Composition de Chlorella pyrenoidosa, structure des cellules et de leurs lamelles chloroplastiques, en fonction de la carence en azote et de

la levCe de carence

EVELINE GU~~RIN-DUMARTRAIT, SAYOKO MIHARA ET ALEXIS MOYSE Laboratoire de Physiologie Celluloire Ve'ge'tale Associe' au C.N.R.S., Foculte' des Scierzces, Orsay, France

Requ le 13 juin, 1969

Dt5dii d la inkmoire de feu Dr G. P. Krotkov et de feu Dr C. D. Nelson

GU~RIN-DUMARTRAIT, E., S. MIHARA et A. MOYSE. 1970. Composition de Chlorella pyrenoidosa, struc- ture des cellules et de leurs lamelles chloroplastiques, en fonction de la carence en azote et de la levee de carence. Can. J. Bot. 48: 1147-1 154.

Autospores of Cl~lorelln (produced in synchronized culture) become hypertrophied cells which have lost their capacity for cell division, when deprived of nitrogen during alternating light and dark periods.

Biochemical analyses and electron microscopic studies (freeze-etching method) reveal an inhibition of protein and pigment syntheses and some chlorophyll degradation, while lipids and carbohydrates accumulate. The thylakoids appear to be somewhat degraded and their number per chloroplast is - -

decreased. When nitrogen is supplied during the light period, a synthesis of proteins and pigments, and an

increase in the thylakoids number are noted, while, simultaneously, the lipid and carbohydrate contents are diminished; this is followed by a re-establishment of cell division.

Electron micrographs reveal a development of lamellar particles. According to their sizes and distribu- tions, we can distinguish three kinds of superimposed or juxtaposed populations within the thylakoids lamella.

The possible spatial arrangement of these particles is discussed.

Au cours de travaux antirieurs, il a CtC montrC au laboratoire que la structure, la com- position et 1'activitC photosynthktique des chloroplastes d'une plante suptrieure, le Bryo- phyllum daigremontianum, subissaient de pro- fondes modifications sous l'effet d'une carence en azote et, ensuite, au cours d'une alimentation nouvelle riche en nitrates (Bourdu et al. 1965a et 6; Rtmy et Champigny 1966). Les quantites et les teneurs en protCines et en pigments dimi- nuent au cours de la carence, mais l'amidon s'accumule dans les plastes. La reprise de l'alimentation azotCe est suivie de la consom- mation de l'amidon et d'une synthise active de prottines et de chlorophylle, accompagnCes d'un abondant dkveloppement des systimes mem- branaires plastidiaux.

Cependant une difficultk, like A l'utilisation de feuilles de plantes supCrieures, fut rencontrte 2 ce propos. Dans une m&me feuille, il est bien facile de reptrer les rkgions les plus carencCes (les plus 2gtes) et de les distinguer des plus jeunes beaucoup moins carencCes parce que sYCtant nourries avant tout aux dkpens des prkckdentes. Mais il est malaisC, sinon impos- sible, d'obtenir des fractions chloroplastiques homogines dans leur t tat nutritionnel. L'absence dYhomogtnCitt constitue une gtne en particulier

pour diverses Ctudes de structure. Aussi nous a-t-il paru bon de reprendre l'examen des effets de carence sur la structure fine des plastes examinee en microscopie tlectronique apris cryodkcapage, avec des Chlorelles synchronides, puis carenctes, puis en levee de carence. De telles cellules, homogtnes A tous les stades, constituent un matkriel de choix pour les ttudes de biologie cellulaire en raison d'une grande homogtnCitC de structure, de croissance et de dCveloppement.

Materiel et techniques

I . Matiriel et me'thodes de culture Des cultures synchrones de Chlorella pyrer~oidosa

Chick (souche 21 1-8b de l'algothique de 1'UniversitC de GBttingen) sont obtenues par la mkthode de Lorenzen (1964). Les algues sont sournises A une alternance de periodes d'illumination de 14 h (10000 lux) et de pModes d'obscurite de 10 h (L.D. 14 h/10 h), A 30 "C.

Les suspensions sont diluees A la densite algale de 1.56 X 109 par litre de culture, au debut de chaque periode d'illumination. Les algues liberent leurs auto- spores en 3 h, A l'obscurite, et sont synchrones B au moins 98% (voir GuBrin-Dumartrait 1968).

Un matMel homogene pour debuter l'ttude des carences en azote est constitut par les autospores, rkoltees A la fin d'une periode d'obscurite.

Ces autospores sont repiquees A la concentration de 5 X lO9/l de milieu de culture dans lequel KN03 est

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TABLEAU I Variations de la croissance, de la teneur en rnatitres skhes, de l'accurnulation de l'azote

proteique, des pigments et de l'ensernble des lipides chez Chlorella pyrenoidosa, en fonction de la carence et de la levee de carence en azote.

Aprts 4 cycles Levee de carence, de carence e n 8 h L

Inoculum -N Tm (-N1-I-N Tm

Volume d'algues en m! 1-1 0.35 1.53 11.25 1.70 17 Nornbre de cellules 1-1 (X 10-9) 5 4.5 109 4.5 135 Masse mat. s., en rng/rnl

d'alyes fraiches 177 325 219 251 206

En mg 1-1 de culture: N prottique Li~ides ~6lorophylles 2.2 0.9 59.6 2.4 102 CarotCnoYdes 0.5 0.6 12.4 1 20.4 Glucides (approxirnatl) 14 229 821 110 969

En rng/rnl d'algues fraiches: N prot6ique 10.7 3.8 10 11.1 12.1 Lipides 43.5 118.5 54.7 89.5 44.8 Chloro~hvlles 6.4 0.6 5.3 1.4 6 Chi. nfchi. b 2.9 1.6 2.8 2.1 3 CarotCnoides 1.3 0.4 1.1 0.6 1.2 Glucides (approximatif) 41 150 73 65 57

NOTES: - N: Culture sur milieu sans mote pendant quatre cycles L.D. 14 h/10 h. 10 000 lux. 30°C. (-N) + N: aprb le traitement ci-dessus, les algues sont cultivdes pendant 8 h sur milieu complet, 10 000 lux.

30 "C. - - -. Tm: tdmoin. Masse mat. s.: masse de matidres sdches. Lipids: dhignent ici les substances extraites par le dthanol-chloroforme, i I'exception des chlorophylles et des

carotdnoides.

rernplack par KzS04 (le molybdate d'amrnoniurn apportB par un melange de carbone et de platine, forme un angle par la solution d'oligo616ments est tenu pour negligeable). voisin de 34" avec le plan du substratum. Les dpliques

Les Chlorelles sont cultivkes dans ce milieu pendant sont photographiees B l'aide d'un microscope HITACHI quatre cycles L.D. 14 h/10 h, dans les memes conditions HU 11. que les cultures synchrones, hormis la dilution au debut RCsultats et discussion de chaque pCriode de lumitre.

Apres cette phiode, les algues carenckes sont repiquees I. Croissance et mod$cations de la composition en milieu contenant KN03, ?I la mCrne densite qu'en fin des Chlorelles aprb carence en azote-levee de carence, pour un cycle de culture. de carence

2. Techniques Les volumes et les nombres d'algues, les masses de

matitre skhe et les teneurs en pigments sont determines (voir GuCrin-Dumartrait 1966).

L'N protkique, avec en fait 1'N des acides nucleiques, est dose aprts minkralisation des prottines (voir Bourdu et al. 1965~).

Les substances lipidiques sont extraites globalement, en trois extractions successives, par le melange chloro- forme-methanol 2 v / l v. Par addition de 0.2 volumes d'eau, on separe a p r b 5 h une fraction lipidique (Hira- yarna 1965) qui est dessichk sous vide, puis pes6e. Les pigments, doses stparkrnent, sont soustraits par calcul.

La structure des algues est Ctudik par la technique de cryodecapage (Moor 1964). Les cellules sont trait6es par la glycerine B 20% pendant 1 ou 2 h, avant d'Ctre con- gel& dans du freon (voir Gu6rin-Dumartrait 1968).

Le cryodecapage est fait au moyen d'un appareil Balzers BA 500 R. La direction de I'ombrage, produit

1. Chlorelles careizce'es en N Les principaux rtsultats sont reunis dans le

tableau I. En quatre cycles de culture sur milieu sans N, le volume des algues est augmente de 4 i 5 fois (augmentation qui a ete contralee par mesure des diamktres cellulaires au microscope photonique), sans qu'il y ait eu de division cellulaire. Ces algues hypertrophiees ont une teneur en matikres skches, exprimte par milli- litre d'algues fraiches, qui est beaucoup plus tlevee que celle du ttmoin: ceci indique que leur teneur en eau par rapport a la matikre skche est considkrablement diminute.

De plus, les suspensions d'algues carenctes sont de couleur jaune : la teneur en chlorophylles totales par millilitre d'algues fraiches est en

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eff'et rtduite d'au moins 90%; 1e rapport quantitatif chlorophylle alchlorophylle b est nettement diminut.

La teneur des algues en carottno'ides est rtduite d'environ 60 B 65y0, ainsi que leur teneur en N prottique. Par contre, la teneur en substances lipidiques a plus que doublt.

La teneur en glucides, que l'on peut estimer par difftrence et dont on se rend compte par examen en microscopie Clectronique, a notable- ment augmentt. (On a admis que les sels mint- raux reprtsentent environ 10yo de la matikre skche, selon Champigny (1957)). La masse globale, prottines - acides nucltiques a t t t approximativement calculte en multipliant la quantitt d'N dost par 6.25, en admettant que ces substances renferment environ 15 16% d'N.)

Notons que les teneurs en lipides et en glucides des tCmoins ont augmentt mais de f a ~ o n moins importante au cours des quatre cycles.

Si on examine les quantitts de substances accumultes par les cultures en 4 jours, on constate que la production de matikre vtgttale globale, de prottines et de pigments est stvkre- ment inhibte par la carence en N; il y a m&me une destruction des chlorophylles touchant apparemment davantage la chlorophylle a que la chlorophylle b.

Seules les quantitts de lipides et de glucides sont importantes.

2. C~zlorelles en leve'e de carence Quand les algues carenctes sont repiqutes en

milieu complet, B la lumikre, en prtsence de COz, d'importants remaniements mttaboliques sont constatts dks les 8 premikres heures d'il- lumination (Tableau I). Aprks ces 8 heures, les cellules ont ltgkrement augmentt de volume sans se diviser; leur teneur en eau est nettement plus Clevte, sans atteindre cependant celle du ttmoin. Pour ce dernier, le repiquage en milieu neuf provoque une reprise de la croissance en volume et en nombre d'algues plus importante que chez les algues carenctes. L'tltvation de la teneur en eau y est relativement plus faible.

Quand les algues prtalablement carenctes sont cultivtes en milieu complet pendant un cycle entier (L.D. 14 h/10 h), une division cellu- laire trks active a lieu B l'obscuritt, aprks laquelle la population algale s'accroit d'environ 12 fois.

Cette importante division fait suite B une reprise rapide des synthkses des pigments et des prottines cellulaires B la lumikre.

En effet, aprks 8 h d'illumination, le reverdis- sement des suspensions d'algues est trks net: il y a environ 2.5 fois plus de chlorophylles dans les cultures. Le rapport chlorophylle a lchloro- phylle b s'tlkve sans cependant atteindre la valeur des ttmoins. La reprise de synthkse des carottnoi'des est moins importante.

Parallklement au reverdissement, une active synthkse prottique est observte: quantitt et teneur d'N prottique sont accrues d'environ 3 fois durant les 8 h.

Cette rapide formation de pigments et de prottines est lite B une consommation de sub- stances lipidiques (la quantitt de lipides des cultures est diminute de 15 B 20y0) et de glucides qui sont estimts par calcul.

Malgrt l'importante accumulation de pro- ttines, la masse de matikre skche des cultures en levte de carence a diminut d'environ 10yo aprks 8 h. I1 est probable que lipides et glucides sont utilists en grande partie comme source de chaines carbontes.

Chez le ttmoin, le repiquage en milieu neuf stimule aussi les synthkses de pigments et de prottines, mais dans de moindres proportions que chez les algues carenctes. Pendant les 8 h d'illumination, la masse de substances skches et la quantitt de lipides par culture augmentent ltgkrement: il apparait que l'activitt photo- synthttique dtpasse nettement l'utilisation simul- tante des rtserves.

II. Structure des algues pendant la carence, puis en levde de carence

Les modifications de la composition des algues se traduisent dans la structure de la f a ~ o n suivante.

Une jeune Chlorelle rtcoltte en fin d'obscurite, point de dtpart de la culture sur milieu caren&, est reprtsentte dans la figure 1. Les cellules, de forme allongte, ont alors une paroi mince. Le chloroplaste relativement volumineux renferme des thylakoides nombreux et serrb, de rares grains d'amidon et quelques globules lipidiques. Le systkme vacuolaire est peu dtveloppt (voir Gutrin-Dumartrait 1968).

I . Chlorelles carence'es en N Aprks deux cycles de culture (L.D. 14 h 110 h)

en milieu sans N, les algues ont l'aspect present6

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dans la figure 2. Les cellules ont augment6 de volume en prenant une forme sphtrique. L'tpaisseur de la paroi est comprise entre 1900 et 2700 A, alors que chez les Chlorelles syn- chrones, elle varie gtntralement entre 1200 et 1700 A. La forme en cloche du chloroplaste est encore discernable mais celui-ci ne renferme plus que quelques faisceaux de lamelles (la teneur en chlorophylles par millilitre de matikre fraiche est diminute d'environ 8OY0 par rapport A l'inoculum); par contre, il est riche en amidon. Le systkme vacuolaire s'est developpt et on observe quelques amas de substances lipidiques dans le cytoplasme. Mis A part ces amas et la grande rtduction du systkme lamellaire, l'aspect des algues carenctes rappelle celui des Chlorelles synchrones aprks 10 A 1 4 h d'illumination (Gutrin-Dumartrait 1968).

Des surfaces lamellaires chloroplastiques sont mises en tvidence dans la figure 3A et B. En Y, les surfaces sont constitutes d'un support d'aspect lisse couvert de particules bien dis- tinctes les unes des autres et de diametre com- pris entre 70 et 120 A; dans les plus grosses (diametre 110-120 A) qui sont les plus nom- breuses, on peut gtntralement distinguer 2 A 4 sous-unitts (voir fig. 3B, dttail). La concentra- tion des particules est le plus souvent comprise entre 1900 et 2400 par p2.

Ces valeurs sont analogues A celles qui sont relevtes sur les surfaces de mCme type, dans les Chlorelles synchrones en fin d'illumination (Gutrin-Dumartrait 1968).

Les surfaces dtsigntes par Z prtsentent des particules semblables A celles des couches Y par leur taille et leur aspect, mais les particules sont ici trks disperstes sur un fond ltgkrement granuleux. De plus, ces surfaces Z semblent

constituer la face externe des empilements de thylakoi'des, autremeilt dit la surface exttrieure des thylakoi'des qui se trouvent en contact avec le stroma (fig. 3A).

On observe, en outre, des surfaces de type X, A grandes particules (pas de photographie), analogues A celles qui sont prtsenttes dans les figures 6-8.

Aprds deux cycles suppltmentaires sur milieu cnrenct, les modifications de la structure des cellules observtes aprks 48 h de carence sont trks accentutes (fig. 4A). Les algues ont une paroi tpaisse (1900 A 2700 A). Leur cytoplasme est envahi par des amas de substances lipidiques de forme irrtgulikre, comparables A ceux qui ont t t t rtcemment observts par Mayer et Czygan (1969) chez Chlorella fusca carencte en azote. Dans la cellule prtsentte ici, ces amas portent des particules de taille variable, t r b intgalement rtparties. I1 est probable qu'ils sont dus essentiellement A l'importante synthkse de lipides prtctdemment dtcrite (voir Sec. 11) et aussi en partie A une lyse du protoplasme.

Le chloroplaste, encore discernable, renferme surtout des plages lipidiques portant quelques particules disperstes et des grains d'amidon semblables A ceux qui sont observts aprks 48 h de carence. Trks rarement, quelques thylakoi'des apparaissent en coupe transversale. Quelques surfaces lamellaires sont mises en tvidence, telles celles qui sont visibles dans la figure 4A et B; dans la figure 4A, elles recouvrent apparem- ment un gros grain d'amidon.

Ces surfaces sont tres differentes de celles que Yon rencontre chez les algues ttmoins ou ca- renctes depuis 48 h et leur sont difficilement assimilables: elles sont constitutes par un sup- port lisse portant de nombreuses particules

FIG. 1. Autospore de Chlorelle recoltee B la fin d'une periode d'obscuritk d'une culture synchrone. FIG. 2. Chlorelle aprks 48 h de carence en azote. FIG. 3A et B. Surfaces lamellaires chloroplastiques de types Y et Z (voir texte) dans une Chlorelle carcncte en azote depuis 48 h. En B: la flkche (+) indique quelq~~es particules

FIG. 4 ~ e t B. Chlorelles aprks quatre cycles de carence en azote. En B, gp: quelques groupes de particules sur une lamelle chloroplastique (Ic). FIG. 5A et B. Chlorelles en lev& de carence depuis 8 h, A la lumikre (aprb quatre cycles de carence prealables). Voir ICgende des figs. 1, 2 et 3.

FIGS. 6, 7, 8. Surfaces lamellaires chloroplastiques de types X et Y' (voir texte) dans des Chlorelles en levee de carence d e p ~ ~ i s 8 h, A la lumikre. Voir legende des figs. 1, 2 et 3. pZ: particules de diamMre 120 A 130 A. Les fleches (->) non accompagnCes d'indication dCsignent la faible denivellation observk entre les surfaces Y' et X.

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irregulibrement dispodes; la plupart d'entre elles semblent Ctre accolCes par groupes de deux B quatre unitb. Les plus petites particules discernables ont un diamktre compris entre 120 et 140 ?I (fig. 4B).

Ces lamelles d'aspect anormal, ainsi que les plages lipidiques dCcrites dans le chloroplaste, peuvent provenir d'une dCgradation plus ou moins poussCe des thylakoi'des, les lipides pouvant aussi Ctre d'origine matricielle.

2. Clzlorelles en leve'e de carence Les importants remaniements mCtaboliques

mis en Cvidence aprks 8 h de lumikre, par les dosages, se manifestent dans la structure des algues (fig. 5A et B). Les cellules sont toujours de grande taille, mais les plages lipidiques sont en rigression dans le cytoplasme et ont pratique- ment disparu du chloroplaste. Ce dernier ren- ferme encore quelques grains d'amidon; de nombreux faisceaux he thylakordes sont apparus (fig. 5B). L'ultrastructure de ces thylakoi'des a pu Ctre mise en Cvidence. En plus de surfaces de type Y, dans les figures 6, 7 et 8 les princi- paux types de surfaces suivants apparaissent.

Des surfaces de type X-ConstituCes de particules compostes de grande taille (diambtre 140 B 170 ?I, atteignant parfois 180 A). Bien distinctes les unes des autres (1400 B 1700 par

p2), elles se dttachent trbs nettement sur un fond lisse ou trbs 1Cgkrement granuleux.

Des surfaces de type Y'-ConstituCes de particules petites (diamktre 60 a 110 A) et serrCes (2500 a 3000 par p2). Assez peu distinctes les unes des autres et de faible relief, elles semblent couvertes par un mince film non particulaire.

Sur les couches de type Y', sont parfois plaquCes des particules (pZ) de diambtre voisin de 120-130 A, irrCgulikrement rCparties et gCnCralement trbs disperstes (figs. 7 et 8).

L'aspect, les dimensions des particules pZ et la repartition de ces dernikres sur les surfaces Y' suggErent que ces formations (Y' + pZ) sont analogues a celles qui sont dtsignCes par Z sur la figure 3A.

3. Relations possibles entre les couches mises en tvidence

S'il est trks difficile de localiser dans le thyla- koi'de les couches rCvClCes par le cryodCcapage, on peut du moins faire des hypothkses sur leurs relations possibles, telle celle qui est illustrCe par la figure 9.

Les couches Y' et X, qui feraient partie intkgrante de la membrane du thylakoi'de, paraissent situtes a des niveaux trks voisins. Les flkches porttes sur les figures 6, 7 et 8, indiquent

FIG. 9. Representation schernatique de deux thylakoi'des superposes et des couches X, Y et Y' (voir texte) rnises en Cvidence par le cryodecapage. Px: grandes particules de diarnetre 140-170 A. Py: petites particules de diarnetre cornpris entre 70 et 120 A. Regions noircies: substance de nature l ipidiq~~e (?) formant le support des Px (cGtC lumen) ou des Py (vers I'exterieur du thylako'ide). Regions pointillees: matrix de nature vraisernblablernent lipidique qui entoure Px et Py et par laquelle passe la fracture, separant ainsi les deux populations de particules respectivernent liees 3. leur support. Pz: particules superficielles (qui seraient en contact avec le stroma), de diarnetre 120-130 A.

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la faible dtnivellation qui apparaPt souvent entre ces deux couches, les particules de Y' semblant recouvrir les particules de X. Cette disposition est tgalement mise en tvidence par Branton et Park (1967), par Phung-Nhu-Hung et al. (1969) et par Rtmy (1969) chez les plantes suptrieures, pour deux populations de particules tout a fait comparables B celles qui sont dtcrites ici.

Pour ttablir les relations possibles entre les deux groupes de particules, il faut tenir compte du fait que chez les Chlorelles ttmoins, l'tpais- seur des thylakoi'des, mesurte sur des coupes transversales, est comprise entre 240 et 260 A. Comme la hauteur des particules X, approxi- mativement calculte d'aprks la longueur de leur ombre, est gtntralement voisine de 110 A, il n'est pas possible que les particules qui com- posent Y' forment une couche bien distincte au- dessus d'une couche X. Comme Branton et Park (1967), nous sommes conduits 2 admettre que les partieules constituant Y' sont pratiquement intercaltes avec les particules X.

De plus il apparait que les couches 2 petites particules (diamktre 70 a 110-120 A) peuvent Ctre observtes au moins sous les deux aspects suivants.

(a) L'aspect Y' dtcrit ci-dessus, dans lequel les particules sont peu distinctes, avec un faible relief. Cet aspect est le plus souvent observe en continuitt avec une couche X et pratiquement sur un mCme plan.

(b) L'aspect Y prtsentt dans la figure 3, dans lequel les particules apparaissent bien nettement sur un fond lisse. Contrairement a l'aspect Y', l'aspect Y n'est gtntralement pas rencontrt sur le meme plan qu'une couche X. Des couches Y ont i t& ttudites chez les Chlorelles synchrones sous le nom de surface de type 1. Rappelons que les particules y sont d'autant plus serrtes que les lamelles sont plus jeunes (Gutrin- Dumartrait 1968). On observe aussi que les petites particules sont plus serrtes dans les thylakoides jeunes des Chlorelles en levte de carence que dans les thylakoi'des plus agts des Chlorelles carenctes en azote depuis 48 h.

Comment expliquer ces deux aspects mis en tvidence pour une mCme couche? Tenant compte de l'ensemble des observations faites, l'aspect Y' serait mis en evidence quand la fracture passe entre deux thylako'ides superposts (voir le schtma propost fig. 9): il s'agirait de la surface

des thylakoi'des, constitute par les petites particules couvertes ou relites entre elles par une substance non particulaire formant support.

L'aspect Y serait mis en tvidence lorsque la fracture, passant ti l'inttrieur de la membrane, stpare les petites particules des grosses parti- cules: on peut alors observer des couches X ou des couches Y, mais non des surfaces X et Y sur un mCme plan.

On peut admettre que, lors du cryodtcapage, les populations de particules bien que mcltes, sont chacune solidaires de leur support, l'un etant situt vers l'exttrieur du thylakolde, l'autre du cot6 du lumen.

Si les particules X et Y' sont considtrtes comme incluses dans la membrane, les popula- tions de particules pZ paraissent Ctre localistes 2 la surface des thylako'ides. Elles semblent n'exister que sur les membranes en contact avec le stroma. Sur la figure 7, ces particules pZ sont plaqutes sur un fond granuleux, constitut vrai- semblablement par une couche Y' qui elle- mCme enrobe une couche X.

Hormis ce qui concerne les particules super- ficielles pZ, le schtma adopt6 est conforme & celui de Branton (1967), repris par Park et Pfeifhofer (1968).

D'autres auteurs (Miihlethaler et al. 1965) sont arrivts a une hypothkse difftrente B partir de rtplique de chloroplastes de plantes sup& rieures et de Chlorelles: la membrane du thxla- ko'ide serait constitute d'une couche lipidique portant, enchasstes, des particules de grande taille c6tt stroma, et des particules de petite taille c6tt lumen.

I1 faut reconnaitre que les images en cryodt- capage des empilements de thylako'ides-et meme de thylako'ides isolts-ne permettent pas de trancher de f a ~ o n decisive entre les deux hypothkses.

A l'appui de l'hypothkse prtsentte ici viennent les faits suivants.

Diverses techniques qui mettent en tvidence la vraie surface des -thylakoldes, ombrage, coloration ntgative, dtcapage profond (deep etching) (Howell et Moudrianakis 1967a et b; Park et Shumway 1968; Park et Pheifhofer 1968), ne rtvklent pas de couche de type X en contact direct avec le stroma, mais des couches lisses, ou finement granuleuses, ou couvertes de particules quadratiques de 120 A labiles dans

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GUBRIN-DUMARTRAIT ET AL.: STRUCTURE DE CHLORELLA ET CARENCE EN AZOTE 1153

l'eau ou dans des solutions d'EDTA, c'est-A- dire des surfaces ressemblant davantage B Y' ou B z.

D'autre part, par action de dttersifs, on dttache en premier des fragments subchloro- plastiques enrichis en petites particules et en- suite des fragments enrichis en grosses particules, ces derniers semblant fixts plus profondtment dans la lamelle. D'aprks les travaux de Briantais (1966) et de Dilley et al. (1968), il semble bien que les petites particules (type Y-Y') qui sont libertes du substratum membranaire par les dttersifs comprennent les pigments et cofacteurs du systkme 1. D'autre part, dans un travail anttrieur, l'un de nous (Gutrin-Dumar- trait 1968) a suggCrt que dans les petites parti- cules de type Y-Y' sont localistes des complexes multienzymes ntcessaires h la croissance des thylakoides.

De plus, parmi les particules tliminables par l'eau ou par les solutions d'EDTA, seraient des complexes enzymatiques tels que la rubimtdine, l'ATPase, la carboxydismutase (Howell et al. 1967a et b). 11 est d'ailleurs possible que ces derniers enzymes soient dans la population de type Z, en contact avec le stroma. Les grosses

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particules X constitueraient des complexes riches en pigments et cofacteurs du systkme I1 (Dilley et al. 1968).

Conclusions Repiqutes en milieu sans azote, les autospores

de Chlorelles sont capables d'une importante croissance en volume, mais la division cellulaire est inhibte dks le premier cycle de culture.

Parallklement B une forte inhibition des synthkses prottiques, les algues se dtpigmentent rapidement. Aprks 48 h de carence, la teneur en chlorophylles de la matikre fraiche est dtja diminute d'au moins 80%; 1e chloroplaste est rtduit B quelques lamelles dont l'ultrastructure est voisine de celle qui est observte chez les Chlorelles synchrones entre 8 h et 14 h d'il- lumination.

Cette faible teneur en chlorophylles rend ntanmoins possible une importante activitt photosynthttique qui donne lieu B une accumu- lation de lipides et de glucides. D6s 48 h de carence, des amas lipidiques, difftrents des globules lipidiques rencontrts chez les Chlorelles synchrones, et de nombreux grains d'amidon

apparaissent dans les cellules dont la paroi est tpaisse.

A p r b 4 joui-s de carence, l'appauvrissement de la mati6re fraiche en chlorophylles atteint au moins 90% tandis que la teneur en lipides est doublte. D'autre part, la teneur en eau est nettement diminute. Cytoplasme et chloroplaste sont riches en amidon et en plages lipidiques. Toutes ces caracttristiques, jointes a 1'Cpaisseur de la membrane, font ressembler la cellule B un gros organe de rtserves.

Les lamelles chloroplastiques qui sont rares sont, de plus, dtsorganistes. 11 semble qu'aprks 4 jours de carence, une lyse de la matikre vegttale dtbute dans tout la cellule.

L'ensemble de ces rtsultats est en accord avec ceux de Bourdu et al. (1965a et b) relatifs aux effets de la carence en N chez l'orge: les pht- nomknes d'inhibition de la croissance, de diminution de la teneur en eau par rapport h la matikre dche, de dtpigmentation, de rtduction du systkme lamellaire chloroplastique et d'ac- cumulation d'amidon sont en effet communs aux deux organismes; par contre, le grand enrichisse- ment en lipides semble Ctre particulier aux algues (Fogg et Collyer 1953; Miller 1962).

Lors de la levte de carence, les syntheses prottiques et pigmentaires reprennent trks vite.

Le temps de latence est apparemment court, puisqu'en 8 h A la lumiere, les quantitts de proteines et de chlorophylles ont B peu p r b triplt. En m2me temps la teneur en eau des algues augmente. Ces transformations sont accompagntes d'une rtorganisation du chloro- plaste avec apparition de faisceaux de lamelles. Parallklement B ces remaniements, une utilisa- tion des rtserves lipidiques et glucidiques des algues est observte.

Les cellules et les chloroplastes trks alttrts par la carence sont donc bien capables de rt- cuperer leur structure et leur composition normales, comme l'ont tgalement montrt Mayer et Czygan (1969).

Les thylakoides, ap rb 8 h de levte de carence, ont une ultrastructure bien difftrencite. On y observe trois principaux types de populations particulaires.

D'aprks les relations que ces dernikres prt- sentent entre elles. la membrane du thvlako'ide serait constitute de grosses particules et de petites particules enchasstes et lites plus ou moins

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profondement dans une substance non particu- laire, vraisemblablement de nature lipidique. La troisiime population de particules est irrkguliire- ment plaqute B I'extCrieur du thylakoi'de; elle semble n'exister que sur les membranes en contact avec le stroma.

Ainsi, avec une population homogine de Chlorelles carencies, la levee de carence est tris rapide, tant dans l'ultrastructure du chloro- plaste que dans la structure gkntrale et la composition de la cellule. Le retour des algues B un Ctat apparemment normal se manifeste dans le fait que, dis le premier cycle de culture en milieu complet, toutes les algues en suspension prtsentent une division cellulaire intense, liberant chacune en moyenne 12 autospores de m&me apparence que celles des ttmoins. La croissance rapide des chloroplastes, la possibilitt d'ex- aminer leur Cvolution B divers stades en font un matCriel de choix pour tenter de comprendre la structure fine des thylakoides.

Remerciements

Nous remercions vivement Mr. M. Hirschauer, qui a obtenu les ripliques presentees dans ce travail, ainsi que le Professeur Tran-Lefort, qui a eu l'obligeance de nous pr&ter le microscope du Laboratoire de Cytobiologie experimentale.

BOURDU, R., M-L. CHAMPIGNY, M. LEFORT, R. RBMY et A. MOYSE. 1965a. Structure et activitds de I'appareil photosynthktique des feuilles de Bryop/zyNum daigre- mon~iunrim Berger, en fonction de leur croissance, de la carence et de la nutrition azottes. I. Croissance et activite photosynthetique des feuilles. Physiol. Veg. 3: ?nC-177 ""< <-. .

BOURDU, R., M-L. CHAMPIGNY, M. LEFORT, M. MASLOW et A. MOYSE. 1965b. Structure et activites de I'appareil photosynthetique des feuilles de Bryophyll~rrrz dnigre- rrzonlian~mz Berger, en fonction de leur croissance, de la carence et de la nutrition azotees. 11. Structure, reaction de Hill et photophosphorylation cyclique des chloroplastes. Physiol. Veg. 3: 355-392.

BRANTON, D. 1967. Structural units of chloroplast membranes. Darzs Le chloroplaste. Ridigtpar C. Siron- val. Masson et Cie, Paris. pp. 48-54.

BRANTON, D., et R. B. PARK. 1967. Subunits in chloro- plast lamellae. J. Ultrastruct. Res. 19: 283-303.

BRIANTAIS, J-M. 1966. lsolement et activite de particules chloroplastiq~~es correspondant aux deux systemes photochimiques. PhotocJiem. Photobiol. 5: 135-142.

CHAMPIGNY, M-L. 1957. Etude de la croissance d'algues monocellulaires en cultures accelCrees (Chlorelles et especes voisines). IV. Variations de la composition en acides amines de ChloreNa pyrenoidosn, selon la nature de l'aliment azotk. J. Rech. C.N.R.S. 38: 72-76.

DILLEY, R. A., C . J. ARNTZEN et L. P. VERNON. 1968. Freeze-etch comparison of the structure of detergent- prepared si~bchloroplast particles with the structure of intact chloroplast membranes. J. Cell Biol. 39: 34a.

FOGG, G. E., et D. M. COLLYER. 1953. The accumulation of lipids by Algae. Darzs Algal cillture from laboratory to pilot plant. Rirligtpar J. S. Burlew. Carnegie Institu- tion of Washington Publication 600, Washington D.C. DD 177-181.

G~~RIN-DUMARTRAIT, E. 1966. Quelques effets du 3- amino-1,2,4-triazol sur Cl~lorella pyrerroidosu Chick- Recherches sur I'action de I'aminotriazol sur la synthkse des acides nucleiques chez des Chlorelles ci~ltivees en cultures synqlirones. Physiol. Veg. 4: 135-193.

1968. Etude, en cryodecapage, de la morphologie des surfaces lamellaires chloroplastiques de Chlorella pyrenoidosn, en ci~ltures synchmnes. Planta, 80: 96- 109.

HIRAYAMA, 0. 1965. Lipids and lipoprotein complex in photosynthetic tissue. 1. Separation of lipids from whole leaves and from their chlorophyll lipoprotein of Sapiun~ sebifkrum Roxb. J . Biochem. 57: 581-589.

HOWELL, S. H., et E. N. MOUDRIANAKIS. 19670. Hill reaction site in chloroplast membranes: non-participa- tion of the quantasome particle in photoreduction. J. Mol. Biol. 27: 323-333.

19676. Function of the "quantasome" in photo- synthesis: structure and properties of membrane- bound particle active in the dark reactions of photo- phosphorylation. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 58: 1261-1268.

LORENZEN, H. 1964. Synchronization of Chlorella with light-dark changes and periodical dilution of the population to a standard cell number. Dans Synchrony in cell division and growth. RPdigk par E. Zeuthen. Interscience Publishers, New York, London, and Sydney. pp. 571-579.

MAYER, F., et F-C. CZYGAN. 1969. Wnderungen der Ultrastrukturen in den Griinalgen Atzkistrodesmus braurzii und Clrlorella jlrsca var. rubescens bei Stick- stoffmangel. Planta, 86: 175-185.

MOOR, H. 1964. Die Gefrier-Fixation lebender Zellen und ihre Anwendung in der Elektronenmikroskopie. Z. Zellforsch. 62: 546-580.

MUHLETHALER, K., H. MOOR et J. W. SZARKOWSKI. 1965. The ultrastructure of the chloroplast lamellae. Planta, 67: 305-323.

PARK, R. B., et A. 0. A. PHEIFHOFER. 1968.Thecontinued presence of quantasomes in ethylenediaminetetra- acetate-washed chloroplast lamellae. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 60: 337-343

PARK, R. B., et L. K. SHUMWAY. 1968. The ultrastructure of fracture and deep etch faces of spinach thylakoids. Dans Comparative biochemistry and biophysics of pho- tosynthesis. RidigP par K. Shibata, A. Takamiya, A. T. Jagendorf, and R. C. Fuller. University of Tokyo Press. pp. 57-66.

PH~NG-NHU-HUNG, S., A. LACOURLY et C. SARDA. 1970. Etude de 1'Cvolution en chloroplastes des plastes Ctiolts d'Orge. I-Structure examinee par cryodeca- page. Z. Pflanzenphysiol. 62: 1-16.

RCMY, R. 1969. ~ t i ~ d e de la structure des lamelles chloro- plastiques de Vicia,fi?ba L. par la technique du cryod6 capage. C. R. Acad. Sci. Paris, 268; 3057-3060.

REMY, R., et M-L. CHAMPIGNY. 1966. Structureet activites de I'appareil photosynthetique des feuilles de Bryo- p/iyllrrm dnigrenzonlinnurn Berger, en fonction de la carence et de la nutrition azotbes. 111. Composition des cliloroplastes et rtpartition des produits photo- synthttiques. Physiol. Veg. 4: 237-261.

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