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III. Substrats sonde pour l’étude des mécanismes
enzymatiquesCP450 (suite)
CP450, mécanisme
Mécanisme concerté vs. 2 étapes
Pas de transposition allylique et rétention de configuration >90%
D
D
D
D
HO
D
D
OH
D
H
Mécanisme concerté
Mécanisme concerté vs. 2 étapes
Mécanisme concerté vs. 2 étapes
+
Horloges radicalaires
H OH
HO
concerté
2 étapes
FeV O
FeIV OH
FeIV OH FeI I I
FeI I I
k
kOH
Horloges radicalaires
Pas de transposition
Pas de transposition
Nitroxyl radical coupling
K. U Ingold
Barton’s PTOC
N S
O
R
O
PhSH (PhSeH)Bu3SnH N SH
O
R
O
R- CO2
RH
Calibration
OO
tBu
O
O NO
N
O Nk k
O-CO2, -
hν
k1
k-1
U R
U' R'
d[R’]/dt = k1[U’] - k-1[R’] - k[R’][P]
0 = k1[U’] - k-1[R’] - k[R’][P]
k1[U’] - k-1[R’] = k[R’][P]
k1[U’]/k[R’][P] - k-1[R’]/k[R’][P] = 1
k1[U’]/k[R’][P] = 1
k1 = k[R’][P]/[U’]
k1 = k[R][P]/[U]
Calibration
k k
k1
k-1O
ON
S-CO2
PhSH
2 1O9 s-1
CP450, mécanisme radicalaire?
d[U’]/dt = k[1] - kreb.[U’] - kR[U’]
d[R’]/dt = kR[U’] - kreb.[R’] = 0 ; [U]/[R] = [U’]/[R’]
kreb. = kR[U’]/[R’] = kR[U]/[R] = 2 109 x 7/1 = 1.4 1010 s-1
OFeV O
HH FeIV OH
FeIV OH
FeII I H
FeII IO
H
R
kreb.
kreb.
kR
k
U'
R'
1 U
U/R = 7
Horloges radicalaires
Les rapides Les très rapides
Horloges radicalaires
1.4 1010<kOH< 7 1012
Pourquoi cet écart?
1) Mécanisme mal modélisé
2) Calibration des horloges pas présise
3) Effet stérique et effet de la protéine sur le réarraangement
kOH = 1013 s-1
Il faut remettre les pendules à l’heure
1.4 1010<kOH< 7 1012
Les horloges ne donnent
pas la bonne heure!!!!!
1-2 1013 s-1 > à la vitesse de décomposition d’un état de transition
Trop rapide pour l’existence d’un intermédiaire
Et M. Newcomb propose un mécanisme avec un C+
A la recherche d’une horloge à C+
A la recherche d’une horloge à C+
A la recherche d’une horloge à C+
Mécanisme avec un ion carbénium?
1 à 3%
M. Newcomb persiste et signe
Si radical temps de demie vie de 1.7 10-13 s (trop court pour un intermédiaire)
Si radical rapport B/C plus grand
Conclusion :
mécanisme avec insertion directe de « OH » avec réaction secondaire
0.6%
Nouveau mécanisme
Effet isotopique kH/kD
Effet isotopique kH/kD
D OH
HO
FeV O FeIV OH
FeIV OH FeI I I
FeI I I
kOH
OHHO
D
1
2
CP450, deux oxydants possibles
CP450, deux oxydants possibles
Insertion de « O »
Hydroxylation
Insertion de « OH »
Responsable de la
formation
des produits transposés
CP450, deux oxydants possibles
Insertion de « O »
Hydroxylation
Insertion de « OH »
Responsable de la
formation
des produits transposés
Epoxydation des oléfines
PhMe
H
H
PhMe
H
HO
PhH
H
Me
PhH
H
MeO
PhH
HMe
FeI I I
OO
H
Substrat-suicide
Vérification des hypothèses
appel à la biologie moléculaireMutant thréonine Alanine (T303A)
Hydroxylation vs. epoxydation
FeV=O FeIIIOOH
Vitesse de réactions nmole/min/nmole de P450
P450
P450
T303A
Hydroxylation vs. epoxydation
FeV=O FeIIIOOH
Vitesse de réactions nmole/min/nmole de P450
P450
P450
T303A
Et avec les horloges?
Hydroxylation
Hydroxylation
Hydroxylation des aromatiques,
NIH shift
Hydroxylation des aromatiques,NIH shift
Et avec les horloges?
Hydroxylation
Hydroxylation
Hydroxylation
Rapport R/U élevéRapport R/U faible
Effet isotopique kH/kD
M. Newcomb, le retour
Pas de radical!!!!!!!
Comment Shaik arrive à réconcilier
tout le monde
Shaik serait-il normand?
Low Spin vs. High Spin
•
•
HS LS
Calculs DFT
Low Spin vs. High Spin
CP450, mécanisme radicalaire?
kreb. = kR[U’]/[R’] = kR[U]/[R] = 2 109 x [U]/[R]
OFeV O
HH FeIV OH
FeIV OH
FeII I H
FeII IO
H
R
kreb.
kreb.
kR
k
U'
R'
1 U
U/R = 7
inhibition par fixation covalentesur l'enzyme fuite
Oxydation des amines
Oxydation des amines
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