ANALYSE DE LIPIDES - UNIGETP de Biochimie Groupe 4 Forestier Michèle 03.06.2010 Fournier Coralie Freyre Christophe Analyse de lipides - 4 - Image N 2 : TLC à deux dimensions pour

TP de BiochimieGroupe 4Forestier Michèle 03.06.2010Fournier CoralieFreyre Christophe

Analyse de lipides

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ANALYSE DE LIPIDES

Assistants:

T. HannichS. EpsteinI. Riezman


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1. Introduction

Dans cette expérience, nous allons nous intéresser aux lipides et plus principalement à leurs voies desynthèse dans les levures saccaromyces cerevisiae. Les lipides, de manière générale, sont des molécules àla fois hydrophobe et hydrophile, il en existe plusieurs variétés qui divergent selon leurs rôles biologiques. Lesphospholipides constituent les membranes, les triglycérides sont stockés comme réserves d’énergie, lesstérols sont responsables de la fluidité des membranes chez les eucaryotes [1], enfin les sphingolipidestransmettent des signaux cellulaires [2]. L’objectif de notre expérience a été de comparer une souche mutée àune souche sauvage afin de visualiser les éventuelles mutations des gênes responsables de la synthèselipidique. Après extractions des lipides, ces derniers ont été mis en évidence par des TLC (chromatographiesur couche mince), chaque sorte de lipide présent a pu être identifié selon son affinité aux substancesrévélatrices décrites ci-dessous. Selon nos analyses, nous pouvons avancer que nos mutants ne synthétisentpas les triacylglycérides, de plus, nous avons pu observer parallèlement par des analyses spectrométriquesde masse, une augmentation des diacylglycérides et des stérols ester.

2. Méthodes

Nous avons suivie les procédures énoncées dans le protocole de biochimie concernant l’extractiondes lipides.

2.1 Techniques

Chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC) [3]

Cette méthode est souvent utilisée pour séparer des composants par migration. Pour ce faire, lasolution à étudier est déposée à un point précis sur une fine plaque de silice (phase stationnaire), ensuite laplaque est positionnée à la verticale dans un fond d’éluant (phase liquide), qui va selon l’affinité de l’éluantavec nos composés faire migrer ces derniers et les séparer par diffusion. Afin d’observer quelles sortes delipides nous avions, nous avons utilisés les substances révélatrices suivantes:- Les vapeurs d’iode pour tous les lipides et plus principalement les lipides insaturés- Un bain d’acide sulfurique composé de méthanol et MnCl2 pour obtenir des couleurs différentes pour

chaque lipide- Une pulvérisation de ninhydrine spécifique aux groupes d’acide aminés.

Spectrométrie de masse (GC/MS et LC/MS) [3]

La spectrométrie de masse est une méthode d’identification sensible permettant de connaître lamasse d’un composé ainsi que ses caractéristiques structurales par analyse du rapport m/z (masse/charge).Couramment utilisée en parallèle avec les techniques de séparations suivantes : chromatographies sur phasegazeuse ou en phase liquide.

GC/MS : La chromatographie en phase gazeuse couplée au spectromètre de masse est utiliséelorsque l’échantillon à analyser est susceptible d’être vaporisé par chauffage sans se décomposer. Lesdiverses molécules vont sortir séparément et pourront alors être identifier par le détecteur du spectromètre demasse. Dans notre cas, nous avons utilisé cette méthode pour détecter et quantifier des molécules non-polaires telles que les stérols et les triglycérides.


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LC/MS : La chromatographie en phase liquide couplée au spectromètre de masse est utilisée pourséparer des ions chargés, le composé va être vaporisé par ionisation jusqu'à l’obtention de gouttelettescontenant un seul ion, qui pourra être détecté par un voltage spécifique à chaque ion. Nous avons eu recoursà cette méthode pour quantifier les masses des phospholipides ainsi que celles des sphingolipides présents.

3. Résultats

3.1 Chromatographie en deux dimensions des glycerophospholipides

Cette chromatographie permettra d’identifier les glycerophospholipides d’après un schéma théorique donnédans le polycopié du TP. [3] Cette TLC est en deux dimensions, elle se déroule comme une migration normale puis laplaque est tournée à 90° et une deuxième migration est effectuée. Le premier mélange de solvant est constitué dechloroforme, méthanol et ammoniac à 25% (65 :35 :5). Puis le second mélange sera chloroforme, acétone, méthanol,acide acétique et eau (50 :20 :10 :10 :5).

Image N° 1 : TLC à deux dimensions pour la souche wt


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Image N° 2 : TLC à deux dimensions pour la souche mutante

Il est difficile d’analyser correctement les résultats au vue de la réussite médiocre de cette TLC. Cependant encomparant la souche wt avec la souche mutante, on remarque la disparition dans la deuxième des phosphatidylinositolet des phosphatidylserine. Par contre il y aurait apparition des caridiolipins. Les lipides naturels sont présents dans lesdeux cas. Mais il est difficile de tenir compte de ces résultats en vue de leur faible fiabilité.


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3.2 Chromatographie à une dimension des stérols et des lipides naturels

Une chromatographie sur couche mince est effectuée, elle se déroule en deux étapes. Une première étapeconsiste à faire migrer les échantillons jusqu’à 3 cm dans un mélange d’éther de pétrole et de diéthyl éther (1 :1). Laseconde étape devra migrer jusqu’à 6 cm dans un mélange d’éther de pétrole et de diéthyl éther (49 :1).

Image N° 3 : TLC à une dimension des stérols et des lipides naturels

Nous remarquons que le wt et le mutant possède un spot au même niveauque le standard d’ergostérol (cercles noirs). Par contre le mutant ne contientpas de triglycéride. Le wt par contre en contient un peu (cercle rouge).


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3.3 Chromatographie à une dimension des glycerophospholopides

Nous avons effectué une chromatographie sur couche mince (TLC), dans un mélange de solvantchloroforme/méthanol/ammoniac (50 :25 :6). Cette TLC permet de détecter les glycerophospholipides, la détection sefera suivant deux types : avec la vapeur d’iode et la ninhydrine.

Image N° 4 : TLC à une dimension des glycerophospholipides avec détection à la vapeur d’iode

Image N° 5 : TLC à une dimension des glycerophospholipides avec détection à la nihnydrine

Nous remarquons que letype sauvage (wt) et lemutant sont identiquesen ce qui concerne lesglycerophospholipides,en comparant avec lesstandards on remarquequ’ils contiennent les 3types (PE, PC et PS).

Nous pouvons effectuer lesmêmes constatations queprécédemment. Seule latechnique de détectionchange. La ninhydrine estplus sensible et précise queles vapeurs d’iodes. Laninhydrine permet dedétecter les acides aminés.


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3.4 Spectrométrie de masse

Deux types de spectrométries sont utilisées dans ce TP. La spectrométrie en phase gazeuse (GC-MS) et laspectrométrie en phase liquide (LC-MS). La première permet d’analyser les molécules à caractère non polaire. [3] Unefois de plus, nos deux souches (wt et mutant) pourront être comparées.

Image N° 6 : Spectrométrie de masse en phase gazeuse

Le graphique duhaut (en rouge)correspond à notresouche sauvage etla graphique du bas(en vert) correspondà la souchemutante.


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Graphique N° 1 : Histogramme des résultats obtenu par GS-MS

Histogramme GC-MS

0.00E+00

2.00E+03

4.00E+03

6.00E+03

8.00E+03

1.00E+04

1.20E+04

1 2 3 4 5 6 7 8

Lipides

Qua

ntité Quantité wt

Quantité mutant

Image N° 7 : Spectrométrie de masse en phase liquide

IPC-C

Le lipide IPC-Cest nettementplus présentdans la souchemutante.

Les 4 premiers graphiques correspondent à la souche sauvage et les 4 derniers à la souche mutante.


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4. Discussion et Conclusion

Les résultats sont difficiles à analyser pour la chromatographie 2D. En effet, nous lors d’une des dimensionspour le mutant, la ligne de base n’était pas totalement linéaire : il y avait comme une vague à environ 2 cm du bord droit.Les lipides sont alors un peu déplacés par rapport à ce que nous aurions pu attendre.

Lors de la TLC, nous pouvons remarquer qu’il manque que la tache correspondant aux triglycérides. La tachecorrespondant à l’ergostérol n’est pas de la même couleur. Il n’y a pas de triglycérides ou elles ne sont pas identiques àcelles du type sauvage.

L’analyse par LC-MS nous permet de déterminer la quantité des différentes PL dans nos échantillons. Notreanalyse nous indique que la quantité de PC, PE et PS sont à peu près identiques entre le type sauvage et le mutant. Ilsemblerait que nous n’ayons pas une mutation qui affecterait la quantité de phospholipides ce qui confirme nos résultatssur plaques TLC.

L’analyse par GC-MS permet de détecter la quantité de lipides de types non polaires. Notre analyse nousdonne des résultats plus précis et plus intéressants par rapport à notre mutation. En effet, les pics correspondant auxtriglycérides et aux esters de cholestérol diffèrent, les autres pics sont à peu près identiques à celui de notre mutant.Nous pouvons remarquer que la quantité de diacylglycérides est différente. Elle est plus importante chez le mutant. Deplus, la quantité de stérols a augmenté parallèlement à la quantité de diacylglycérides. Il y a environ 10 fois plus d’estersstérols dans notre mutant. Nous pensons que c’est une conséquence de la mutation qui a affecté la synthèse de plusd’acides gras, qui ont été ensuite synthétisés en cholestérol.

En observant le schéma (figure 3A du cours), nous concluons que notre mutant a subi une mutation sur lesgènes suivants : DRGA1, LRO1. Ces gènes codent normalement l’enzyme qui permet la synthèse des triglycérides (voirfigure 1).

Figure 1 : Voies biosynthétiques des phosphoglycerides [3]

La classe de lipide affectée par notre mutation s’est révélée être la classe des triglycérides, produitspar les diacylglycérides par le biais des gènes DGA1 et LR01. Les triglycérides sont les constituants premiersdes huiles végétales et des graisses animales, comme on peut le voir sur le schéma ci-dessous, lestriglycérides sont facilement identifiables car le glycérol est estérifié par trois acides gras.


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Figure 2 : Triacylglycérides [4]

Les triglycérides possèdent un haut potentiel énergétique, lorsque le corps est au repos, ce sont lestriglycérides, hydrolysés en acide gras qui sont la source d’énergie principale. La synthèse des triglycéridesest complexe et se déroule en trois étapes :- formation de l’acide phosphatidique,- déphosphorylation de l’acide en diglycéride- estérification de la dernière fonction alcool du glycérol.

5. Sources bibliographiques[1] http://fr.wikipedia.org/wiki/Stérol, (consulté le 01.06.2010)[2] http://fr.wikipedia.org/wiki/Sphingolipide, (consulté le 01.06.2010) [3] TRAVAUX PRATIQUE DE BIOCHMIE, Analyse de lipides, T.Soldati, 2010[4] http://fr.wikipedia.org/wiki/Triglycérides, (consulté le 01.06.2010)

"J'atteste que dans ce texte toute affirmation qui n'est pas le fruit de ma réflexion personnelle est attribuée à sa sourceet que tout passage recopié d'une autre source est en outre placé entre guillemets"

Michèle Forestier Coralie Fournier Christophe Freyre

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