Analyse Bacteriologique

5/17/2018 Analyse Bacteriologique - slidepdf.com

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ANALYSEANALYSE

BACTERIOLOGIQUEBACTERIOLOGIQUED’UNE DENREED’UNE DENREE

ALIMENTAIREALIMENTAIRELa prise d’essai:

A - cas de produit solide(exemple: viande).

B -cas de produit liquide(exemple: jus).



Références

• Norme NF V 08- 010 :règles générales pour lapréparation des dilutions en vue de l’examenmicrobiologique.

• Norme NF EN ISO 6887-1 relative à la suspensionmère et dilutions décimales;1.règle générale.

• Norme NF V 08- 057- 2 Microbiologie alimentaire -Directives générales pour la préparation desdilutions en vue de l’examen microbiologique.

• Norme XP V 08 – 102 relative aux règles généralespour le comptage des colonies et l’expression des

résultats.• Norme NF ISO 7218 :règles générales pour lesexamens microbiologiques.

• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptionsgénérales concernant la compétence des

laboratoires d’étalonnage et d’essais.



A- Cas de produit solide.

25 gr

Peser dans un sachetstérile 3× 25 gr du produit

à analyser aseptiquement.

BALANCEBALANCE

La 1La 1èreère pesée servira aupesée servira au

contrôle bactériologique.contrôle bactériologique.

La seconde servira à laLa seconde servira à la

recherche des Salmonella etrecherche des Salmonella et

des shigella.des shigella.

La troisième servira à laLa troisième servira à larecherche de Listéria.recherche de Listéria.



La prise d’essai pour une analysebactériologique classique:

Verser le TSE dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit

à analyser.Broyer l’aliment 6 à 8 minutes.

Verser le contenu dans le flacon de TSE.

BROYEUR TSE

10ˉ10ˉ¹¹

225225mlml

(suspension mère)

DE TYPE

STOMACHER



La prise d’essai pour la recherchedes Salmonella et des Listéria.

Verser l’Eau Peptonée Tamponnée(Salmonella) et le bouillonFraser(Listéria) dans le sachet stérile contenant 25 gr de produità analyser.

Broyer l’aliment 6 à 8 minutes.Verser le contenu dans les flacons respectives.

BROYEUR

DE TYPE

STOMACHER Eau Peptonée

tamponnéeBouillonFraser

225

ml ml

225



B – Cas de produit liquide:Faire un mélanger de 3 à 5 unités

du produit à analyser.

Suspension mère

+1

JUS

JUS

JUS

JUS

JUS



La prise d’essai pour les recherchesdes Salmonella et des Listéria.

5ml

25 mlPrélever

2×25 ml de la

Suspensionmère.

+1+1 EauEaupeptonnéepeptonnée

tamponnéetamponnée

25 ml

FRASERFRASER

SalmonellaSalmonellaListériaListéria



PREPARATIONDES DILUTIONS

DECIMALES

a - cas de produit solide.b - cas de produit liquide.



a - Cas de produit solide:Introduire 1 ml de la suspension 10ˉ¹ dans 9 ml de TSE.

Mélanger,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et

l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE.1 ml

1 ml 1 ml

10ˉ² 10ˉ³

10ˉ¹

9 ml de TSE

SuspensionSuspension

mère



b - Cas de produit liquide:Introduire 1 ml de la suspension +1 dans 9 ml de TSE.

Mélanger,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ¹ et l’introduire ensuite dans9 ml de TSE,mélanger, puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et

l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE pour obtenir la dilution 10³.

1 ml

1 ml 1 ml

10ˉ²

10ˉ³9 ml de TSE

10ˉ¹

1 ml

Solution mère

+1

9 ml de TSE

suspensionmère



PARAMETRES RECHERCHES

• Recherche et dénombrement des microorganismes totaux(Flore mésophile).

• Recherche et dénombrement des levures et moisissures.• Recherche et dénombrement des Coliformes, Coliformes

thermo tolérants et EscherichiaColi.• Recherche et dénombrement des Anaérobies Sulfito –

Réducteurs à 46°C.• Recherche et dénombrement de Clostridium Perfringens à

37°C.• Recherche et dénombrement des Staphylococcus aureus.• Recherche des salmonelles.• Recherche de Listéria.



RECHERCHE ETRECHERCHE ETDENOMREMENT DESDENOMREMENT DES

MICROORGANISMES PARMICROORGANISMES PARCOMPTAGE DES COLONIESCOMPTAGE DES COLONIES

OBTENUES A 30 °C,OBTENUES A 30 °C,DANS LES DENREESDANS LES DENREESALIMENTAIRES.ALIMENTAIRES.

Milieu utilisé:Gélose PCA



Références

• Norme NF 08 – 051 relative au dénombrement des micro–organismes – méthode par comptage des colonies obtenues à30°C.

• Norme XP V 08 – 102 relative aux règles générales pour lecomptage des colonies et l’expression des résultats.

• Norme NF V 08 – 002:Microbiologie alimentaire – Directivesgénérales pour les examens microbiologiques.

• Norme NF V- 057- 2 Microbiologie alimentaire - Directivesgénérales pour la préparation des dilutions en vue de l’examenmicrobiologique.

• Norme NF ISO 7218:règles générales pour les examensmicrobiologiques.• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales

concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage etd’essais.



Inoculer les boites de pétri avec 1 mldes différentes dilutions.

11mlml mlml mlml

11 11

10ˉ10ˉ¹¹ 10ˉ10ˉ²² 10ˉ10ˉ³³

1 ml1 ml 1 ml1 ml 1 ml1 ml



Couler la gélose PCA ≈ 15 mlrefroidie ≈ 45°C.

Mélanger et laisser solidifier.

PCAPCA PCAPCA

10ˉ10ˉ¹¹ 10ˉ10ˉ²² 10ˉ10ˉ³³



Couler une deuxièmecouche de gélose blanche ≈ 4 ml.

Laisser solidifier.

GELOSEGELOSE

BLANCHEBLANCHE

GELOSEGELOSE

BLANCHEBLANCHE

10ˉ10ˉ¹¹ 10ˉ10ˉ²² 10ˉ10ˉ³³



Incuber les boites couvercle en bas72 ±3h à 30°C.

Incuber 72h à 30°CIncuber 72h à 30°C



RECHERCHE ET DENOMREMENT DESRECHERCHE ET DENOMREMENT DES

MICROORGANISMES PAR COMPTAGEMICROORGANISMES PAR COMPTAGEDES COLONIES OBTENUES A 30 °C,DES COLONIES OBTENUES A 30 °C,DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

1ère Lecture après 24h

d’incubation



Dénombrer les colonies de formes lenticulairesqui poussent en masse et noter les dilutions

correspondantes.

Tenir compte des boites ayant un nombrecompris entre 15 et 300.

Germes totaux Germes totaux





2ème Lecture après 48h

d’incubation




correspondantes.







3ème Lecture après 72h

d’incubation




correspondantes.



L i é i



Retenir 2 dilutions successives ( plusfortes dilutions) oū le nombre de colonies

dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 300.Appliquer cette formule:

∑ c

1,1 x d

∑c : c + c (c = nombre decolonies de la 1ère dilution et c = nombre

de colonies de la 2ème dilution ).

d : le taux de dilution de la 1ère boiteretenue.

N = nombre de

micro-organismes /gr ou ml

Lecture et interprétation:

N

1 2 1

2



RECHERCHE DES

COLIFORMES PARCOMPTAGE

DES COLONIES A 30°,35°OU 37° C DANS LES

DENREESALIMENTAIRES.



Références

• Norme NF V 08-051:dénombrement des coliformes

par comptage des colonies,méthode de routine.• Norme NF V 08-017:dénombrement des coliformes

fécaux et d’Eschérichia Coli(annexe NF V 08-015 etNF V08-016).

• Norme NF ISO 7218:règles générales pour les

examens microbiologiques.• Norme NF V 08- 010 :règles générales pour la

préparation des dilutions en vue de l’examenmicrobiologique.

• Norme XP V 08-102:règles générales pour le

comptage des colonies et l’expression desrésultats:cas des dénombrements en milieu solide.• Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions

générales concernant la compétence deslaboratoires d’étalonnage et d’essais.



Milieu utilisé:

VRBL: (gélose au cristal

Violet et au Rouge neutre, Biliée et Lactosée).

I l l é i d b it



mlml

11 11

mlml

11

mlml

10ˉ10ˉ¹¹

1 ml1 ml 1 ml1 ml

Inoculer la série de boites avec1 ml des différentes dilutions.

1 ml1 ml

10ˉ10ˉ²² 10ˉ10ˉ³³



Couler une couche de gélose de VRBL ≈ 15 ml,refroidie à la température ≈ 45± 1 °C.


VRBL VRBL

I b l é i d b it 24 ± 2 h à



Incuber la série de boites 24 ± 2 h à30°,35° ou 37°C pour la recherche

des coliformes.

2424 ± 2 h± 2 h à 37°Cà 37°C 2424 ± 2 h± 2 h à 37°Cà 37°C2424 ± 2 h± 2 h à 37°Cà 37°C



Dénombrer les colonies rouges qui poussenten masse , noter la dilution correspondante.


Colonies rouges Colonies rouges

L t t i t ét ti





∑ c

1,1 x d

∑c : c + c (c = nombre decolonies de la 1ère dilution et c = nombrede colonies de la 2ème dilution retenues).


N = nombre de

Lecture et interprétation:

N

1 2 1

2



RECHERCHE ET

DENOMBREMENT DESCOLIFORMES

THERMOTOLERANTSET ESCERICHIA COLIDANS LES DENREES

ALIMENTAIRES.



Milieu utilisé:

VRBL: (gélose au cristal

Violet et au Rouge neutre, Biliée et Lactosée).

I l l é i d b it



mlml

11 11

mlml

11

mlml

10ˉ10ˉ¹¹

1 ml1 ml 1 ml1 ml

Inoculer la série de boites avec1 ml des différentes dilutions.

1 ml1 ml

10ˉ10ˉ²² 10ˉ10ˉ³³



Couler une couche de gélose de VRBL ≈ 15 ml,refroidie à la température ≈ 45± 1 °C.


VRBL VRBL



Incuber la série de boites24 ± 2 h à 44°C.

2424 ± 2 h± 2 h à 44°Cà 44°C 2424 ± 2 h± 2 h à 44°Cà 44°C2424 ± 2 h± 2 h à 44°Cà 44°C



Dénombrer les colonies rouges qui poussenten masse , noter la dilution correspondante.


Colonies rouges Colonies rouges



LECTURE ETINTERPRETATION

Comptage des

coliformestermotholérants.





∑ c

1,1 x d

∑c : c + c (c = nombre decolonies de la 1ère dilution et c = nombre

de colonies de la 2ème dilution ).


N

1 2 1

2

N = nombre de coliformes

termotholérants /gr ou ml.



Recherche etdénombrementd’Escerichia Coli:



Repiquer 3 à 5 colonies caractéristiques sur lemilieu Urée Indole.



Ensemencer le milieu Urée Indole.



Incuber le milieu Urée Indoleensemencé 24 h à 37°C.

UREE



Lecture du milieu Urée Indole.

Production d’indole

= formation

d’un anneau rouge.

indole +

-KOVACS KOVACS

E.Coli: urée -Indole +

indole



Lecture et interprétation.

Formule: a =b x c

A

b :Nombre de colonies caractéristiques indole +

Nombre total de colonies caractéristiques sur

la boite.c :

A : Nombre de colonies caractéristiquesrepiqués.

a : Nombre d’Escherichia Coli identifiés.



Retenir 2 dilutions successives( plus fortes dilutions) oū le nombrede colonies dénombrées soit : 15

≤ c ≤ 150.Appliquer cette formule:

∑ a =N

Nombre d’Escherichia Coli identifiés.

d : le taux de dilution correspondant à la 1ére

dilution retenue.

∑ a

1,1 x d

N = nombre d’Escherichia Coli /gr ou ml.

HERCHE DES SALMONEL



HERCHE DES SALMONELDANS LES DENREES

ALIMENTAIRES.



Références

• Norme NF V 08 6- 052 relative à la méthodede routine pour la recherche des Salmonella.

• Norme EN 12824 relative à la recherche des

Salmonella.• Norme NF ISO 17025 relative aux

prescriptions générales concernant lacompétence des laboratoires d’étalonnage etd’essais.

A Cas de prod it solide



A - Cas de produit solide:Verser l’Eau Peptonée Tamponnée dans le sachet stérile

contenant 25 gr de produit.Broyer l’aliment.

Verser le contenu dans le flacon d’E.P.Tamponnée.

BROYEUR

DE TYPE

STOMACHER

EauEau

peptonnéepeptonnée


flaconflacondede

225 ml225 ml



B - Cas de produit liquide.

11

mlml

25 ml

Introduire dans

225 ml d’Eau Peptonée

TamponnéePrélever 25 ml de la

Suspension

mère

(+1)(+1)EauEau



+1+1



Étape de pré enrichissement:

Incuber la solution ensemencéed’Eau Peptonée Tamponnée

16-20h à 37°C.

INCUBER 16- 20h à 37°CINCUBER 16- 20h à 37°C



EauEau

Étape d’enrichissement:



Étape d’enrichissement:Ensemencer les bouillons de Rappaport Vassiliadis et

de sélénite à partir de la solution pré enrichie.

EauEau



0,1 ml 2 ml2 ml

BouillonBouillon

RappaportRappaport

VassiliadisVassiliadis RAPPA-RAPPA-

PORTPORT

SFBSFB

S/CS/C

Solution pré enrichieSolution pré enrichie

Incuber 18- 24h à 42°CIncuber 18- 24h à 42°C Incuber 18- 24h à 37°CIncuber 18- 24h à 37°C

BouillonBouillon

sélénitesélénite



Étape d’isolement:

Milieux utilisés:Gélose Hektoen

Gélose au VertBrillant et au Rouge

de Phénol.

Isoler par des stries :



Isoler par des stries :a- Ensemencer une boite de gélose

Hektoen à partir du tube SFB.

b- Ensemencer une boite de géloseau Vert Brillant et au rouge de phénol

à partir du tube de Rappaport Vassiliadis.

37°C37°C 42°C42°C

Anse de platine Anse de platine

SFBSFB

S/CS/C

RAPPA-RAPPA-

PORTPORT

18-24 h à 37°C

R i 5 l i t i d



Repiquer 5 colonies typiques deSalmonella sur le milieu TSI.

...

Colonies ayant un contour régulier.

Colonies ayant la couleur du milieu ,parfois avec ou

sans centre noir sur la gélose Hektoen.

Colonies de couleur rose sur la gélose V.BR.RP

R i 5 l i t i d



Repiquer 5 colonies typiques deSalmonella sur le milieu TSI.

Stries

Anse de platine

Isoler par

des stries

faire une

piqûre centrale.

Incuber 24h à 37°C



Aspect d’un TSI de Salmonella.

TSI TSI TSI

Pente

Rouge

CulotNoir

Gaz +Pente

Rouge

Culot

Jaune

H2S +

Gaz

Pente

Rouge

Jaune

Culot

H2S

Gaz +

S.Typhi S.Paratyphi AAutres Salmonella

H2S+

Ensemencer une galerie



Ensemencer une galeriebiochimique.

.

LDCTEMOIN ODC ADH ONPG UREE GN

CITRATE DE SIMMONS

CLARK ET

LUBS

Lecture de la



Lecture de lagalerie biochimique.

.

LDCTEMOIN ODC ADH ONPG UREE GN

CLARK ET

LUBS

KOVACS RM

VP1

VP2

+ - -

Citrate de SIMMONS +

L t d l’i d l t d l TDA



Lecture de l’indole et de la TDA.

2 gouttesde réactif

KOVACS

1 goutte deréactif TDAUREE

INDOLE - TDA -

Pas de

virage.Pas de

formation

d’anneau

rouge.

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