Régulations post-transcriptionnelles de l'expression génétique au cours du développement...

Régulations post-transcriptionnelles de l'expressiongénétique au cours du développement

Luc PaillardCNRS UMR 6061Faculté de médecineUniversité Rennes 1

http://perso.univ-rennes1.fr/luc.paillard/ensgnmt/odonto080307.ppt

IntroductionPlace des régulations post-transcriptionnelles

Fonctions cellulaires

Activité des protéines

Activité "spécifique"(phosphorylations…)

Concentrations

Dégradation

Traduction

TraductibilitéConcentration d'ARNm

Dégradation des ARNm

Synthèse

Transcription Maturation

IntroductionMaturation des ARNm eucaryotes

ADN

ARN prémessagerTranscription

5' Ajout decoiffe (Cap)7mG-PPP-NExcision des introns

Epissage des exons

Exon 1 Exon 2 Exon 3

Intron 2Intron 1

Ajout d’une queue poly(A)à l’extrémité 3’

5'

Introduction Structure des ARNm eucaryotes

AAAA…AAA5' 3'

Coiffe (Cap)7mG-PPP-N

AUG STOP

Région 5'non codante

(5'UTR)

Région 3'non codante

(3'UTR)Phase codanteQueue poly(A)

Après l’épissage des exons!

3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants

1. Epissages différentiels et développement

2. Traduction, stabilité et état d’adénylation

1. Epissages différentiels et développement

Exon 1 Exon 2 Exon 35'

Exon 3’ Exon 4

Exons alternatifs

Situation 1

Situation 2

1. Epissages différentiels et développement

Exon 1 Exon 2 Exon 35'

Exon 3’ Exon 4

Exon 1 Exon 2 Exon 35'

Exon 4

Saut d’exon

Et beaucoup d’autres possibilités…

Situation 1

Situation 2

Situation 1

Situation 2

Exons alternatifs

1. Epissages différentiels et développementL’exemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile

Gène sex-lethal : transcription sous le contrôle de facteurs de transcriptionactiviteurs et inhibiteurs

Activateurs produits par le chromosome XInhibiteurs produits par des autosomes

Femelles XX : activateurs>inhibiteurs Synthèse sxlMale XY activateurs<inhibiteurs Pas de synthèse sxl

(Pas de compensation de dosage…)

1. Epissages différentiels et développementL’exemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile

La protéine sxl contrôle l’épissage alternatif de transformer

Femelle : sxl

sxl

STOP

Protéine tra active

STOP

Male : pas de sxl

Protéine tra tronquée : inactive

1. Epissages différentiels et développementL’exemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile

La protéine tra contrôle l’épissage alternatif de doublesex

Femelle : tra actif

tra

Male : tra inactif

Protéine dsx a un exon en plus chez la femelle que chez le male

Même activité de liaison à l’ADN,mais effets différents sur la transcription

Extrait (œufou embryon)

ARN

Northern blotFraction A-

Fraction A+

Oligo(dT)cellulose

Northern blot

Centrifugation surgradient de saccharose Polysomes

(traduit)

Monosomes(non traduit)

Northern blot

Northern blot

2. Traduction, stabilité et état d’adénylationL’exemple du développement précoce du xénope

Northern blot

1. Electrophorèse des ARN

Gel d'agarose

2. Transfert sur membrane

Membrane de nylon

3. Hybridation avec une sonde radioactivecomplémentaire d'un ARN

Sonde radiomarquéehybridée

4. Autoradiographie

Le film photo estimpressionné

par la radioactivité

Etat d'adénylation et traduction

Paris et Philippe (1990) Dev Biol 140, 221

Corrélation état A+ et traduction, état A- et absence de traduction

Stimulationtraductionnelle

Répressiontraductionnelle

Stable

Traduit Non traduit

Instable en général

Stable chez le xénope jusqu ’à la MBT

Polyadénylation

Désadénylation

AA..AACADRE DE LECTURE5 ’ 3 ’ CADRE DE LECTURE5 ’ 3 ’

Les variations de longueur de la queue poly(A)régulent l'expression génétique

Recherche d'éléments contrôlant lapolyadénylation cytoplasmique (1)

Certains ARNm sont polyadénylés pendant lamaturation ovocytaire

Mais qu’est-ce que la maturation ovocytaire?-Méiose (PI à MII)

- Pas de transcription- Peut être faite in vitro (progestérone)

Recherche d'éléments contrôlant lapolyadénylation cytoplasmique (2)

Alignement des séquences d'ARNmpolyadénylés pendant la

maturation ovocytaire

McGrew et al. (1989) Genes Dev 3, 803

Recherche d'éléments contrôlant lapolyadénylation cytoplasmique (3)

Test de la séquence : principe

A0

A+

t0 t1

A0

A+

t0 t1

ARN polyadénylépendant l'incubation

ARN non polyadénylépendant l'incubation

Injection d'ARN synthétisés in vitro, radiomarqués, contenantou non la séquence à tester

Extraction des ARN après incubation (en présence ou non de Pg)Électrophorèse, autoradiographie

Recherche d'éléments contrôlant lapolyadénylation cytoplasmique (4)

Test de la séquence : Résultats

McGrew et al. (1989) Genes Dev 3, 803

Une séquence non spécifique (AAUAAA)et une séquence spécifique sontnécessaires à la polyadénylation

cytoplasmique

La séquence spécifique a été appeléeCPE (Cytoplasmic Polyadenylation Element)

Régulation de la polyadénylationdépendante du CPE

Identification de la CPEB (CPE Binding protein)

Modèle : - Le CPE lie la CPEB- La CPEB provoque la polyadénylationdes ARNm auxquels elle est liée

Pourtant : - La CPEB est présente dès le débutde l'ovogenèse...

Régulation de l'activité de la CPEB

B. Pendant la maturation ovocytaire

Progesterone

CPEB

CPEBP

CPE AAA…AAA 3'

+

5'

Eg2 protein

Traduction

A. Dans l'ovocyte non maturé

CPEB

CPE 3'5' Pas de traduction

Fonction de la polyadénylation contrôlée par la CPEB

L’injection d’anticorps anti CPEB bloque la maturation ovocytaireIdentification de certains ARNm dont la polyadénylation

est nécessaire à la maturation (c-mos…)

Mais ce n’est pas tout!

Souris dont le gène CPEB est inactivé…

Fonction dans le fonctionnement neuronal

Et les désadénylations?

Contrôles aberrants de l’état d’adénylationdes ARNm et pathologies humaines

Exemple 1

L'ARNm -globine est très stable pendant la différenciation érythrocytaire

Cette stabilité lui est conférée par un élément de séquence dans la 3'UTR

Cet élément maintient une queue poly(A) longue sur l'ARNm -globine

Une forme de thalassémie est liée àl'inactivation de cet élément

Exemple 2

Les ARNm des cytokines ou proto-oncogènes sont souvent très instables

Cette instabilité leur est conférée par un élément de désadénylation dans la 3'UTR

L'inactivation de cet élément conduit à la surexpression de la protéine codée

Cette surexpression peut être associéeà une transformation cellulaire

Contrôles aberrants de l’état d’adénylationdes ARNm et pathologies humaines

3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codantsUne histoire récente…

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

miRNA RNAiPrix Nobel oct 2006

(C Mello, A Fire) siRNA

Et alors?

3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codantsUne histoire récente…

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

Mécanismes biochimiques

Biosynthèse des miRNA

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519Reconnaissance d’un ARN

double brin par Argonaute!

Fonction des miRNA

L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNmcible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN

1. Hybridation imparfaite sur les 22 nt :

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

Conséquence : inhibition de latraduction de l’ARNm cible

Voie miRNA « classique » chez l’animal

Fonction des miRNA

L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNmcible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN

2. Hybridation sur la totalité des 22 nt :

Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

Conséquence : dégradationde l’ARNm cible

Voie miRNA « classique » chez la plante

Fonction des miRNA

L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNmcible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN

2. Hybridation sur la totalité des 22 nt :

Conséquence : dégradation de l’ARNm cible

Voie miRNA « classique » chez la plante…

… Mais si l’on apporte un ARN double brin parfaitementcomplémentaire d’un ARNm cible chez l’animal, cela provoque

sa dégradation… voie « siRNA » chez l’animal

Reprenons…

miRNA : ARN double brin (2*22nt) codé par le génomede la cellule (sous forme d’un précurseur qui est maturé)

Environ 250 chez l’humain

S’apparie imparfaitement à un ARN cible et inhibe satraduction (animal), ou s’apparie parfaitement et provoque

sa dégradation (plante) (Il y a des exceptions…)

En général, un miRNA s’apparie aux 3’UTR d’un ou plusieurs ARNm

siRNA : ARN double brin (2*22nt) apporté par l’expérimentateurdans une cellule animale

S’apparie parfaitement à un ARNm cible et provoque sa dégradation

Utilisation des siRNA

L’expression d’un ARN double brin (2*22nt) dans une celluleanimale provoque la dégradation des ARNm dont la séquence

est parfaitement identique à celle de l’un des deux brins

Applications en recherche…

… Et en médecine?

Régulations post-transcriptionnelles parles miRNA et développement

L’exemple de Caenorhabditis elegans

La vulve de Caenorhabditis elegans

*

proximité de la vulve.

Formation de la vulve

*

proximité de la vulve.

P6.p se divise en cellules qui sedifférencieront en cellules centrales

de la vulve

P5.p et P7.p se divisent en cellules qui sedifférencieront en cellules latérales

de la vulve

Rôle de AC (induction)

Les inductions dans la formation de la vulve

Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

Première induction(voie EGF)

Deuxième induction(voie Notch)

« Marqueurs » de destinée cellulaire

La GFP “marque” les cellules P5.p et P7.p, mais pas P6.p

Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

Contrôle

Le miRNA mir-61 est présent dans P5.p et P7.p, mais pas P6.p

… Sauf si on exprime le miRNA mir-61 dans P6.p

Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

Contrôle

Expression de mir-61dans P6.p

… Sauf si on fait s’exprimer le miRNA mir-61 dans P6.p

Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

Contrôle

Expression de mir-61dans P6.p

mir-61 exprimé dans P6.p « fait devenir » P6.p comme P5.p et P7.p

Recherche d’un ARNm cible de mir-61

Fonction de la protéine codée par cet ARNm :faire « devenir une cellule comme P6.p »

Dans l’embryon normal : mir-61 est présent dans P5.p et P7.pIl empêche l’expression de cet ARN dans P5.p et P7.p

P5.p et P7.p deviennent « comme P5.p et P7.p »

Si on exprime mir-61 dans P6.pIl empêche l’expression de cet ARNm dans P6.p aussi

P6.p devient « comme P5.p et P7.p »

ARNm codant la protéine vav-1

Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

D’où la fonction d’un miRNA dansla mise en place de la vulve…

… Implication dans d’autres processus de développementchez C. elegans

Le cycle de C. elegans

Alvarez-Garcia et Mlska 2005 Development 132, 4653

Les mutants hétérochrones chez C. elegans

Alvarez-Garcia et Mlska 2005 Development 132, 4653

Rôle de miRNA dans la coordination d’évènementsde développement chez C. elegans

miRNA et pathologies humaines (1)

Mutation dans la 3’UTR de SLITRK1, au niveau du site de reconnaissance de miR-189

Perte de la répression traductionnelle de SLITRK1 : surexpression de la protéine SLITRK1

Responsable de la maladie?

miRNA et pathologies humaines (2)

miRNA et pathologies humaines (3)