EMMIEMMI
Mesure de l’Exposition aux
Moisissures en Milieu Intérieurapproche qualitative et quantitative
à partir d’un prélèvement d’air de longue durée
Valérie Bex
Laboratoire d’Hygiène de la Ville de Paris
Equipe 1 Responsabilité scientifique
Laboratoire d’Hygiène de la Ville ParisValérie Bex, Sophie Barral, Corinne Lebrun, Christina Vernant, Vincent Doucet, Sylvie Dubrou, Dr Fabien Squinazi
Equipe 2Unité Mixte de Recherche BIPAR « Biologie Moléculaire et Immunologie Unité Mixte de Recherche BIPAR « Biologie Moléculaire et Immunologie Parasitaires et Fongiques » ANSES-ENVA-UPEC
Jacques Guillot, Manjula Deville, Adélaide NieguitsilaBenoit Durand : Epidémiologie, ANSES
Equipe 3Centre Scientifique et Technique du Bâtiment
Stéphane Moularat
Collaboration Collaboration Efficacité biologique des capteurs individuels
Ecole Normale Supérieure de LyonVance Bergeron
Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, EA 3520, faculté de Médecine Xavier Bichat, université Denis Diderot, Paris
Firas Choukri, F. Derouin
Objectif - OriginalitéProposer un outil pour la mesure de l’exposition aux moisissures dans l’air intérieur
- Mettre au point les différentes approches analytiques
-Tester 3 dispositifs portables permettant des prélèvements d’air de longue durée : 24 heures
- Mettre en oeuvre la méthodologie dans 30 environnements intérieurs moisis pour obtenir une description exhaustive de l’aérosol fongique
biomasse fongique
analyse quantitative
- dénombrement des spores fongiques revivifiables
- ergostérolfongique
biomasse fongique
quantitative
analyse qualitative COVm
mycotoxines
- ergostérol- (1→3)-b-D-glucanes
identification fongique - par culture- par PCR-D-HPLC
indice de contamination fongique
Stérigmatocystine, Ochratoxine, Trichothécènes
.. de différents constituants de la spore
une description de l’aérosol fongique
par l’analyse…
.. de différents constituants de la sporeIdentification de l’ADN fongiques ENVA Dosage de l’ergostérol membranaire
LHVP/CSTB
Dosage des (1→3)-b-D-glucanes de la paroiLHVP
Présence de COVm ciblesPrésence de COVm ciblesMycotoxinesCSTBDénombrement et
identification des sporesfongiquesLHVP
. . des spores
.. de certains
métabolites
Intérêt du sujet et résultats attendus
Rechercher des corrélations entre les différents Rechercher des corrélations entre les différents indicateurs fongiques mesurés
Associer différentes approches analytiques
Proposer un outil de mesure de l’exposition aux moisissures pour les études épidémiologiques Proposer un outil de mesure de l’exposition aux moisissures pour les études épidémiologiques permettant d’obtenir à la fois une information
– quantitative sur la biomasse fongique
– qualitative sur les moisissures présentes (effets sur la santé / espèces fongiques)
Méthodes analytiquesMéthodes quantitatives
Cible Méthode
analytique
Limite de
quantification
Laboratoire
analytique quantification
Spores
revivifiables
culture
Milieu MEA
10 UFC/mLsoit 6,25 UFC/m3
pour un volume d’air de 14,4 m3
LHVP
(1,3)-beta-
D-glucanes
Kit Glucatell : dosage LAL (facteur G)
3,125 pg/mLsoit 5,43 pg/m3
pour un volume d’air de 2,88 m3
LHVP
(mise au point pour EMMI)
50 µg/L LHVP + ENVA
Ergostérol
24h
Extraction liquide-
liquide + dosage par
HPLC
soit 1,7 ng/m3
pour un volume d’air de 14,4 m3
Validation d’une LQ à 30 µg/L (soit 1,0 ng/m3) en cours
(mise au point pour EMMI)
Ergostérol
7j
Extraction liquide-
liquide + dosage par
HPLC
50 µg/L
Soit 0,50 ng/m3
pour un volume d’air de 100,8 m3
CSTB
Méthodes analytiquesMéthodes qualitatives
Cible Méthode
analytique
Identification Laboratoire
Spores Culture Identification des colonies selon des critères
LHVPSpores
revivifiables
Culture
milieu MEA
Identification des colonies selon des critères morphologiques/microscopiques
LHVP
Génomes
fongiques
PCR-D-HPLC +
séquençage
Par comparaison des séquences d’ADN obtenues à des séquences publiées dans des banques de données
ENVA
COVm Brevet d’invention déposé
COVm cibles :spécifiques des moisissures, de leur métabolisme, de leur activité de biodégradation
CSTB
COVm déposébiodégradation
Construction d’un indice : incrémentation en fonction de la présence ou de l’absence des COVm cibles
Mycotoxines HPLC
Stérigmatocystine : cytotoxique par inhalationOchratoxine A : immunotoxique par inhalationDéoxynivalénol : famille des trichothécènes
CSTB
Etape IIEtape II
Choix des capteurs
portablesgénération d’un aérosol fongique en pièce expérimentalegénération d’un aérosol fongique en pièce expérimentale
Les capteurs individuelsCIP10 IOM C37
10 L/min 2 L/min 1 L/minmousse en polyuréthanne filtre en polycarbonate filtre en polycarbonateen rotation à 7000 tr/min 0,4 µm 0,4 µm
- portables
- autonomes sur 24 heures
- recueil de la fraction inhalable (efficacité physique connue Kenny et al., 1997)
bio-collecteur de référence, Andersen 6 étages analyse granulométrique
La pièce expérimentale
volume 75 m3
- important réservoir fongique
- comparaison simultanée de plusieurs appareils- comparaison simultanée de plusieurs appareils
décontamination - ventilation,
- plasma froid,
- filtration
hermétique - conditions d’ambiance fixes
20°C, 25%, 800 Pa
- absence de flux d’air
= ambiance maîtrisée
essais en condition de répétabilité
- filtration- absence de flux d’air
Conditions expérimentales
Choix de la souche, Aspergillus niger ATCC 16 404Aspergillus niger ATCC 16 404
- agent biologique du groupe 1- identifiée dans l’habitat «moisi»- conidies rugueuses : 3 à 4,5(5) µm, faciles à
aérosoliser
NébulisationCollisson®Collisson®
- 2 bars, eau ppi - tween 80 à 0,002%- quantitatif, reproductible- capacité importante de dispersion- largement utilisé
Déroulement d’un essaicompteur de particules
ventilation et
t0 t5 t55 t60 min
CIP10 - IOM - C37 60min600 L 120 L 60 L
retrait des bio-collecteurs
installation des bio-collecteurs
A
ventilation etdécontamination de la pièce
A
aérosolA. Niger5 min
A2min
57 L
A = andersen 1 ou 6 étages
A2min
57 L
Comptage des particules
100000
t0 t60
1000
10000
Partic
le C
ounts
(#/m
3)
0,3 à 0,5 µm
0,5 à 1 µm
1 à 5 µm
> 5 µm
conidies A. niger3 à 5 µm
10
100
0 20 40 60 80 100
Time (min)
Partic
le C
ounts
(#/m
3)
100
Répartition des particules
aérosolisées selon leur tailleAndersen 6 étages
n = 21
40
60
80
quantité relative %
n = 21
> 9,2 5,5 à 9,2 3,3 à 5,5 2 à 3,3 1 à 2 <1
0
20
étage 1 étage 2 étage 3 étage 4 étage 5 étage 6
quantité relative %
diamètre aérodynamique µm
10000
E = CT / CR x 100
CIP10 68% ± 25
IOM 17% ± 23
Efficacité des capteurs portables / Andersen
n = 11 essais
10
100
1000
ufc/m3
CIP10
IOM
C37
Andersen
IOM 17% ± 23
C37 21% ± 27
1
10
05/05/2009 - E2
05/05/2009 - E3
16/06/2009 - E1
16/06/2009 - E2
16/06/2009 - E3
22/03/2010- E1
22/03/2010- E2
22/03/2010- E3
29/03/2010- E1
29/03/2010- E2
29/03/2010- E3
Choix des capteurs
compatibilité/méthodes d’analyseCIP10 C37 IOM
efficacité biologique +++ + +efficacité biologique +++ + +
fiable +++ - +
silencieux +++ + +
équipé d’un compteur - + +
facilité d’élution - + +
glucanes - +/- +glucanes - +/- +
ergostérol + + +
culture + + +
PCR-D-HPLC + + +
Campagne sur site dans 30 logements
Nombre de logements échantillonnés : 16+ 3 prévus ou en cours + 3 prévus ou en cours
Protocole d’échantillonnagetirage aléatoire de la position des capteurs
J0 J1 J8
A B C A B CA B CPAS CIP10 CIP10
A B CCIP10 IOM
COVm ergostérolGlucanesCulturedénombrement + identificationPCR-D-HPLC
CIP10
Ergostérol mycotoxines
ufc ou pg/m3 ng/m3
analyse quantitative sur 24 h
culture / glucanes / ergostéroln=16
400
500
600
700
800
900
1000
6
8
10
12
14
CIP10 culture ufc/m3
IOM glucanes pg/m3
CIP10 ergostérol
ufc ou pg/m ng/m
0
100
200
300
400
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
2
4
CIP10 ergostérol ng/m3
LQ ergostérol
analyse quantitative sur 24 h
culture / glucanes / ergostéroln=11
ufc ou pg/m3ng/m3
300
400
500
600
3
4
5
6
CIP10 culture ufc/m3
IOM glucanes pg/m3
petites spores
0
100
200
0 1 3 5 7 8 9 10 11 12 13
0
1
2
pg/m3
CIP10 ergostérol ng/m3
grosses spores
analyse qualitative n=16
250
Autres
Ulocladium
Trichoderma
Stachybotris
Rhizopus sto lonifer
Penicillium
fréquence
résu
lta
ts e
n c
ou
rs
100
150
200 Penicillium chrysogenum
M ucor
Geotrichum
Fusarium
Eurotium
Cladosporium
Cladosporium sphaerospermum
Cladosporium cladosporio ides
Cladosporium herbarum
Chaetomium
Botrytis
Aureobasidium pullulans
résu
lta
ts e
n c
ou
rs
résu
lta
ts e
n c
ou
rs
0
50
PRC-D-HPLC CIP10 contact
Aureobasidium pullulans
Aspergillus
Aspergillus terreus
Aspergillus versico lo r
Aspergillus ochraceus
Aspergillus niger
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus
Alternaria
Acremonium
résu
lta
ts e
n c
ou
rs
Indice COVm
détection d’une
N° EMMI Indice
COVm
Humidité
visible dans détection d’une
croissance fongique
active
COVm visible dans
le logement
2 + oui
3 - non
4 + oui
7 + oui7 + oui
8 + oui
9 + oui
11 - non
12 - ouidiscordance indice / humidité
concordance indice / humidité
Mycotoxines
N° EMMI Stérigmatocystine Ochratoxine A DéoxynivalénolN° EMMI Stérigmatocystine Ochratoxine A Déoxynivalénol
2
non détectée non détectée non détectée
3
4
5
66
7
8
Conclusions
Définition d’un protocole de prélèvement et d’analyse pour les différentes cibles fongiques choisies pour les différentes cibles fongiques choisies
Difficulté de recrutement– logements insalubres, petits, sur-occupés, enfants en bas âge…
L’analyse des données (n=30)– quantitative : recherche de corrélations entre les résultats de – quantitative : recherche de corrélations entre les résultats de
dénombrements par culture, de concentrations d’ergostérol et de glucanes,
– qualitative à l’aide de test de concordance kappa et X2 de Mac Nemarpour les espèces fongiques communes (identification par culture, PCR-
D-HPLC)
ValorisationCongrès
– Microbaéro 2009ETUDE DE L’EFFICACITÉ DE DIFFÉRENTS BIOCOLLECTEURS APRÈS NÉBULISATION D’ASPERGILLUS NIGERETUDE DE L’EFFICACITÉ DE DIFFÉRENTS BIOCOLLECTEURS APRÈS NÉBULISATION D’ASPERGILLUS NIGERDANS UNE SALLE À AMBIANCE CONTRÔLÉE
– Indoor Air 2011Measurement Of Indoor Mould Exposure: Development Of A Global Approach Associating Quantitative And Qualitative Tools From A Long Duration Air Sampling
2 publications prévues– Applied and Environmental Microbiology– Indoor Air– Indoor Air
1 publication sous presse
Nieguitisla A, Goldenberg O, Deville M, Arné P, Benoît-Valiergue H, Chermette R, Latouche-Cottenot S, Pissard S, Guillot J. 2010. Molecular monitoring of fungal communities in air samples by denaturing high performance liquid chromatography (D-HPLC). Journal of Applied Microbiology