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Laboratoire Expert BVD
- DS2 -
Travaux en cours et Perspectives
Journée nationale de la référence professionnelle
4 novembre 2016
Aurore TEILLET – Aude ALLEMANDOU
1
Avec le soutien
financier de la
Sommaire
I. Performances des tests sérologiques p80
a) sérums individuels
b) mélange de sérums
II. Evaluation des kits PCR sur la matrice Biopsie Auriculaire
III. EILA
IV. Perspectives
2
Performances des tests
sérologiques p80
3
Performances des kits sérologiques – sérums individuels
Caractérisation de 553 sérums de l’échantillothèque avec tous les kits / protocoles
en sérologie p80
8 résultats par échantillons
3 catégories d’échantillons :
Echantillons Positifs avec un ou
plusieurs protocole(s) et Négatifs
avec un ou plusieurs protocole(s)
Résultats SN : 18 Positifs et 24 Négatifs
Positifs avec
tous les kits
275
Négatifs avec
tous les kits
236
Répartition des 553 sérums caractérisés
Quelle est la Sensibilité / Spécificité des différents kits ?
42
4
Performances des kits sérologiques – sérums individuels
Objectif :
Comparaison des kits afin d’évaluer la sensibilité et la spécificité
diagnostique
Kits évalués :
• 5 kits dont 3 proposant 2 protocoles.
Comparaison de 8 protocoles
Choix de la méthode statistique: • Absence de technique de référence : pas d’hypothèse de départ où l’on donne
les VP et VN
• Echantillonnage de petite taille
Construction d’un statut théorique des échantillons selon la
convergence des tests
5
Performances des kits sérologiques – sérums individuels
Kit A court A long B C court C long D E court E long
Sensibilité 92,60% 98,10% 95,90% 98,60% 96% 97,80% 99,70% 99,60%
Spécificité 99,70% 99,60% 98,20% 99,60% 99,60% 98,30% 98,70% 97,90%
Les kits C et E en protocole court sont les kits combinant les meilleures sensibilité
et spécificité
Poursuite
caractérisation avec
ces 2 kits
Choix du kit C pour
accréditation ELISA
en 2017
Sensibilité et spécificité des tests vis-à-vis du statut anticorps p80
Résultats :
Forte concordance des kits en analyse individuelle
6
Etude de séroprévalence – mélange de sérums
Interrogations du gestionnaire
Quelle est la valeur d’une analyse sérologique de mélange en BVD?
Peut-on envisager d’effectuer le suivi sérologique d’un troupeau allaitant en
définissant comme pour les cheptels laitiers des classes de séroprévalence?
N = 90
Protocole Sélection de 3 kits p80 de 3 producteurs de
réactifs proposant un protocole en
mélange
Mélanges à partir d’animaux de
l’échantillothèque avec un statut Ac p80
Positif ( ) ou Négatif ( )
7
Etude de séroprévalence – mélange de sérums
Test de mélanges composés de 5, 10, 15 et 20 animaux avec +/-20%
d’animaux séropositifs
Résultats différents selon le kit utilisé
Kit A : résultats variables selon les
mélanges testés
Kits C et E : Résultat Positif si ≥ 20 %
de séropositifs et variable si < 20 %
Résultats Mélanges ≥ 20% de séropositifs
KIT A KIT C KIT E
5 animaux N ou P P P
10 animaux N ou P P P
15 animaux N ou P P P
20 animaux N ou P P P
KIT A KIT C KIT E
5 animaux - - -
10 animaux N ou P P P
15 animaux N ou P N ou P P
20 animaux N ou P N ou P N ou P
Résultats Mélanges < 20% de séropositifs
0%
20%
40%
60%
80%
100%
KIT A KIT C KIT E
% de mélanges Positifs (38 mélanges)
5%
76%
97%
8
Etude de séroprévalence – mélange de sérums
Analyse en loi dose effet de 38 sérums
No
mb
re d
’éc
ha
nti
llo
ns
Détectabilité des kits variable
Réponse immunitaire individuelle variable
Les résultats observés sont-ils liés à une variabilité de la réponse
immunitaire individuelle ?
Seuil de coupure
0
2
4
6
8
10
12
14
pur 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 ≥ 1/128
KIT A
KIT C
KIT E
9
0
20
40
60
80
100
Etude de séroprévalence – mélange de sérums
3 situations terrains à l’échelle du troupeau
Situation intermédiaire Cheptel majoritairement
négatif
Cheptel majoritairement
positif
Zone de
positivité
Elevage 1
Elevage 2
Elevage 3
Seuil
Résultats de caractérisation de 20-25 sérums d’animaux issus de 3 cheptels avec le kit C
%DO
3 cheptels différents : si mélange aléatoire = risque de résultat non représentatif
10
Etude de séroprévalence – mélange de sérums
Approche binaire Mise en place du suivi sur un groupe d’animaux « sentinelles »
Choix d’un groupe de
5 à 20 animaux dans
la jeune génération
Animaux naïfs vis-à-vis
du BVD « Sentinelles »
Alternatives possibles pour repérer une circulation virale :
Approche par classes de séroprévalence (équivalent cheptels laitiers)
Kits à adapter ? Diluer les mélanges de sérums avant analyse ? …
A explorer
Freins / Difficultés : complexe car situations régionales et conduites
d’élevage variables
Conclusion : Variabilité entre les kits et des réponses immunitaires
Alerte = Mélange Positif
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Evaluation kits PCR sur la matrice
Biopsie Auriculaire
12
Evaluation kits PCR sur la matrice Biopsie Auriculaire
Diagnostic virologique du BVD sur la matrice Biopsie auriculaire (BA)
• Cahier des charges PCR Rédaction selon les critères de performance / Normes U47-600-2 et U47-311
CC disponible pour les producteurs de réactifs sur demande au LE-BVD
Même démarche pour l’ELISA (en cours de finalisation)
• Bilan évaluation de kits PCR Biopsie auriculaire 2016
Nombre de kits PCR : 4
Nombre de méthodes d’extraction : 10 dont 1 non satisfaisante non
commercialisée
Matrices : BA individuelle et mélange (10)
MR disponibles à ce jour : NED BA + Panel de 9 BA pour dilution du NED
13
EILA
14
EILA
Campagne 2017 : lancement début Janvier
Année 2014 2015 2016 2017
Matrice BA Sérum et lait Sang total
Méthode ELISA Ag PCR
ELISA Ac
ELISA Ag PCR
Nombre de participants
22 en ELISA 43 en PCR
75 en sérum 19 en lait
15-20 en ELISA 70-80 en PCR
100% satisfaisants
100% satisfaisants
15
Perspectives de travail pour 2017
16
Echantillothèque
● Complétion et renouvellement:
– 45% des objectifs atteints
– Evaluation des besoins et des demandes pour 2017
● Caractérisation :
– 2016 : sérums (Kits ELISA Ac)
– 2017 : laits
● Kits ELISA Anticorps
● Kits de PCR Virus et Antigène
Meilleure connaissance Evaluation des caractéristiques des kits
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Projet détectabilité d’un IPI laitier
Etat des lieux:
● Kits PCR avec taille de mélange proposée variable
● Augmentation des tailles de cheptels
● Diverses méthodes d’extraction
Problématique:
Lait de tank = X laits individuels
18
Projet détectabilité d’un IPI laitier
Questions posées: ● Quel niveau de dilution?
● A quelle taille de cheptel?
● Peut-on optimiser cette détection?
Correspondance dilution/taille élevage
Nombe
d’animaux
2 10 50 100 200 1000
Production
IPI ( L)
5 5 5 5 5 5
Production
élevage ( L)
40 320 1720 3470 6970 34970
Taux dilution 1/8 1/63 1/344 1/693 1/1393 1/6993
Dilutions
testées
1/10 1/100 1/1000 1/10000
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IPI:
– 4 animaux : génotypes 1b et 1e
4 Elevages:
–Négatif = Ag et Ac Négatif
–Positif Ac (+ vaccination)
–Positif Ac > 30%
–Positif Ac 10%< séroprévalence
cheptel < 30%
Provenance des animaux sélectionnés
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Détectabilité des IPIs laitiers: protocole
Schéma expérimental:
Pool de laits
Lait d’IPI
2 méthodes d’extraction + PCR
-Niveau de détection limite -Correspondance taille de cheptel
-Répétabilité des méthodes d’extraction -Optimisation de la méthode
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Autres axes de développement & recherche
1. Avec les outils existants:
1. Poursuite des mélanges de sérum
● Optimiser les méthodes
● Nouvelles études
Réponse objectifs de gestion
2. Détectabilité des IPI
● Sérum vs Sang Total (PCR et ELISA Ag IPI)
● Augmentation des mélanges / différentes matrices
– Laits, sérums, BA
Finalité : Mieux répondre aux objectifs des GDS
● Identifier des méthodes préférentielles / objectifs de gestion
● Harmoniser les méthodes
● Simplifier le diagnostic de la BVD
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Autres axes de développement & recherche
2. Nouveaux outils différentiels (BVD / autres Pestivirus)
1. Test direct : RT-PCRq
● Cible différente des tests commerciaux
● Différenciation des virus BVD, BD, Hobi et Chamois
● Typage rapide
2. Test indirect : ELISA- Ac
– Différenciation des Ac contre BVD et autres Pestivirus
– Etude bibliographique : faisabilité d’un ELISA Ac?
– Différenciation BVD et autres Pestivirus
Finalité : épidémiologie après éradication de la BVD
origine de la circulation virale
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Merci de votre attention
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