LES PROTEINES
SEQUENÇAGE DES PROTEINES
Détermination de la structure d'un peptide
• La détermination de la structure primaire d'un peptide est conduite en deux étapes :
1) détermination de la composition en aminoacides
2) détermination de l'ordre des enchaînements des résidus
Ces deux étapes ont comme point commun l'hydrolyse
de la liaison peptidique.
Hydrolyse de la liaison peptidique
• La liaison peptidique est très stable, son hydrolyse
spontanée est quasiment nulle.
Hydrolyse chimique complète
Hydrolyse chimique spécifique
Hydrolyse enzymatique
Détermination de la composition en Acides Aminés
Hydrolyse chimique complète
• HCl 6M à 100°c pendant au moins 24heures: rupture des
liaisons peptidiques aboutissant à un hydrolysat.
hydrolyse Acide totale
• l'aminoacide acide tryptophane est entièrement détruit, et les
amides (Asn, Gln) sont hydrolysées en ammoniac et acides
correspondants (Asp, Glu).
Hydrolyse alcaline par chauffage.
Destruction de tous les acides aminés sauf le TRP.
Détermination de la composition en Acides Aminés
Analyse du mélange obtenu par chromatographie sur une
résine échangeuse d’ions ( Qualitative et Quantitative) .
détermination de l'ordre des enchaînements
des résidus
Identification des aminoacides terminaux
N terminaux
Méthode de Sanger (FDNB)
La présence de lysine dans le peptide va perturber cette méthode
puisque la chaîne latérale de ce résidu porte un groupe -NH2 qui
réagira avec le FDNB.
Le NDFB forme, avec la fonction N terminale, un dérivé( peptide
dinitrophénylé) avec libération d'acide fluorhydrique.
L'hydrolyse de la protéine libère ensuite les AcA dont l’AcA N
terminal sous forme de α dinitrophenyl aminoacide de couleur
jaune :
qui peut être identifié par chromatographie ou électrophorèse, et dosé par spectrophotométrie à 360nm.
détermination de l'ordre des enchaînements
des résidus
Identification des aminoacides terminaux
N terminaux
Méthode de dansylation (chlorure de dansyl )
• La présence de lysine dans le peptide va perturber cette
méthode puisque la chaîne latérale de ce résidu porte un
groupe -NH2 qui réagira avec le DNS-Cl.
Le chlorure de 1-diméthyl-amino-naphtalène-5-sulfonyle
(DANS) réagit avec le NH2 terminal et donne un dérivé
(dansyl-amino-acide) décelable par sa fluorescence jaune.
La réaction est 100 fois plus sensible: composé sulfonamide
très fluorescent permettant une plus grande sensibilité dans
la détection.
Utilisée pour doser les acides aminés par HPLC.
détermination de l'ordre des enchaînements
des résidus
Identification des aminoacides terminaux
N terminaux
Méthode enzymatique (Exopeptidases /Aminopeptidases)
L'enzyme n'hydrolyse que la première liaison peptidique.
Cinétique de libération : Ordre de l’enchainement.
Méthode non précise: affinité enzyme-substrat:
Ex : Leucine aminopeptidase hydrolyse les liaisons N.t de
tous les AcA sauf Proline.
détermination de l'ordre des enchaînements
des résidus
Identification des aminoacides terminaux
C terminaux
Méthode enzymatique (Carboxy-peptidasepeptidases)
L'enzyme n'hydrolyse que la derniére liaison peptidique.
Carboxy-peptidase A ( la plus utilisée): extraite du pancréas :
attaque les liaisons Ct sauf celle du glycocolle et AcA basique .
Carboxy-peptidase B : extraite du pancréas : attaque les liaisons
Ct des AcA basiques .
détermination de l'ordre des enchaînements
des résidus
Identification des aminoacides terminaux
C terminaux
Méthode chimique (Hydrazinolyse)
Un traitement à l'hydrazine(H2N-NH2) à 100°C hydrolyse toutes
les liaisons peptidiques, et libère des hydrazides de tous les AA
sauf le C terminal, qui se présente comme un AA libre normal.
Il est alors facile à isoler et à identifier.
Nécessite moins d’une micromole de peptide mais ne permet de
déterminer qu’un seul résidu Ct .
la dégradation récurrente d'Edman
• formation d'un PTC-peptide à pH 9. Par un changement de pH
(légèrement acide), il y a cyclisation et libération d'un dérivé
PTH-aminoacide et d'un peptide amputé de son aminoacide
N-terminal.
• En répétant ces cycles : action du PTC à pH 9 pour donner un
PTC-peptide puis libération du PTH-aminoacide par passage à
un pH acide, et du peptide (n-1) amputé du côté N-terminal, on
a, à chaque cycle, la libération de l'aminoacide suivant dans la
séquence du peptide original. L’AcA peut être isolé et identifié
par chromatographie.
• Des appareils (séquenceur) sont capables d'effecteur ces
cycles automatiquement. Toutefois l'analyse est
techniquement limitée à de séquences dont le nombre
d'aminoacides est inférieur à 60.
Hydrolyse chimique spécifique
• - le bromure de cyanogène (BrCN) hydrolyse la liaison
peptidique du côté carboxyle de la méthionine .
• - le 2-nitro-5-thiocyanobenzoate (NTCB) hydrolyse la liaison
peptidique du côté amine de la cystéine.
• - Hydroxylamine(NH2OH): coupe entre Asn-Gly.
• - N-Bromosuccinimide: hydrolyse la liaison peptidique du côté
carboxyle de la Tyrosine et Tryptophane.
détermination de l'ordre des enchaînements
des résidus Dégradation des peptides en fragments
Hydrolyse enzymatique : endo-peptidases
• L'enzyme hydrolyse des liaisons peptidiques internes entre
deux aminoacides i, (i+1).
• Il peut être spécifique du résidu en position i ou (i+1).
• L'hydrolyse d'un peptide par une endopeptidase donnera
plusieurs fragments peptidiques : si on a m coupures (m
liaisons peptidiques hydrolysées), le peptide sera dégradé en (m+1) fragments peptidiques.
détermination de l'ordre des enchaînements
des résidus Dégradation des peptides en fragments
Exemples d’endo-peptidases
Enzyme Coté N-t Coté C-t Particularité
Trypsine Lys et Arg Sauf si Pro en N-t
Chymotrypsine Tyr, Try et Phe
Protéase stapylo Asp et Glu
Pepsine Tyr, Try et Phe
clostriparine Arg
Thermolysine Leu, Ile et Val
Séquençage des Protéines ayant Plusieurs
Chaines Polypeptidiques
• - Agents dénaturants : Urée ou le chlorhydrate de guanidine .
Deux chaines ou plus
Chaines liées par des ponts disulfures
Réduction par le B-mercapto-éthanol
Oxydation par l’acide performique : transforme la Cystéine et la cystine en acide Cystéique.
HO-COOH
Acide performique
SO3H
Deux Acides cystéique
2[ HS-CH2-CH2OH ]
S-CH2-CH2OH
S-CH2-CH2OH
B-mercapto-éthanol
Deux cystéine
Technique d’électrophorèse diagonale
• Utilisée pour déterminer la position des liaisons disulfures.
• Clivage spécifique de la protéines : les disulfures restent intactes.
• Electrophorèse puis exposition aux vapeurs d’acide performique qui clive les disulfures et les convertis en résidus d’acide cystéique.
• 2ème électrophorèse perpendiculaire .
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
Ele
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1ère direction avant exposition à l’acide performique
techniques récentes
spectrométrie de masse
Technique du DNA recombinant
La séquence des quatre types de base du DNA (A, T, G, C)
révèle directement la séquence des AcA de la protéine
codée par le gène ou la molécule de RNA messager
correspondante
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