D

20

13. L'expérience ci-dessus a été répétée comme précédemment, mais sur des échantillons traités à

l’ADNase. Un des patrons observés est illustré ci-dessous. À quel (s) individu (s) est-ce que

ce patron pourrait correspondre?

14. Quelle polymérase pouvait lire la matrice d'acide nucléique suivante et synthétiser un nouveau

brin complémentaire? Choisissez toutes celles possibles.

5’- AUUCUGGCUCGAAUGACUACUGGACC-3’

A. Une polymérase ADN ADN dépendante

B. Une polymérase ARN ADN dépendante

C. Une polymérase ARN ARN dépendante

D. Une polymérase ADN ARN dépendante

15. Indiquez la séquence dans la direction 5 'à 3' des 6 premières bases qui serait synthétisée

par la polymérase choisie.

Partie II : Expression génique - transcription (4.5 points/ question pour un total de

total of 45 points)

1. Indiquez l’ABS260, l’ABS280 et le rapport ABS260 / ABS280 de votre préparation d'ARN (p. 47).

2. Soumettre une figure du gel d'ARN fait dans le laboratoire ; d'exercice 6. Inclure une légende

appropriée.

Ci-dessous est un autoradiogramme obtenu d’une hybridation northern de l’ARN total de levure

utilisant le gène CTT1 et le gène de l’actine comme sonde. (Vous pouvez obtenir une copie de ces

résultats sur la page Web de ce cours sous la rubrique données> northern)

-RT +RT

GAPDH

VIH

Sonde actine Sonde YRA 1 2 3 4 1 2 3 4

1. Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 0 minute. 2. Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 30 minutes. 3. Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 60 minutes. 4. Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 120 minutes.

21

3. Soumettre une table de l'analyse densitométrique de cette hybridation northern. Votre tableau

doit inclure les données brutes (les valeurs pour chacune des aires), les valeurs normalisées

(lecture YRA / lecture actine) pour chacune des conditions de croissance et l'expression relative

par rapport à la croissance en l'absence de choc osmotique.

4. Soumettre une figure du gel 1 de RT-PCR généré dans l'exercice 7. Inclure une légende

appropriée qui indique les tailles des produits observés dans chaque voie.

Ci-dessous est un gel des réactions de RT-PCR semblables à celles que vous avez effectuées dans

l'exercice 5. (Vous pouvez obtenir une copie de ces résultats sur la page Web de ce cours sous la

rubrique données> rt pcr)

5. Quel était le but du traitement à l’ADNase?

6. Quel était le but de la réaction de PCR de l’ARN qui n’a pas été traité avec de l’ADNase

ou de la RT?

7. Quelles sont les tailles des produits de PCR RT-dépendants et RT-indépendants?

8. Qu’est ce que la différence de taille entre les produits de PCR vous dit à propos du gène

duquel cet ARN est dérivé?

9. Soumettre une figure du gel 2 de RT-PCR (CTT1 et actine) générés dans l’exercice 7.

Inclure une légende appropriée qui indique les tailles des produits observés dans chaque

voie.

10. Soumettre un tableau de l'analyse densitométrique de ces réactions RT. Votre tableau doit

inclure les données brutes (les valeurs pour chacune des zones) pour la plus grande bande

d'ARNr observée pour la condition correspondante sur le gel d'ARN coloré au bromure

d'éthidium correspondant (semaine 6) et le produit RT-PCR YRA correspondant observé

sur RT -PCR gel 2, les valeurs normalisées (lecture YRA / lecture de l'ARNr) pour chacune

des conditions de croissance et l'expression relative par rapport à la croissance en l'absence

de choc osmotique.

E 1 2 3 4 5

Réaction Matrice

PCR-1 R (Étape I)

PCR-2 DR (Étape II)

PCR-3 RT-R (Étape III)

PCR-4 RT-DR (Étape III)

PCR-5 ADN génomique

22

Bioinformatique 4 & 5 (1 point/ question pour un total de 25 points) 1. Quel est le numéro d'accession du premier fichier nucléotidique pour l’ARNm de

l'hémoglobine alpha 2 de Bos taurus?

2. Quel est le numéro d'accession du premier fichier nucléotidique pour l’ARNm de

l'hémoglobine alpha 1 de Gallus gallus (poulet)?

3. Quel est le numéro d'accession du premier fichier nucléotidique pour l'hémoglobine fœtale

humaine?

4. Quel est le pourcentage d'identité au niveau nucléotidique entre les gènes de l'hémoglobine de

chacune des paires d'organismes suivantes:

A. Hémoglobine alpha humaine à l'hémoglobine de la vache

B. Hémoglobine alpha humaine à l'hémoglobine du poulet

C. Hémoglobine de la vache à l'hémoglobine du poulet

D. Hémoglobine alpha humaine à l'hémoglobine fœtale humaine

5. Quelle paire de séquences, s’il y en a, sont des analogues?

6. Quelle paire de séquences, s’il y en a, sont des paralogues?

7. Quel est le pourcentage d’identité au niveau protéique pour chacune des paires d’organismes

suivantes:

A. Hémoglobine alpha humaine à l'hémoglobine de la vache

B. Hémoglobine alpha humaine à l'hémoglobine du poulet

C. Hémoglobine de la vache à l'hémoglobine du poulet

D. Hémoglobine alpha humaine à l'hémoglobine fœtale humaine

8. Quel est le numéro d'accession pour le fichier protéique de la déshydrogénase d’alcool de Bos

taurus?

9. Quel est le numéro d'accession pour le fichier protéique de la déshydrogénase d’alcool de Mus

musculus?

10. Quel est le numéro d'accession pour le fichier protéique de la déshydrogénase d’alcool de

Saccharomyces cerevisiae obtenu par une recherche générale?

11. Quelle paire de séquences d'acides aminés, le cas échéant, est analogue?

12. Quelle paire de séquences d'acides aminés, le cas échéant, est orthologue?

13. Quels sont les numéros d'accèssions protéique et nucléotidique pour les homologues de

AAA82165 de Myotis ricketti?

14. Quel type d’homologues est-ce que les séquences nucléotidiques de Myotis ricketti et

d’U09623 sont ?

15. Quel type d’homologues est-ce que les protéines de Myotis ricketti et d’U09623 sont ?

16. La protéine inconnue de Danio rerio partage le plus haut degré d'identité avec une protéine de

quel organisme?

23

17. Quelle est la fonction potentielle de la protéine inconnue de Danio rerio?

18. Quelles sont les définitions qui correspondent aux plus longs ORFs des séquences virales 1 et

2?

19. De quel organisme proviennent les séquences virales 1 et 2?

20. Quel est le nom des produits protéiques des plus longs ORFs des séquences virales 1 & 2?

21. Est-ce que le plus long ORF trouvé pour la séquence virale 1 était sur la séquence entrée ou

son inverse du complément?

22. Quel est le pourcentage d'identité entre l'ORF traduit du virus 1 et la protéine la plus

étroitement liée?

23. Lorsque l'on compare l'ORF le plus long traduit de la séquence virale 1 à la protéine la plus

étroitement apparentée, quel est le pourcentage d’acides aminés qui représente des

substitutions conservées?

24. Quel snp la séquence virale 3 a-t-elle acquise? Indiquer la position et le changement de base.

Ex. C118 à A.

25. Quel type de changement d'acide aminé, le cas échéant, est-ce que ce snp cause?

24

Devoir No 5

Partie I Référez-vous à la description suivante pour répondre aux questions 1-6 (2 points/ question

pour un total de 50 points)

Ci-dessous sont les 210 paires de base consécutives de l'ADN qui inclut le début de la séquence

du gène X. La séquence soulignée (position 20 à 54) représente le promoteur du gène X et la

séquence soulignée et en italiques (71-90) indique le site de liaison des ribosomes (RBS). La

transcription débute et inclut la paire de base T / A à la position 60 (souligné).

1 10 20 30 40 50 60 70

I--------I---------I---------I---------I---------I---------I---------I

5’ ATCGGTCTCGGCTACTACATAAACGCGCGCATATATCGATATCTAGCTAGCTATCGGTCTAGGCTACTAC

3’ TAGCCAGAGCCGATGATGTATTTGCGCGCGTATATAGCTATAGATCGATCGATAGCCAGATCCGATGATG

80 90 100 110 120 130 140

I---------I---------I---------I---------I---------I---------I

5’ CAGGTATCGGTCTGATCTAGCTAGATGCTCTTCTCTCTCGAACCCGCGGGGGCTGTACTATCATGCGTCG

3’ GTCCATAGCCAGACTAGATCGATCTACGAGAAGAGAGAGCTTGGGCGCCCCCGACATGATAGTACGCAGC

150 160 170 180 190 200 210

---------I---------I---------I---------I---------I---------I---------I

5’ TCTCGGCTACTACGTAAACGCGCGCATATATCGATATCTAGCTAGCTATCGGTCTCGGCTACTACGTAAA

3’ AGAGCCGATGATGCATTTGCGCGCGTATATAGCTATAGATCGATCGATAGCCAGAGCCGATGATGCATTT

1. Quels sont les 6 premiers nucléotides de l’ARNm du gène X?

2. Quels sont les 4 premiers acides aminés codés par le gène X? Utiliser le code d’une lettre

d’acides aminés pour indiquer votre réponse. Ex. TRCG

3. Vous avez trouvé un mutant du gène X. La mutation représente un SNP qui change la paire de

base G/C à la position 110 (soulignés) à T/A. Est-ce que l'ARNm exprimé à partir de cette

version du gène X serait plus long, plus court ou le même que celui produit à partir du gène X

normal?

4. Si l’ARNm mutant peut être traduit, vous vous attendriez à ce que la protéine soit plus longue,

plus courte ou la même que celle produite à partir du gène X normal?

5. Vous avez trouvé un autre mutant du gène X. La mutation représente un SNP qui change la

paire de base G/C à la position 110 (soulignés) à C/G. Vous attendez-vous à ce que la protéine

produite ait un niveau d’activité semblable à celle de la protéine normale X?

6. Quelle est la longueur de la région 5’ non traduite?

Promoteur

RBS

25

Référez-vous à la description suivante pour répondre aux questions 7-11

Le schéma suivant représente un gène de levure et ces différents éléments :

Indiquez les tailles prédites pour chacun des scénarios suivants :

7. Pre-ARNm (non traité)

8. ARNm

9. Protéine

10. ARNm d'un gène avec une mutation ponctuelle qui crée un codon d'arrêt à la position 1698

11. Protéine d'un gène avec une mutation ponctuelle qui crée un codon d'arrêt à la position 1698

12. Fred est marié à Helen, qui a déjà été mariée à George, maintenant décédé. George et Helen

ont conçu un enfant ensemble et ont adopté un enfant. Fred et Helen ont également conçu un

enfant. Tous les membres de la famille actuelle d’Helen ont eu des empreintes génétiques faites

d'un locus VNTR unique. Malheureusement, la feuille qui a identifié chaque enfant a été

égarée. Identifier les empreintes génétiques dans chaque voie (dans les voies 5, 6 et 7) qui

correspond à chaque enfant.

Enfant conçu par Fred et Helen Enfant ____

Enfant conçu par George et Helen Enfant ____

Enfant adopté par George et Helen Enfant ____

ATG (510) TAG (2510) (2890) (2110) (1850) (1600) (1060) (200) (1)

Promoteur

Site de terminaison de la transcription

Exon

Intron

ADN codant

26


Ce schéma montre un transfert Southern de l'ADN génomique digéré

par enzyme de restriction d’une mère lutin (M) et le père lutin (F) et

ses quatre enfants lutins potentiels (C1 à C4) sondés avec une

séquence ADN VNTR. L'enzyme de restriction utilisée était NotI. Un

autre lutin (F2) prétend être le père de l'enfant C4. Supposons que la

mère, M, est la vraie mère de ces quatre enfants.

13. Quels enfants sont les enfants biologiques du père lutin (F)?

14. Quel (s) enfant (s), s’il y en a, pourrait (ent) être l’enfant (s) du

lutin F2?

15. Considérez les données dans la voie étiquetée «markers». Selon

cette voie seulement, quel est le nombre minimum de loci qui sont

examinés?

16. Si le nombre de loci indiqué dans la question précédente représente le nombre total des loci

étant examinés, le profil de C4 doit inclure un minimum de combien de loci hétérozygotes?


Le schéma suivant montre la région d'un gène associé aux orteils poilus (OPO). Le phénotype des

orteils poilus est dû à des mutations récessives qui créent un RFLP au sein d'un site de restriction

HaeIII à la position 550 (les sites HaeIII sont indiqués par des flèches). Notez qu’il pourrait y avoir

d’autres snp, mais ceux-ci ne sont pas associés au phénotype des orteils poilus. Cette région du

génome a été examinée chez différents individus en effectuant une analyse de type Southern sur

des échantillons d'ADN génomique digéré par HaeIII et sondé avec un fragment d'ADN recouvrant

la région 425-650. Les résultats de l'hybridation sont présentés dans le tableau ci-dessous.

17. Quel (s) individu (s) possède (ent) un génotype qui leur attribuerait un phénotype d’orteils

poilus?

18. Quel (s) individu (s) possède (ent) un génotype qui leur attribuerait un phénotype normal?

19. Quel (s) individu (s) est (sont) porteur (s) du génotype des orteils poilus, mais a (ont) un

phénotype normal?

20. Combien de différents allèles ont été décelés parmi les quatre individus?

Individus Tailles des bandes observes (pb)

A 450 et 625

B 475, 300, et 150

C 300 et 150

D 475, 450 et 150

550 250 10 1075

700 75

27

21. Ci-dessous sont une partie des séquences de l’ARNm d’yfg1 et de trois variantes d’ARNm

d’yfg1 (A, B, et C) retrouvées dans les embryons des poissons-zèbres.

5’...GAUGAAAGAUCAGGUCUGAAUGUAU...3’ yfg1 mRNA

5’...GAUGAUUCAUCAGGUCUGAAUGUAU...3’ Variant A

5’...GAUGAAAGAUCAGGACAGAAUGUAU...3’ Variant B

5’...GAUGAAAGAUCAACUCUGAAUGUAU…3’ Variant C

Vous avez créé une sonde qui est complémentaire à 100% à la séquence de l'ARNm d’yfg1:

5’...TTCAGACCTGATCTTTCATC...3’. Vous hybrider la sonde à l'ARN total de poisson zèbre

à la température ambiante (20°C), puis ajuster la stringence par des lavages à 50°C. Lequel

(lesquels) des quatre ARNm allez-vous "voir" en tant que des bandes sur le film lorsque vous

développez votre transfert northern?

A. Seulement yfg1

B. yfg1 et A

C. yfg1 et B

D. yfg1 et C

E. Tous ceux ci-dessus

F. Aucun d’entre eux

Indiquez comment chacune des conditions suivantes influencerait le Tm d’hybrides d’acides

nucléiques: Augmenter, diminuer ou aucun effet.

22. Augmenter la température

23. Augmenter la concentration de formamide

24. Un contenu G : C plus élevé

25. Vous souhaitez utiliser une sonde de 250 bases qui est de 40% G / C pour effectuer une

hybridation à 40°C dans un tampon qui contient 0.5 M de NaCl. En supposant 100% de

complémentarité, votre tampon d'hybridation doit contenir quel pourcentage maximal de

formamide? Présumez qu’une hybridation optimale serait à 5oC sous le Tm.

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Partie II : (10 points/ question pour un total de 50 points)

Amplification par PCR du VNTR ApoC2 (Exercice de labo 7, p. 61)

1. Soumettre une figure des profils de VNTR de la classe. Inclure une légende appropriée qui

inclut une brève analyse. Votre analyse devrait inclure les tailles des différents allèles observés

identifiés alpha numériquement, le pourcentage des individus de la classe qui possèdent

chaque allèle et si chaque individu et hétérozygote ou homozygote.

Amplification par PCR du RFLP ApoB (Exercice de labo 7, p. 61)

2. Soumettre une figure des profils RFLP de la classe. Inclure une légende appropriée qui inclut

une brève analyse. Votre analyse devrait inclure les différents allèles observés identifiés alpha

numériquement, le pourcentage des individus de la classe qui possèdent chaque allèle et si

chaque individu et hétérozygote ou homozygote.

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Partie III : Bioinformatique (2 points/ question pour un total de 30 points) Vous devriez maintenant être assez familier avec le site de NCBI et être en mesure de

compléter l'exercice suivant avec peu de directives. Considérez ceci comme une pratique

pour la partie de bioinformatique qui sera sur l'examen final.

Utilisez la séquence suivante pour répondre aux questions 1-10 AAGACGACGGCCTCAGACTTCTTGGGTATTTGGACCACTGCACTGAAGAGATCATCTCTCCAGATTACTT

TCCCCTGAGCTCCAGGCACCATGAACTTTCCTTCTACAAAGGTTCCCTGGGCCGCCGTGACGCTGCTGCT

GCTGCTACTGCTGCCGCCGGCGCTGCTGTCGCTTGGGGTGGACGCACAGCCTCTGCCCGACTGCTGTCGC

CAGAAGACGTGTTCCTGCCGTCTCTACGAACTGTTGCACGGAGCTGGCAACCACGCTGCGGGTATCCTGA

CTCTGGGAAAGCGGCGGCCTGGACCTCCAGGCCTCCAGGGACGGCTGCAGCGCCTCCTTCAGGCCAACGG

TAACCACGCAGCTGGCATCCTGACCATGGGCCGCCGCGCAGGCGCAGAGCTAGAGCCACATCCCTGCTCT

GGTCGCGGCTGTCCGACCGTAACTACCACCGCTTTAGCACCCCGGGGAGGGTCCGGAGTCTGAACCCATC

TTCTATCCTTGTCCTGATCCAAACTTCCCCCTCTGCTCGCCGCTGTCAGTCTCTTGGTAAATGGCAATAA

AGACGATTCTCTGTTGGTGTGACT

1. Quel est le nom de l’organisme duquel cette séquence génique provient?

2. L'un des fichiers nucléotidiques obtenu en utilisant la séquence ci-dessus comme requête

appartient à Felis catus. Quel est le numéro d'accession de ce fichier?

3. Quelles sont les chances que la séquence trouvée dans la question numéro 2 soit un « hit »

aléatoire?

4. Quel est le nom du produit protéique codé par la séquence de Felis catus?

5. Le produit protéique de la séquence de Felis catus est combien d'acides aminés de long?

6. 6. Quel est le nom d'un domaine conservé associé à la protéine de Felis catus?

7. La séquence ci-dessus (provenant de l'organisme en question 1) a été clonée dans le site BamHI

de pUC19. Quelles sont les tailles de fragments attendues à la suite d'une digestion avec PstI

de recombinants contenant l'insert d'intérêt dans l'une ou l'autre orientation?

8. Laquelle de ces amorces pourrait être utilisée pour une réaction de transcriptase inverse sur

l’ARN codant?

A. AAGTCTGAGGCCGTCGTCTT

B. CACCAACAGAGAATCGTCT

C. AGGGTCCGGAGTCTGAACC

D. CAGCGGCGAGCAGAGGTTC

9. Une hybridation Southern a été effectuée sur de l'ADN génomique d'un nouveau variant du

virus de l'hépatite B digéré par XbaI. L'ADN digéré a été sondé avec la région correspondant

aux bases 1638 - 2638 du génome original de l'hépatite B (numéro d'accession NC_003977).

L'hybridation Southern a révélé des bandes de 1894 bases et 1039 bases. Quelle (s) bande (s)

était (ent) inattendue?

10. Tenez compte des informations fournies dans la question précédente. La (les) mutation (s) a

(ont) probablement eu lieu dans le gène codant pour quelle protéine du virus de l'hépatite B?

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Référez-vous au fichier avec le numéro d’accession NM_010030 pour répondre aux

questions 11-15

11. Quel est le numéro d’accession du premier homologue nucléotidique de Rattus norvegicus de

cette séquence?

12. Quel type d’homologues est-ce que les protéines codées par la séquence de requête originale

et celle de Rattus norvegicus sont?

13. Quel est le pourcentage d’acides aminés identiques entre les deux protéines de la question

précédente?

14. Quel type de substitution d’acides aminés est le plus abondant entre les deux homologues

(question 12)?

15. La séquence suivante : GGACCGTCTTCCTCCTGTTTACCGAGACTGTGTCAT représente

la séquence originale, la séquence inverse, le complément, ou l’inverse du complément de la

séquence avec le numéro d’accession NM_010030?

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Devoir No 1 Partie I : Dilutions et Concentrations (3 ...mysite.science.uottawa.ca/jbasso/moleculaire/devoirs_2018.pdf · Quelle est la molarité finale de « B » dans la solution?