Master 1 «Physiopathologie cellulaire et moléculaire ......

Mécanismes moléculaires de la résistancede Plasmodium falciparum aux antipaludiques

Master 1 « Physiopathologie cellulaire et moléculaire »Unité d’enseignement de microbiologie médicale

Denis Filisetti

Laboratoire de Parasitologie des Hôpitaux Universitaires de Strasbourg

Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire du CNRS

1er avril 2011

Faculté

de médecine

Plan du cours

• Enjeux de la question (paludisme)

• Généralités sur les résistances aux traitements

– chloroquine, sulfadoxine, pyriméthamine

• P. falciparum et résistance à la chloroquine

– mécanismes d’action de la chloroquine– mécanismes d’action de la chloroquine

– gène PfMDR1 (pompe à efflux)

– gène PfCRT (canal / transporteur chloroquine)

• P. falciparum et résistance à la pyriméthamine

– métabolisme des bases pyrimidiques

– gène DHFR

– régulation traduction ARNm DHFR

Objectifs pédagogiques

Être capable d’expliquer :

• la résistance de P. falciparum à la chloroquine

• la résistance de P. falciparum à la pyriméthamine

Enjeux de la question

• Le paludisme

– Une des maladies les plus fréquentes :

• 250 000 000 cas de paludisme par an ;

• 1 000 000 de décès par an :• 1 000 000 de décès par an :– 95 % = enfants africains < 5 ans

– Femmes enceintes

– Co-infectés VIH/SIDA

• Distribution géographique du paludisme

• Le paludisme

– Transmis (Anopheles)

– Plasmodium

• falciparum• falciparum

• vivax, ovale, malariae, (knowlesi)

• parasite protozoaire (embranchement apicomplexa)

Embranchement des apicomplexa

mérozoïte

Mérozoïte

Pénétration dans le globule rouge

Vacuole parasitophore

Mérozoïte

Globule rouge

Aspect des globules rouges infectés

• Le paludisme

– Fièvre, anémie (toutes les espèces)

– Atteinte grave d’organes (P. falciparum)

Hématie normale Hématie infectéeSphérique protrusions

• Le paludisme

– Fièvre, anémie (toutes les espèces)

– Atteinte grave d’organes (P. falciparum)

• neuropaludisme• neuropaludisme

• Traitement du paludisme à P. falciparum

– Chloroquine (CQ) (NIVAQUINE) : 1946

Généralités résistance

Résistance à la chloroquine chez P. falciparum

Résistance CQ détectée

• Résistances de P. falciparum :

– classification par rapport à CQ :

• classement des pays (1-2-3)

• recommandations de traitement (curatif / préventif)• recommandations de traitement (curatif / préventif)

– Sufladoxine – pyriméthamine (SP)

Résistance à la pyriméthamine chez P. falciparum

Résistance SP détectée

– Sufladoxine – pyriméthamine (SP)

– Artémisinine combinée– Artémisinine combinée

Pourquoi étudier et connaitre les mécanismes des résistances ?

• pour détecter plus rapidement la résistance sur le terrain,

• pour améliorer les antipaludiques existants,

• pour aider au développement de nouveaux antipaludiques.

Résistance à la chloroquine

chez Plasmodium falciparum

Hémoglobine

Résistance chloroquine P. falciparum

Globule rouge = environnement hostile pour Plasmodium

Plasmodium falciparum

(Vacuole parasitophore)

(Vacuole digestive)

« The Big Gulp »

ProtéasesAcides Aminés

Acides Aminés

Hémoglobine

Hématine

Oxydation

Vacuole digestive

Globine

(Protoporphyrine Fe+++)

Toxique pour Plasmodium

Vacuole digestive

Hématine Hémozoïne

TOXIQUE

NON TOXIQUE

Cristal

insoluble

Vacuole digestive

Hématine Hémozoïne

TOXIQUE

Mécanisme d’action de la chloroquine ?

Vacuole digestive

Hématine HémozoïneChloroquine

Vacuole digestive

Liaison directe ? OUI mais

CQ (1 mM) v. hématine (400 mM)TOXIQUE

Vacuole digestive

TOXIQUE

HDP : Heme Detoxifying Protein

Vacuole digestive

HémozoïneHématine

Adsorption sur

l’hémozoïne ?

– P. falciparum résistant CQ :

– + vérapamil : réversion résistance (sensible)

Hypothèse 1

– Réversion résistance cellules cancéreuses au

vérapamil

– Surexpression d’une glycoprotéine P

– Pompe à efflux « transporteur ABC » (ATP Binding

Hypothèse 1

– Pompe à efflux « transporteur ABC » (ATP Binding

Cassette)

– Pompe à efflux « transporteur ABC »

Hypothèse 1

D. transmembranaire

D. liant l’ATPATP ATP

Cellule cancéreuse résistante

Cellule cancéreuse sensible

Hypothèse 1

ATP ATPAnti mitotique

Anti mitotique

Hypothèse 1

Anti mitotique

Hypothèse 1

ATP ATP

Anti mitotique

– « transporteur ABC » : Pgh1 (paroi vacuole digestive)

– = P. falciparum Multi Drug Resistance (PfMDR1)

Hypothèse 1

P. falciparum sensible CQ

P. falciparum résistant CQ

– « transporteur ABC » Pgh1

• non surexprimé en présence de CQ chez Pf R CQ

• mutations chez Pf R CQ = Pf S CQ (allèles)

Hypothèse 1

• mutations augmentent parfois la [CQ]VD

• taux pompage Pgh1 < diffusion passive CQ

Hypothèse 1

• gène muté PfMDR1 ne confère pas de R à Pf S

• Orientation vers vacuole digestive

Hypothèse 1

Hypothèse 1 rejetée

Le « transporteur ABC » Pgh1 codé par le gène

PfMDR1 n’est pas le facteur de résistance de P.

falciparum à la CQ

Hypothèse 1

falciparum à la CQ

– Régions génétiquement différentes (PfSCQ/PfRCQ)

Hypothèse 2

– Croisement gamète male et femelle (PfSCQ/PfRCQ)

– Sélection des PfRCQ en ajoutant CQ

– Etude de liaisons génétiques (marqueurs

polymorphiques)

Hypothèse 2

polymorphiques)

– Localisation d’une région de 36 Kb différente entre

PfSCQ et PfRCQ sur le chromosome 7 :

Hypothèse 2

Gène (protéine 424 AA)

Hypothèse 2

Etude des mutations dans le gène

Hypothèse 2

S CQ (Soudan)

Hypothèse 2

• Mutation K76T chez Pf S CQ :

⇒ devient résistante à la CQ⇒ devient résistante à la CQ

La résistance de P. falciparum à la CQ est due à la

mutation K76T dans le gène

Mutation K76T = résistance CQ

S CQ (Soudan)

D’autres mutation (mineures)

Limites GR

Limites VP

Localisation de la protéine

La protéine est localisée dans la membrane de la VD

Anticorps @ protéine

transmembranaire

Protéine transmembranaire

Cytoplasme P. falciparum

Vacuole digestive

Membrane VDMembrane VD

AA identiques (S/R)

AA différents (R)

Plasmodium falciparum Chloroquine Resistance

Transporter (PfCRT)

Dénomination gène / protéine

– La mutation acidifie la VD

– Favorise le flux de CQ hors de la VD ?

PfCRT et chloroquine

PfCRT K76 PfCRT T76 PfCRT T76

+ vérapamil

– Canal ou transporteur ?

PfCRT et chloroquine

– Parfois résistant à CQ

– Gène homologue à PfCRT : PvCRT

– Pas de mutation dans PvCRT chez Pv R CQ

– PvCRT non responsable de la R à CQ chez P. vivax

Et chez Plasmodium vivax ?

– PvCRT non responsable de la R à CQ chez P. vivax

Résistance à la pyriméthaminechez Plasmodium falciparum

– Utilise les bases puriques de l’être humain (AG)

– Synthèse de novo des bases pyrimidiques (CT)

Résistance pyriméthamine P. falciparum

Synthèse ADN / ARN chez P. falciparum

Synthèse des bases pyrimidiques

H. sapiens / P. falciparum

méthylation

mTHF DHFméthylène tétra hydro folate di hydro folate

H. sapiens

TS Thymidylate synthase

H. sapiens

mTHF DHF

NADPH DHFR

tétra hydro folateTHF

di hydro folate

réductase

Thymidylate synthase

mTHF DHF

P. falciparum

mTHF DHF

Une seule et même enzyme bifonctionnelle

Mécanisme d’action de la pyriméthamine

THFNADPH

P. falciparum

mTHFDHF

La pyriméthamine est un analogue structural du DHF (inhibition compétitive)

DHFR P. falciparum sensible : S108

Résistance à la pyriméthamine

DHFR P. falciparum résistant : N108

AA 108 dans le site actif

WRA P. falciparum SENSIBLE

Site actif DHFR

(analogue PYR)

P. falciparum SENSIBLE

(S108)

Diminution affinité P. falciparum RESISTANT

Site actif DHFR

Diminution affinité

pour WRA (PYR)

(mais pas pour DHF)NADPH

P. falciparum RESISTANT

(N108)N

• Mutation diminue affinité DHFR pour la pyriméthamine

Site actif DHFR

• Mutation diminue affinité DHFR pour la pyriméthamine

• DHF transformé en THF puis mTHF

• La synthèse de dTMP a de nouveau lieu

% de croissance cellulaire

P. falciparum

Fibroblaste humain

DHFR et pyriméthamine

Fibroblaste humain

Concentrations inhibitrices 50 (CI50)

0,1 nM 5 000 nM

WRA inhibe 50 000 fois plus la DHFR de Plasmodium

Concentration WRA

– Affinité PYR pour DHFR Plasmodium > affinité PYR

pour DHFR humaine ?

AA différents (H. sapiens / P. falciparum)

Affinité DHFR Plasmodium > affinité DHFR humaine ?

• Constantes d’inhibition réaction DHF – THT

identiques pour les deux DHFR

Inhibition DHFR Plasmodium > DHFR humaine

n’est pas due à une différence d’affinité

En d’autres termes, la CI50 de la PYR devrait être la même

chez Plasmodium et l’Homme

Introduction du gène de la DHFR humaine dans P. falciparum

% de croissance cellulaire

P. falciparum

Fibroblaste humain

Concentration WR (PYR)

0,1 nM 5 000 nM

Concentrations inhibitrices 50 (CI50)

1000 nM

P. falciparum devient aussi « insensible » à la PYR que des cellules humaines

Fibroblaste humain

P. falciparum + DHFR humaine

traitement WRA traitement WRA

Quantité de DHFR produite

après

Plasmodium humaine Plasmodium humaine

1 2 3 4

La quantité de DHFR humaine est régulée

Elle s’adapte à la présence de PYR

– SANS PYR :

L’ARN messager de la DHFR est fixé sur l’enzyme DHFR (Homme et Plasmodium)

Régulation de la DHFR

(Homme et Plasmodium)

Absence traduction ARNm DHFR (rétro contrôle – )

– SANS PYR :

L’ARN messager de la DHFR est fixé sur l’enzyme DHFR (Homme et Plasmodium)

(Homme et Plasmodium)

ARNm DHFR humaine fixé dans site actif protéine

ARNm DHFR Plasmodium pas fixé dans site actif

Pyriméthamine et DHFR

– AVEC PYR chez l’Homme :

Libération de l’ARNm DHFR humaine

Pyriméthamine et DHFR

– AVEC PYR chez l’Homme :

Traduction ARNm DHFR humaine

Synthèse de DHFR et de dTMP

Quantité DHFR > capacité inhibition de la PYR

– AVEC PYR chez Plasmodium :

L’ARNm de la DHFR n’est pas libéré

La quantité d’enzyme DHFR Plasmodium n’augmente pas

DHFR Pf inhibibée totalement par PYR

Pas de dTMP synthétisé

• Sulfadoxine (DHPS)

• Artémisinine (?)

Autres résistance chez P. falciparum

• Defining the role of PfCRT in Plasmodium falciparum chloroquine

resistance.

Bray, PG, et al. Molecular Microbiology 2005. 56(2):323-33.

• Divergent regulation of dihydrofolate reductase between malaria

parasite and human host.

Bibliographie du cours

parasite and human host.

Zhang, K., et al. Science 2002. 296(5567):545-7.

• When the host is smarter than the parasite.

Goldberg, DE. Science 2002. 296(5567):482-3.

• Organisation Mondiale de la Santé / Paludisme :

http://www.who.int/topics/malaria/fr

• Nations Unies « Faire reculer le paludisme »

http://www.rollbackmalaria.org/

Pour approfondir

http://www.rollbackmalaria.org/

• Fonds Mondial de Lutte contre le Sida, la Tuberculose et le Paludisme

http://www.theglobalfund.org/fr/

Master 1 «Physiopathologie cellulaire et moléculaire ......

Documents

Données actuelles sur la physiopathologie du paludisme à Plasmodium falciparum

65 66 Douleurs Physiopath Trait

Le voyageur fébrile - smurbmpm.frsmurbmpm.fr/.../17-12-2015-infectiologie/ppt/le_voyageur_febrile.pdf · neuropaludisme) J0 J2 J4 J6 « Prise en charge et prévention du paludisme

Sécrétion exocrine du pancréas et sa régulationarihge.fr/WordPress3/wp-content/uploads/2011/11/TOPO-physiopath... · Sels biliaires Lipase Colipase ... Sécrétion acide Acétylcholine

ANEMIES DE L’ENFANT · PHYSIOPATH • Mécanismes des anémies 1. Insuffisance de production des précurseurs érythroîdes • Aplasie médullaire • Erythroblastopenie • Envahissement

Plasmodium falciparum - Institut de recherche pour le

Filter paper collection of Plasmodium falciparum mRNA for

Conf 1 - IOA Physiopath DESC jpb 20 09 18 · 2018-10-09 · Title: Microsoft PowerPoint - Conf 1 - IOA Physiopath DESC jpb 20 09 18.pptx Author: Admin Created Date: 10/9/2018 2:49:28

PHYSIOPATHOLOGIE DE L’ASTHME - التعليم الجامعيuniv.ency-education.com/uploads/1/3/1/0/13102001/pneumo31-physiopath... · 2 Lymphocytes T Régulateurs « Treg « -Capables

Dossier Pedagogique Spe Physiopath Cellul Moleculaire

DCEM1 Paris 7 Paludisme, épidémiologie et …julioone.free.fr/palu epidemio physiopath.pdf · Neuropaludisme : hypothèse de la séquestration • cytoadhérence ischemie cérébrale

Les protéines RESA de Plasmodium falciparum

Invasion érythrocytaire par les mérozoites: rôle de l'antigène EBA-175 de P. falciparum

Performance des tests diagnostiques rapides du paludisme · une cohérence. Les teneurs médianes en P. falciparum-HRP2 et P. falciparum-pLDH étaient légèrement plus faibles pour

Detection des premiers cas de P. falciparum mutant pour pfCRTà Madagascar

Mode de transmission des infections bactériennes ... Physiopath/Microbiologie/Mode de transmission... · Bordetella pertussis Plan 1-historique 2-caractères bactériologiques et

Surveillance de la chimiosensibilité de Plasmodium falciparum

Diversité génétique de Plasmodium falciparum : facteur limitant pour la recherche de vaccin antipaludique

Le cycle de Plasmodium falciparum: aspects genetiques et antigéniques

Etude des effets de Trema orientalis Linn. sur le paludisme simple à plasmodium falciparum