Méthodes d’étude des virus et de diagnostic virologique

Chapitre 9 du cours de Virologie Générale

MATIERE D’EXAMEN

Vous disposez de deux heures pour :

Evoluer dans ce diaporama relatif au chapitre 9 du cours de virologie générale

Visionner les films relatifs à plusieurs méthodes définis par l’assistante

Les questions pourront être posées lors des jours suivants de TP

Objectifs

Intérêt en virologie : production de virus en laboratoire

Les différents typesdifférents types de cultures cellulaires

Culture de cellules primaires :cellules mises en culture à partir de l’organe prélevé chez l’animal (souvent un fœtus), utilisées dès la 1ère culture.

Lignée diploïde :nombre de chromosomes constant, durée de vie limitée (cellules meurent après un certain nombre de divisions)

Lignée continue :transformées in vitro ou provenant de tumeurs, aneuploïdes, durée de vie illimitée

Milieu de cultureMilieu de culture : liquide, riche en acides aminés, minéraux, tampon pH, source d’énergie, facteurs de croissance, facteurs d’attachement.

9.1 La culture de cellules

La culture de cellules

Cellules adhérentes :Cellules adhérentes :2 types de morphologies : épithéliale (polygonale) et 2 types de morphologies : épithéliale (polygonale) et fibroblastique (étiré).fibroblastique (étiré).

Cellules non adhérentes :Cellules non adhérentes :Flottent dans le milieu de cultureFlottent dans le milieu de cultureSphériquesSphériquesDestinées à la production cellulaire en masse.Destinées à la production cellulaire en masse.

Les cellules

Les supports

Supports de cultures cellulaires

Supports de cultures cellulaires

Plaque de 6 puits Plaque de 96 puits

La notion du passage cellulaire

9.2 Dénombrement des particules virales

Définitions : Particules physiques = infectieuses + non infectieuses Particules infectieuses =

particules dénombrées par la méthode des plages de

lyse ou de la méthode des DICC50

Méthode des plages de lyse

Détermination de la dose infectieuse en culture de cellules

Dénombrement de particules physiques

Effet cytopathogène

Méthode des plages de lyse-Particules infectieuses

ND 10-1 10-2 10-3 10-4 T-

Concentration virale de départ (non diluée) ?

200 µl / puits

ND 10-1 10-2 10-3 10-4 T-2

9

7

7

Méthode des plages de lyse-Particules infectieuses

Moyenne de 6,25 Plages de lyse à la dilution 10-3

La concentration virale de départ est de 3,1 104 UFP / ml.

Détermination de la dose infectieuse en culture de cellules (DICC 50)

On cherche la dilution virale pour laquelle 50% des On cherche la dilution virale pour laquelle 50% des supports de cellulles montrent un effet cytopathogène supports de cellulles montrent un effet cytopathogène (cette dilution est celle dont le volume contient une (cette dilution est celle dont le volume contient une DICCDICC5050).).

Détermination de la dose infectieuse en culture de cellules

T -

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-9

DICC 50

50 µl par

puits

Dilution Dilution viralevirale

Nbre d’infectés/ Nbre d’infectés/ Nbre d’inoculésNbre d’inoculés

Nbre Nbre Nbre Nbre d’infectés de non d’infectés de non

infectés infectés

SommeSomme

I I non non II

% % d’infectésd’infectés

1010-2-2 10/1010/10 10 010 0 37 037 0 100100

1010-3-3 10/1010/10 10 010 0 27 027 0 100100

1010-4-4 10/1010/10 10 010 0 17 017 0 100100

1010-5-5 6/106/10 6 4 6 4 7 4 7 4

6464

1010-6-6 1/101/10 1 91 9 1 131 13 77

1010-7-7 0/100/10 0 100 10 0 230 23 00

1010-8-8 0/100/10 0 100 10 0 330 33 00

1010-9-9 0/100/10 0 100 10 0 430 43 00

Le point d’infectivité à 50 % se situe entre 10-5 et 10-6 : (64-50) / (64-7) = 0.25

Cela signifie que 50 µl d’une dilution à 10-5,25 contient 1 DICC50,

donc, le titre de la suspension virale 1/10-5,25 X 1000/50 = 3,6 .106 DICC50 / ml

Dénombrement des particules physiques - Microscopie électronique

Particules physiques : microscopie électronique

Particules physiques enveloppées

Particules physiques non enveloppées

Récapitulatif Récapitulatif :

9.2 Dénombrement des particules virales

Particules infectieuses : 2 méthodes

- Plages de lyse

- DICC50

Particules physiques :

Microscopie électronique

9.3 Purification des virus Par cPar centrifugationentrifugation : :

– 1.Centrifugations différentielles1.Centrifugations différentielles ::» Centrifugation à Centrifugation à basse basse accéléraccélérationation » Centrifugation àCentrifugation à haute haute accéléraccélérationation sur surnageant sur surnageant

Obtention d’un culot contenant le virus semi-purifiéObtention d’un culot contenant le virus semi-purifié

– 2.Ultracentrifugation2.Ultracentrifugation ::séparation virus-impuretés par propriétés physiquesséparation virus-impuretés par propriétés physiques

» ""en gradient de densité à l’équilibreen gradient de densité à l’équilibre" " (séparation sur base de la (séparation sur base de la densité)densité)

» ""zonalezonale" " (séparation sur base de la vitesse de sédimentation)(séparation sur base de la vitesse de sédimentation)

Obtention d’une suspension de virus très purifiéeObtention d’une suspension de virus très purifiée

9.4 Etude de l’acide nucléique viral

Analyse de restriction et hybridation moléculaireAnalyse de restriction et hybridation moléculaire Amplification génique (PCR) Amplification génique (PCR)

– ConventionnelleConventionnelle

– PCR en temps réelPCR en temps réel

SéquençageSéquençage

La PCR en temps réel

La PCR en temps réelChimie des intercalants

Chimie des intercalantsChimie des intercalants : :

Molécules (SYBR Green, bromure Molécules (SYBR Green, bromure d’éthidium) ayant la propriété de d’éthidium) ayant la propriété de s’intercaler de façon aspécifique s’intercaler de façon aspécifique dans les doubles brins d’ADN, dans les doubles brins d’ADN, conformation qui les rend conformation qui les rend fluorescentes.fluorescentes.

Excitation (UV) Excitation (UV) émission de émission de fluorescence fluorescence lecturelecture

PCR en temps réel

Chimie des sondesChimie des sondes : :Fixation d’une sonde spécifique du Fixation d’une sonde spécifique du fragment amplifié, lié à 2 fragment amplifié, lié à 2 fluorochromes, 1 émetteur (en vert) et fluorochromes, 1 émetteur (en vert) et 1 récepteur (en rouge).1 récepteur (en rouge).Sonde intègre : émission uniquement Sonde intègre : émission uniquement par fluo récepteur (rouge)par fluo récepteur (rouge)

Polymérisation Polymérisation action action exonucléasique de la polymérase exonucléasique de la polymérase sonde lysée sonde lysée séparation fluo séparation fluo émetteur et fluo récepteurémetteur et fluo récepteur

Emission par fluo émetteur (vert)Emission par fluo émetteur (vert)

Chimie des sondes Ex. : TaqMan

Séquençage de l’ADN

Détermination précise de la séquence en nucléotides Détermination précise de la séquence en nucléotides (laboratoires spécialisés)(laboratoires spécialisés)

Méthode de Sanger (plus rarement Maxam et Gilbert)Méthode de Sanger (plus rarement Maxam et Gilbert) Si virus à ARN : ADN complémentaire nécessaireSi virus à ARN : ADN complémentaire nécessaire A partir du produit de PCR ou clonage de la séquenceA partir du produit de PCR ou clonage de la séquence

Application : Lors d’épidémie (ex. : intoxication Application : Lors d’épidémie (ex. : intoxication alimentaire), isolement d’un virus, puis envoi au labo alimentaire), isolement d’un virus, puis envoi au labo qui séquence une partie déterminée du génome de la qui séquence une partie déterminée du génome de la souche pour permettre un typage très fin du virus.souche pour permettre un typage très fin du virus.

9.5 Etude des protéines virales Marquage radioactif : un acide aminé essentiel du milieu Marquage radioactif : un acide aminé essentiel du milieu

remplacé par le même ayant incorporé un isotope radioactif remplacé par le même ayant incorporé un isotope radioactif (méthionine marquée S(méthionine marquée S3535). Marquage de toutes les protéines ). Marquage de toutes les protéines néosynthétisées.néosynthétisées.

Electrophorèse en gel de polyacrylamide : séparation des Electrophorèse en gel de polyacrylamide : séparation des protéines selon leur masse moléculaire, révélation par protéines selon leur masse moléculaire, révélation par radioactivité ou colorants spécifiques des protéines.radioactivité ou colorants spécifiques des protéines.

Western blotting ou Immunoblot : électrophorèse, transfert sur Western blotting ou Immunoblot : électrophorèse, transfert sur membrane puis identification des déterminants antigéniques membrane puis identification des déterminants antigéniques par des anticorps spécifiques et révélation par une méthode par des anticorps spécifiques et révélation par une méthode immuno-enzymatique.immuno-enzymatique.

Immunoprécipitation

Extraction d’une protéine d’un mélange de protéines Extraction d’une protéine d’un mélange de protéines marquées radioactives, par des anticorps spécifiques liés marquées radioactives, par des anticorps spécifiques liés à des billes de sépharose, Centrifugation, Analyse par à des billes de sépharose, Centrifugation, Analyse par électrophorèse.électrophorèse.

Marquage radioactif Immunoprécipitation Electrophorèse

Récapitulatif Récapitulatif : METHODES D’ETUDE

9.4 De l’acide nucléique viral 9.5 Des protéines

Analyse de restriction Marquage radioactif

Southern blot Immunoprécipitation

PCR Electrophorèse

Séquençage Western blot

9.6 Diagnostic des infections virales

Pathologie clinique observée, récolte des signes cliniques

Diagnostic différentiel

Confirmation de l’étiologie par :

- Mise en évidence de l’agent pathogène (direct)

- Mise en évidence de la réponse immunitaire (indirect)

Diagnostic des infections virales

B. Méthodes de diagnostic indirect (mise en évidence de la réponse immune, Ac)

Elisa indirect Immunofluorescence indirecte Séroneutralisation Inhibition de l’hémagglutination

A.1 Non spécifiquesDétermination de l’origine virale, sans identification de l’agent étiologiqueEffet cytopathogèneTest d’hémadsorption

A. Méthodes de diagnostic direct(mise en évidence du virus, Ag)

A.2 Spécifiques Mise en évidence directe d’un constituant du virus

Détection du génomeDétection des protéines

A.1 Méthodes de diagnostic direct non spécifique

I. Effet cytopathogène en culture de

cellules

Méthodes de diagnostic direct non spécifique

II. Test d’hémadsorption :

Virus des oreillons virus Sendai(paramyxovirus)

A.2 Méthodes de diagnostic direct spécifique

Enveloppe

Tégument

DNA

Capside

Glycoprotéines

Méthodes de diagnostic direct spécifique

I. Visant la détection de l’ADN viral à partir du prélèvement

II. Visant la détection des protéines virales :

Techniques immunoenzymatiques (ELISA)

Techniques immunofluorescence

ELISA directRéactifs

Réactifs

Réactifs

- Ac spécifiques des Ag d’intérêt

- Echantillon inconnu

Laisser incuber (temps de réaction)

Lavages (enlève toutes substances non liées)

- Ac couplés à une enzyme (E) spécifique des Ag d’intérêt

Laisser incuber (temps de réaction)

Lavages (enlève tous les Ac-E non liés)

- Substrat de l’E

POSITIF : substrat converti en produit coloré

NEGATIF : pas de coloration

Echantillon positif Echantillon négatifAg présents

et fixation aux Ac

Ag absentEtape 1 : Ajout de l’échantillon sur le support

Etape 3 : Révalation par ajout du substrat de l’enzyme

Etape 2 : Ajout des anticorps couplés à une enzyme

Immunofluorescence (direct spécifique)

Ac anti-gC d’isotype IgG2a

Ac anti-gE d’isotype IgG1

Goat anti-IgG2a de souris couplé à la FITC

Goat anti-IgG1 de souris couplé à la R-PE

* *

gEgC

Immunofluorescence

FITC emissionanti-gC

R-PE emissionanti-gE

Merge

Sample 1

Sample 2

Immunofluorescence

B. Méthodes de diagnostic indirect

ELISA indirect

Immunofluorescence indirecte

Séroneutralisation

Inhibition de l’hémagglutination

ELISA indirectRéactifs

Réactifs

Réactifs

- Ag

- Echantillon inconnu

Laisser incuber (temps de réaction)

Lavages (enlève toutes substances non liées)

- Ac couplés à une enzyme (E) spécifiques des Ac (antiglobuline)

Laisser incuber (temps de réaction)

Lavages (enlève tous les Ac-E non liés)

- Substrat de l’E

POSITIF : substrat converti en produit coloré

NEGATIF : pas de coloration

Echantillon positif Echantillon négatifAc spécifiques présents

et se fixent aux Ag

Ac spécifique absent ; les autres Ac sont

éliminés aux lavagesEtape 1 : Ajout de l’échantillon sur le support

Etape 3 : Révalation par ajout du substrat de l’enzyme

Etape 2 : Ajout des anticorps couplés à une enzyme

ELISA indirect de blocageRéactifs

Réactifs

Réactifs

- Ag

- Echantillon inconnu

Laisser incuber (temps de réaction)

Lavages (enlève toutes substances non liées)

- Ac couplés à une enzyme (E) spécifiques des Ag

Laisser incuber (temps de réaction)

Lavages (enlève tous les Ac-E non liés)

- Substrat de l’E

POSITIF : pas de coloration

NEGATIF : substrat converti en produit coloré

Echantillon positif Echantillon négatifAg viraux fixés ; les Ac

spécifiques s’y fixent

Ac spécifique absent ; les autres Ac sont

éliminés aux lavages Etape 1 : Ajout de l’échantillon sur le support

Etape 3 : Révalation par ajout du substrat de l’enzyme

Etape 2 : Ajout des anticorps couplés à une enzyme

SéroneutralisationBasée sur la capacité des Ac à empêcher le virus d’infecter un tapis cellulaire.

Réactifs

Réactifs

- virus- Echantillon inconnu

Laisser le temps à la réaction Ag-Ac de se produire

Ajouter le mélange sérum-Ag à la culture de cellules

Laisser incuber (temps de multiplication du virus)

POSITIF : les Ac ont empêché la multiplication virale : le tapis cellulaire est intact

NEGATIF : le virus s’est multiplié et a détruit le tapis cellulaire

Echantillon positif Echantillon négatifAc spécifiques se fixent aux virus

Ac spécifique absentEtape 1 : Mélange du sérum à tester avec une suspension virale

Etape 3 : Lecture du résultat après coloration

Etape 2 : Mise en contact du mélange avec un tapis cellulaire confluent

Séroneutralisation

T -

Sérum 1 Sérum 2 Sérum 3 Sérum 4

1/2

1/4

1/8

1/32

1/16

1/64

T +

Inhibition de l’hémagglutinationBasé sur la capacité des Ac à neutraliser le virus Pas de fixation du virus aux GR

Réactifs

Réactifs- Virus- Echantillon inconnu

Laisser le temps à la réaction Ag-Ac de se produire

Ajouter une suspension de globules rouges (GR)

POSITIF : les Ac ont empêché la fixation des GR aux virusinhibition de l’hémagglutination

NEGATIF : le virus se fixe aux GRhémagglutination

Echantillon positifAc spécifiques se fixent aux virus

Echantillon négatifAc spécifique absent

Inhibition de la fixation des virus aux GR

Fixation des virus aux GR

Etape 1 : Mélange du sérum à tester avec une suspension virale

Etape 3 : Lecture du résultat (voir photo dia suivante)

Etape 2 : Mélange avec une suspension de globules rouges

Récapitulatif Récapitulatif : 9.6 METHODES DE DIAGNOSTIC

B. Méthodes de diagnostic indirect (mise en évidence de la réponse immune, Ac)

Elisa indirectImmunofluorescence indirecteSéroneutralisationInhibition de l’hémagglutination

A.1 Non spécifiquesDétermination de l ’origine

virale, sans identification de l’agent étiologique

Effet cytopathogène Test d’hémadsorption

A. Méthodes de diagnostic direct(mise en évidence des virus, Ag)

A.2 SpécifiquesMise en évidence directe

d’un constituant du virus

Détection du génome Détection des protéines