Immunoprécipitation Travaux Pratiques Partie I. 1.1 Préparation de la solution d'Anticorps...

Immunoprécipitation

Travaux Pratiques Partie I

1.1 Préparation de la solution d'Anticorps étudiée

La solution mère AB contient 7,5 mg IgG/mL (Volume total: 1mL)• Prélever 100 µL de solution d'anticorps mère contenue dans le tube jaune (AB) et le mettre dans le tube rouge (AB étudiée).

• Prélever ensuite 900µL de la solution de NaCl et l'introduire dans le tube rouge (AB étudiée).

• Mélanger la solution AB étudiée en aspirant et réfoulant la solution plusieurs fois.

Arrétez-vous à la première butée de la pipette, Autrement des bulles d'air pourraient se former!

1. Préparation de l'expérience

1.2 Dilution de la solution d'antigène étudiée

• Prélever 40µL provenant du tube violet (AG) et le mettre dans le tube bleu.

• Prélever ensuite 960µL de solution de NaCl et le mettre dans le tube bleu (AG étudiée).

• Mélanger la solution d'AG étudiée en aspirant et refoulant, la solution plusieurs fois.

1. Préparation de l'expérience

2.1 Mettre dans chaque cupule ( 1 à 7 ) 100µL de solution de NaCl.

2.2 Prélever 200µL de solution d'AG étudiée contenue dans le tube bleu et l'introduire dans la cupule 8.

8 7 6 5 4 3 2 1

200 µLAG

2. Préparation de la série de dilutions

2.3 Prélever 100µL de la solution d'AG de la cupule 8 et la mettre dans la cupule 7.

2.4 Mélanger le contenu de la cupule 7 en aspirant et refoulant la solution plusieurs fois.

Arréter-vous à la première butée de la pipette autrement des bulles d'air pourraient se former.

8 7 6 5 4 3 2 1

200 µLAG

2. Préparation de la série de dilutions

2.5 Prélever 100µL provenant de la cupule 7 et la mettre dans la cupule 6.

2.6 Mélanger le contenu de la cupule 6 en aspirant et refoulant plusieurs fois. Procéder de la même façon jusqu'à la cupule 1.

2.7 Enlever 100µL de la cupule 1.100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL

8 7 6 5 4 3 2 1

Enlever

100µL

2. Préparation de la série de dilutions

2.8 Mettre dans chaque cupule 100µL d‘AB étudiée provenant du tube rouge.

2.9 Incuber 5 minutes à température ambiante.

2. Préparation de la série de dilutions

Quelle est maintenant la concentration d'antigène dans chaque cupule ?

Analyse des Anticorps

Travaux Pratiques Partie II

Préparer les tubes selon le mode opératoire suivant.

1. Préparation des tubes pour la PAGE

1.1 Prélever 25µL de tampon Lämmli dans le tube vert (LÄ) à verser dans chaque tube (1 à 9).

1.2 Introduire 15µL d'H2O dans les tubes 1, 2, 4, 5, 7 et 8, puis 5µL d'H2O dans les tubes 3, 6 et 9.

1.3 Mélanger le contenu de la cupule 4 en aspirant et refoulant plusieurs fois. Introduire 10µL de précipité de la cupule 4 dans les tubes 1, 2 et 3.

1.4 Prélever 10µL de solution d'anticorps du tube rouge (AB étudiée) à mettre dans les tubes 4, 5 et 6.

1. Préparation des échantillons pour la PAGE

1.4 Prélever 10µL du tube bleu (AG) à mettre dans les tubes 7, 8 et 9.

1.5 Prélever 10µL de Dithiotreitol du tube jaune (DTT) à mettre dans les tubes 3, 6 et 9.

1. Préparation des tubes pour la PAGE

1.6 Mettre les tubes 2, 3, 5, 6, 8 et 9 pendant 5 minutes à 95° C sur plaque chauffante.

Tube Heat DTT

AB/AG

1 - -

2 + -

3 + +

AB

4 - -

5 + -

6 + +

7 - -

8 + -

9 + +

1. Préparation des tubes pour la PAGE

2. Préparation des cassettes de gel

2.1 Couper l'emballage du gel PAGE en coupant le long de la ligne noire et prendre la cassette.

2.2 Couper avec un scalpel la bande de la cassette le long le la ligne marquée et enlever la bande du bas.

2. Préparation de l'expérience

3.1 Mettre la plaque de gel avec la plus petite plaque de verre vers l‘intérieur dans le support

d‘électrode.

3.2 Placer le compartiment intérieur dans la structure d‘attache et fermer les attaches.

3.3 Mettre la structure d‘attache avec le compartiment intérieur dans la cuve de tampon.

3. Préparation de la cuve d‘électrophorèse

4.1 Remplir l‘électrode verticale avec le tampon TGS jusqu‘au bord.

4.2 Remplir la cuve tampon avec 800mL de tampon TGS.

4.3 Retirer le peigne.

4. Remplissage de la chambre avec du tampon.

Remplir les puits de gel :

- 20 µL à partir du tube (1)- 20 µL à partir du tube (2)- 20 µL à partir du tube (3)- 5 µL de marqueurs protéique Kaleidoscope(KS) - 20 µL à partir du tube (4)

- 20 µL à partir du tube (5)- 20 µL à partir du tube (6)- 20 µL à partir du tube (7)- 20 µL à partir du tube (8)- 20 µL à partir du tube (9)

AB AGAB/AG KS

5. Remplissage des puits de gel

6.1 Fermer la cuve et commencer l‘électrophorèse à 150 V.

6.2 Arrêter l‘électrophorèse quand le colorant atteint l‘extrémité la plus basse du gel.

6. Exécution de l‘électrophorèse

7.1 Retirer la structure d‘attache et remettre le tampon dans le récipient du tampon. (Le tampon est à

nouveau réutilisable!).

7.2 Retirer les plaques de gel.

7. Démoulage du gel

8.1 Ouvrir les plaques de verre et mettre le gel dans le bac à coloration.

8.2 Avant la coloration du gel le plonger dans l 'eau pendant 2 minutes puis le retirer.

8.3 Le colorer en ajoutant 100 mL de Bleu de Coomassie pendant 30 minutes au maximum.

8.4 Remettre le Bleu de Coomassie dans la bouteille de stockage et ajouter 100 mL d'eau tiède.

8.5 Mettre le gel dans l'agitateur.

8. Coloration des protéine

Tableau: Masses moléculaires des marqueurs protéiques Kaléidoscope

9.1 Tracer la droite d'étalonnage à l'aide des marqueurs protéiques Kaléidoscope.

Protein Color M

Myosine Bleu 201090 Da

ß-galactosidase Magenta 133730 Da

Albumine bovine Vert 83559 Da

Anhydrase carbonique Violet 39559 Da

Inhibiteur trypsique de graine de soja Orange 31405 Da

Lysozyme Rouge 17408 Da

Aprotinin Bleu 7081 Da

9. Analyse

9.2 Déterminer la masse moléculaire des bandes de chaque ligne.

Quelle bande appartient à quelle protéine?

9. Analyse