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Généralités
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
SEPARATION ET CULTURES CELLULAIRES
Cours de Cytologie
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
SEPARATION ET CULTURES CELLULAIRES
Cours de Cytologie
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
SEPARATION ET CULTURES CELLULAIRES
Cours de Cytologie
Intro :
Plusieurs types de cellules peuvent être cultivés :
des micro-organismes unicellulaires (bactéries, levures, etc.) et des cellules provenant d'organismes
pluricellulaires (végétaux et animaux).
En les cultivant en laboratoire, on peut contrôler leur croissance et obtenir de grandes quantités de
micro-organismes ou de substances utiles.
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Définition :
>> La culture cellulaire est un moyen technique utilisé afin de faire croître des cellules hors de
leur environnement directe (ou organisme).
>> L’utilisation de cellules en culture, va permettre de reproduire des conditions conduisant à
une pathologie, de tester des molécules sur leur survie ou de les utiliser afin de produire des
protéines.
Objectif:
La principale difficulté de la culture cellulaire correspond à sa sensibilité aux
contaminations :
Permettre la (re)production de cellules en quantité suffisante pour pouvoir ensuite s'en
servir comme matériel expérimental.
elle doit donc être réalisée dans des conditions stériles dans la plupart des cas.
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Avantages des cultures cellulaires par rapport à l’expérimentation animale :
– Réduction du nombre d’animaux
– Matériel abondant
– Matériel standardisé
– Maîtrise des conditions expérimentales
– Effet mécanistique sur effet cible direct
> De l’In Vivo à l’In Vitro : Intérêt et application des modèles
Tests Validés et reconnus
> Doivent être une méthode alternative des études in vivo
> Validation (physiologie, pharmacologie, toxicologie, pharmacie industrielle, cosmétique, …)
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Principes généraux
Les procédés utilisés pour la culture cellulaire
La culture cellulaire se fait en plusieurs étapes.
Il faut d'abord obtenir des cellules et les installer dans un milieu de culture approprié afin de reproduire
les conditions de vie que connaissait la cellule dans son milieu d'origine.
1- Obtenir des cellules
2- Trouver un support et un milieu de culture appropriés
3- Reproduire les conditions du milieu de vie d'origine des cellules
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1- Obtenir des cellules
L'obtention de cellules diffère selon qu'elles proviennent d'êtres vivants unicellulaires ou pluricellulaires.
Les cellules provenant d'êtres unicellulaires (levure, bactérie, etc.) sont directement prélevées dans divers
milieux et transférées dans un milieu de culture approprié.
Par contre, dans le cas d'organismes formés de plusieurs cellules, les spécialistes peuvent utiliser des
cellules isolées, par exemple celles du sang.
Cependant, ils utiliseront généralement des cellules liées les unes aux autres trouvées dans les différents
tissus du corps. Dans ce cas, la première étape de la culture cellulaire sera la séparation de ces cellules.
Échantillonnage de cellules à l'aide d'un écouvillon et transfert sur un milieu de culture
Gradient de Fucol
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2 Trouver un support et un milieu de culture appropriés:
Selon le type de cellule cultivé, les cellules prélevées doivent être placées dans un milieu de culture qui
répond à leurs besoins.
Un milieu de culture se définit donc comme un milieu dans lequel on trouve tous les éléments
nécessaires à la croissance de cellules mises en culture.
La composition des milieux de culture varie, mais ils contiennent, entre autres, de l'eau, des sels
minéraux, des acides aminés, du glucose, des gaz, etc.
Les milieux de culture peuvent être liquides ou solides. Généralement, on estime qu'un milieu de culture
liquide favorise une croissance rapide des micro-organismes alors qu'un milieu solide est pratique pour les
recenser et les identifier.
Milieu de culture liquideMilieu de culture solide
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3- Reproduire les conditions du milieu de vie d'origine des cellules
La culture cellulaire exige la reconstitution des conditions originales du milieu des cellules.
Pour ce faire, on doit contrôler
la température,
la pression,
le taux d'humidité,
le pH,
la composition en nutriments et en minéraux, etc. du milieu de culture.
On peut ainsi favoriser une croissance normale et une reproduction efficace des cellules.
Incubateur permettant de contrôler les conditions environnantes du
milieu de culture (température, pression, taux d'humidité, quantité de
lumière)
Milieu RPMI 1640
+10% SVF
+ATB
Le travail en milieu stérile
Toutes les procédures nécessaires à la culture cellulaire nécessitent un travail en milieu stérile, c'est-à-
dire un milieu exempt de tout micro-organisme vivant.
Pour ce faire, de nombreux traitements existent pour stériliser le matériel utile au travail.
Travail sous une hotte aspirante permettant
de maintenir un milieu stérile
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• Il existe plusieurs applications à la culture cellulaire, entre autres :
- permettre aux chercheurs de mieux comprendre le fonctionnement des
cellules;
- permettre de tester des médicaments, des produits de beauté ou
encore de vérifier la toxicité de certains produits chimiques et ainsi
éviter des tests sur les animaux;
- permettre la production de certains vaccins dont les virus se
développent à l'intérieur des cellules;
- permettre de produire des tissus tels que de la nouvelle peau pour les
grands brûlés.
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Exemples (Neuro pathologie/ physiologie)
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comportement de cellules
en culture
La croissance et la conservation des cultures cellulaires :
Lors d'une culture cellulaire, le taux de croissance des cellules n'est pas constant. Il s'effectue
plutôt selon une courbe dans laquelle on peut distinguer 4 phases.
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1.LA PHASE D'ADAPTATION. Il n'y a pratiquement pas de croissance cellulaire puisque les
cellules s'adaptent à leur nouvel environnement et s'y installent.
2, LA PHASE DE CROISSANCE RAPIDE. Les cellules se divisent rapidement, car elles
consomment la majeure partie des nutriments contenus dans le milieu de culture.
La croissance et la conservation des cultures cellulaires :
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3, LA PHASE STATIONNAIRE. Le nombre de cellules est constant puisqu'il y a autant de
cellules qui meurent que de nouvelles qui sont produites.
Cela s'explique par un épuisement des nutriments, une accumulation de déchets et un
manque d'espace disponible.
4, LA PHASE DE DÉCLIN. Les nutriments et l'espace se font trop rares pour maintenir un
nombre de cellules maximum.
Ce nombre décroît.
Croissance et conservation de cellule :
Le maximum de cellules possible est atteint à la fin de la phase de croissance
rapide.
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C'est aussi lors de cette phase que l'on doit repiquer les cellules (les transférer)
dans un nouveau milieu de culture puisque les nutriments du milieu initial sont en
train de s'épuiser, ce qui déclenchera la phase de déclin.
Lorsque la phase stationnaire est atteinte, il peut être utile d'arrêter la culture et
de la conserver à des fins d'analyse ou d'utilisation ultérieure.
On peut congeler les cultures afin de les conserver.
Les cellules
Cellules normales
Mise en culture :
Obtention
Repiquage ou « passage » :
À partir d’un prélèvement tissulaire : avec ou sans dissociation
Dissociation des liaisons fortes entre cellules
Mécanique : broyage, vortexage …
Enzymatique essentiellement
À nombre de repiquages limité
culture primaire
culture secondaire
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Les cellules
Cellules transformées (ou éventuellement embryonnaires)
Cellules tumorales :
les plus utilisées en culture cellulaire et virologie médicale cellules VERO
Cellules embryonnaires :
cellules rénales de singe vert africain
À nombre de passages illimité donnant une lignée continue
HeLa (tumeur utérine) ;
KB (carcinome oral humain) >>>
MRC-5 (poumon de foetus humain) ;>>>
3T3 (embryon de souris)
Autres cellules
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Croissance des cellules en culture in vitro
Immortalisation cellulaire:
Acquisition de la capacité à se multiplier indéfiniment in vitro
Transformation cellulaire: acquisition de caractères
propres à la cellule maligne
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Autonomie de croissance
Perte de l’inhibition de contact
Immortalité
Indépendance vis-à-vis des facteurs de croissance
Tumorigénicité chez la souris NUDE
Cycle de croissance d'une lignée cellulaire en culture in vitro)
La sénescence (du latin senex, "vieil homme" ou "grand âge« ) est le
processus de vieillissement biologique : c’est la suite des changements
irréversibles dans un organisme qui aboutissent à la mort.
Comportement des cellules in vitro
soit rester en suspension comme les lymphocytes, ou d'autres cellules si le
milieu est carencé en Ca2+ par l'EDTA.
Les cellules cultivées peuvent:
soit former une monocouche, les cellules adhérant sur un support :
• verre
• plastique
• couche de matrice rappelant le milieu extracellulaire, autrement dit mimant
les conditions naturelles et permettant ainsi aux cellules de conserver leur
différenciation
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Les cellules HeLa en culture
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Contraste interférentiel
Contraste de phase
Cellules après
la division
Cellules en division
(métaphase)
L'évolution des cellules en culture:
Les cellules in-vitro présentent 2 propriétés fondamentales qui sont:
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Ces propriétés ont tendance à évoluer de manière très différentes quelle que soit la
méthode de culture employée.
la capacité proliférative et leur fonction différentiée.
L'évolution des cellules en culture:
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Notons que certains types cellulaires révèlent leur fonction spécifique que lorsqu'ils sont cultivés en
vie ralentie.
Pour cela, on procède à un appauvrissement progressif du milieu ou on utilise une substance
inhibitrice de la division cellulaire.
Les cellules conservent la plupart du temps leur potentiel de division, pouvant être stimulé au début de
la culture par des facteurs de croissances.
Même si au cours du temps, on peut noter un ralentissement de celui-ci.
A l'inverse, les cellules en culture voient souvent leur fonction différentiée se
modifier et même disparaître.
Ce phénomène de dédifférentiation peut être visible morphologiquement.
sélection de cellule
Sélection de cellules
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Le graph 2D des cellules de sang
L’analyse multiparamétrique constitue le point fort de la cytométrie en flux, ce qui
nous permet par exemple de séparer les cellules pour les cultivées
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- +
Tube de collecte
Laser
Plaques de déflexion
Veine liquide d’entraînement
Non sélectionnées
Conservation
On congèle, en présence de cryoprotecteur (diméthylsulfoxyde = DMSO).
une suspension de 4 millions de cellules par mL en phase exponentielle à - 40°C
lentement (1-4°C par min) puis dans le diazote liquide (-196°C).
La décongélation est rapide à 37°C.
Wéé Chérif je crois que cette
fois ci le Pr Vainchenker va
s’arracher les cheveux
Dit joseph ce n’est pas
les cellule à William
par hasard ?? T’a
oublier de mettre
l’azote là !!
Oups !!
le Pr Vainchenker
Conservation des cellules
• On utilise le DMSO pour les congeler.
• Ce produit protège les membranes lysosomiales et empêche le relargage des protéines.
• On congèle une suspension de 3 à 4. 106 cellules par mL de milieu en phase exponentielle, à -
40°C lentement (1 ou 4°C par min) puis dans le diazote liquide.
• La décongélation est rapide à 37°C suivie d'un lavage et d'un contrôle de viabilité.
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Culture et entretien
des cellules
Culture primaire
La notion de culture primaire est simple: il s'agit d'aller chercher une
cellule dans un organisme pluricellulaire et de la faire pousser in vitro.
En pratique, c'est un peu plus compliqué.
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L’entretien
Microscope inverséAction de la trypsine surveillée au microscope
Élimination du milieu ancien Rinçage en tampon sans Ca2+ Ajout de trypsine
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L’entretien
Inaction de l’activité enzymatique de ta
trypsine par ajout de milieu complémenté
Prélèvement d’une fraction de la suspension pour
dénombrement après une série d’aspirations refoulements
prolongée pour détacher les cellules
Falcon
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Plaque de
culture
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Control et Dénombrement en présence d’un colorant pour estimation de la viabilité cellulaire :
Calcul du volume de suspension cellulaire (cellules viables) à introduire dans le milieu neuf pour une
nouvelle incubation de 2 à 3 jours
Par exemple, Bleu de Funk (ou Trypan) exclus des cellules vivantes et pénétrant dans les cellules mortes
> soit grâce à des colorants vitaux tels que le rouge neutre incorporé dans les lysosomes des cellules
vivantes
> soit grâce à des colorants d'exclusion tels que le bleu Trypan pénétrant dans les cellules mortes .
Le comptage
Malassez
Volume = 1mm3
Concentration (c./ml) = (Nb cell./chambre) x Fd x 1000
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Par exemple, si 30 cellules sont observables sur 10 rectangles, on obtient un total
de 300 000 cellules par ml
Aspect de cellules
en culture
Cellules de sang : colonies sur Methylcellulose
Notion de Lignées
cellulaires
Culture de lignées
Les lignées cellulaires sont des cellules "immortelles", c'est-à-dire que l'on peut maintenir en culture indéfiniment.
Ce sont des cellules qui ont été rendues immortelles car :
Leur culture est considérée comme facile, car elles échappent à tout phénomène de sénescence, et échappent plus
ou moins à l'apoptose.
Elles s'adaptent donc facilement aux conditions de culture artificielles.
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elles sont cancéreuses ;
elles sont contaminées par un virus qui les rend immortelles (comme un virus du groupe Herpès ou le SV40);
elles ont été modifiées par génie génétique pour être immortelles ;
le plus simple étant de leur injecter le gène codant pour la protéine rendant immortel (comme le gène T du virus
SV40).
Transformation
Cours de CytologieMéthodes d’étudeSEPARATION ET CULTURES CELLULAIRES
VIRUS (par ex. : Epstein Barr ou HHV5)
Plasmide exprimant la « telomerase
reverse transcriptase protein (TERT) »
L’insertion génomique du virus
provoque des modifications des
contrôles cellulaires de la croissance.
L’expression de la télomérase permet
la reconstitution des télomères, assurant
l’immortalisation.
Production d’anticorps monoclonaux
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SEPARATION ET CULTURES CELLULAIRES Cours de CytologieMéthodes d’étude
BIOSTAT® ORB
La culture cellulaire en Bioréacteur
UniVessel® SU
Cas pratique
Cellules souches
La culture des cellules souches
Notre corps contient deux types de cellules:
Les cellules spécialisées remplissent des rôles particuliers dans notre organisme.
Lorsqu'on met un tel type de cellule en culture, on obtient des cellules qui ont exactement la même spécialisation que
la cellule initiale.
Ainsi, une cellule musculaire ne produira que des cellules musculaires.
>> Pour contourner ce fait, on peut utiliser des cellules souches.
les cellules spécialisées et les cellules souches.
CELLULES SOUCHES.
Cellules souches embryonnaires pouvant se développer en divers types de cellules spécialisées
Les cellules souches sont des cellules qui ne jouent pas de rôle particulier
dans l'organisme.
Elles ont la capacité de se diviser quasi indéfiniment et, dans des conditions
particulières, elles peuvent se transformer en cellules spécialisées.
Grâce à ces deux particularités, les cellules souches permettent de produire
des tissus et des organes de rechange.
CELLULES SOUCHES.
Cellules souches et régénération
Image of neuron progenitor cells provided
courtesy of Dr. Hans Keirstead's lab.
Image of pancreatic islet provided
courtesy of Dr. Marc Montminy's lab.
Image of smooth muscle cells provided
courtesy of Dr. Deepak Srivastava's lab
CELLULES SOUCHES.
Cellules souches embryonnaires pouvant se développer en divers types de cellules spécialisées
Chez l'adulte, on retrouve quelques cellules souches dans
le sang et dans la moelle osseuse.
Les premières cellules d'un embryon sont également des
cellules souches qui se spécialiseront par la suite pour
donner les différentes cellules spécialisées du corps.
On peut donc obtenir des cellules souches à partir d'un embryon, d'un cordon ombilical ou d'un placenta.
CELLULES SOUCHES.
Œuf fertilisé
Blastocyte
Cellules souches non
différenciées en culture
Différenciation
dirigée
Cellules sanguines
Muscle
Cellules nerveuses
Embryon
Cellule
pluripotente
isolée
Culture de cellules souches
CELLULES SOUCHES.
Cellules souches & cancer
Cellule souche Cellule progénitrice Cellule différentiée
Cellule de-différentiée
Mutation / Gene
autorenouvèlement
« Activé » ON
Cellule cancéreuse
Perte de la
régulation de
la division
Cellule souche normale
Mutation/Gene
autorenouvèlement
« Activé » ON
Cellule progénitrice normale
Mutation/Gene
autorenouvèlement
« Activé » ON
Cellule souche
CELLULES SOUCHES.
ANATOMY ART ( GUNTER von HAGEN )
CONSTRUIRE
RENOUVELLER
REPARER
REGENERER
REMPLACER
PHYSIOLOGIE
MORPHOGENÈSE
RENOUVELLEMENT
RÉPARATION
RÉGÉNÉRATION
PATHOLOGIE
TUMEURS BÉNIGNES
TUMEURS MALIGNES (CANCER)
TOXICOLOGIE
THÉRAPEUTIQUE
PHARMACOLOGIE
THÉRAPIE CELLULAIRE
THÉRAPIE GÉNIQUE
CELLULES SOUCHES.
BIOLOGIE CELLULAIRE
BIOLOGIE MOLECULAIRE
TRANSPLANTATION
MODELISATION
PHYSIOLOGIE
CELLULES SOUCHES.
Embryonnaires
Embryon - fœtus
Formation des organes et des tissus (200 types cellulaires
différents - acquisition de fonctions spécialisées et organisées -
organogenèse)
Adulte
Le renouvellement, la régénération, la réparation des tissus, afin
d’assurer la pérennité des fonctions physiologiques
CELLULES SOUCHES.
Germinales
Adultes
Cellules souches embryonnaires (ES)
Neurones
Cellules épithéliales
Fibroblaste
Cellules de sang
Cellules souches neuronales (NS)
Cellules souches hématopoïétiques (HSC)
Cellules souches somatiques (SSC)
Cellule Œuf
Embryon stade 8 cellule
blastocyste
Neurones
Cellules de sang
Cellules de foie
Cellules musculaires
peau
Neurones
Cerveau
Moelle osseuse
PeauAdulte
CELLULES SOUCHES.
1 - COMPRENDRE
PROLIFERATION
MIGRATION
DIFFERENCIATION
MORT
2- MANIPULER
LOCALISER ISOLER
MULTIPLIER
DIFFERENCIER REPARER
3- TRANSPLANTER
RENOUVELLER
CELLULES SOUCHES.
Utilisations possibles des cellules souchesMaladies possiblement guérissables grâce à la recherche sur les cellules souches
