« Actualités ( commentées…) du Diagnostic Virologique »

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Patrice Morand

Laboratoire de Virologie

Faculté de Médecine-CHU Grenoble

DU Antibiologie Grenoble 2007

- Y a t-il du nouveau en Sérologie ?

- Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire?

-Les difficultés d’interprétation de la charge virale

- Intérêts et limites du séquençage moléculaire

L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac ) dans le dépistage des primo-infections à VIH et à VHC ?

Y Y YY

Y

Y

Ag Ac

SérumPatient

YY

Y YY EEE

Y a t-il du nouveau en Sérologie (1) ?

- 5 000 primo-infection / an / France ? .

- 50 % symptomatiques.

-Intérêt du dépistage des primo-infection.

.pour l’individu infecté :traitement de la primo-infection symptomatique ?30%- 50% des infections découvertes au stade SIDA

.pour ses partenaires :transmission très fréquentes à partir de patients en primo-infection

L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac ) dans le dépistage des primo-infections à VIH

joursJ 0

Ac

ARN

Ag P24

Fenêtre sérologiques

Fenêtres virologiques

ARN

11-12

14-15

20-21

28-29

Ag p24

Sérologie 3° G (Ac)

Test sérologiques combinés (Ac +Ag)Raccourcissement de la fenêtre sérologique


- Nouveaux Test combinés Ag- Ac ( les plus récents) :

- gain moyen en jours /test Ac lors d’une séroconversion = 5 jours

- sensibilité détection Ag variable mais se rapprochant de parfois des test Ag P24 (5 à 20 pg/ml )

- quelques cas de résultats douteux avec 3 génération +

Suspicion de PI VIH avec 4e génération négatif ou douteux : toujours faire Ag P24 ou ARN

Kwon JA J Virol Method 2005Ly TD J Virol Method 2004


Sérologie combinée Ag + Ac dans l’infection VHC

Laperche S , Transfusion 2005

- Alternative au DGV dans pays en développement ?

- Panels de séroconversions VHC .délai moyen apparition

Ac = 66 jours Ag- Ac délai moyen = 40 joursARN = 35 jours

. Spécificité test Ag-AC 99.8%

5 jours (0-24)

- transfusion sur les 2.5 millions de dons en France2 cas de contamination prévenus par DGV 1 cas de contamination prévenu par Ag-Ac

- suivi hémodalysé ?- suivi sujet à risque de primo-infection (épidémie chez homosexuel VIH +)

- Intérêt en France ? :

Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de typeHSV1- HSV2 dans l’herpes génital ?


- Séroprévalence HSV2 :

. USA: + 30 % dans la population générale (1980-1990)

. France étude herpimax : HSV2 +: 17.9% femmes 13.5 % hommes

. 100 patients HSV2.20 « diagnostiqués ».60 symptomatiqués et non diagnostiqués . 20 asymptomatique

. La majorité des transmission HSV2 à partir d’une excrétion asymptomatique

- des herpes génitaux HSV1 dans les pays occidentaux :. 30% - 50% des premiers épisodes?

Malkin JE, 2002

Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ?

herpes génital (HSV2) et VIH:

- Patient HSV2 + VIH-

Augmentation X2 du risque d’être contaminé par HIV

- Patient HSV2+VIH+

Probable augmentation du risque de transmettre VIH

herpes génital et herpes néonataux- USA Seattle 1 in 3,200

- Netherlands National 1 in 35,000


HSV1 et HSV2 85 % identité en aa

Glycoprotéinetrès semblables :

ex : gD Tests non spécifiques


glycoprotéines très différentes

ex / gG1 et gG2 Tests spécifiques de types

Sensibilité HSV2 80 à 98% (délai de séroconver. 20-60 jours)Spécificité HSV2 95 %

Wald A, Clin Infect Dis 2002Aslley -Morrow R, Sex Transm Dis 2003

Doctor test Anticorps HSV2 :

POCkit HSV2

HSV-1 HSV-2 1 +2Non

typable

01

02

03

04

05

06

07

08

IgG cont.

gDgG2

gG1

gB1 pep

IgG cont.

Sérologies spécifiques de types : l ’immunoblot

gG2

. Intérêts épidémiologiques : oui

.IVS va lancer une nouvelleenquête de séroprévalence HSV 2

. Intérêts individuels : très discuté

Couple avec un partenaire porteur de l’herpes génital ? Femme enceinte ? Sujet à multipartenariat sexuel (CDAG)….problème du HSV1 génital et de la méconnaissance de l’herpes génital dans le milieu médical


Les sérologies pour dater l’infection VIH :

Test spécifiques pour diagnostiquer une infection < 6 mois sang sur buvard et quantification des Ac anti enveloppe (V3,gp41)

Sensibilité 88% Spécificité 98%

Ex Mars –Septembre 2003 :

Découvertes séro + % d’infections récentes < 6mois

Homosexuel masc.

Héterosex

111

156

58 %

32 %

Lot F, Eurosurveillance 2004Barin F, J Clin Microbiol 2005


Les sérologies pour dater l’infection : Avidité des IgG :

.L’avidité des IgG pour l’antigène augmente avec le temps : une avidité élevée est en faveur d’une infection ancienne

. Infection à CMV chez la femme enceinte :

CMV: 1ere cause d ’infection congénitale (0,4 à 2,3%) en France

Femme Enceinte Sero + : 50 %

Fréquence

transmission

fœtus sympto

Mortalité

Réactivation Primo-infec

10-30 % 1- 4%

0.2- 2 % 35- 50%

excep 10 %

excep 10 %

Femme Enceinte Sero - : 50 %

chez la femme enceinte face à des IgM anti-CMV avec ou sans signe clinique de primo-infection :

avidité < 20% primo-infection ds les deux mois précédent

> 70 % infection datant de plus de 3 mois

. à ne pas mettre entre toute les mains

. à utiliser avec les autres stratégies pour dater l’infection

. sérums antérieurs

. culture ou PCR dans les urines

. Si doute Liquide amniotique

Les sérologies pour dater l’infection : Avidité des IgG :

Evolution des anticorps anti-CMV avec le temps :

IgG

IgM

IgG

IgM

IgG

IgM

Persistance prolongée des IgM

IgM

Réactivation

Avidité des IgG

Groupe 1Suspicion d’infections

respiratoires bassesn= 117

Groupe 2Absence d’infection

n= 31

Sub-groupe 1Transplantés pulmonaires

n= 31

148 LBA (2001-2002) (chez 111 adultes dont 78 % immunodéprimé ,113 LBA sous ATB )

Garbino J, Am J Respi Crit Care Med, 2004

Sub-groupe 2Transplantés pulmonaires

n= 26

4 types de Cultures cellulaires

11 RT PCRs Qualitatives

Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire?

Exemple 1 : infection respiratoires basses :

Garbino J,2004

Groupe 1 n= 117

34 virus respiratoires (29%)

Groupe 2 n= 31

2 virus respiratoires (7%)

P<0.01

- PCR positive 3 fois plus souvent que la culture ( p< 0.001)

- 45 % des infections virales : printemps- été

- Mortalité à J 30 ds groupe 1 :

-Virus + = 10%-Virus - = 14%

P=0.49

- Virus le plus fréquent dans le LBA : rhinovirus > VRS


Garbino J 2004

CMV 4

Co- infect. bact/fung 5 (16%) versus 6 (23%)

CMV 4

pas de métapneumovirus ni de coronavirus

Sub Groupe 1Transplantés :

17 /31 = 55%


1/26= 4%

P <0.001

Rhinovirus 9RSV 4Influenza A /B 2Parainfluenza 1Adenovirus 1

Rhinovirus 1

Virus présent uniquement au moment des symptômes



17 /31 = 55%


1/26= 4%

P <0.001

Garbino J 2004

Pas de différence de survie à J30 selon la présence ou non de virus dans le LBA

LBA virus + = 89 % LBA virus - = 100 %


Van Kraaij M, Clin Infect, Dis 2005

- 72 greffés médullaires adultes ( 75 % allogreffe) (Oct. 99-Avril 2001)

. prélèvement nasal et gorge systématique J0 S3 S8 S16 S26

. prélèvement si suspicion infection respiratoire :- nez-gorge si infection haute - LBA si besoin dans infection basse

. Culture et PCR

. 41 infections respiratoires hautes et 11 infections basses (9LBA)

. Inf. hautes : 25 PCR + (61%) vs 10 Culture + ( 24%) ( p< .0001)

. Inf. basses : 8 PCR + (73%) vs 1 culture + ( 9%) ( p= .008)


- Virologie moléculaire et infections respiratoires basses :

-3 fois plus de prélèvements positifs pour les Virus respiratoires

-mise en évidence de nouveaux virus

. métapneumo, coronaV, boccaV. (. Ou de virus respiratoires haut dans les LBA)

-Rôle en terme de mortalité et morbidité pas toujours évident

-Peu d’antiviraux


PCR HSV 2

Cult. Pos

Neg

Pos Neg

157

104 68

Exemple 2 : l’herpes génital tout venant:334 prélèvements de patients (HSV2 séro+) avec lésions

suspectes d’herpes génital :

Ryncarz AJ, J Clin Microbiol 1999

5

Cult. + : 10 4 copies (101 à 10 6 ) Cult. - : 10 1 copies (101 à 10 4 )


Cone RW, JAMA 1994

-Exemple 2 : l’herpes génital femme enceinte

. 100 femmes enceintes asymtomatique à l ’accouchement:

. 0 culture positive (littérature 0.05 à 2.3%)

. 9 PCR positives

. Aucun herpès néonatal

. 2 femmes asympto. avec culture négative et herpès néonatal . 2 PCR + (avec une CV élevée)

Que faire devant une culture- PCR+ ?


Cas clinique

Femme enceinte sur le point d ’accoucher dans une clinique privée :

- Lésions grande lèvre droite. Premier épisode

- Antigène : + avec neutralisation douteuse: faux + ?

- PCR le même jour : HSV +

Césarienne

Culture positive le lendemain HSV2

- BLIPs : épisodes transitoires de 50 < CV< 1000 copies/ml chez des patientscompliants :

.Fréquence ? 30 % lors d’un suivi tous les 3mois ?

. Pas prédictif d’un échec virologique

. n’entraînent pas l’apparition de mutants résistants ?

Nettles Re, JAMA 2005Sungkanuparph S, Clin Infect Dis 2005Macias J, J Infect , 2005

-Virémie persistantes > 400 -10000

. apparition résistances

. évolution clinique à terme

Les difficultés de l’interprétation des charges virales

Exemple 1 : les charges virales faibles chez le VIH

208 patients ARN VHC – par technique conventionnelle (50 UI/mL)à la fin du Tt Peg IFN +Riba

26 ARN +

22 rechutes(96%)

26 rechutes(14%) P<0.0001

Gerotto J hepatol 2006

TMA (10UI/mL)

182 ARN -


Exemple 2 Charge virale VHC en fin de traitement :

Exemple 3 :

valeur prédictive de la Charge virale EBV pour la prise en charge des syndrome lymphoprolifératifs post transplantation SLPT


Slifkin M, Drugs 2004

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

PBMC SERUM PBMC SERUM SERUM PBMC

healthy IM NPC PTLD (n=32) (n=17) (n=10) (n=5)

EB

V c

opie

s /µ

g D

NA

or

/mL

ser

um

(lo

g10)

37 % 0 % 100 % 80 % 80 % 100 %

Brengel-Pesce, J Med virol 2002

Valeur prédictives des charges virales EBV dans les SLPT ?

Brengel Pesce J Med Virol, 2002

07/99 09/99 11/99 01/00 03/00 05/00

EBV load (copies/µg ADN)

16,00014,00012,00010,0008,0006,0004,0002,000

localized PTLD

tonsillectomy

systemic PTLD

anti-CD20


Etude

Gärtner et al (2002)

Méthode

Quantitative PCR(copies/µg ADN)

Sensibilité

87%

Spécificité

91%

Cut-off

10 000

Grenoble PCR en temps réel :

CV élevée > 10 000 copies / mlCV tres élevée > 100 000 copies/mlVariation significative 1log


- intérêt d’une cinétique hebdomadaire les 3 premiers mois pour les greffes à haut risque ( R-/D+, IS+++) : Augmentation rapide de la charge virale = prédictive

- possibilité de charge virale élevée sans maladie seulement 50 % des CV élevé font un SLPT ?(Wagner Blood 2004). Charge virale haute : à interpréter avec précaution en tenant compte des autres facteurs de risque de SLPT

- possibilité de charge virale faible dans maladie localisée

- possibilité d’absence de rémission malgré évolution favorable de la cv ?

- intérêt de la mesure des CTL anti EBV ?


Exemple 3 la MEH Plutôt oui :

.16 patients - réaugmentation chez un patients traité décès- >100 copies / ml mauvais pronostic ?

Domingues, J Clin Microbiol 1998

. 27 enfants avec réponse au TT- 7 rechutes - 2 / 7 réapparition secondaire de l ’ADN HSV

Ito; Clin Infect Dis 2000

Plutôt non :

- 26 patients MEH (98 LCR)- diminution CV sous traitement- pas de corrélation avec gravité

Revello , Clin Diagn Virol 1997


Exemple 4 : Faut-il mesurer autres choses en plus des charges virales

. VIH et ADN Proviral

.322 patients de la cohorte Séroco suivi 8 ans (1988-1996)

.dans les 6 mois qui suivent la séroconversion, l’ADN est plus prédictif de la progression de la maladie que l’ARN ou les CD4.ensuite ( 6-24mois) facteur prédictif indépendant de ARN ou CD4

Rouzioux C, J Infect Ds 2005

. ARN Messager du cycle lytique et herpes virus ?

. + Prédictif d’une maladie virale ?


Intérêts et limites des génotypages viraux

Intérêts et limites des génotypages viraux « pré thérapeutiques »

En routine

Genotypage VHC

Genotypage Papilloma

Intérêt pour les autres virus ?

Génotypage VHB

Soustypage VIH

Intérêts et limites des génotypages des résistances par séquençage moléculaire

Exemple Génotypage VIH

-intérêt certains en cas d’échec virologique et dans les primo-infecet probable en début de traitement

- interprétation spécialisée

- les questions en suspend :

. sensibilité suffisante du séquençage ?

. différences d’interprétation selon les algorithmes

. intérêt de l’association avec critères pharmacologiques

. corrélation phénotype –génotype

Conclusions :

La sérologie a un avenir :

indispensable en épidémiologieintéressante dans des cas individuels difficile à condition d’avoir des bons sérologistes

La biologie moléculaire va remplacer la culture virale (et la détection d’Ag) en routine

garder un petit nombre de centre de référence pour collectionnerles souches

l’ amélioration de la sensiblité pose des pb d’interprétations médicale

les VPP pour les maladies à Herpes virus chez le transplantés sontdifficile à établir

le génotypage des résistances nécessite une expertise

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