Cancérogenèse chimique

Introduction1 bases moléculaires et cellulaires de la cancérogenèse chimique

1-1 le cycle cellulaire1-2 l’ADN et les lésions de l’ADN1-3 cancérogène génotoxique et cancérogène non génotoxique1-4 cancérogène et procancérogène

2 les tests à court terme2-1 mise en évidence des cancérogènes génotoxiques2-2 mise en évidence des cancérogènes non génotoxique2-3 pertinence des tests à court terme

3 cancérogenèse3-1 choix de la dose, procédure3-2 pertinence et limite

conclusion

Contrôle de la proliférationFacteur de croissanceex: EGF; TGF-

Récepteurex: erb

Mortapoptosemultiplication

Second messagerex: ras

Transductionex: raf

Promoteurex: myc, jun

prolifération

G1

S

G2

M

RBG0

+

Contrôle du cycle cellulaire

cycline Dcycline Ecycline Acycline B

F+

signaux

P

P P

P

G1

S

G2

M

RBG0

Contrôle du cycle cellulaire

cycline Dcycline Ecycline Acycline B

F+

P21

P53

Télomères et télomérase : âge de la cellule

Extrémités des chromosomes(TTAGGG)n : 5 – 15 kbasesTélomérase = télomère reverse transcriptaseARN : matrice

Cycle cellulaire : diminution mort de la cellule

O

CH2

OP

O

O

O

O

NN

NN

O

NH2

P

O

O O

H

O NCH2 N

O

O

ADN = molécule chimique

guanine

thymine

hydrolyse

adduit

oxydation

Lésions de l ’ADN

Oxydation

Elimination d ’une base (site AP)

Dimères

Fixation covalente

alkylation, arylation, amination...

adduits

monovalentdivalent (pontage)

intrabrininterbrin

intercalant

Cassures simple brindouble brin

Lésions de l ’ADN

Mortnécrose/apoptose

RéparationréversionREBRENmésappariementKu/DNA PKrecombinaison...

Tolérancemutation géniquemutation chromosomique

Excision de bases

Excision de nucléotides

Exemple de système de réparation : BER et NER

1 – reconnaissance de la lésion / distorsion2 – incision, excision3 - resynthèse exacte

Xeroderma pigmentosum : système de réparation de l’ADN déficient

Peau non protégée des UV tumeurs

Tolérance de la lésion : mutation génique

C A C C G T A

G T G G C A T

Oxydation (8 oxo guanine)

réplication

C A C C G* T A

G T G G A A T

G T G G A A T

C A C C T T A

réplication

Mutation par substitution

Transition : A G ; T C

Transversion : A TA C

Mutations géniques par décalage du cadre de lecture

-GGGGGGG--CCCCCCC-

-GG GGG--CC CCC-

GG

Perte de deux bases

Décalage du cadre de lecture (frameshift – 2)

réplication

Mutations chromosomiques

- Structure des chromosomes : chromosomes circulairesfusion de morceau de chromosome…

clastogène : agent physique ou chimique capable de casser les chromosomes

- Nombre des chromosomesaneuploïdie : 2n +/- x chromosomespolyploïdie : n, 3n, 4n … chromosomes

Caryotype après traitement en fausses couleurs

Cellule tumorale (polyploïdie) Cellule normale

Cancérogène génotoxique 

Composé (molécule mère ou métabolite) dont l’activité biologique primaire est l’altération de l’information codée par l’ADN.

Mutation qui se traduit par :Activation d’oncogènesInactivation d’anti-oncogènes

Cancérogène non génotoxique (épigénétique)

Non organe spécifique : interagit avec les protéines de proliférations des cellules (en activant les protéines codées par des oncogènes ou en inhibant les protéines codées par des anti-oncogènes).

responsable d’une inflammation : facteurs de prolifération et production de radicaux libres (ex : ROS = reactive oxygen species).

Organe spécifique :hormones : œstrogène et cancer du sein, testostérone et cancer de la prostate.

TSH et thyroïdes.

Génotoxique / non génotoxique

1970 - 1978 : cancérogènes = mutagènes

1978 - 1985 : il y a quelques exceptions

1985 - 1990 : exceptions de plus en plus nombreuseautre mécanisme ?

1994 : génotoxique / non génotoxique

Détection, évaluation ??

Composé progénotoxique : bioactivation indispensable

OOH

OH

OHOH

O

OHOH

OH

G

N d ’une guanine

Cancérogenèse chimique : plusieurs étapes

Cellules épithéliales

Cellules initiées

Papillome bénin

Carcinome squameux

Carcinome spino-cellulaire

Progressionperte p53

PromotionSur-expression cycline D1

InitiationMutation H-ras

ProgressionE-cadherineTGF-

métastases

1 - Initiation (irréversible)

2 - Promotion (réversible)

3 - Progression (irréversible)

Plusieurs étapes et plusieurs clones de cellules :

mutation mutation

Facteurs de croissance

+/- facteurs de croissance

probabilité : facteurs risquesirréversible multiplication

- Cancérigènes génotoxiques : lésions tolérées – mutation – oncogène activé / anti-oncogène inactivé

Cancérigènes non génotoxiques (épigénétiques) : stimule la prolifération, inhibe l’apoptose, inhibe communication entre les cellules

- Cancérogenèse : molécule mère et/ou métabolites

Bilan première partie :

- Cancérogenèse : plusieurs étapes, phénomènes irréversibles et réversibles

2 les tests à court terme

2-1 mise en évidence des cancérogènes génotoxiques2-2 mise en évidence des cancérogènes non génotoxique2-3 pertinence des tests à court terme

Marqueurs à court terme de génotoxicité

Mortapoptose (cassure de l’ADN)nécrose

Lésionsoxydationperte de basesdimèrefixationintercalantcassures

RéparationréversionREBRENmésappariement….

Mutationsgéniquechromosomique

Essai comète :

Faux positifs : apoptose

Micronoyaux:

fémur

1 000 cellules (bruit de fond : 0,5%)1 à 2 cycles pour réponse optimaleFaux positifs : apoptose

Réparation par excision de nucléotides

1 – culture de cellules / produit à tester2 – éventuellement lésions de l’ADN réparées par NER3 – étape resynthèse en présence de nucléotides radio-marqués

Synthèse non programmée ADN (UDS)

Autoradiographie sur cellules : taches / radioactivité

UDS :

RéparationADN

Réplication

Test de Ames (Mutatest)

Sans S9 Avec S9

négatif positif

Témoins:

Bactérie + produit+/- S9

Étude des composés non génotoxique : test de proliférationtest de phosphorylation

Facteur de croissanceex: EGF; TGF-

Récepteur

multiplication

Second messagerex: ras

Transductionex: raf

Promoteurex: myc, jun

prolifération

Prolifération de péroxysomes

Organites cytoplasmiquesH2O2 oxydase /H2O2 catalaseenzymes oxydation

Produit à tester

Marqueurs d ’une génotoxicité

Batterie: spécificité

Pertinence: modèle de la cancérogenèse chimique

relation marqueur / cancer ???

donc : facteur risque (probabilité)

in vitro automatisable

extrapolation in vivobiodisponibilitéélimination (t1/2)dosebioactivation (système biaisé)

3 cancérogenèse

3-1 choix de la dose, procédure3-2 pertinence et limite

Essai de cancérogenèse sur 2 ans

Principe : Produit à tester / animal / longue duréeMarqueur : tumeur

Problème : Bruit de fond important

Fréquence des tumeurs spontanées

organe : sourisB6C3F1

mâle

sourisB6C3F1femelle

ratF344mâle

ratF344

Femelle

foie 31 % 8% 3% 3%

Surrénales 4% 1% 20% 8%

Thyroïde 1% 2% 10% 9%

Glandesmammaires

0% 2% 2% 26%

Poumon 17% 7% 2% 1%

Rongeurs habituellement utilisés en toxicologieaprès 2 ans, protégés des cancérogènes:

Exemple : détermination de la DT01; chez des souris:24 000 animaux / groupe

Compromis: MTD50 animaux / groupe

Extrapolation des résultats des études de cancérogenèse

Cancérogènes non génotoxiques :

tumeurs

Boite noire

Glycidol : Bilan : 24 organes avec des tumeurs

Rats mâles Rats femelles souris femellesSouris mâles

Rats mâles Rats femelles souris femellesSouris mâles

Limonène : Bilan : 1 site (reins) dans 1 groupe

Cytotoxicité du composé et tumeurs (MTD, 2 ans !)

2µ-globuline : protéine synthétisé chez le rat mâle (hépatique)filtrée / glomurulepartiellement réabsorbée (endocytose)

La fraction réabsorbée se trouve dans les lysosomes où la protéine est hydrolyséed-limonène se fixe sur la globuline qui n’est plus hydrolysée, elle s’accumule et entraîne la libération des enzymes des lysosomes dans le cytoplasme nécrose des cellules, inflammation chronique et développement de tumeurs.

Saccharine : formation de microcristaux dans la vessie, lésions de l’épithélium, inflammation chronique, prolifération cellulaire, tumeur

Caractérisation du mécanisme de la toxicité

Pertinence de l’information

Cancérogenèse sur 2 ans +

Conclusion :

Estimation du risque cancérogène

Cancérogène génotoxique

irréversible

1 cellule 1 clone (1 tumeur)

Aléatoire - probabilité

bilan: pas de seuilpas de dose / effetdose / probabilité

Cancérogène non génotoxique

réversible

dépend de l ’environnement (ex: inflammation, alimentation riche en AG poly-insaturés…)

bilan: dose/réponse et seuil

Mutation transmise cellules filles

10-9 10-8 10-7 10-6

Activité du TPA (phorbol ester)

0

15

3

6

9

12

Nombre de papillomespar souris

ConcentrationM

Estimation du risque cancérogène Agent à tester (100 000 / an)

structure ?

mutation in vitro (Ames) ?

cytogénétique ?

micronoyau in vivo ?

mutation in vivo (animaux transgéniques) ?

Essais non génotoxique

prolifération (foie, estomac, peau, poumon…)

peroxysomes hépatiques

thyroïdes

induction de P450

inflammation

...

en fonction des résultats de toxicologie générale (sensibilité d ’organe)

Cancérogenèse à long terme (2 ans)

Abandon du composé

Caractérisation, DSE, …

Classification des substances (Europe)

Cancérogènes

- catégorie 1 : substances que l’on sait être cancérogènes pour l’homme. On dispose de suffisamment d’éléments pour établir l’existence d’une relation de cause à effet entre l’exposition de l’homme à de telles substances et l’apparition d’un cancer.

-- catégorie 2 : substances devant être assimilées à des substances cancérogènes pour l’homme. On dispose de suffisamment d’éléments pour justifier une forte présomption que l’exposition de l’homme à de telles substances peut provoquer un cancer. Cette présomption est généralement fondée sur des études appropriées à long terme sur l’animal ou d’autres informations appropriées.

-- catégorie 3 : substances préoccupantes pour l’homme en raison d’effet cancérogènes possibles mais pour lesquelles les informations disponibles ne permettent pas une évaluation satisfaisante (preuves insuffisantes). Il existe des informations issues d’études adéquates sur les animaux mais elles sont insuffisantes pour classer la substance dans la catégorie 2.

Classification des substances (Europe)

Mutagènes

- catégorie 1 : substances que l’on sait être mutagènes pour l’homme. On dispose de suffisamment d’éléments pour établir l’existence d’une relation de cause à effet entre l’exposition de l’homme à de telles substances et des défauts génétiques héréditaires.

-- catégorie 2 : substances devant être assimilées à des substances mutagènes pour l’homme. On dispose de suffisamment d’éléments pour justifier une forte présomption que l’exposition de l’homme à de telles substances peut provoquer des défauts génétiques héréditaires. Cette présomption est généralement fondée sur des études appropriées sur l’animal ou d’autres informations appropriées.

-- catégorie 3 : substances préoccupantes pour l’homme en raison d’effet mutagènes possibles. Des études appropriées de mutagénicité ont fournies des éléments, mais ils sont insuffisants pour classer la substance dans la catégorie 2.

Etiquetage - Europe

classement Symbole Phrases de risque

Seuil (1)

Seuil (2)

Cancérogène catégorie 1 T (toxique) R 45 ou R 49 0,1% 0,1%

Cancérogène catégorie 2 T (toxique) R 45 ou R 49 0,1% 0,1%

Cancérogène catégorie 3 Xn (nocif) R 40 1 % 1 %

Mutagène catégorie 1 T (toxique) R 46 0,1% 0,1%

Mutagène catégorie 1 T (toxique) R 46 0,1% 0,1%

Mutagène catégorie 1 Xn (nocif) R 68 1 % 1 %R 40 : effet cancérogène suspecté – preuves insuffisantesR 45 : peut causer le cancerR 49 : peut causer le cancer par inhalationR 46 : peut causer des altérations génétiques héréditairesR 68 : possibilité d’effets irréversibles(1) : préparations autres que gazeuses, (2) : préparations gazeuses

Classification du centre internationale de recherche sur le cancer (CIRC/IARC)

5 catégories:

- groupe 1 : l’agent (ou le mélange) est cancérogène pour l’homme

- groupe 2A : l’agent (ou le mélange) est probablement cancérogène pour l’homme

- groupe 2B : l’agent (ou le mélange) est un cancérogène possible pour l’homme

- groupe 3 : l’agent (ou le mélange) ne peut être classé du point de vue de sa cancérogénicité pour l’homme

- groupe 4 : l’agent (ou le mélange) est probablement non cancérogène pour l’homme