EMMIEMMI

Mesure de l’Exposition aux

Moisissures en Milieu Intérieurapproche qualitative et quantitative

à partir d’un prélèvement d’air de longue durée

Valérie Bex

Laboratoire d’Hygiène de la Ville de Paris

Equipe 1 Responsabilité scientifique

Laboratoire d’Hygiène de la Ville ParisValérie Bex, Sophie Barral, Corinne Lebrun, Christina Vernant, Vincent Doucet, Sylvie Dubrou, Dr Fabien Squinazi

Equipe 2Unité Mixte de Recherche BIPAR « Biologie Moléculaire et Immunologie Unité Mixte de Recherche BIPAR « Biologie Moléculaire et Immunologie Parasitaires et Fongiques » ANSES-ENVA-UPEC

Jacques Guillot, Manjula Deville, Adélaide NieguitsilaBenoit Durand : Epidémiologie, ANSES

Equipe 3Centre Scientifique et Technique du Bâtiment

Stéphane Moularat

Collaboration Collaboration Efficacité biologique des capteurs individuels

Ecole Normale Supérieure de LyonVance Bergeron

Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, EA 3520, faculté de Médecine Xavier Bichat, université Denis Diderot, Paris

Firas Choukri, F. Derouin

Objectif - OriginalitéProposer un outil pour la mesure de l’exposition aux moisissures dans l’air intérieur

- Mettre au point les différentes approches analytiques

-Tester 3 dispositifs portables permettant des prélèvements d’air de longue durée : 24 heures

- Mettre en oeuvre la méthodologie dans 30 environnements intérieurs moisis pour obtenir une description exhaustive de l’aérosol fongique

biomasse fongique

analyse quantitative

- dénombrement des spores fongiques revivifiables

- ergostérolfongique

biomasse fongique

quantitative

analyse qualitative COVm

mycotoxines

- ergostérol- (1→3)-b-D-glucanes

identification fongique - par culture- par PCR-D-HPLC

indice de contamination fongique

Stérigmatocystine, Ochratoxine, Trichothécènes

.. de différents constituants de la spore

une description de l’aérosol fongique

par l’analyse…

.. de différents constituants de la sporeIdentification de l’ADN fongiques ENVA Dosage de l’ergostérol membranaire

LHVP/CSTB

Dosage des (1→3)-b-D-glucanes de la paroiLHVP

Présence de COVm ciblesPrésence de COVm ciblesMycotoxinesCSTBDénombrement et

identification des sporesfongiquesLHVP

. . des spores

.. de certains

métabolites

Intérêt du sujet et résultats attendus

Rechercher des corrélations entre les différents Rechercher des corrélations entre les différents indicateurs fongiques mesurés

Associer différentes approches analytiques

Proposer un outil de mesure de l’exposition aux moisissures pour les études épidémiologiques Proposer un outil de mesure de l’exposition aux moisissures pour les études épidémiologiques permettant d’obtenir à la fois une information

– quantitative sur la biomasse fongique

– qualitative sur les moisissures présentes (effets sur la santé / espèces fongiques)

Etape IEtape I

Mise au point des

techniques analytiquestechniques analytiques

Méthodes analytiquesMéthodes quantitatives

Cible Méthode

analytique

Limite de

quantification

Laboratoire

analytique quantification

Spores

revivifiables

culture

Milieu MEA

10 UFC/mLsoit 6,25 UFC/m3

pour un volume d’air de 14,4 m3

LHVP

(1,3)-beta-

D-glucanes

Kit Glucatell : dosage LAL (facteur G)

3,125 pg/mLsoit 5,43 pg/m3

pour un volume d’air de 2,88 m3

LHVP

(mise au point pour EMMI)

50 µg/L LHVP + ENVA

Ergostérol

24h

Extraction liquide-

liquide + dosage par

HPLC

soit 1,7 ng/m3

pour un volume d’air de 14,4 m3

Validation d’une LQ à 30 µg/L (soit 1,0 ng/m3) en cours

(mise au point pour EMMI)

Ergostérol

7j

Extraction liquide-

liquide + dosage par

HPLC

50 µg/L

Soit 0,50 ng/m3

pour un volume d’air de 100,8 m3

CSTB

Méthodes analytiquesMéthodes qualitatives

Cible Méthode

analytique

Identification Laboratoire

Spores Culture Identification des colonies selon des critères

LHVPSpores

revivifiables

Culture

milieu MEA

Identification des colonies selon des critères morphologiques/microscopiques

LHVP

Génomes

fongiques

PCR-D-HPLC +

séquençage

Par comparaison des séquences d’ADN obtenues à des séquences publiées dans des banques de données

ENVA

COVm Brevet d’invention déposé

COVm cibles :spécifiques des moisissures, de leur métabolisme, de leur activité de biodégradation

CSTB

COVm déposébiodégradation

Construction d’un indice : incrémentation en fonction de la présence ou de l’absence des COVm cibles

Mycotoxines HPLC

Stérigmatocystine : cytotoxique par inhalationOchratoxine A : immunotoxique par inhalationDéoxynivalénol : famille des trichothécènes

CSTB

Etape IIEtape II

Choix des capteurs

portablesgénération d’un aérosol fongique en pièce expérimentalegénération d’un aérosol fongique en pièce expérimentale

Les capteurs individuelsCIP10 IOM C37

10 L/min 2 L/min 1 L/minmousse en polyuréthanne filtre en polycarbonate filtre en polycarbonateen rotation à 7000 tr/min 0,4 µm 0,4 µm

- portables

- autonomes sur 24 heures

- recueil de la fraction inhalable (efficacité physique connue Kenny et al., 1997)

bio-collecteur de référence, Andersen 6 étages analyse granulométrique

La pièce expérimentale

volume 75 m3

- important réservoir fongique

- comparaison simultanée de plusieurs appareils- comparaison simultanée de plusieurs appareils

décontamination - ventilation,

- plasma froid,

- filtration

hermétique - conditions d’ambiance fixes

20°C, 25%, 800 Pa

- absence de flux d’air

= ambiance maîtrisée

essais en condition de répétabilité

- filtration- absence de flux d’air

Conditions expérimentales

Choix de la souche, Aspergillus niger ATCC 16 404Aspergillus niger ATCC 16 404

- agent biologique du groupe 1- identifiée dans l’habitat «moisi»- conidies rugueuses : 3 à 4,5(5) µm, faciles à

aérosoliser

NébulisationCollisson®Collisson®

- 2 bars, eau ppi - tween 80 à 0,002%- quantitatif, reproductible- capacité importante de dispersion- largement utilisé

Déroulement d’un essaicompteur de particules

ventilation et

t0 t5 t55 t60 min

CIP10 - IOM - C37 60min600 L 120 L 60 L

retrait des bio-collecteurs

installation des bio-collecteurs

A

ventilation etdécontamination de la pièce

A

aérosolA. Niger5 min

A2min

57 L

A = andersen 1 ou 6 étages

A2min

57 L

Comptage des particules

100000

t0 t60

1000

10000

Partic

le C

ounts

(#/m

3)

0,3 à 0,5 µm

0,5 à 1 µm

1 à 5 µm

> 5 µm

conidies A. niger3 à 5 µm

10

100

0 20 40 60 80 100

Time (min)

Partic

le C

ounts

(#/m

3)

100

Répartition des particules

aérosolisées selon leur tailleAndersen 6 étages

n = 21

40

60

80

quantité relative %

n = 21

> 9,2 5,5 à 9,2 3,3 à 5,5 2 à 3,3 1 à 2 <1

0

20

étage 1 étage 2 étage 3 étage 4 étage 5 étage 6

quantité relative %

diamètre aérodynamique µm

10000

E = CT / CR x 100

CIP10 68% ± 25

IOM 17% ± 23

Efficacité des capteurs portables / Andersen

n = 11 essais

10

100

1000

ufc/m3

CIP10

IOM

C37

Andersen

IOM 17% ± 23

C37 21% ± 27

1

10

05/05/2009 - E2

05/05/2009 - E3

16/06/2009 - E1

16/06/2009 - E2

16/06/2009 - E3

22/03/2010- E1

22/03/2010- E2

22/03/2010- E3

29/03/2010- E1

29/03/2010- E2

29/03/2010- E3

Choix des capteurs

compatibilité/méthodes d’analyseCIP10 C37 IOM

efficacité biologique +++ + +efficacité biologique +++ + +

fiable +++ - +

silencieux +++ + +

équipé d’un compteur - + +

facilité d’élution - + +

glucanes - +/- +glucanes - +/- +

ergostérol + + +

culture + + +

PCR-D-HPLC + + +

Etape IIIEtape III

Etude sur sites

Campagne sur site dans 30 logements

Nombre de logements échantillonnés : 16+ 3 prévus ou en cours + 3 prévus ou en cours

Protocole d’échantillonnagetirage aléatoire de la position des capteurs

J0 J1 J8

A B C A B CA B CPAS CIP10 CIP10

A B CCIP10 IOM

COVm ergostérolGlucanesCulturedénombrement + identificationPCR-D-HPLC

CIP10

Ergostérol mycotoxines

EMMI 12

EMMI 13

EMMI 16

ufc ou pg/m3 ng/m3

analyse quantitative sur 24 h

culture / glucanes / ergostéroln=16

400

500

600

700

800

900

1000

6

8

10

12

14

CIP10 culture ufc/m3

IOM glucanes pg/m3

CIP10 ergostérol

ufc ou pg/m ng/m

0

100

200

300

400

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

0

2

4

CIP10 ergostérol ng/m3

LQ ergostérol

analyse quantitative sur 24 h

culture / glucanes / ergostéroln=11

ufc ou pg/m3ng/m3

300

400

500

600

3

4

5

6

CIP10 culture ufc/m3

IOM glucanes pg/m3

petites spores

0

100

200

0 1 3 5 7 8 9 10 11 12 13

0

1

2

pg/m3

CIP10 ergostérol ng/m3

grosses spores

analyse qualitative n=16

250

Autres

Ulocladium

Trichoderma

Stachybotris

Rhizopus sto lonifer

Penicillium

fréquence

résu

lta

ts e

n c

ou

rs

100

150

200 Penicillium chrysogenum

M ucor

Geotrichum

Fusarium

Eurotium

Cladosporium

Cladosporium sphaerospermum

Cladosporium cladosporio ides

Cladosporium herbarum

Chaetomium

Botrytis

Aureobasidium pullulans

résu

lta

ts e

n c

ou

rs

résu

lta

ts e

n c

ou

rs

0

50

PRC-D-HPLC CIP10 contact

Aureobasidium pullulans

Aspergillus

Aspergillus terreus

Aspergillus versico lo r

Aspergillus ochraceus

Aspergillus niger

Aspergillus flavus

Aspergillus fumigatus

Alternaria

Acremonium

résu

lta

ts e

n c

ou

rs

Indice COVm

détection d’une

N° EMMI Indice

COVm

Humidité

visible dans détection d’une

croissance fongique

active

COVm visible dans

le logement

2 + oui

3 - non

4 + oui

7 + oui7 + oui

8 + oui

9 + oui

11 - non

12 - ouidiscordance indice / humidité

concordance indice / humidité

Mycotoxines

N° EMMI Stérigmatocystine Ochratoxine A DéoxynivalénolN° EMMI Stérigmatocystine Ochratoxine A Déoxynivalénol

2

non détectée non détectée non détectée

3

4

5

66

7

8

Conclusions

Définition d’un protocole de prélèvement et d’analyse pour les différentes cibles fongiques choisies pour les différentes cibles fongiques choisies

Difficulté de recrutement– logements insalubres, petits, sur-occupés, enfants en bas âge…

L’analyse des données (n=30)– quantitative : recherche de corrélations entre les résultats de – quantitative : recherche de corrélations entre les résultats de

dénombrements par culture, de concentrations d’ergostérol et de glucanes,

– qualitative à l’aide de test de concordance kappa et X2 de Mac Nemarpour les espèces fongiques communes (identification par culture, PCR-

D-HPLC)

ValorisationCongrès

– Microbaéro 2009ETUDE DE L’EFFICACITÉ DE DIFFÉRENTS BIOCOLLECTEURS APRÈS NÉBULISATION D’ASPERGILLUS NIGERETUDE DE L’EFFICACITÉ DE DIFFÉRENTS BIOCOLLECTEURS APRÈS NÉBULISATION D’ASPERGILLUS NIGERDANS UNE SALLE À AMBIANCE CONTRÔLÉE

– Indoor Air 2011Measurement Of Indoor Mould Exposure: Development Of A Global Approach Associating Quantitative And Qualitative Tools From A Long Duration Air Sampling

2 publications prévues– Applied and Environmental Microbiology– Indoor Air– Indoor Air

1 publication sous presse

Nieguitisla A, Goldenberg O, Deville M, Arné P, Benoît-Valiergue H, Chermette R, Latouche-Cottenot S, Pissard S, Guillot J. 2010. Molecular monitoring of fungal communities in air samples by denaturing high performance liquid chromatography (D-HPLC). Journal of Applied Microbiology