Laboratoire Expert BVD - DS2 - Travaux en cours et ... · Diagnostic virologique du BVD sur la...

Laboratoire Expert BVD

- DS2 -

Travaux en cours et Perspectives

Journée nationale de la référence professionnelle

4 novembre 2016

Aurore TEILLET – Aude ALLEMANDOU

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Avec le soutien

financier de la

Sommaire

I. Performances des tests sérologiques p80

a) sérums individuels

b) mélange de sérums

II. Evaluation des kits PCR sur la matrice Biopsie Auriculaire

III. EILA

IV. Perspectives

2

Performances des tests

sérologiques p80

3

Performances des kits sérologiques – sérums individuels

Caractérisation de 553 sérums de l’échantillothèque avec tous les kits / protocoles

en sérologie p80

8 résultats par échantillons

3 catégories d’échantillons :

Echantillons Positifs avec un ou

plusieurs protocole(s) et Négatifs

avec un ou plusieurs protocole(s)

Résultats SN : 18 Positifs et 24 Négatifs

Positifs avec

tous les kits

275

Négatifs avec

tous les kits

236

Répartition des 553 sérums caractérisés

Quelle est la Sensibilité / Spécificité des différents kits ?

42

4

Performances des kits sérologiques – sérums individuels

Objectif :

Comparaison des kits afin d’évaluer la sensibilité et la spécificité

diagnostique

Kits évalués :

• 5 kits dont 3 proposant 2 protocoles.

Comparaison de 8 protocoles

Choix de la méthode statistique: • Absence de technique de référence : pas d’hypothèse de départ où l’on donne

les VP et VN

• Echantillonnage de petite taille

Construction d’un statut théorique des échantillons selon la

convergence des tests

5

Performances des kits sérologiques – sérums individuels

Kit A court A long B C court C long D E court E long

Sensibilité 92,60% 98,10% 95,90% 98,60% 96% 97,80% 99,70% 99,60%

Spécificité 99,70% 99,60% 98,20% 99,60% 99,60% 98,30% 98,70% 97,90%

Les kits C et E en protocole court sont les kits combinant les meilleures sensibilité

et spécificité

Poursuite

caractérisation avec

ces 2 kits

Choix du kit C pour

accréditation ELISA

en 2017

Sensibilité et spécificité des tests vis-à-vis du statut anticorps p80

Résultats :

Forte concordance des kits en analyse individuelle

6

Etude de séroprévalence – mélange de sérums

Interrogations du gestionnaire

Quelle est la valeur d’une analyse sérologique de mélange en BVD?

Peut-on envisager d’effectuer le suivi sérologique d’un troupeau allaitant en

définissant comme pour les cheptels laitiers des classes de séroprévalence?

N = 90

Protocole Sélection de 3 kits p80 de 3 producteurs de

réactifs proposant un protocole en

mélange

Mélanges à partir d’animaux de

l’échantillothèque avec un statut Ac p80

Positif ( ) ou Négatif ( )

7

Etude de séroprévalence – mélange de sérums

Test de mélanges composés de 5, 10, 15 et 20 animaux avec +/-20%

d’animaux séropositifs

Résultats différents selon le kit utilisé

Kit A : résultats variables selon les

mélanges testés

Kits C et E : Résultat Positif si ≥ 20 %

de séropositifs et variable si < 20 %

Résultats Mélanges ≥ 20% de séropositifs

KIT A KIT C KIT E

5 animaux N ou P P P

10 animaux N ou P P P

15 animaux N ou P P P

20 animaux N ou P P P

KIT A KIT C KIT E

5 animaux - - -

10 animaux N ou P P P

15 animaux N ou P N ou P P

20 animaux N ou P N ou P N ou P

Résultats Mélanges < 20% de séropositifs

0%

20%

40%

60%

80%

100%

KIT A KIT C KIT E

% de mélanges Positifs (38 mélanges)

5%

76%

97%

8

Etude de séroprévalence – mélange de sérums

Analyse en loi dose effet de 38 sérums

No

mb

re d

’éc

ha

nti

llo

ns

Détectabilité des kits variable

Réponse immunitaire individuelle variable

Les résultats observés sont-ils liés à une variabilité de la réponse

immunitaire individuelle ?

Seuil de coupure

0

2

4

6

8

10

12

14

pur 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 ≥ 1/128

KIT A

KIT C

KIT E

9

0

20

40

60

80

100

Etude de séroprévalence – mélange de sérums

3 situations terrains à l’échelle du troupeau

Situation intermédiaire Cheptel majoritairement

négatif

Cheptel majoritairement

positif

Zone de

positivité

Elevage 1

Elevage 2

Elevage 3

Seuil

Résultats de caractérisation de 20-25 sérums d’animaux issus de 3 cheptels avec le kit C

%DO

3 cheptels différents : si mélange aléatoire = risque de résultat non représentatif

10

Etude de séroprévalence – mélange de sérums

Approche binaire Mise en place du suivi sur un groupe d’animaux « sentinelles »

Choix d’un groupe de

5 à 20 animaux dans

la jeune génération

Animaux naïfs vis-à-vis

du BVD « Sentinelles »

Alternatives possibles pour repérer une circulation virale :

Approche par classes de séroprévalence (équivalent cheptels laitiers)

Kits à adapter ? Diluer les mélanges de sérums avant analyse ? …

A explorer

Freins / Difficultés : complexe car situations régionales et conduites

d’élevage variables

Conclusion : Variabilité entre les kits et des réponses immunitaires

Alerte = Mélange Positif

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Evaluation kits PCR sur la matrice

Biopsie Auriculaire

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Evaluation kits PCR sur la matrice Biopsie Auriculaire

Diagnostic virologique du BVD sur la matrice Biopsie auriculaire (BA)

• Cahier des charges PCR Rédaction selon les critères de performance / Normes U47-600-2 et U47-311

CC disponible pour les producteurs de réactifs sur demande au LE-BVD

Même démarche pour l’ELISA (en cours de finalisation)

• Bilan évaluation de kits PCR Biopsie auriculaire 2016

Nombre de kits PCR : 4

Nombre de méthodes d’extraction : 10 dont 1 non satisfaisante non

commercialisée

Matrices : BA individuelle et mélange (10)

MR disponibles à ce jour : NED BA + Panel de 9 BA pour dilution du NED

13

EILA

14

EILA

Campagne 2017 : lancement début Janvier

Année 2014 2015 2016 2017

Matrice BA Sérum et lait Sang total

Méthode ELISA Ag PCR

ELISA Ac

ELISA Ag PCR

Nombre de participants

22 en ELISA 43 en PCR

75 en sérum 19 en lait

15-20 en ELISA 70-80 en PCR

100% satisfaisants

100% satisfaisants

15

Perspectives de travail pour 2017

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Echantillothèque

● Complétion et renouvellement:

– 45% des objectifs atteints

– Evaluation des besoins et des demandes pour 2017

● Caractérisation :

– 2016 : sérums (Kits ELISA Ac)

– 2017 : laits

● Kits ELISA Anticorps

● Kits de PCR Virus et Antigène

Meilleure connaissance Evaluation des caractéristiques des kits

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Projet détectabilité d’un IPI laitier

Etat des lieux:

● Kits PCR avec taille de mélange proposée variable

● Augmentation des tailles de cheptels

● Diverses méthodes d’extraction

Problématique:

Lait de tank = X laits individuels

18

Projet détectabilité d’un IPI laitier

Questions posées: ● Quel niveau de dilution?

● A quelle taille de cheptel?

● Peut-on optimiser cette détection?

Correspondance dilution/taille élevage

Nombe

d’animaux

2 10 50 100 200 1000

Production

IPI ( L)

5 5 5 5 5 5

Production

élevage ( L)

40 320 1720 3470 6970 34970

Taux dilution 1/8 1/63 1/344 1/693 1/1393 1/6993

Dilutions

testées

1/10 1/100 1/1000 1/10000

19

IPI:

– 4 animaux : génotypes 1b et 1e

4 Elevages:

–Négatif = Ag et Ac Négatif

–Positif Ac (+ vaccination)

–Positif Ac > 30%

–Positif Ac 10%< séroprévalence

cheptel < 30%

Provenance des animaux sélectionnés

20

Détectabilité des IPIs laitiers: protocole

Schéma expérimental:

Pool de laits

Lait d’IPI

2 méthodes d’extraction + PCR

-Niveau de détection limite -Correspondance taille de cheptel

-Répétabilité des méthodes d’extraction -Optimisation de la méthode

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Autres axes de développement & recherche

1. Avec les outils existants:

1. Poursuite des mélanges de sérum

● Optimiser les méthodes

● Nouvelles études

Réponse objectifs de gestion

2. Détectabilité des IPI

● Sérum vs Sang Total (PCR et ELISA Ag IPI)

● Augmentation des mélanges / différentes matrices

– Laits, sérums, BA

Finalité : Mieux répondre aux objectifs des GDS

● Identifier des méthodes préférentielles / objectifs de gestion

● Harmoniser les méthodes

● Simplifier le diagnostic de la BVD

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Autres axes de développement & recherche

2. Nouveaux outils différentiels (BVD / autres Pestivirus)

1. Test direct : RT-PCRq

● Cible différente des tests commerciaux

● Différenciation des virus BVD, BD, Hobi et Chamois

● Typage rapide

2. Test indirect : ELISA- Ac

– Différenciation des Ac contre BVD et autres Pestivirus

– Etude bibliographique : faisabilité d’un ELISA Ac?

– Différenciation BVD et autres Pestivirus

Finalité : épidémiologie après éradication de la BVD

origine de la circulation virale

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Merci de votre attention

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