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1
La scurit microbiologique des eaux potables :
un des enjeux majeurs du XXIme sicle
Henry-Michel Cauchie
Aquaple22 fvrier 2007
2
1. Prsentation du Centre de Recherche Public Gabriel Lippmann
2. Le risque microbiologique li aux eaux potables
1. Dfinitions: risque microbiologique, scurit,
2. Caractristiques des agents pathognes
3. Situation actuelle dans le monde
3. Moyens mettre en uvre pour assurer la scurit microbiologique
des eaux potables
4. Recherche et dveloppement au CRP-GL dans ce domaine
5. Conclusions
Structure de lexpos
3
1. Prsentation du Centre de Recherche Public Gabriel Lippmann
4
Mission du Centre de Recherche Public Gabriel Lippmann
Recherche applique
Recherche fondamentale
Transfert technologique
Partenaires publics et privs
Recherche oriente
5
Dpartement EVA Environnement et Agro-BiotechnologiesResponsable Dr L. Hoffmann
Cr en 2000, actuellement 17 chercheurs et techniciens
Deux axes de recherche principaux :
Analyse et gestion de la biodiversit et des services cologiques des cosystmes
Microbiologie environnementale
Taxonomie et cologie microbienne Microbiologie applique (puration, biomthanisation,) Analyse quantitative du risque microbiologique dans les eaux
Unit de recherche Ecosystmes aquatiques et terrestres Responsable Dr H.M. Cauchie
6
Analyse quantitative du risque microbiologique dans les eaux
Dynamique des pathognes lis leau dans les bassins versants ou zones contributives
(protection des ressources, sant publique, interactions cologiques)
Indicateurs : E. coli, intestinalenterococci, bacteriophages,
Pathognes:Salmonella, Legionella, Giardia, Cryptosporidium, Hpatite A, norovirus, poliovirus, cyanobactries,
7
2. Le risque microbiologique li aux eaux potables
8
Dfinitions
Danger : Source de dommage pour lhomme ou les biens exposs
Risque : Probabilit de dommage dans des conditions donnes
dexposition au danger
Scurit (safety) : mise en place de barrire de protection
(traitements de leau, pratiques,) entre le danger (agent pathogne)
et les personnes
9
Brve histoire de la connaissance des maladies lies leau
Du moyen ge la moiti du XVIIIme sicle:
Les maladies (la Peste, le Cholra,) se propagent par les miasmes
disperss dans lair.
10
John Snow, pidmiologiste anglais (1813 1858)
Brve histoire de la connaissance des maladies lies leau
Il analyse la dynamique spatiale et temporelle
de lpidmie de cholra qui svit dans le
quartier de Soho Londres en 1854.
Il en dduit que le cholra
atteint les personnes ayant bu
de leau de la pompe deau
publique de Broad Street.
11
Un certain nombre de maladies sont dues des germes prsents dans leau
Cholra : bactrie Vibrio cholerae
7 pandmies entre 1817 et 1961
Fivre typhode : bactrie Salmonella typhi
Epidmie en Rpublique dmocratique
du Congo (27 Septembre 2004 - 11
Janvier 2005):
- 42 564 cas
- 214 mort (taux de mortalit: 0.5%)
12
Traitements des eaux et sant
A partir du XIXme sicle, mise en place de systmes
de collecte et traitement des eaux uses
(assainissement)
de traitement de leau destine la consommation
humaine : filtration de leau, chloration
Paris 1820
13
Le traitement de leau rduit la mortalit due la fivre typhode
Salmonella typhi
14
Endmisme, pisodes pidmiques (outbreak)
15
1920 1930 : ~ 17 pisodes pidmiques par an
1991 2002 : ~ 15 pisodes pidmiques par an
pisodes pidmiques aux tats-Unis (1920 2002)
16
pisodes pidmiques aux tats-Unis (1920 2002)
Vaccinations
Traitements thrapeutiques
17
Dans les pays industrialiss, la mise en place de mesures
dassainissement des eaux uses et de traitement de potabilisation des
eaux ont rduit loccurrence endmique des maladies lies leau.
Par contre, la frquence des pisodes pidmiques na par contre pas diminu au cours du XXme sicle.
Les causes en sont notamment les changements doccupation des sols
(intensification de lagriculture, urbanisation), la croissance
dmographique et la centralisation des systmes de distribution deau.
Constats
18
Diversit et caractristiques majeures des pathognes
Bactries:
Campylobacter jejuni Gastroentrite grave
Escherichia coli O157:H7 Enterohmorragique
Entroinvasive (dysenterie - fivre),
Salmonella spp Diarrhe sanglante, arthrite
Shigella spp. Dysenterie, fivre
Vibrio cholera Diarrhe, vomissements,
- Dose minimale infectieuse: 102 (Shigella) 108 (E.coli) cellules.
- Peuvent entrer en dormance dans le milieu ou se multiplier.
- Fort abattement avec les systmes de dsinfection classique (filtration,
chloration,)
- Traitements thrapeutiques gnralement efficaces
19
Diversit et caractristiques majeures des pathognes
Virus entriques:
Astrovirus Gastroentrite svre
Norovirus Gastroentrite svre, nause, vomissement
Entrovirus (poliovirus) Diarrhe, mnigites, encphalite,
Hpatite A Fivre, anorexie, douleur abdominale
Dose minimale infectieuse: 1 10 (100)
- Persistance importante ou inconnue
- Abattement significatif avec chloration, ultrafiltration efficace
20
Diversit et caractristiques majeures des pathognes
Protozoaires parasites:
Cryptosporidium parvum Diarrhe svre
Entamoeba histolytica Douleur abdominale, diarrhe sanglante
Giardia lamblia Douleur abdominale
Dose minimale infectieuse: 1 20 (100)
- Persistance trs importante
-Relativement rsistant la chloration
- ultrafiltration efficace
21
Diversit et caractristiques majeures des pathognes
Cyanobacteries:
- Certaine souches sont toxiques, relarguant leur toxine aprs la mort
cellulaire
- Dermatites, hpatotoxicit, neurotoxicit
Anabaena
22
1920-1940 1941-1960
1961-1970
1971-1990 1991-2002
Source : Craun et al., 2006 J Water Health
23
Situation mondiale actuelle
24
Distribution du Cholra ltat endmique aujourdhui
25
Situation globale quelques chiffres
1,1 milliards de personnes nont pas
accs au volume minimum deau propre
ncessaire journellement (5 litres)
2,6 milliards de personnes (la moiti
de la population des pays en
dveloppement) nont pas accs un
assainissement
1,8 millions denfants meurent chaque anne de diarrhe induite par des
pathognes vhiculs par leau
443 millions de jours dcole manqus chaque annes
Des millions de femmes passant plusieurs heures aller chercher de
leau chaque jour
26
Donnes 1995-2004
Lassainissement et lamlioration de lapprovisionnement en eausont la priorit des pays en dveloppement pour rduire lendmisme des maladies vhicules par leau
27
2 dfis majeurs au XXIme sicle: laccroissement de la population mondiale et le changement climatique
28
3. Moyens mettre en uvre pour assurer la scurit microbiologique des eaux potables au XXIme sicle
29
Origines des pollutions tats-Unis (1971 2002)
30
Constats
La qualit de leau peut tre altre diffrents endroits de la
chane dapprovisionnement
Une surveillance au niveau de la source deau et/ou du
consommateur (End-of-pipe control) uniquement savre inefficace
prvenir le risque de contamination.
Le risque de contamination doit tre caractris chaque tape
de la production deau potable suivant un principe similaire au
principe HACCP ( hazard analysis critical control point ) utilis
dans lindustrie alimentaire.
31
Mise en place de systmes de contrle multi-barrires
Approche catchment to consumer propose par lOMS
Connatre
son bassin
versant
Connatre la qualit de
leausource
Matrise des
traitements
de leau
Protection
de la
distribution
Eau potable
sre
32
Evaluation du
systme
Surveillance oprationnelle
Gestion
&
Communication
Description de la ressource
Identification & prioritisation des dangers
Identification des mesures de contrle
Dfinir les limites oprationnelles
Etablir une surveillance
Actions correctives, rponses aux incidents
Enregistrement des actions
Validation et vrification
Rvision, approbation et
audit
Plan de scurit
pourleau
tapes des plans de scurit pour leau (OMS) Water Safety Plans
33
Analyse quantitative du risque microbiologique
34
Bioterrorisme : le cas particulier dune contamination intentionnelle
Aux Etats-Unis, le Center for Disease Control and Prevention
(CDC) a class certains pathognes vhiculs par leau dans la
catgorie dagents biologique 2 (dissmination moyennement ais
raliser, faible mortalit):
Vibrio cholerae
Cryptosporidium parvum
Aucune attaque de cette nature ce jour
Stimulation des recherches sur les moyens de dtection en temps-rel des pisodes pidmiques volontaires ou non
Rflexion sur la protection des infrastructures
35
Rglementation actuelle et future
Actuellement, la Directive europenne 98/83/CE (eaux destines
la consommation humaine) est dapplication.
Cette Directive ninclus pas les principes des Plans pour le
Scurit pour lEau.
Par ailleurs, la Directive-cadre 200/60/CE fait rfrence explicite
la gestion des eaux de surface et des eaux souterraines en
vue de leur usage comme source deau potable.
La Directive europenne 98/83/CE est en rvision et devrait
inclure plus explicitement une rfrence aux Plans de Scurit
pour lEau. Un groupe de travail OMS/UE a t cr.
36
3. Recherches dans le domaine de lanalyse du risque microbiologique
37
Dmarche classique pour dterminer la prsence dun risque pathognes
Les pathognes sont souvent prsents des concentrations
relativement basses;
La dose minimal infectante de certains pathognes est relativement
basse, voire trs basse (virus, parasites).
Une dtection dindicateurs de contamination fcale plutt quune
dtection des pathognes eux-mme est gnralement utilise. Les
critres de qualit de la Directive 98/83/CE sont dailleurs fixs vis-vis
dindicateurs.
38
Les indicateurs sont prsents en beaucoup plus grande abondance que les pathognes
39
Mais leur survie nest pas toujours en rapport avec la survie de certains pathognes
40
Beaucoup de
donnes
disponibles
Non-bacterial pathogens(e.g. viruses, parasites)
Water
Biofilm
Inactivation
Inactivation
Inactivation
Attachm
entD
etachment
Sloughingor erosion Manque de
donnes
Surface
Importance des biofilms dans la dynamique des pathognes ?
41
Lanalyse quantitative du risque microbiologique ncessite
des techniques dvaluation:
de labondance des pathognes;
de la viabilit de ces pathognes;
de leur caractre infectieux.
des techniques de concentrations
des pathognes partir de grands
volumes deau ou partir de biofilms.
Dfinition des questions de recherche
42
1) Objectifs mthodologiques:
Dvelopper et appliquer des techniques de concentration de pathognes et de dtermination de leur abondance et de leur viabilit (bactries, parasites), de leur virulence (virus) ou de leur toxicit (cyanobactries).
2) Objectifs exprimentaux:
Comprendre les interactions pathognes - biofilms
3) Objectifs appliqus:
Identifier et localiser les danger microbiologique non bactriens dans les parties majeures du systmes de production deau potable au Grand-duch de Luxembourg
Objectifs des recherche en cours
43
VirusDure
moyenne d'excrtion
fcale
Concentration virale par
gramme de selles
Dose minimale infectante
(DMI)Symptmes
Norovirus
3 jours(entre 12 h
et >15 jours)
> 106 10-100 Gastro-entrite
Entrovirus 1 mois 103 - 106 10-15
Gastro-entrite, mningite, affection
respiratoire
Pathognes-cibles
Parasite Transmission DMI Incubation Symptmes Giardia Fcale-Orale 1 10 kystes 6-16 jours Diarrhes profuses, nauses
Cryptosporidium Fcale-Orale 10 100 oocytses 4-9 jours Diarrhes profuses, vomissements
Virus : norovirus, entrovirus
Protozoaires parasites : Giardia, Cryptosporidium
Cyanobactries toxiques
44
Cyanobactries
Vsiculesgazeuses
100 x
Microcystis
Anabaena
Aphanizomenon
Planktothrix Cylindrospermopsis
5 genres principaux
45
Cyanotoxines
1. Neurotoxines :
2. Dermatotoxines :
Lipopolysaccharides endotoxines (LPS)
Alcalodes
Paralytic Shellfish Poisons (PSPs) :
Saxitoxine (carbamate),
Toxicit : Venin du Cobra
3. Hpatotoxines : polypeptides
Microcystine plus de 60 variantes Inhibiteurs de phosphatases Dsorganisation ducytosquelette
46
Concentration de virus et de parasites partir de grands volumes deau (> 1000 litres)
Filtration sur membrane ultrafiltration : essai de rcupration
simultane des pathognes
47
Rendement des systmes de concentration
Dopage de 50
litres deau
avec virus et
protozoaires
Concentration primaire
200 ml
Concentration secondaire
quelques ml
Rendement total : < 20% 60%
48
Dtection et dtermination de la virulence des virus
Eau
Biofilms
Concentration
Elution
virus
Virulence :
culture cellulaire
Occurrence :
qPCR
49
La PCR (Polymerase chain reaction), un nouvel outil
PCR
50
Dtection des produits de PCR
Visualisation sur gel : prsence dune bande
= prsence du pathogne
PCR en temps rel PCR quantitative
51
Signification de la prsence de produits de PCR
On dtecte la prsence de gnome viral ou parasitaire.
Aucune information sur la viabilit ou la virulence des pathognes
52
Culture cellulaire : estimation de la virulence des virus
Dilutions 101 102 103
53
Vinj, 2006QIAampViral RNA
NF XPT90-451Norovirus(GGI et II)
NF XPT90-451Fuhrman etal., 2005
QIAampViral RNA
NF XPT90-451Enterovirus
Pathogenicviruses
ISO/FDIS10705-1 (1997)
Ogorzaly &Gantzer, 2006
QIAampViral RNA
NF XPT90-451F-specificBacteriophages
(GenogroupI to IV)
ISO/FDIS10705-2 (1999)
QIAampViral RNA
NF XPT90-451Somatic
Coliphages
Viral indicators
Virulence(Cell culture)
Occurrence(PCR)
ExtractionConcentration
DetectionSample preparation
Virus
NEW!
Bote outil disponible au CRP-GL
54
Eau
Biofilms
Concentration
Elution
parasites
Viabilit : RT-qPCR
Occurrence : qPCR
Occurrence : microscopieUSEPA Method 1623
IFA DAPI DICIFA DAPI DICIFA DAPI DIC
mRNA giardin, HSP70
Dtection et dtermination de la viabilit des parasites
Sparation
Immuno-
magntique
55
0
10
20
30
20/01/06 27/01/06 03/02/06 10/02/06 17/02/06 24/02/06 03/03/06 10/03/06 17/03/06 24/03/06
Kys
tes
ou
oo
cyst
es/ 5
0 L
0
2
4
6
8
10
12
14
Pr
cip
itat
ion
s (m
m)
Provar Provar
Bavigne Bavigne
Misre Misre
Prcipitations (mm)
La dynamique des pathognes est lie lhydrologie des eaux considres
SEBES : 60000 m3/jour = 5.106 Giardia et Cryptosporidium /jour
56
Post-doc 2006-2007:
Recherche exploratoire de nouveaux indicators de viabilit de
Giardia lamblia
kystes dsenkystement trophozotes
Comparison
Marqueurs gnomiques et protomiques de viabilit chez Giardia lamblia
57
Cyanobactries
Eau de surface
Echantillonnage au filet plancton
Microscopie culture in vitro
Echantillons deau
Eau traite
Dosage des hpatotoxines &
neurotoxines
Abondance
Toxicit
PCR(toxin-producing
Genes)
58
Microcystines:
Screening: Test ELISA
Analyse: LC-MS
(MC-LR, -RR, -YR, -LW, -LF)
Anatoxin-a:
Saxitoxine:
Analyse: LC-MS
Screening: PSP Kit detection
Analyse: LC-MS
1. Hpatotoxine:
2. Neurotoxine:
Cyanobactries
59
Schma
opron mcy
Toxicit non lie la
morphologie !Toxique ? Toxique ?
1. Souches monoclonales
2. Echantillons ESS
Cyanotoxines-opron mcy (microcystine)
60
Des efflorescences abondantes en 2005
61
Recommendations OMS :
0
25
50
75
100
125
150
Apr-0
5Ma
y-05
Jun-
05Ju
l-05
Aug-
05Se
p-05
Oct-0
5No
v-05
Dec-
05Ja
n-06
Feb-
06Ma
r-06
g/l
Niveau dalerte 2 (OMS)Niveau dalerte 2 (OMS)
LultzhausenMain reservoir
Cyanobactries en 2005
1)
2) Moins de 1 g microcystine par litre :> 1 g.l-1
62
Cyanotoxines (mcy) - souches monoclonales
Conditions
contrles11 souches
PCR Souche Lieu Date Espce
mcyA mcyE 05BA40S1 05 / 10 / 05 Microcyst is sp. + +
05BA41S1 12 / 10 / 05 Microcyst is sp. + +
05BA43S1 26 / 10 / 05 Planktothr ix agardhii + +
05BA45S1
Bavigne
09 / 11 / 05 Planktothr ix agardhii + +
05ES37S1 15 / 09 / 05 Planktothr ix agardhii
05ES40S1 03 / 10 / 05 Planktothr ix agardhii + +
05ES41S1 12 / 10 / 05 Planktothr ix agardhii + +
05ES42S1 19 / 10 / 05 Planktothr ix agardhii + +
05ES43S1
Lulthauzen
26 / 10 / 05 Planktothr ix agardhii
05MI39S1 28 / 09 / 05 Microcyst is sp.
05MI43S1
M isre
26 / 10 / 05 Aphanizomenon gracile - -
3 genres diffrents
7/8 potentiellement hpatotoxiques
63
Travail exprimental sur les relations entre pathognes et biofilms
Racteur annulaire pour la production de biofilms
Temperature: 4C
dop avec 106 :
- 1 and 10-m billes fluorescentes
- Cryptosporidium parvum oocysts
- Giardia lamblia kystes
- Poliovirus (enterovirus)
- PhiX174 (somatic coliphage)
64
Travail exprimental sur les relations entre pathognes et biofilms
65
Les biofilms apparaissent comme tant des environnement protecteur pour les virus et les parasites Lors de flux turbulent, les dtachements de biofilms peuvent tre important, remettant en circulation des pathognes toujours actifs
Biofilms deau uses Exprimentation avec des conduites frachement excaves
Travail exprimental sur les relations entre pathognes et biofilms
66
Conclusions
Les problmes se situent des niveaux diffrents dans les pays
industrialiss et les pays en dveloppement
Laccroissement dmographique va augmenter de manire trs
importante la pression sur les eaux de telle manire que leau potable
sera un des enjeux stratgiques majeurs des annes venir
La mise en place des Plans de scurit pour leau constitue une
rponse adquate la gestion du risque biologique
mais ce risque volue (pathognes mergents) et des besoins
scientifiques et techniques spcifiques apparaissent
La R&D en gestion du risque microbiologique sera ds lors de plus en
plus sollicite.
67
CRP-GL : Centre de connaissance et dexpertise
Veille documentaire
Expertise
Analyses
68
http://swap2007.lippmann.lu/ !!! avant 1er mars !!!
69
Personnel impliqu dans lanalyse des risques microbiologiques
Cyanobactriologie Dr Raphal WILLAME
Virologie Dr Sylvain SKRABER
Dr Christophe GANTZER (LCPME, Nancy)
Parasitologie Mr Karim HELMI
Dr Isabelle BERTRAND (LCPME, Nancy)
Bactriologie Mlle Laurence LEBLANC
Ecologie Dr Isabelle THYS
Epidmiologie Dr Jol MOSSONG (Laboratoire National de Sant)
Rgulation lgale Dr Jean-Paul LICKES (Ministre de lIntrieur)
Assistance technique Mr Nicolas BONJEAN
Mme Delphine COLLARD
Mlle Julie MATHU