DYNAMIQUE DE LA LONGUEUR DESTELOMERES AU COURS DE LA SENESCENCE ET
DE L’IMMORTALISATION DE CELLULESHUMAINES
CEA / DSV / DRR
LABORATOIRE DE RADIOBIOLOGIE ET ONCOLOGIE
13 décembre 1999
Jean-Patrick Pommier
Dynamique de la longueur des télomères etinstabilité chromosomique spécifique
Les télomères :des sabliers mitotiques?
Sénescence in-vivo
Sénescence in-vitro
Cellules primairesTélomérase OFF
Cellules ImmortellesTélomérase ON
Passage P1
Passage Pn
Ensemencement
Confluence
Trypsination
La sénescence réplicative des fibroblastes humains in-vitro
Hayflick et Moorhead (1961)
Explants de tissu
Nombre de passages :•Fini : 40 à 60 DPMs•Variabilité interindividuelle
Localisation des signaux télomériquesHIS sur chromosomes métaphasi ques hum ains, avec une sonde PNA (CCCTAA)3-Cy3
2q13-q14
Yq?
2q13-q14
Organisation génomique des télomères
• Séquences répétées en tandems directs jointifs.
• Localisation terminale, brin G orienté en 3’
•Localisation intrachromosomique : Blocs de tandems inverses (ex HS 2q13-q14) ?
Réplication incomplète des télomères
+
TTAGGG
synthèse continue
synthèse discontinue
3’
5’AATCCC
Progression de la fourche de réplication
amorce ARN
fragment d’Okasaki
(1)-Dégradation amorce ARN(2)-Synthèse ADN(3)-Ligation5’
3’
5’
(1)
(2)
(3)
Dégradation de la dernièreamorce ARN synthétisée
+
Fin du passage de la fourche de réplication
Post-traitement du brin C-Dégradation ou-Structure secondaire ?
100 à 275 bases simples brins
±10 bases simples brins
Fonctions des télomères
• Stabilisation du génome– Supportent la réplication incomplète de l’ADN.
– Blocage des fusions chromosomiques dans les cellulesmitotiques.
• Absence de motifs TTAGGG
– Blocage irreversible en G1/S (sénescence)
– Signal apoptotique
• Topographie des chromosomes interphasiques
– Appariement des homologues dans la méiose
La télomérase est un complexeribonucléoprotéique
5’
3’
AAUCCCAAUCCCAAUCCCTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 3’ 5’
site catalytique
sous unité catalytique: hTERT (Homme); Est2p (Levure); p123, p133 (Ciliés)
cofacteurs protéiques: p80, p95 (Ciliés)
protéine d’amarrage: Est4 Cdc13 p (Levure)
matrice ARN: hTER (Homme); TLC1 (Levure)
motif télomérique néosynthétisépar la télomérase
TTAGGGAATCCC
Chromatine télomérique des vertébrés
3’AATCCC
TTAGGG
Boucle T
5’
Boucle D
TRF1TRF2
de Lange et al. (1999)
Limitation de la prolifération des fibroblastes parla quantité de motifs TTAGGG présente à chaque
télomère ?• Les fibroblastes primaires n’expriment pas la télomérase.• Les divisions cellulaires générent des télomères avec peu ou
pas de motifs TTAGGG (réplication incomplète, autre(s)mécanisme(s) ?).
• Les télomères privés de TTAGGG sont équivalents à descassures d’ADN double brin:– Blocage constitutif en G1– Réparation par end-joining: Dicentrique ter-ter (fréquence ?).
• Expression ectopique de hTERT dans les fibroblastes :– Immortelles
– Normales : éternellement “jeunes” (Bodnar et al. 1998)
Fusions télomériques dans les fibroblastes sénescents(Benn 1976)
Fibroblastes MRC5 sénescents
0
5
10
15
20
25
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
chromosomes
occu
renc
e
pterqter
Fibroblastes WI38 sénescents
0
5
10
15
20
25
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Chromosomes
occu
renc
e
pterqter
Hypothèses
• Les dicentriques sont le produit d’une réparationinappropriée des télomères érodés.
• Etat des télomères érodés dans une cellule sénescente?
• Implications de chromosomes spécifiques
• Différence entre donneurs
• Rôle du polymorphisme de longueur des séquencestélomériques?
Support Méthode Sonde Marquage + -ADNgéno mique
SouthernBlot
Telomérique Chaud •Sensibilité : 32
P•Calibration interne•Mesure en Kb
•Quantité ADN•Effet longueur de la cible• Smearing non linéair e•Non télomère spécifique•Subtelo inconnu•Durée•Sensible à la fragmentationde l’ADN•Echantillonage
Métaphase FISH Télomérique(+autres)
Froid •Hybr idation simultanée•Télomère spécifique•Homologue spécifique•Calibration interne.
•Représentativité métaphases/noyaux(Culture cellulaire)•Traitement informatique lourd• Calibration externe pour la longueur ?
Noyaux FISH Télomérique(+autres)
Froid •Hybr idation simultanée•Quantité de cellules
•Calibration externe pour la longueur•Focalisation (100x)
FlowFISH
Télomérique(+alphoïde)
Froid •Rapidité •Cytométr ie en flux
QUANTIFICATION DES SEQUENCES TELOMERIQUES
Analyse de la longueur des FRTsPrincipes
Sonde subtélomérique (minisatellite)S(x)=k•N(x)
Sonde pantélomérique (CCCTAA)n
S(x)=k•N(x)•L(x)
RsaI, HinfIFRT
Digestion enzymatique
Migration électrophorétique(échantillons + calibration)
+Autoradiographie
Dynamique de la longueur des télomères etinstabilité chromosomique spécifique
Les télomères :des sabliers mitotiques?
Sénescence in-vivo
Sénescence in-vitro
Cellules primairesTélomérase OFF
Cellules ImmortellesTélomérase ON
Evolution de la longueur des télomères /immunosénescence
• Modèle in-vivo– Patients HIV+ vs HIV-
• Hypothèse– Augmentation du renouvellement cellulaire
– =>Erosion des télomères dans les lymphocytes?
Southern-Blot Patients VIH+ vs VIH-
Calcul de la longueur moyenne des FRTsBET Autoradiogramme BET
Individus HIV+
23
12111098
7
6
5
4
3
2
1.6
Individus HIV- Plac PYKbλ ladder ladder
6
7
8
9
10
11
12
13
Témoins Patients Groupe A (T8)
Groupe B (B)n=11
n=16 n=6n=10
p=0.0104p=0.0005p=0.0002
Patients
> 200 T CD4+ /µl
n=5
p=0.6917
< 200 T CD4+ /µl
Comparaison de la taille des télomères des CMSPau cours de l'infection à VIH
Long
ueur
moy
enne
des
FR
Ts
(kb)
(Pommier JP ,Gauthier L et al., Virology, 1997)
Immunosénescence in-vivo
• -40 bp/an dans les CMSP (Vaziri et al. 1993)• Patients avec moins de 200 T4/mm3 :
– ∆FRT=-2,78 Kb : vieillissement de 70 ans des CSMP.
– Réduction de la longueur des télomères dans les:• Lymphocytes T8
• Lymphocytes B
• 2 patients avec réduction dans les lymphocytes T4
• Immunosénescence des progéniteurs hématopoétiques parsénescence réplicative ?
• La télomérase est incapable de maintenir la longueur destélomères.
Dynamique de la longueur des télomères etinstabilité chromosomique spécifique
Les télomères :des sabliers mitotiques?
Sénescence in-vivo
Sénescence in-vitro
Cellules primairesTélomérase OFF
Cellules ImmortellesTélomérase ON
SENESCENCE - CELLULES TP
Passage P20 P35 P44 (senescence)Analysed mitosis 50 50 20Abnormal mitosis 0 15 19Dicentrics+rings 0 14 21Rea Chr13 0 13 15
Chromosomes dicentriques dans les fibroblastesTP
Effets à long terme d’une irradiation aux ions lourds.
0
50
100
150
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
souscultures précocesP ≤ 10
souscultures tardivesP> 10
Réactivation de l’activité télomérase dans lesfibroblastes transformés par SV40.
TSV40
augmentation de l'instabilitéchromosomique
Sénescence (M1) Crise (M2) ImmortalisationDivisions cellulaires supplémentaires
réactivation de la télomerase
Addition de motifs TTAGGG
+
++
+
+-
érosion des télomeres
G1 SG1 S
p53
p21WAF1
p16INK4a
+
-
+
activité télomérase OFF ON
ATM
érosion des télomeres
clone(s) immortalisé(s)
hTERT
Pla
cent
a
Pet
eb
6 8 15 25 33 50 64 78Peteb PB1.2
CRISE
8
12
6
5
4
3
2
Kb
10
Hétérogénéité de la taille des télomères
Pl TP 5 8 10 14 19 29 34 40 45 50 56 65
Passages
Crise
121110987
6
5
4
3
TP15.5
0
100
200
300
400
500
600
700
DIC
EN
TRIQ
UE
S
0 2,5 5 7,5 10
TRF (Kb)
CRISE
CRISE
CRISEMRC5
Peteb PB1.2
TP15.5
Avant crise : corrélation inverse entre la taille moyenne destélomères et le nombre de dicentriques
La longueur télomérique critique est-elle identique pour toutes les lignées ?
HYPOTHESE : Les télomères courts sontinstables
TP15.5, Peteb -> hétérogènes
MRC5-> homogènes
Localisation des points de cassure dans lesdicentriques
centromère-centromèretélomère-centromèretélomère-euchromatine
télomère-télomère
0
25
50
75
100
% de
mito
ses av
ec de
s rem
aniem
ents
chro
mosom
iques
0 5 10 15
passages après transfection par SV40
14
8
6
1
16
13
dic + r
INSTABILITE CHROMOSOMIQUE
Buts
• Relation entre la longueur des télomères et lastabilité des chromosomes.
• Mesure de la longueur des télomères– cellule par cellule et chromosome par chromosome
– Comparaison de la longueur des télomères à l’intérieur d’une mêmecellule.
– Comparaison d’un télomère d’une cellule à l’autre.
L’INSTABILITÉ CHROMOSOMIQUE EST SPÉCIFIQUEQUELQUE SOIENT LES ÉVÈNEMENTS INDUISANT LA PROLIFÉRATION
HYP : CARACTÉRISTIQUE INTRINSÈQUE DES TÉLOMÈRES
Détection des motifs TTAGGG sur chromosomesmétaphasiques
Sondes PNA (CCCTAA)3-FITCPNA (CCCTAA)3-Cy3
Directement f luorescentesSpécificité très grandeStabilité des complexes PNA-DNA
ChromosomesDAPI (Bandes Q)
Acquisition des imagesCCD monochromes
caméra 8bits (256 niveaux de gris)caméra 12bits (4096 niveaux de gris)
Codage des mesures
• Association à chaque mesure d’un code numériquearbitraire précisant:– Le type du signal (paire, non résolu, “orphelin”)
– La localisation (télomère pter ou qter).
– Le chromosome auquelle elle appartient :• “objet chromosome” (1-46)
• caryotype (1-24 avec X=23 et Y=24)
• Etiquetage des particules binaires– spots
– Chromosomes
Mesure des signaux télomériques parsegmentation binaire
0
255 0
255
0
255Soustraction locale du fond
Seuillage
Surface (pixels)
Niveau de grismoyen
Etiquetage des spots binaires
255
0
0
255
255
0
PaireDouble
Orphelin
pter
qter
Localisation(coordonnées cytogénétique)
Type de spot(Etiquettes en type de spot)
Etiquetage des chromosomes
B
★
★
A
★
★ ★
★
C
★
★
D
★
★
F
★
★
E
Construction du tableau Ligne-particule
Volume desspots
Type4 couleurs
Localisation2 couleurs
Objet46 couleurs
Caryotype24 couleurs
Homologue2 couleurs
Standardisation des mesures
• Variabilité des mesures d’intensité des signaux
– D’un champ à l’autre.
– D’une lame à l’autre.
– Selon les expériences
– Biais dans l’analyse des mesures absolues
– Calibration externe, mesures en Kb (Lansdorp)
• Nécessité d’une indépendance des mesures / conditions
– Calibration interne
– Standardisation interne : mesures centrées-réduites
Si , k
* =S
i− S
k
σk
Construction d’un tableau métaphase-ligne
Tableau T1 Variables utilisées
1430
241058
287+94=381
Interface de l’outil Tableau Croisé Dynamique
Tableau T3 : valeurs brutes
Tableau T3 : valeursCentrées-Réduites
0 1500 30000
1500
3000
pter
qter
Les mesures sont ensuitecentrées-réduites
HETEROGENEITE DES INTENSITESSTANDARDISEES DE 10 MÉTAPHASES
-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Normalized intensity (p arm)
Nor
mal
ized
inte
nsit
y (q
arm
)
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Normalized intensity (10 metaphases)C
umul
ated
cou
nts
Sample size=920
? LES TÉLOMÈRES LES PLUS COU RTS SONT-ILS IDENTIQUESPOUR CHAQUE MÉTAPHASE?
Diagramme pter-qterRecherche d’une différence de longueur des télomères entre
les chromosomes homologues: Cas des chromosomes 1 dans les fibroblastes TP (P14).
-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1pter*
12345678910
1qte
r*
Chromosome 1 (Passage P14)
Métaphase
A
B
Construction d’un tableau métaphase-ligne :Tri des télomères des groupes A et B2 groupes : -> distribution aléatoire?
-> paternel / maternel
Distinction des chromosomes 1 homologues
Association du marquage télomérique fort au marquage hétérochromatique foncé (P=0.08)
Recherche d’hétéromorphismestélomériques
21 22 X Y
32 51 4
6 97 8 10
1211 13 14 15
16 17 18 2019
-2
-1
0
1
2
3
4
-2 -1 0 1 2 3 4 5-2
-1
0
1
2
3
4
-2 -1 0 1 2 3 4 5
-2
-1
0
1
2
3
4 -2
-1
0
1
2
3
4
-2 -1 0 1 2 3 4 5 -2 -1 0 1 2 3 4 5-2 -1 0 1 2 3 4 5
-2
-1
0
1
2
3
4
Recherche du nombre de sous classes delongueur des télomères
1 pa
1 qa
1 pb
1 qb
6 pA
6 qA
6 pB
6 qB
7 pA
7 qA
7 pB
7 qB
11 pA
11 qA
11 pB
11 qB
19 pA
19 qA
19 pB
19 qB
Xp
Xq
Yp
Yq
0
25.1
-0.428 3.35
Classe I
Classe II
Classe I.1
Classe I.2
Classe II.1
Classe II.2
Classe II.1.2
Classe II.1.1
2 134
P<0.0001
P=0.0069
P<0.0001
P<0.0001
1pa = 1qa
Seul 1pa instable
5 sous classes de télomères
confirmation de l’hétérogénéité de longueur des télomères (southern)
Instabilité chromosomique et longueur destélomères
• Differenciation de chromosomes homologues 1, 6, 7, 11, 19, X, Y
• Les chromosomes instables aux passages proches de la sénescence avaientdes petits télomères en P14 (chromosome 1A, 7B ?, 19B ?).
• Les chromosomes avec des petits télomères (11B, 6B) en P14 ne sont pasforcement instables.
• La faible longueur des télomères est nécessaire mais pas suffisante.
Hypothèses• Le taux d’érosion est différent pour chaque télomère ?
• Sélection cellulaire ?
• Effet des séquences flanquantes : recombinaison preférentielle ? (associationspréférentielles : Dic 13-13; Dic 1-13)
Erosion des télomères du chromosome Y aucours de la prolifération cellulaire.
-2 0 2 4 6
-2
-1
0
1
2
3
Yqt
er (i
nten
sité
télo
mér
ique
sta
ndar
disé
e)
P14
P39-1
P39-2
P44
Ypter (intensité télomérique standardisée)
Erosion Yq >> Yp
Hypothèse:dégradation plus élevé
ou recombinaison intratélomérique
->expulsion mini cercle
Dynamique de la longueur des télomères etinstabilité chromosomique spécifique
Les télomères :des sabliers mitotiques?
Sénescence in-vivo
Sénescence in-vitro
Cellules primairesTélomérase OFF
Cellules ImmortellesTélomérase ON
2,5
5
7,5
10
12,5
Tai
lle m
oye
nne d
e té
lom
ères
(Kb
)
0 100 200 300 400
Divisions cellulaires
Après la crise
Juste après la crise
Avant la crise
5
10
15
20
25
Tél
om
ères
lon
gs (K
b)
25 50 75 100 125
Juste après la crise
Avant la crise
Divisions cellulaires
400 pb / division
58 pb / division
110 pb / division
69 pb / division
TP15.5
TP15.5
Corrélation entre l’activation dela télomérase etun ralentissement de la pertedes séquences télomériques
- allongement et dégradation enfaveur d’un raccourcissementtélomérique
- pas d’élongation : latélomérase perturbe lefonctionnement de l’exonucléase
Erosion des télomèrespré et post crise
Le taux d’érosion :équilibre entre élongation et dégradation
la diminution des télomères n’est pas constante
Le taux d’érosion varie en fonction de la longueur des télomères dans le cloneTP15.5
0 100 200 300 4004
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
DPM
Long
ueur
(Kb)
Pic à 21Kb (fibroblastes Primaires TP)
Pic Haut Poids moleculaires (Tp15.5)FRTs moyens ( FRTs homogènes; MPD>200)
Fonction Hyperbolique
0 5 10 15 20 25-400
-350-300
-250-200-150
-100-50
050
100
5Kb’Tau
x dé
rosi
on
Longueur des pics télomériques
autres facteurs influençant la dynamique d’érosion?
TP
TP15.5 p5
TP15.5 p11
TP15.5 p55
Variation de l’hétérogénéité télomérique au cours des passages
Hétérogène
homogénéisation
Relation entre l’instabilité chromosomique, la longueurdes télomères et l’activation de la télomérase
0 10 20 30 40 50 60 70 80 900
2
4
6
8
10
12
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
TP15.5++
0
20
40
60
80
100
120
Nb
Dic
pou
r 10
0 m
itose
s
FR
T m
oyen
s (k
b)
1) érosion des télomèresprécrise télomérase OFF -> instabilité chromosomiquepostcrise télomérase ON -> chromosomes relativement stables2) homogénéisation de la taille des télomères -> évolution autour d’une taille “optimale
CONCLUSIONS• Dans les fibroblastes, les télomères sont hétérogènes en longueur. Certains
chromosomes homologues sont hétéromorphes. Origine de cette hétérogénéité etde cette différence ?– Recombinaison (méiose) ? Différence entre lignée masculine et féminine ?
• En absence de télomérase, la variation de longueur peut être différente d’untélomère à l’autre:– Erosion constante et élevée ou recombinaison mitotique?
• Le taux de variation de la longueur des grands télomères est d’autant plus fortque les télomères sont longs :– Mécanisme coopératif du blocage de l’amarrage de la télomérase aux télomères ?
érosion différentielle ?
• Il y a stabilisation de la longueur des télomères autour d’une valeurs ± constante(homogénéisation)– Facteurs déterminant cette longueur : Contrôle de l’accessibilité des télomères? de
l’efficacité de la télomérase ?
• Stabilité différentielle des chromosomes homologues selon leur télomère?
PERSPECTIVES (1)• Augmenter le nombre de chromosomes homologues différentiables (autres
sondes polymorphes).– Sondes alphoïdes, minisatellites ... en multiFISH.
• Suivi de la longueur des télomères dans des contextes à réarrangementchromosomiques complexes, au cours de la prolifération cellulaire.– Sondes subtélomériques.
• Analyser la distribution de la longueur des télomères des cellules sénescentes(bloquées en G1/S).
– PCC ?
• Mécanismes de réactivation de la télomérase ?
• Rôle de la structure des télomères (protéines spécifiques), absence de latélomérase/ dynamique des télomères (Taux d’érosion ?)
• Automatiser la segmentation des images de cytogénétiques.– Smart Snakes ?
PERSPECTIVES (2)
}
Mutated
Normal
MutatedMutated
No phenotypic effect of LOH Phenotypic effect of LOH
Unstable telomere
Commitment towards immortalization of a specific cell type
Mutated
Normal
Repressed gene Expressed gene
Specific pattern of tissular expression
Whole or partial chromosome lossoriented by telomere loss
Cell proliferation leading to telomere length reduction in somatic cells
A recessive mutation is present in the zygote or is acquired in somatic cells
Biochi mi e (1995) 77, 817-825