Travaux pratiques de biochimie (30h)

Année 2015-2016

Enseignant : Guillaume Caulier (Prof. Ruddy Wattiez)Fonction : Assistant en biologieContact : guillaume.caulier@umons.ac.be

Biochimie

Introduction : les travaux pratiques de biochimie ont pour but d’illustrer lesnotions théoriques vues aux cours du Professeur Ruddy Wattiez. Chaquejour sera dédié à l’extraction, la mise en évidence et la purification dedifférentes macromolécules (protéines, ADN, sucres, lipides).

Dynamique de groupe : Laboratoire divisé en 4 ateliers. 2 groupes paratelier.

Evaluation : 1 rapport par groupe

Travaux pratiques de biochimie (30h)

Enseignant : Guillaume Caulier (Prof. R. Wattiez)Fonction : Assistant en biologieContact : guillaume.caulier@umons.ac.be

Biochimie

Consignes pour la rédaction du rapport (1 pour 2 étudiants):

Deadline : à discuter.N.B. le rapport peut être commencé lors des scéances.

Fonds : General: Page de garde (noms), introduction, but, bibliographie² .Pour chaque atelier: Introduction, but, matériel et méthode (pas uncopier/coller du protocole), analyse des résultats de l’expérience etdiscussion/conclusion pour chaque atelier.

Forme : Word/PDF d’uneTrentaine de pages maximum.

A envoyer via Moodle: NOM1-Nom2_Tpbiochimie 14-15

² Introduction du TP de biochimie, Caulier 2014.

Année 2015-2016

Remarques préalables :

• Port du tablier de laboratoire, gants et lunettes obligatoires! Prise de conscience du matériel de sécurité en cas d’incident.

•Ne pas manger ni boire dans le laboratoire, attention aux nouvelles paillasses.

• Bien suivre les instructions, comprendre l’expérience avant de commencer.

•Ne pas manipuler les solvants ou autre produit toxique en dehors des hottes prévues à cet effet!

• Bien respecter le matériel! micropipettesbalancespectrophotomètre

Bien nettoyer les paillasses + matériel

Travaux pratiques de biochimie (30h)

Biochimie Année 2015-2016

Protéines

Biochimie

Séparation de protéines par colonne de chromatographie

Dosage de protéines par spectrophotométrie

Réalisation d’une électrophorèse SDS-PAGE

Année 2015-2016

Séparation de protéines par colonne de chromatographie

Biochimie

-Chromatographie d’exclusion (stérique)

-Phase stationnaire : Sephadex G10,20,30…Polymères de dextran hydrophile, différents domaines de réticulation

-Phase mobile : NaCl

-Séparation sur base de la taille, mesure des volumes d’élution. V0 = volume mort.

Déroulement de l’expérience:-Couler 2 colonnes-Séparation de 3 molécules : Blue dextran (2000000 Da)Hémoglobine (65000 Da)Ferycianine de K (329 Da)-Mesure des volumes d’élution-Droite d’étalonnage

Année 2015-2016

Dosage de protéines par spectrophotométrie

Biochimie

-Fonctionnement d’un spectrophotomètre

-Formule de Beer Lambert

A λ = ε λ LC

A = absorbance du chromophore (DO : densité otpique)ε = coefficient d’extinction molaire (mg-1.ml.cm-1)L= longueur du trajet de la lumière dans le spectrophotomètre (cm)C= concentration du chromophore (mg/ml)

Année 2015-2016

Dosage de protéines par spectrophotométrie

Biochimie

-Protéines et chromophores :

-Absorption des Uvs:

280nm 230nm : lien peptidique

-Absorption des protéines avec bleu de Comassie (dosage de Bradford)

595nm

Déroulement de l’expérience:-Vérifier la concentration BSA 1g/l-Spectre abs. (250-350nm) blanc d’oeuf-Droite étalonnage (BSA-bradford)-Determination concentration protéines dans le blanc d’oeuf

Année 2015-2016

Réalisation d’une électrophorèse SDS-PAGE

Biochimie

-Electrophorrèse :

Mobilité et séparation de molécules de différentes tailles dans un gel soumis à un champs électrique.

SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) détergeant-dénature-uniformise les charges

Gel d’acrylamide en 2 phases (PH et concentration)- concentration-séparation

Tampon Tris-glycine

Déroulement de l’expérience:-Préparation du gel-Dépôt des échantillons et electrophorèse-Comparer les distances de migration des protéines du blanc d’œuf avec un Référent (droite de calibrage).

Année 2015-2016

ADN

Biochimie

Extraction et précipitation

Dénaturation et mesure de la densité optique

Année 2015-2016

Extraction et précipitation

Biochimie

-Extraction à partir de thymus de veau (ris de veau)-Role biologique-Rapport nucléocytoplasmique élevé

Déroulement de l’expérience:- Destruction des membranes cellulaires (citrate de sodium)-Séparer les protéines de l’ADN (centrifugation)-Dissocier les histones (SDS)-Précipiter les protéines (NaCl)-Précipitation de l’ADN ( alcool) observation

Dénaturation

Déroulement de l’expérience:-Faire chauffer l’ADN et mesurer la DO régulièrement à 260 nm-Déterminer le pourcentage en GC

Année 2015-2016

Lipides

Biochimie

Séparation de différents groupes de lipides

Chromatographie sur couche mince

Année 2015-2016

Séparation de différents groupes de lipides

Biochimie

-graisse neutre vs phospholipides vs stéroides

-Comparaison des contenus en lipides de 2 tissus différents : du lard et dela cervelle de porc.

Déroulement de l’expérience:- Extraction chloroforme/methanol-Précipitation des phospholipides (sels de cadmium)-Saponification

-bêcher cervelle ampoule à décanter (séparation savons et stéroides)-bêcher lard précipitation des acides gras

Année 2015-2016

Chromatographie sur couche mince

Biochimie

-Séparation des différents lipides en fonction de leursaffinitiés pour les deux phases :

-solide : silice (capilarité)

-liquide : solvants

-Révélation de différentes couleurs :

- Vapeur d’iode (taches jaunes)

- Ninhydrine (rose)

- Réactif du phosphore (bleu)

Déroulement de l’expérience:-Préparation de la plaque de silice, notamment pour les aires de dépôt.-Déposer les échantillons et faire migrer dans la cuve avec les solvants.-Révéler avec un spray les différentes couleurs.

Année 2015-2016

Sucres

Biochimie

Tests de révélation de carbohydrates

Digestion d’amidon par l’amylase

Digestion de glucose par les levures

Année 2015-2016

Tests de révélation de carbohydrates

Biochimie

•Sucre = Carbohydrate= plusieurs unités aldéhydiques ou cétoniques polyhydroxylées.

•Coloration couleur de Fehling (oxydoréduction du cuivre)sur 4 sucres différents : glc, fruc, gal, amidon.

•Coloration réactif de Tollens (miroir d’argent)

Déroulement de l’expérience:-Préparation des réactifs de Fehling et Tollens.-Mise en contact (Bain Marie 100°C)-Expliquer les différents résultats.

Année 2015-2016

Digestion d’amidon par amylase

Biochimie

•Mise en évidence de l’activité enzymatique De l’amylase contenue dans notre salive afinde dégrader l’amidon. Vérification par

Coloration à l’iode (lugol) et liqueur de Fehling.

Déroulement de l’expérience:-Mettre l’amidon en solution-Incuber en bain marie à 37°C avec notre salive-test à l’iode + fehling

Digestion de glucose par les levures

•Fermentation alcoolique (anaérobie)C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi → 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP

Mesure du métabolisme de la levure par titration du CO2 produit, capté par du NaOH en fiole conique (anaérobie)

Année 2015-2016

Utilisation du matériel

Biochimie

•Systèmes de sécurité, que faire en cas de brulure physique/chimique

•Comment mettre/retirer des gants?

•Utilisation de la balance

•Utilisation du spectrophotomètre

•Utilisation des micropipettes

•Droite de calibration avec Excell

Année 2015-2016