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5. Essais immunologiquesLes essais immunologiques sont basés sur la réaction spécifique entre un antigène et un anticorps, les biomolécules impliquées dans le système immunitaire, pour la détection et quantificationd’antigènes.

Les essais immunologiques constituent une des méthodes les plus communes en chimie bioanalytique pour le diagnostic et contrôle des maladies.

Des anticorps (Ab) ou des immunoglobulines (Ig) sont des glycoprotéines (masse moléculaire de 150 kDa) dont la synthèse est déclenchée dans l'organisme par injection d'un antigène (produit d’une réponse immunitaire). Les anticorps sont bivalent; ils contiennent deux sites de liaison identiques par molécule.

Des immunogènes ou des antigènes (Ag) sont des substances (masse moléculaire > 1 kDa) dont l'injection provoque la synthèse, par l'organisme, d'anticorps spécifiques.

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Les anticorps et antigènes contiennent des sites de reconnaissance moléculaire, appelés « paratope » et « épitope », respectivement. Un anticorps réagit spécifiquement avec un antigène complémentaire pour former un complexe Ab-Ag:

La spécificité des interactions Ab-Ag est analogue à celles entre substrat et enzyme. Cette grande spécificité permet dans plusieurs cas l’analyse directe de matrices complexes, tel que du sang ou de l’urine non-traité.

L’affinité d’un anticorps pour son antigène est très élevée et il y a liaison même à des concentrations très faibles. Ceci explique la sensibilité élevée des essais immunologiques.

Des limites de détection de l’ordre du fmol (10-15 mol) peuvent être atteintes pour certains essais.

(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

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5.1 Structure et propriétés des anticorps

Toutes les immunoglobulines sont constituées de:- 2 chaînes polypeptidiques « légères » de 25 kDa chacune- 2 chaînes polypeptidiques « lourdes » de 50 kDa chacune.

Ces 4 chaînes sont associées ensemble par des liens disulfures et des interactions non-covalentes.

Chaque molécule est un dimère symétrique en forme de « Y ». Les deux moitiés d’une immunoglobuline naturelle sont identiques.

axe de symétrie

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bouts N-terminal

fragments Fab(sites de liaison

de l’antigène)

bouts C-terminal

fragments Fc(classe d’anticorps)

(L)

(H)

bout C-terminal

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Propriétés des différentes classes d’immunoglobulines


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Dans une molécule d’Ig, on retrouve des régions constantes (C) et des régions variables (V) qui sont constituées de motifs spécifiques de repliement des séquences d’acides aminés.

Les régions constantes sont les mêmes pour chaque Ig d’une classe et sont localisées au bouts C-terminaldes chaînes légères (CL) et sur les bouts C-terminal des chaînes lourdes(CH1, CH2, CH3).

Les régions variables constituent les paratopes ou sites anticorps qui visent l’antigène d’intérêt. Il y a 2 sites anticorps identiques par molécule.

Les paratopes sont situés aux extrémités de la forme « Y », dans les régions N-terminaldes châines légères (VL) et lourdes (VH).

Les paratopes possèdent une structure permettant une interaction complémentaire avec les éléments structuraux et groupements fonctionnels sur la surfacede l’antigène.


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Anticorps polyclonaux vs. monoclonal

On peut identifier 2 types d’anticorps: des anticorps polyclonaux et un anticorps monoclonal.

Anticorps polyclonaux: - un mélange complexe d'immunoglobulines isolées du sérum sanguin- Ces anticorps reconnaissent une série d'épitopes différents. - Ils possèdent une large gamme de sélectivités et affinités. Ceci peut donner lieu à des réactivités croisées ou à des interférences dans un essai immunologique.

Anticorps monoclonal: - anticorps spécifique sécrété par les hybridomes produits grâce aux méthodes de la technologie des hybridomes (impliquant des cultures cellulaires)- Il se lie à un épitope particulier .- Les anticorps monoclonaux sont plus spécifiques et possèdent des propriétés plus reproductibles. Ils sont les anticorps de choix pour les essais analytiques.

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Les immunoglobulines peuvent être coupées en fragments par traitement enzymatique.La papaïne coupe l’immunoglobuline en 3 fragments d’environ 50 kDa chacun: 2 Fab et 1 Fc. Puisque les fragments Fab contiennent les paratopes, ils retiennent leur capacité à lier l’antigène.Le fragment Fc est facilement cristallisable. Il ne contient pas de sites de reconnaissance de l’antigène.La pepsine coupe l’immunoglobuline à la base, en dessous du pivot, produisant un fragment F(ab)2. Le fragment F(ab)2 contient les 2 paratopes.Les fragments Fab et F(ab)2 sont à l’occasion utilisés dans des essais immunologiques au lieu de l’immunoglobuline entière.


papaïne

pepsine

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5.2 Structure et propriétés des antigènes

L’épitope ou déterminant antigénique est la partie de l’antigène qui interagit de manière spécifique avec le site anticorps.

Les dimensions d’un épitope: ~ 0.7 x 1.2 x 3.5 nm (l’équivalent d’environ 5 à 7 acides aminés).

Il y a deux types antigènes: les antigènes complets et les antigènes incomplets. (D’après McMurry & Castellion,

Fundamentals of General, Organic& Biological Chemistry, 4è éd., 2003)

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Antigènes complets: - peuvent induire une réaction immunitaire par eux-mêmes (ex. un microorganisme)

Antigènes incomplets ou haptènes:- molécules de plus faible masse moléculaire qui ne peuvent pas induire de réaction immunitaire par elles-mêmes- Lorsqu’attaché à une protéine (transporteur protéique), telle que l’albumine ou la ferritine, un haptène peut stimuler la production d’anticorps spécifiques. Une fois produits, les anticorps anti-haptène reconnaîtront l’haptène même sans le transporteur protéique.- Les haptènes présentent généralement un seul épitope.

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Les antigènes sont classifiés selon leurs caractéristiques de liaison (nombre total de sites et nombre de sites différents):

1- Antigène univalent et uni-déterminé: possède un seul épitope à la surface qui est capable de se lier à un anticorps. Les haptènes sont univalent et uni-déterminé.2- Antigène multivalent et uni-déterminé : possède au moins deux épitopes du même type sur une molécule d’antigène.3- Antigène multi-déterminé et univalent: présente plusieurs épitopes de différents types, mais seulement un de chaque type sur une molécule d’antigène. La plupart des antigènes protéiques tombent dans cette catégorie.4- Antigène multi-déterminé et multivalent: présente plusieurs épitopes de différents types et plus d’un épitope de chaque type par molécule d’antigène. Les protéines ayant des multiples sous-unitésidentiques, ainsi que des protéines réticulées et des cellules entières, tombent dans cette catégorie.

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5.3 Interactions anticorps-antigène

Un immuno-complexe est formé entre des anticorps et antigène, ayant des paratopes et épitopes assortis.

La formation du complexe antigène-anticorps est réversible et implique de nombreuses interactions non-covalentes (et relativement faibles) de types électrostatique, hydrophobe, van der Waals et ponts hydrogène.

Toute interaction anticorps-antigène débute par une interaction primaire impliquant la reconnaissance spécifique et liaison de l’épitope antigénique au paratope de l’anticorps correspondant. L’interaction primaire est rapide (durée de milliseconde) et macroscopiquement invisible.

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Équilibre d’une interaction liante primaire étudiée avec des haptènes:

Des réactions secondaires anticorps-antigène résultant d’antigènes multivalents produisent de l’agglutination ou précipitation d’un réseau polymérique antigène-anticorps. Un produit visible est formé sur un temps allant de quelques minutes à quelques heures:

(D’après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004)

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Même si les deux types d’interactions anticorps-antigènes (primaire et secondaire) peuvent être exploitées pour des fins analytiques, des méthodes quantitatives utilisent extensivement les réactions primaires.

L’affinité est la force d’interaction entre un seul épitope et paratope. L’affinité dépend du nombre et de la force des liaisons formées entre l’épitope et paratope..

L’affinité est quantifiée à travers la constante d’équilibre (Keq) pour la formation du complexe anticorps (Ab)-épitope (haptène; H):

Ab + H Ab:H

Affinité = Keq = [Ab:H]/[Ab][H]

Valeurs typiques d’affinité pour des interactions anticorps-haptène: 105 à 1012 M-1. Le renversement de la liaison Ab-H peut seulement être accompli sous des conditions extrêmes de pH, force ionique, etc.

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Les affinités peuvent être déterminées en gardant [Ab] constante et en variant [H].

La quantification de [Hnon-lié] et [Hlié] permet la construction d’un graphique de type Scatchard.

Les anticorps polyclonaux donnent une courbe Scatchard non-linéaire dues aux différentes sélectivités et affinités des épitopes.

Pour des anticorps polyclonaux, les valeurs expérimentales de Keqreprésentent une affinité moyenne.

Graphique de Scatchard


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5.4 Applications analytiques des réactions anticorps-antigène secondaires

1. Réactions d’agglutination:

L’agglutination se produit lorsque un anticorps interagit avec une particule antigénique multivalente, résultant dans la réticulation des particules antigéniques par l’anticorps. Une agglutination peut se produire lorsqu’un antigène uni-déterminé et multivalent (plusieurs copies du même épitope A) interagit avec un seul anticorps (anti-A) ou lorsqu’un antigène univalent et multi-déterminé (avec épitopes A, B, C, etc.) interagit avec au moins 2 différents anticorps (Anti-A plus Anti-B, etc.)L’occurrence d’une agglutination dépend des concentrations relatives des anticorps et antigènes.L’agglutination est utilisée comme un test qualitatif de la présence d’anticorps dans le sérum sanguin et pour déterminer le groupe sanguin.

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Exemple 5.1: test d’agglutination pour les anticorps Brucella abortus(bactérie)

• Chaque tube contient la même quantité de la suspension bactérienne(antigène).• Une solution de sérum de plus en plus diluée est ajoutée à chaque éprouvette.• Si l’anticorps est présent dans le sérum, une agglutination sera observéesur une gamme de dilutions (i.e. éprouvettes 3 à 9) • Deux zones de dilution sont observées: prozone (éprouvettes1 et 2)et zone d’agglutination (éprouvettes 3 à 9).


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L’agglutination se produit seulement dans une certaine région dedilution du sérum dû à un excès d’antigène ou d’anticorps.

Prozone (éprouvettes 1 et 2)- un grand excès d’anticorps existe et chaque anticorps se comporte de manière univalente.

Région de forte dilution du sérum (éprouvette 10)- grand excès d’antigène existe et il n’y a pas suffisant d’anticorps pour la réticulation. L’antigène se comporte de manière univalente.

Ag(bactérie)

Ab (sérum) Ab-Ag

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L’identification du groupe sanguin est une application commune du test d’agglutination.Les globules rouges sanguines possèdent sur leur surface soit l’un des épitopes A et B ou les deux. Certains individus ne possèdent aucun épitope et des anticorps anti-A et anti-B.


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2. Réactions avec précipitation:

Les réactions avec précipitation sont basées sur un principe semblable aux réactions par agglutination; la différence étant que l’antigène est une espèce moléculaire soluble au lieu d’une particule (bactérie ou cellules).

À une certain rapport Ab/Ag, le réseau polymérique d’anticorps et d’antigènes devient insoluble et précipite.

Quantité de précipité formé en fonctionde la quantité d’antigène ajoutée pourune concentration totale d’anticorps fixe


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Test de la présence d’anticorps dans le sérum par la méthode de double diffusion sur gel: (a) un seul anticorps

(b) multiples anticorps.

Dans (b) les vitesses de diffusion des antigènes suivent l’ordre1 > 2 > 3. Une ligne de précipité est formée à une distance correspondant à l’équivalence Ab/Ag.


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Test de l’identité d’un antigène par la méthode de diffusion sur gel:(a) cas d’identité(b) cas de non-identité(c) cas d’identité partielle.


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L’anticorps est uniformément distribué dans le gel. Due à la diffusion de l’antigène à travers le gel, des anneaux de

précipité sont formés autour des puits contenant des solutions d’antigènede différentes concentrations.

Le diamètre carré (d2) d’un anneau de précipité α [antigène].

Concentrations d’antigène différentes

Courbe d’étalonnage

Quantification d’antigène par la méthode d’immuno-diffusion radiale
