FACULTÉ DES SCIENCES DE MARSEILLE

LABORATOIRE DE CHIMIE BACTÉRIENNE (C.N.R.S.)

Contribution à l'étude dumétabolisme du glucose chez~ip6ntgee~ ~tackegi

THÈSE DE DOCTEUR-INGÉNIEUR (BIOCHIMIE)

présentée par

Maurice RAIMBAULT

1969

MEMBRES DU JURY

MM. .i.-c, SENEZ. Président

J. RICARD

F. PICHINOTY Examinateurs

Y. DOMMERGUES 1

UNIVERSI~ D'AIX-MARSEILLE

FACULTE DES SCIENCES DE MARSEILLE

Doyens honoraires: MM. MARCHAUD, CORROY, CHOUX.

Professeurs honoraires: MM. J. MARC IffiUD , C. PETIT, J. BOSLER, A. TIAN,L. MARGAIL"LAN, P. BENOIT, H. CABANNES, P. CHOUX,G. LIANDRAT, R. CERIGHELLI, C. CORROY, L. ROYERP. VINCENS INI •

Doyen 1 M. v. BODIOU Assesseur : M. A. GUILLEMONAT.

Secrétaire principal honoraire 1 M. H. LANFRANCHI.

Conseiller, chef des services administratifs: M. C. MOYNAULT.

PROFESSEURS

MM. J. VALENSIP. ROUARDH. PRATP. DESNUELLEM. ABELOOSM. MERIGOUXC. FEHRENBACHÂ. FAVREA. GUILLEMONATG. CARPENIC. J AUSSERANR. MOLINIERY. DOUCETJM.SOURIAUJ. ME'IZGERL. FaURESD. MALEG. BODIOUM. NAUDETJ. PAILLARDP. BOUSQUETP. PE3TEILP. CASAL

Mécanique expérimentale des fluidesPhysique généraleBotaniqueChimie biologiqueBiologie généralePhysique industrielleAstronomieMécanique de l'atmosphère et météorologioChimie industrielleChimiePhysique expérimentaleBiologie végétaleP:jJ-'::':':' Cl....CMéthodes mathématiques de la physiqueChimieMathématiquesPhysiqueMathématiques appliquéesChimie des corps grasPsycho-physiologiePhysiquoPhysiqueMécanique rationnelle et appliquée

.../ ...

G. GOUVERNET Géologie appliquéeA. VISCONTI PhyGique théorique, BLANCHJ.RD Mathématiques généraleil.

M. DUSSJ. RDIER Physiologie animaleM. PEBROT PhysiqueP. QUEZEL BotaniqueE. CRAUSSE Physique (Avignon)f • JULG Chimie théorique..t, •

S. TL'l..Y (Mme) Géologie historiqueF. TESSIER Géologie généraleML.FURNESTIN (Mme) Biologie animaleM. BERTRAND ChimieJ. TROMPETTE PhysiçueM. LAFFIrrTE ChimieR. FRAISSE MathématiquesC. BLANCHARD (Mme) MathématiquesR. NEGRE Biologie végétaleR. COULON Ph,ysiqueR. KERN MinérFl.logieL. SIDERIADES PhysiqueJM.SURZUR Chimie organiqueH. CHANTREL Physique de l'espaceJ. SOUGY GéologieJ. HERVE ElectroniqueH. BODOT ChimieG. LAPLUYE Chimie (La Réunion)

'~

PROFESSEUns SANS CHAIRE

C. CLAnION (Mlle)R. AMAnJ. CHOUTE1~UL. DEVEZEJ. MANDELBROJTF. BORELR. CHANDEBOIS (Mlle)H. PIDLIPM. BIZOUJ.llDH. GUENOCHEJP.DAVID

Mécanique des fluidesZoologiePhysiologie animaleBiologie marinePhysiqueTechniques mathématiques de la physiqueBiologie animalePhysiquePhysiqueMathématiques appliquéesPhysique

. . ·1 · · ·

MM. Je .TRll.YNAIillF. PECAUT (Mme)J. HE:r.TNEQUINL. CAPELLAJC .M1I.IRES. GUEIr~RD (Mlle)e. FEUGE.A.SJ. CABANEG. RASIGNIS. COMBETH. GATIRON

, M. eADILHACA. PONSP. BILLARDM. BONNE1~U

H. PATINL. LAGARDE (Mlle)M. PIC RENOT (Mlle)M. SIMONM. EGOG. MAnc HIS -MOUmmF. HALBWACHSM. GILLETB. WAEGELLJP .nOGGEROJ. CIŒSPG. nAUZYL. SARDA111. BENA RROC HEH. TACHOIRETI. PE'T'ITM. HUGONe. ROMANA. GILLETG. RENUCCIE. VINCENTL. VICENTES. MARTINUZZIJ. MANUCEAUGuy R. GIHAUD

Chimie industrielleMathématiques (Avignon)ElectroniqueMinéralogieChimieP8 ~.L'ugré1lJtiie

ChimieChimiePhysiqueChimiePhysique ~xpérimentale

PhysiqueBiologie végétaleMathématiquesMathématiques

MAITRES DE CONFEHENCES

Chimie .Chimie minéraleBiologie végétalePhysiologie animaleMathématiques (La Réunion)Chimie biologiquePhysique (Avignon)PhysiqueChimieChimie (Avignon)Biologie animaleMathématiquesBiochimiePhysiqueCh::'mioPhysiquePsyoho-p~ysiologie

Physiologie animaleMathématiquesPhysique (La Réunion)ChimieBiologio animalePhysiqueMathématiquesMathématiques (Avignon)

-0-0-0-0-0-0-

Ces recherches ont été réalisées au Laboratoire de Chimie

Bactérienne du C.N.R.S., sous la direction de M. le Professeur J.C. SENEZ.

Qu'il veuille bien trouver ici l'expression de ma respectueuse gratitude.

Je le remercie également de m'avoir fait l'honneur de présider le jury de

cette thèse.

Je tiens à exprimer ma sincère reconnaissance à M. F. PICHINOTY,

llattre de Recherche au C.N.R.S., qui m'a dirigé et conseillé.

Mes premiers travaux ont été effectués à Nancy, dans le

Laboratoire de Pédologie Biologique, sous la direction de M. Y. DO~'ŒRGUES

à qui j'exprime ma reconnaissance pou~ les précieux conseils qu'il m'a

toujours prodigués.

Je remercie M. le Professeur J. RICARD qui a bien voulu faire

partie de mon jury, ainsi que M.' E. AZOULAY pour l'aide qu'il m'a apportée.

INTRODUCTION

En 1946, Starkey (33) isola du sol une levure que Lodder et Kreger-

van Rij (22) dénommèrent plus tard Lipomyces starkeyi. Dans sa description origi­

nale (33), Starkey note que la croissance en milieu liquide est largement accrue

par l'aération. Dans un milieu sucré et déficient en azote, les cellules sont

sphériques, grosses (9 ~) et presque remplies de globules gras réfringents. Culti­

vées sur un milieu contenant 2 % de glucose et 0,1 % de sulfate d'ammonium, elles

ont par contre un faible contenu lipidique, sont sphériques ou faiblement ovales

(5 x 7 ~), puis, lorsque la culture devient âgée, elles forment un pseudomycélium

rudimentaire constitué par des projections d'hyphes.

L. starkeyi est aérobie stricte et utilise comme aliments carbonés, le

glucose, le galactose, le saccharose, le maltose, mais pas le lactose.• Elle n'as­

simile pas le nitrate et pousse mal sur éthanol comme seule source de carbone.

La croissance et la production de lipides sont abondantes dans des cultures aérées

contenant du glucose, et un peu d'extrait de levure comme source d'azote. Dans

les conditions les plus favorables, 10 à 14 % du glucose consommé est converti en

lipides.

La formation des spores chez les Lipomwccs est différente de celle que

l'on trouve chez les autres levures sporogènes. Ici la cellule végétative, riche

en lipides, forme d'abord des bourgeons normaux. Mais, quelques semaines plus tard

ceux-ci ressemblent à des sacs contenant du matériel granulaire, lequel est trans­

formé ensuite en ascospores. Les spores ne sont jamais formées dans la cellule

mère, et leur nombre varie (4, 8 ou même 16) suivant la souche et la composition

du milieu.

Les deux espèces de Lipomyces connues : ~. starkcyi et~. lipofcr, syn­

thétisent et accumulent de grandes quantités de lipides intracellulaires. Pendant

la seconde guerre mondiale des recherches furent faites en vue d'utiliser ceux-ci

pour l'alimentation. Dans ce but, Kleinzeller (19) travailla sur Torulopsis

lipofera • Lipomyces lipofer (22), et Starkey montra que l'ion ammonium augmente

la croissance de~. starkeyi mais fait baisser son contenu en lipides (33). Ces

auteurs mirent surtout l'accent sur les facteurs affectant la production de lipide

totaux. En 1964, Stewart et coll. s'intéressèrent à~. lipofer et décrivirent la

2

préparation et les propriétés des protop1astes (12), des mitochondries (13), la

constitution des lipides (23) et leur biosynthèse par des fractions subcellulai­

res (24). Slodki et Wickerham (31) étudièrent la composition des polysaccharides

extrace11u1aircs de~. starkeyi et ~. 1ipofer, et proposèrent un nouveau critère

de différenciation de ces deux espèces sur la base de leurs résultats. Robinow

(28) montra, à l'aide du microscope électronique, la présence d'éléments figurés

ressemblant à des mitochondries chez ~. 1ipofer. Enfin, Dommergues et ~lutaftschiev

(9) estiment que~. starkeyi peut vivre en association avec des bactéries fixa­

trices d'azote: les Beijerinckia.

llis à part les quelques travaux précédents portant sur la production et

la biosynthèse des lipides, on ne dispose que de très peu de données expérimenta­

les concernant le métabolisme carboné intermédiaire des Lipomyce~. Notre travail

a porté essentiellement sur ~. starkeyi. Nous avons mesuré les paramètres de la

croissance, déterminé la nature des produits accumulés dans le milieu de culture

et précisé quelles sont les voies métaboliques qui interviennent dans la dégrada­

tion aérobie du glucose.

3

CHAPITRE l

GENERALITES

l - LES LEVURES FER1IENTATIVES ET LES LEVURES OXYDATIVES

Les 'levures peuvent ,être rangées en deux catégories

a) Les espèces anaérobies facultatives. Elles respirent l'oxygène en

aérobiose, font fermenter le glucose ou d'autres sucres en anaérobiose avec pro­

duction de CO2 • Les différentes espèces de Saccharomyces appartiennent à cette

catégorie.

b) Les espèces aérobies strictes. Elles oxydent le glucose ou d'autres

sucres en aérobiose mais sont incapables de les faire fermenter en anaérobiose.

1. starkeyi appartient à cette catégorie.

Toutes les levures sont capables d'assimiler le glucose en aérobiose.

En principe, une levure assimile en aérobiose les sucres qu'elle fait fermenter

en anaérobiose.

II - CROISSANCE ET ENERGIE

L'énergie nécessaire aux réactions de biosynthèse est transportée des

systèmes cataboliques aux systèmes anaboliques sous forme de liaisons riches, la

plus importante étant celle de l'ATP.

~~nod (26) a montré qu'il existe une relation lin6airo ontre la maSSG de

matière vivante formée par une culture bactérienne et la masse de l'aliment car­

boné dégradé. Il en résulte que le rendement matériel

R • poids de bactéries formépoids de substrat consommé

est constant pendant la croissance si les conditions de culture ne changent pas.

4

III - LES DIFFERENTES VOIES DE DEGRADATION DU GLUCOSE

Jusqu'ici on a montré l'existence de trois voies métaboliques pour la

dégradation du glucose par les micro-organismes: la voie d'Embden-Meyerhof-Parnas

(glycolyse), la voie d'Entner-Doudoroff, et la voie de Warburg-Dickens-Horecker

(voie des pentose-phosphates).

a) Glycolyse (figure 1)

C'est la voie de dégradation la plus répandue. Dans le cas des levures

elle fait intervenir successivement les enzymes suivants : hexokinase, hexose-6­

phosphate-isomérase, phosphofructokinase, fructose-l,6-diphosphate-aldolase,

triose-phosphate-isomérase, glycéraldéhyde-3-phosphate-déshydrogénase, phosphogly­

céromutase, énolase, carboxylase, éthanol-déshydrogénase, pour donner finalement

de l'éthanol. Le pyruvate est un métabolite intermédiaire important, car il peut

conduire soit à l'éthanol, soit à l'acétate qui peut être oxydé par le cycle de

Krebs en aérobiose. Le bilan énergétique de cette voie est :

1 glucose ~ 2 pyruvate + 2 ATP

b) Voie d'Entner-Doudoroff (figure 2)

Le glucose est phosphorylé en glucose-6-P qui subit une déshydrogé­

nation et donne le 6-P-gluconate. Celui-ci grâce aux actions successives d'une

déshydrase et d'une aldolase, conduit à la formation d'une molécule de glycéral­

déhyde-3-P et d'une molécule de pyruvate. La glycéraldéhyde-3-P peut ensuite.

emprunter la dernière partie de la chatne glycolytique et fournir du pyruvate. Le

bilan énergétique de cette voie est :

1 glucose ~ 2 pyruvate + l ATP

A l'inverse de la glycolyse, la molécule de glucose est ici oxydée

avant d'être scindée en deux portions. Cette voie de dégradation du glucose a été

découverte chez Pseudomonas saccharophila, mais elle existe également chez d'autes

espèces de Pseudomonas ou de Xanthomonas ainsi que chez Azotobacter, plusieurs

champignons et protozoaires (15).

, .

5

D-glucos~ATP---...... .

glucose-G -p.. .

fructose -6-PATP---.......

fructose-l/6 -di-P1

, "

1

L__ - -_' .-- ----------------.- --------~Figure 1 - Voie d'Emden-Meyerhof-Parnas.

.,,

. D-glucose

ATPi

gLucose- 6-P1----..·2H+

6-phosphogluconate

H20~ j .... ~~

2-ceto-3-desoxy-6-phosphogluconate

1

+-- -- condensation aldolique

6. \

11

~D-glYCé1é~~de- 3-P

L..--4 2ATP .... r 1 .2H+-----t

~---.~2 pyruvate ~,

---"-- -----.:.-- ...~._--- ~- - ~._--- .----

Figure 2 - Voie d'Entner-Doudoroff.

7

c) Voie de Warburg-Dickens-Horecker (figure 3)

Les premières étapes de cette voie sont identiques à celles de la

voie d'Entner-Doudoroff jusqu'au stade du 6-P-gluconate, mais elles diffèrent

ensuite. Ici le 6-P-gluconat~ est décarboxylé en ribulose-5-P, lequel est isoméris

en xylulose-5-P et en ribose-5-P. Puis, par des réactions de transaldolisation et

de transcétolisation, on aboutit au fructose-6-P et à la glycéraldéhyde-3-P.

En aérobiose la voie des pentose-phosphates peut fonctionner de

façon cyclique et réaliser l'oxydation complète de la molécule de glucose en CO2

et H20. Dans ce cas, une molécule de glycéraldéhyde-3-P est isomérisée en dihydro­

xyacétone-P qui, sous l'action de l'aldolase, réagit avec une autre molécule de

glycéraldéhyde-3-P pour donner du fructose-l,6diP ; celui-ci est transformé en

fructose-6-P grâce à la fructose-l,6-diphosphatase et isomérisé en glucose-6-P.

Hais cette voie de dégradation peut aussi emprunter la dernière partie de la

chatne glycolytique et transformer la glycéraldé~yde-3-Pen pyruvate ; le bilan

énergétique est alors :

1 glucose ~ 3 CO2 + 1 pyruvate + 1 ATP

La voie des pentose-phosphates existe chez de nombreux micro-organis­

mes, en particulier chez les levures où elle joue un rôle plus ou moins important

dans la dégradation du glucose. Ohez certaines bactéries elle constitue la prin­

cipale, sinon la seule voie d'utilisation du glucose (8, 18).

Pour qu'une molécule de glucose soit oxydée en pyruvate par la voie

des pentose-phosphates, il faut que trois molécules de glucose pénètrent dans le

cycle, ce qui entratne la formation de 6 NADPH2• Il se peut donc que la synthèse

des acides gras' et des lipides, qui dépend de la teneur en NADPH2 de la cellule

(5), soit favorisée par cette voie.

IV - ASSIMILATION DU MANNITOL

Chez les micro-organismes le mannitol peut être assimilé de deux façons

différentes :

- phosphorylation par une mannitol-kinase ou une phosphotransférase (16)

puis oxydation en fructose-6-P. comme dans le cas de Staphylococcus aureus (34).

8

gLucose

ATP -i NADP 0NA PH2

gLucose-6- P"----......;;a--4~. 6-phosphogLuconate

~ NADP

C02~NADPH2ribuLose-S-P

fructose-6 -p

3-p-gLycéraLdéhyde

2ATP1pyruvate

xytuLose-S-P

3-P-gLycéraLdéhvde

ribose-S-P

1. 1

-_... " -'.. ..... - - ---._- - --- _.. ---... - ---_.._._..- -- -- ------ -- --- - --------.!

Figure 3 - Voie de Warburg-Dickcns-Horecker.

9

Le fructose-6-P est ensuite isomérisé en glucose-6-P et suit alors la même voie

de dégradation que le glucose.

- oxydation en fructose par une mannitol-déshydrogénase dont la spécifi­

cité peut être large (polyol-déshydrogénase). Le fructose formé est ensuite phos­

phorylé en position 6 et isomérisé en glucose-6-P. C'est ce qui se passe chez

Acetobacter aceti (8).

1. starkeyi assimile le mannitol aussi bien que le glucose. Nous avons

déterminé à laquelle des deux catégories ci-dessus elle appartient.

v - STIiTHESE DES POLYSACCHARIDES

En dehors des différentes voies cataboliques que nous venons de décrire.

le glucose peut être orienté vers des voies anaboliques qui conduisent à la syn­

thèse de substances qui servent de réserves ou qui sont utilisées pour la consti­

tution du matériel cellulaire. en particulier pour la formation de la paroi et de

la capsule. Il s'agit de la synthèse du glycogène ou de polysaccharides par des

voies ne fournissant pas de glycéraldéhyde-3-P comme métabolite intermédiaire. et

appelées pour cette raison voies "non triose-phosphates".

Slodki et Wickerham (31) ont noté l'accumulation de polysaccharides

extracellulaires chez 1. starkeyi et 1. lipofer. Ils ont étudié leur composition

et montré que. dans le cas de 1. starkeyi. ils étaient-constitués d'une unité

d'acide glucuronique pour deux unités d'hexose. ces, hexoses étant représentés par

le mannose et le galactose.

Dans la synthèse de tels polysaccharides, les nucléotide-phosphates

jouent un rôle très important. Nous avons représenté sur la figure 4l'intercon­

version du glucose en mannose. galactose. et acide glucuronique. Pour le mannose

et le galactose il n'intervient aucune réaction d'oxydation de la molécule de

glucose • seule la stéréochimie de la molécule est modifiée. Par contre. en ce

qui concerne la formation de l'acide glucuronique. une oxydation intervient au

niveau du carbone portant la fonction alcool primaire. Cette oxydation est effec­

tuée grâce à l'UDP-glucose-déshydrogénase dont le cofacteur est le NAD. L'oxydatiol

de la fonction alcool en fonction acide exige la réduction de deux molécules de

NAD. La formation d'un composé intermédiaire n'a pas encore été établie.

glucose

ATP

10

glucose-6-P44-----~.glucose-l-P

fructose-6 -P Pi

UTP

mannose-l-P

GTP

UDP ~glucose

GDP- mannose UDP-galactose UDP':"glucuronate11.---1-·__1

polysacch arides

. ~ "Figure 4 - Voies "non triose-phosphates •

11

Dans la synthèse des polysaccharides la réaction de base est la sui-

vante

Polysaccharide-l + NuDP-sucre ~ Polysaccharide-l-sucre + NuDP

Polysaccharide-l-sucre + NuDP-sucre ~ Polysaccharide -l-sucre-sucre + NuDP

Le nucléotide-triphosphate est régénéré grâce au couplage avec l'ATP

NuDP + ATP ~ NuTP + ADP

1Dans le cas de biosynthèse d'hétéropolysaccharides spécifiques, conm~

chez~. starkeyi, il existe deux éventualités. La première suppose que les rési­

dus monomériques impliqués viennent s'accrocher les uns après les autres et dans

un ordre contrôlé;; la seconde consiste en u~e formation préliminaire de di- ou

oligo-saccharides encore liés à un nucléotide-phosphate par le carbone l, suivie

de la polyméfisation de ces unités. Ce problème n'a pas encore été résolu.

VI - SYNTHESE DES LIPIDES

Lorsque ~. starkeyi est cultivée en aérobiose sur glucose, elle peut

accumuler des lipides en quantités allant jusqu'à 63 % de son poids sec (33) ;

dans les mêmes conditions ~. lipofer en accumule 40 % (23). McElroy et Stewart

(24) ont étudié la synthèse des lipides chez~. lipofer. Ils ont montré que leur

accumulation se produit surtout après la période de croissance rapide et d'acidi­

fication du milieu, c'est-à-dire, pendant et juste après la phase de ralentisse­

ment. D'après ces mêmes!auteurs les tri-glycérides représenteraient environ 60 %

des lipides totaux. Le glucose permet la synthèse de ces tri-glycérides en four­

nissant d'une part le L-a-glycérophosphate et d'autre part le matériel de base

pour la synthèse des acides gras. Selon MeElroy et Stewart cette synthèse s'effec­

tue par la voie du malonyl-CoA, à partir de l'acétate provenant de la décarboxy­

lation oxydative du pyruvate.

La figure 5 représente les différentes étapes de la synthèse des acides

gras, et en particulier de l'acide palmitique qui est le plus répandu, à partir

de l'acétyl-CoA par la voie du malonyl-CoA. La première étape est une carboxyla­

tion de l'acétyl-CoA en présence de CO2 et d'ATP grâce à un enzyme à biotine :

l'acétyl-CoA-carboxylase (36). La synthèse débute par la condensation d'un radical

12

HS-ACP+C02

HS-ACP

NADP OH 01 Il

CH3-~-CH2C-S-ACP~

H ~ 0o CHr CH=CH-ë-s-ACPfi NADPH2 1H-C-S-ACP

2 NADP. e 0CH-CH-CH-ë-s-ACP

~ -=-__-,3 2 2oIl

COOH- CH2 C-S-ACP

CH-C-sc..A3 Il

o

11

HS-ACP:COOH-CH2~~CoA 1 0 0

o 1--1

. ë Il~. 1 CH-(C~}- -C~-C-:-S-ACP__ 3 . ~l2 . 7-

~C02: 1" 1, 1

CH-C-e:t" A " 1

3 .. --- '"o ~I1

o HS-A~ ./1

CH3-(CH2)1-'~-sc..A."""""~-",,~CH:r(CH~~-S-ACP

palmityl-CoA H5-Cc.A 0

NADPH2oIl

CH-C­3

CH3~-S-ACP

oHS-~A

HS-ACP+

CO2

j

Figure 5 - Synthèse des acides gras par la voie du ma1ony1-CoA.

13

acétyle et d'un radical malonyle, mais par la suite ce dernier pourra être con­

densé sur un radical acyle dont le nombre de carbone sera de plus en plus élevé,

jusqu'à l'obtention de.:l'acide gras désiré. La réduction de la fonction cétonique

est effectuée en plusieurs étapes; d'abord hydrogénation en fonction alcool,

puis déshydratation et à nouveau hydrogénation. Les hydrogénations sont effectuées

grâce à deux enzymes dont le cofacteur spécifique est le NADPHZ' Le bilan de la

synthèse de l'acide palmitique, à partir de l'acétyl-CoA comme seul précurseur,

est le suivant :

8 CH3-CO-SCoA + 7 COZ + 14 NADPHZ + 7 ATP + CH3-(CHZ)14-COOH + 7 COZ

+ 8 CoASH + 14 NADP + 7 ADP + 7 Pi + 6 HZO

Chez !.~ le système synthétisant les acides gras est soluble et

comporte : une acétyl-transférase, une malonyl-transférase, un enzyme de conden­

sation, une 8-céto-acyl-réductase, et une énoyl-hydrase. En outre, le système

comporte une protéine de transport des groupements acyles (ACP), à laquelle les

acyles intermédiaires sont attachés pendant tout le processus synth~tique. Le

point d'attache est de type thiolester et a été récemment identifié à un groupe­

ment prosthétique 4'-phosphopantéthéine. Chez Clostridium kluyveri le système a

été résolu en deux composants. Par contre dans le cas de la levure il est consti­

tué par une particule à fonctions mu1ti~~nzymatiques ayant un poids moléculaire

de Z 300 000.

VII - UTILISATION DU GLUCOSE RADIO-ACTIF

Les méthodes isotopiques utilisées pour estimer l'importance des diffé­

rentes voies du métabolisme du glucose se répartissent en deux catégories. Les

unes sont basées sur la mesure de la radio-activité du COZ métabolique, les autres

sur l'isolement d'intermédiaires ou de produits finaux du catabolisme du glucose

(glycéro1, lactate, pyruvate ••• ) dont on détermine la radio-activité spécifique.

Les méthodes au COZ ont l'avantage d'être plus simples. La technique

la plus utilisée consiste à employer le glucose-1-C14• Dans ce cas, en effet, le

COz radioactif qui est produit provient uniquement de la voie des pentose­

phosphates. Wang et coll. (37) ont montré que le pourcentage de glucose oxydé

par cette voie est donné par la formule :

14

G - G1 G 6 x 100

T

où Gl et G6 représentent respectivement les radio-activités récupérées sous forme

de cO2 à partir du glucose-l-C14 et du glucose-6-C14 ; GT

étant la radio-activité

totale du glucose consommé. Cette technique présente cependant des inconvénients.

En pratique, il faut manipuler de petites quantités de l4c02 , d'où des difficultés

dues au cO2 atmosphérique et la nécessité d'ajouter du carbonate non radio-actif

comme entraineur pour avoir des quantités de CO2 manipulables. D'autre part cette

méthode n'est ,applicable que dans certaines conditions bien précises: le glucose

ne doit pas être utilisé par des voies "non triose-phosphates", et le dégagement

de CO2 provenant du carbone 6 doit être faible, ce qui exige que le cycle de Krebs

ne fonctionne pas. Il s'agit donc d'une méthode ayant un champ d'application

limité, susceptible de fournir surtout des renseignements qualitatifs.

En ce qui concerne la seconde catégorie de méthodes, l'isolement des

composés est plus laborieux, mais elles présentent des avantages. En effet, on

effectue des mesures de radio-activités spécifiques, et par conséquent, la perte

de matériel au cours de la purification n'est pas gênante. Par ailleurs, il est

possible de soumettre les substances isolées à la dégradation et d'obtenir de

précieux renseignements supplémentaires. Le principe général de ce type de méthode

est d'isoler un intermédiaire, comme le glycérol ou le pyruvate, représentatif

des triose-phosphates, à partir de glucose spécifiquement marqué en position

l, 2, ou 6. La radio-activité spécifique de ce produit est comparée à celle du

glucose utilisé comme précurseur. Grâce à l'établissement de graphiques théoriques

préalables il est alors possible de déduire la part prise par chacune des voies

du métabolisme.

La principale difficulté rencontrée a été de trouver un procédé de

calcul théorique tenant compte du recyclage des carbones 2 et 3 du glucose dans

le cycle des pentose-phosphates. Dawes et Holms (6) ont calculé, pour des pour­

centages donnés du cycle des pentose-phosphates, le pourcentage apparent de molé­

cules de triose-phosphates (donc de pyruvate) portant le marquage ; ils ont ainsi

établi des graphiques théoriques à partir de ces données pour le glucose-l-C1 4,

_2_c14 et _6_c14 utilisés comme précurseurs (figure 6). Notons ici que le pour­

centage de participation du cycle des pentose-phosphates est exprimé en pourcen­

tage d'activité par rapport à la glycolyse, et non pas en métabolisme total; en

effet le résultat représente le nombre de molécules de glucose qui sont oxydées

15

.:

T---- --- --,1

1

l11

1l

Glucose-2-C14

Glucose _6_C14

Q,I 50k---.-------TCl

g 40E"Ë30

~ 20-6 10+'L.

&. 50t---i-......=;;:;:;t:::~-+--+---~

~ 40c>2 30>.Q. 20QI"0

U1 10QI

...J

~100r-----r----+-----+-----+---~'QI...JE90

Q,I 80"C

~ 70QIL.

~600-c 50 __l~_~ l _

;!!. 20 40 60 80 100-/0 de molécules de glucose oxydées par

le cycLe des pentose-phosphates

Figure 6 - Relation entre le pourcentage apparent de molécules de pyruvate portant

le marquage et le pourcentage de molécules de glucose oxydées par le

cycle des pentose-phosphates~Cas où l'hexose-phosphate régénéré par

le cycle est dégradé dans les mêmes proportions que l'hexose initial

par le cycle des pentose-phosphates et la glycolyse.

16

par cette voie, mais un tiers seulement fournira du pyruvate et du CO2

, le reste

étant recyclé. Cette technique n'est applicable que dans le cas où il n'y a pas

de voies "non triose-phosphates" actives. Il faut en effet supposer que tout le

glucose est métabolisé par le cycle des pentose-phosphates et la glycolyse. En

outre, chez les organismes où il y a une dilution endogène du pyruvate, il est

plus précis d'utiliser des rapports, à partir de deux sucres, qui éliminent ce

facteur.

Pour. surmonter les précédentes difficultés, Katz et Wood (17) ont pro­

posé une méthode générale d'estimation des différentes voies du métabolisme du

glucose. A la différence de la technique de Dawes et Holms, les calculs sont

effectués par rapport au métabolisme total. Ils donnent donc les proportions de

glucose réellement métabolisé par chacune des voies.

Voici comment sont effectués les calculs lorsque l'on isole le pyruvate.

Soit Rl , R2 et R6 les radio-activités spécifiques molaires relatives comparées14 14 14respectivement au glucose-l-C ,-2-C ,et -6-C • Le pourcentage de glucose-6-P

total métabolisé par le cycle des pentose-phosphates est déterminé à partir du

rapport Rl /R2 grâce à une courbetthéorique calculée (figure 7). La valeur obtenue

(PC) nous permet d'apprécier l'importance du recyclage:

100Q • 100 + 2 PC

Dans une seconde étape, on détermine la fraction de triose-phosphates formés par

la glycolyse :

REM'. 1

Q x R6

et par le shunt: PC' • 1 - EM'.

Le rapport EM'/PC' est égal au rapport Etl/PC. Connaissant déjà PC, on

peut calculer EM (fraction du glucose total transformé en pyruvate par la gly­

colyse). Enf in la frac tion du glucose métabo1isé par les voies "non triose­

phosphates" (NTP) est obtenue par différence: NTP • 1 - (EH + PC).

Comme l'ont fait remarquer Katz et Wood U7), dans le cas où il existe

des voies "non triose-phosphates", si on utilise la méthode d'estimation de

Dawes et Holms, seule la valeur obtenue à partir du glucose-6-c14 est valable

le résultat représente alors le pourcentage d'activité du shunt par rapport à

17

0,80.60,40.2

20

~100 .----·----.-----r------ --1- -- -- --. - .o

~ 1

8°111

1

60 r-i1

1

L

Figure 7 - Rapport des radio-activités dans les dérivés des triose-phosphates en

fonction du pourcentage de glucose-6-P métabolisé par le cycle des

pentose-phosphates. Rt et R2 • radio-activités spécifiques molaires

du dérivé triose-phosphate comparées respectivement au glucose-l-c1 4

et _2-c14 utilisés comme précurseurs,

18

la glycolyse. En effet, le carbone 6 du glucose n'est pas affecté par le recyclage

Il est possible de passer des résultats de Katz et Wood exprimés en

termes de glucose réellement métabolisé, aux résultats de Dawes et Halms exprimés

en pourcentages d'activité des différentes voies. Soit PC, EM, et NTP les résul­

tats exprimés comme dans le premier cas et pc, em, et ntp les résultats exprimés

comme dans le second cas.

PC • 100 nombre de molécules de glucose dégradées par le shuntx nombre de molécules de glucose dégradées par le shunt

+ nombre de molécules dégradées par les autres voies

pC/3donc : PC • pc/3 + (100 _ pc) x 100

Par un calcul algébrique simple on trouve

_

-.;;.30.;..0.;..,.,,;;P,.;;C~pc • 100 + 2 PC

D'autre part, EM/NTP • em/ntp, et em + ntp • 100 - pc.

Prenons un exemple pour illustrer la différence qui existe entre ces deux modes

d'expression. Supposons que 100 molécules de glucose entrent dans le "pool" des

hexose-phosphates. Si on raisonne en pourcentages d'activité, on dira par exem­

ple, que 40 molécules passent par les voies "non triose-phosphates", 30 molécules

par la glycolyse et 30 molécules par le cycle des pentose-phosphates. Si au

contraire on considère les molécules de glucose réellement métabolisées, les

fractions seront différentes, car à partir des 30 molécules qui passent par le

cycle des pentose-phosphates, la seront transformées en triose-pho~phates et CO2,

le reste étant régénéré. Ces 20 molécules d'hexose-phosphates qui arrivent dans

le "pool" seront redistribuées de la même façon que les 100 premières : 40 %

(8 molécules) vers les voies non-triose-phosphates, 30 % (6 molécules) vers la

glycolyse, et 30 % (6 molécules) vers le cycle des pentose-phosphates. 4 molécules

seront régénérées de nouveau, ceci jusqu'à l'épuisement total des 100 molécules

initiales. On trouve alors que: 40 + 8 + •• • 50 molécules ~e glucose sont

métabol isées par les voies "non triose-phosphates" : 30 + 6 + ••• • 37,5 molécu­

les par la glycolyse, et seulement la + 2 + •• , • 12,5 molécules par le cycle

des pentose-phosphates. Sur la figure 8 les deux modes d'expression des résultats

sont comparés synoptiquement.

~recycLage

cycLe despentose - phosphates

(30%)

~1pyruvate 1

125 moLécuLes

1GLUCOSE 1

glycoLyse(30%)

l1pyruvate 1

37,5 molécules

voies "non

triose - phosphates"

(40%)

~1poLysaccharides 1

50 molécules

19

~ .. ~~_~~_I

Figurl 8 ~ COmparaison des deux modes d'expression de la participation des

différentes voies au métabolisme du glucose.

20

On doit effectuer les estimations des différentes voies en termes de

métabolisme total, mais il est intéressant de pouvoir aussi les exprimer en

pourcentages d'activité. En effet, dans le premier cas les résultats traduisent.

le bilan global du métabolisme du glucose, tandis que dans le second cas ils

représentent mieux les activités enzymatiques et l'importance relative des diffé­

rentes voies dans le métabolisme intermédiaire.

21

CHAPITRE II

MATERIEL ET METHODES

l - ORGANIS}ŒS ET CULTURES

Nous avons utilisé Lipomwces starkeyi C 79 (M. Dommergues, Centre de

Pédologie Biologique, C.N.R.S., Nancy) et Saccharomyces cerevisiae 59 RL

(M. Sloni~ki, Centre de Génétique }wléculaire, C.N.R.S., Gif-sur-Yvette). Ces

deux organismes sont conservés sur gélose nutritive inclinée contenant du glucose

et de l'extrait de levure.

Lors de l'étude de la croissance et de l'accumulation de produits inter­

médiaires, 1. starkeyi a été cultivé en milieu l~quide ayant la composition

suivante (milieu AB) : KH2P04 : 1 g ; Na2HP04.l2 1120 : 0,3 g ; MgS04.7 H20 : 0,1 i

CaC1 2 : 0,1 g ; FeS04 : 0,01 g ; MnS04 : 0,002 g ; Molybdate de Na : 0,0001 g. LeI

cultures carencées en azote, contiennent du glucose (8 g/l) ou du mannitol

(10 g/l) mais d'aliment azoté. On ajoute, aux cultures non carencées, 10 ml d'une

solution tamponnée de phosphates mono- et diammoniques ; cette solution est pré­

parée en mélangeant 7,8 g de NH4H2P04 et 1,75 g de (NH4)2HP04 pour 100 ml d'eau.

Le pH est de 5,7 dans le premier cas, et de 6 dans le second. Les fioles à toxi­

nes contenant 0,5 1 de milieu sont agitées à 32°.

Dans tous les autres cas, les cultures ont été faites en milieu liquide

ayant la composition suivante (milieu C) : KH2P04 : 7 g ; Na2HP04.l2 U20 : 1,2 g

MgS040 7 H20 : 0,2 g ; NaCl : 0,1 g ; NH4Cl : 2,5 g ; eau du canal, 100 ml ; eau

distillée : 900 ml. Le pH de ce milieu est de 5,5. On ajoute en plus la source

de carbone: glucose (8 g/l) ou mannitol (10 g/l), et dans le cas de i. cerevisia.

2 g/l d'extrait de levure Difco. Les fioles à toxines contenant 0,5 1 de milieu

sont agitées à 32° ; l'incubation est arrêtée juste avant la fin de la croissance

(60 heures pour 1. starkeyi et 16 heures pour i. cerevisiae).

II - PREPARATION DES SURNAGEANTS DE CULTURES ET DES EXTRAITS

Le surnageant est séparé des cellules par centrifugation à 4 000 tours/I

22

pendant 20 minutes • les cellules sont remises en suspension dans un tampon phos­

phates M/15 pH • 6, puis lavées 2 fois. Elles peuvent alors être utilisées pour

la préparation des suspensions cellulaires ou des extraits enzymatiques. Dans ce

dernier cas on fait une suspension dense. dans le tampon, que l'on traite à la2presse de French exerçant une pression de 1 200 Kg/cm. Dans ces conditions 50 %

des cellules de levure sont détruites. On centrifuge ensuite à 16 000 tours/min.

dans une machine Servall réfrigérée, pendant 20 minutes, afin d'éliminer les

débris cellulaires. le surnageant, qui constitue l'extrait brut, est utilisé

pour les mesures d'activités enzymatiquese

III - METHODES EMPLOYEES POUR DETEIDIINER LES BILANS ET LES RENDE~ŒNTS

a) Croissance des levures

Elle est mesurée par opacimétrie à 450 m~ (spectrophotomètre Jean et

Constant) dans une cuve ayant 1 cm de trajet optique, et en se référant à une

courbe d'étalonnage densité/poids sec. Les masses cellulaires seront toujours

exprimées en poids sec.

b) Dosage du glucose

Il est dosé par la technique colorimétrique de Park et Johnson (27).

c) Dosage des acides volatils

Après avoir été acidifié jusqu'à pH • 1,7 par l'acide tartrique, le

surnageant de la culture est placé dans un appareil d'entratnement à la vapeure

On mesure l'acidité du distillat recueilli (6 fois le volume de la solution) par

NaOH N/50 en présence de phénol-phtaléinee

Voici comment est effectuée l'identification des acides volatils. Le

distillat, recueilli en l'absence d'indicateur coloré, est fortement alcalinisé

puis évaporé jusqu'à un très faible volume. On effectue alors une chromatographie

de partage sur gel de silice Mallinckrote en employant comme solvant d'élution

un mélange butanol tertiaire/chloroforme (8 : 92 v/v). La colonne est préparée

selon le procédé de Bové et Raveux (3). On dose l'acidité des fractio~s recueil­

lies (4 ml) avec NaOH N/20 en présence d'indicateur. On trace la courbe d'élution

23

et on la compare à celle obtenue à partir d'un mélange témoin d'acides acétique

et formique.

d) Dosage de l'acide glucuronique

Cet acide est dosé par la méthode colorimétrique au carbazole (1). On SE

sert des surnageants de cultures sur mannitol j en effet, contrairement à ce

polyol, le glucose interfère dans ce dosage. Nous avons pu cependant doser l'acidE

glucuronique dans des cultures sur glucose en fin de croissance lorsque l'aliment

carboné est épuisé. Nous avons comparé le spectre d'absorption donné par l'acide

glucuronique témoin à celui de notre échantillon, après réaction avec le carbazolE

Il faut noter que cette méthode a l'avantage de doser tout l'acide glucuronique

présent dans le milieu, qu'il soit sous forme libre ou conjuguée dans les

polysaccharides.

e) Dosage du pyruvate

Après précipitation des protéines par i'acide trichloracétique à 10 X,

l'acide pyruvique est dosé directement dans le milieu par la réaction colorée

que donne sa 2,4-dinitrophénylhydrazone en milieu alcalin (35).

IV - DOSAGE DES ENZYMES

a) ~mnnitol-déshydrogénase

Nous avons utilisé la méthode spcctrophotométrique de Edmundowicz et

Wriston (10) ; cuve de 1 cm ; composition des systèmes : tampon tris 0,05 M

pH • 8: 2,5 (ou 2,4) ml ; extrait: 0»2 ml ; NAD, NADP, NADH2 ou NADPH2 0,01 M

0,1 ml ; MgC1 2 0,1 M : 0,1 ml ; fructose 0,1 M : 0,1 ml ou mannitol 0,5 M : 0.2 ml

Température ambiante. Les activités enzymatiques ont été mesurées dans le sens de

la réduction du fructose avec le NADPH2 ou le NADH2 et dans le sens de la déshydro

génation du mannitol avec le NADP ou le NAD.

b) Mannitol-l-phosphate-déshydrogénase

Nous avons employé la technique décrite par Wolf et Kaplan (39) avec

le fructose-6-P comme substrat et le NADPH2 ou le NADH2 comme donneurs

d'électrons.

24

c) Glucose-6-phosphate- et 6-phosphogluconate-déshydrogénases

Nous avons employé la méthode de Komberg et coll. (20). Nous avons

utilisé comme substrats le glucose-6-P et le 6-P-g1uconate respectivement dans le

cas de la glucose-6-phosphate-déshydrogénase et de la 6-phosphog1uconate-déshy­

drogénase. Dans les deux cas le NADP est l'accepteur d'électrons. Pour la mesure

de l'activité du premier enzyme, la vitesse de la réaction est calculée en utili­

sant la variation de la densité optique pendant les 30 premières secondes, pour

éviter l'interférence du second enzyme.

d) Hexokinase, fructokinase

Hexokinase : On suit la vitesse de réduction du NADP en mesurant la

densité optique à 340 m~. On opère en présence d'un excès de glucose-6-phosphate­

déshydrogénase. le glucose-6-P formé par l'hexokinase est oxydé aux dépens.;du

NADP. Dans nos conditions expérimentales, la vitesse de réaction est proportion­

nelle à la concentration d'hexokinase.

Le mélange réactionnel a la composition suivante tampon tris l M

pH • 8,: 1,6 ml • 1~C12 0,1 M : 0,75 ml ; extrait: 0,1 ml glucose-6-phosphate­

déshydrogénase 10 unités/ml : 0,1 ml ; NADP 0,01 M : 0,1 ml • ATP 0,3 M : 0,1 ml ;

S-mercaptoéthanol 0,15 11 : 0,1 ml ; glucose 1,0 M,: 0,15 ml.

Fructokinase : On utilise la méthode précédente, le fructose étant

substitué au glucose. Nous avons vérifié que la fructose-6-phosphate·isomérase

présente dans l'extrait brut se trouve en large excès par rapport à la fructoki-

nase.

e) Phosphofructokinase

Nous avons employé la technique de Sols et Salas (32), dont le principe

est le suivant: en présence d'un excès d'aldolase, de triose-phosphate-isomérase

et de glycéraldéhyde-3-phosphate-déshydrogénase, le fructose-6-P est phosphorylé

en fructose-l,6-diP par la phosphofructokinase, puis sous l'action des trois

enzymes ajoutés il est converti en glycérophosphate. La vitesse de la réaction

est suivie au spectrophotomètre en mesurant la vitesse d'oxydation du NADH2servant à la réduction de la glycéraldéhyde-3-P.

Il se pose ici un problème car la phosphofructokinase de la levure est

soumise à l'inhibition allostérique de l'ATP. On empêche cette inhibition par un

traitement préalable de l'extrait par NaF 20 mM (4).

25

f) Fructose-diphosphate-a1do1ase

Nous avons employé la technique de Rutter et coll. (29). Le fructose­

l,6-diP est utilisé comme substrat ; il est scindé en glycéra1déhyde-3-P et

dihydroxyacétone-P. La glycéra1déhyde-3-P est réduite en glycérophosphate alors

que la dihydroxyacétone-P est isomérisée en glycéra1déhyde-3-P. Comme dans le

cas du dosage de la phosphofructokinase, il y a donc oxydation de deux molécules

de NADH2 par molécule de substrat métabo1isé. Nous en avons tenu compte dans le

calcul des activités spécifiques.

g) Transcéto1ase

Cet enzyme catalyse la réaction

xy1u1ose-5-P + ribose-5-P ~ sédoheptu1ose-7-P + glycéra1déhyde-3-P

La vitesse de la réaction est mesurée, par la méthode de De La Haba et Racker (7).

en dosant la glycéra1déhyde-3-P à mesure de sa formation. Nous avons utilisé le

ribose-5-P comme substrat et non pas le mélange de xy1ose-5-P et de ribose-5-P.

Ici le mélange de ces deux produits est obtenu grâce à l'action des deux isomé­

rases des pentose-phosphates. Par cette modification nous avons la preuve de la

présence de ces deux enzymes et de la transcéto1ase dans les extraits actifs.

Nous ne pouvons pas affirmer que la transcéto1ase est le facteur limitant. Toute­

fois. les isomérases sont en général beaucoup plus actives que cet enzyme. De

toute façon, l'activité obtenue est caractéristique de la partie non oxydative

du cycle des pentose-phosphates.

i) 6-phosphog1uconate-déshxdrase et 2-céto-3-désoxX-6-phosphog1uconate­

a1do1ase

Nous avons dosé simultanément ces deux enzymes, de la voie d'Entner­

Doudoroff par la méthode de Kovachevich et Wood (21). Le pyruvate formé à partir

du 6-phosphog1uconate est dosé par la réaction colorée que donne sa 2.4-dinitro­

phény1hydrazone en milieu alcalin (35) •

.j) Expression des résultats

Toutes les activités enzymatiques sont exprimées en ~mo1es de substrat

métabo1isé par minute et par mg d'azote. La teneur en azote des extraits est

évaluée par micro-Kje1dah1.

26

v - EXPERIENCES REALISEES AVEC LE GLUCOSE RADIO-ACTIF'

Nous avons utilisé du glucose spécifiquement marqué en positions 1. 2.

et 6. En outre. le glucose uniformément marqué (U_C14) a été utilisé comme témoin

pour l'estimation de la dilution due au métabolisme endogène.

a) Méthode de comptage

Les mesures de radio-activité sont effectuées dans un compteur à scin­

tillations (Nuclear Chicago). en utilisant un liquide ayant la composition sui­

vante (liquide de Bray) : naphtalène : 50 g ; PPO : 4 g ; POPOP : 0.2 g ; méthanol

absolu : 100 ml ; éthylène glycol; 20 ml ; dioxane : quantité nécessaire pour

compléter le volume à 1 000 ml. Ce liquide a l'avantage de rendre possible les

mesures de radio-activité à partir d'échantillons en solution aqueuse. Suivant

son activité, on utilise de 0.05 à 0.3 ml d'échantillon. puis on complète le

volume à 14 ml avec le liquide de Bray.

En utilisant des standard de contenu radio-actif en désintégrations par

minute (d.p.m.) connu et ayant des "quenching" différents. nous avons pu établir

une courbe d'étalonnage de l'appareil. donnant le rapport c.p.m./d.p.m. en fonctioD

du rapport B/A. Lors d'une mesure effectuée sur un échantillon. l'appareil nous

donne le nombre de coups par minute (c.p.m.) et le rapport B/A • nous pouvons

donc en déduire le nombre de d.p.m. Les radio-activités spécifiques seront tou­

jours exprimées en d.p.m./umole.

b) Mesure de la radio-activité spécifique du pyruvate

Extraction du pyruvate : L'acide pyruvique est extrait sous forme de

sa 2.4-dinitrophénylhydrazone suivant la technique de White et Wang (38). Le

résidu obtenu à partir de l'échantillon initial (18 ml) est dissous dans 5 ml de

NaOH 0.01 N. Pour contrôler la pureté du produit isolé. on compare son spectre

en milieu alcalin à celui de la 2.4-dinitrophénylhydrazone préparée à partir de

l'acide pyruvique pur. Ce produit sert également à établir une courbe d'étalon­

nage pour le dosage colorimétrique en milieu alcalin d'une solution de 2.4-dini­

trophénylhydrazone de l'acide pyruvique. Ce dosage nous permet de connattre la

concentration du dérivé du pyruvate dans nos échantillons. Grâce à la mesure de

la radio-activité de ceux-ci. on peut calculer la radio-activité spécifique de la

2.4-dinitrophénylhydrazone qui est la même que celle de l'acide pyruvique.

27

Corrections: Comme l'ont fait remarquer Dawes et Holms (6), une correc­

tion est nécessaire en raison de l'échange du groupement carboxyle du pyruvate

avec le CO2 atmosphérique par le mécanisme de Wood et Werkman. En principe. dans

le cas du glucose-l-C14 et _6_C14 on ne doit pas trouver de radio-activité dans

le -COOH du pyruvate ; celle que l'on mesurera sera due à la fixation du l4C02produit métaboliquement. et l'on devra donc la soustraire. Par contre, dans le

cas du glucose-U-C14• la perte de radio-activité dans le carbone 1 du pyruvate

par rapport aux carbones 2 et 3 est due à la fixation du CO2 atmosphérique. Il

n'est pas possible d'effectuer de correction pour le pyruvate provenant du14glucose-2-C ,car le fonctionnement simultané du cycle des pentose-phosphates

14et de la glycolyse peut entraîner la formation de pyruvate-l-C ; on suppose

alors que le gain et la perte s'équilibrent.

Pour effectuer ces corrections on prélève une fraction de l'échantillon

de radio-activité connue, que l'on soumet à la décarboxylation dans des coupes

de Warburg en présence de sulfate cérique selon la technique de Meister (25). Le

CO2 provenant du -COOH du pyruvate est absorbé par NaOH 2 N. récupe~e et sa

radio-activité mesurée. On en déduit le pourcentage de radio-activité contenu

dans les carbones 2 et 3 du pyruvate. A partir de ces valeurs on calcule les

radio-activités spécifiques corrigées du pyruvate en appliquant les hypothèses

énoncées ci-dessus.

c) Radio-activités spécifiques comparées au glucose

Elles sont calculées en faisant le rapport de la radio-activité spéci­

fique corrigée du pyruvate sur la radio-activité spécifique du glucose utilisé

comme précurseur. C'est ce rapport que nous avons appelé R dans le premier cha­

pitre. au paragraphe 7. A partir de ces différents rapports. on calcule le pour­

centage de participation des différentes voies du métabolisme total du glucose

suivant le procédé de Katz et Wood (page:'16).

Pour pouvoir utiliser la méthode d'estimation de Dawes et Holms

(page 14). il faut effectuer une correction supplémentaire due à la dilution du

pyruvate par le métabolisme endogène de la cellule. La valeur de cette dilution

est estimée grâce à l'emploi du glucose-u-c14 • En effet. s'il n'y a pas de

dilution le rapport est égal à 0.5. puisque tout le pyruvate provenant du glucose­

U_c14 est marqué mais ne contient que 3 atomes de carbone par molécule au lieu

de 6. La valeur de la dilution endogène est représentée par le facteur par lequel

28

il faut multiplier la valeur observée pour obtenir 0,5. La dilution endogène

étant supposée avoir la même importance quel que soit le marquage dans le

glucose, on utilise le même facteur correctif dans le cas du glucose l, 2 et

6_C14 • En multipliant le résultat par 100 on obtient ce que Dawes et Holms ont

appelé le pourcentage de molécules de pyruvate portant le marquage, et qui nous

per~t d'estimer le pourcentage d'activité du cycle des pentose-phosphates.

29

CHAPITRE III

CROISSANCE ET RESPIRATION

1 - ETUDE CYTOLOGIQUE

Nous avons mis en évidence les lipides intracellulaires en les colorant

au noir Soudan. Cette coloration a été faite sur filtre millipore et non sur une

suspension fixée sur lame afin d'éviter l'altération des cellules. Après avoir

été traitées, les cellules retenues par le filtre sont remises en suspension dans

un peu d'eau j on ajoute ensuite quelques gouttes d'encre de Chine et l'on examine

entre lame et lamelle. L'encre de Chine fournit un fond sombre sur lequel les

levures se détachent parfaitement. On peut ainsi.observer les capsules qui

autrement seraient invisibles au microscope optique.

Nous avons examiné des cellules provenant de cultures sur milieu

liquide glucosé carencé ou non en azote. Dans le cas des cultures avec chlorure

d'ammonium, les cellules sont habituellement groupées par paires, contiennent

relativement peu d'inclusions lipidiques et possèdent une capsule très développée

(photographie nO 1). Par contre les cellules provenant de cultures carencées en

azote sont remplies de globules gras et présentent une capsule très petite

(photographie nO 2).

Les observations précédentes confirment celles de Starkey en ce qui

concerne l'influence de l'ion ammonium sur le contenu lipidique de~. starkeyi

(33).

II - TAUX DE CROISSANCE

Nous avons déterminé le taux de croissance. Pour cela nous avons effec­

tué des cultures de ~. starkeyi sur un milieu minéral AB auquel nous avons ajouté,

soit du glucose, soit du mannitol pour les cultures carencées en azote, et en plus

du phosphate d'ammonium pour les cultures non carencées. Nous avons également

fait des cultures contenant en plus de l'extrait de levure. Nous avons suivi les

30

(1 )

(2)

Planche 1 - Cellules de 1. starkeyi cultivé sur milieu liquide glucosé.

Photographie nO 1 : milieu non carencé en azote t âge des cultures

60 heures.

Photographie nO 2 : milieu carencé en azote t âge des cultures

90·heures.

31

variations de la densité optique et du pH de chaque culture. Grâce à une courbe

d'étalonnage: densité/poids sec, nous avons pu suivre les variations de la masse

de levure produite.

On obtient des résultats comparables avec le glucose et le mannitol

comme source de carbone, même lorsque le milieu contient de l'extrait de levure.

Par contre, les résultats diffèrent suivant que le milieu contient ou ne contient

pas de source d'azote (figure 9). En présence d'ammonium, la phase exponentielle

dure 66 heures environ avec un milieu contenant a g/l de glucose. D'autre part

nous observons une forte acidification du milieu dont le pH passe de 6 à 2,6.

1. starkeyi n'exige aucun facteur de croissance, puisque d'une part

elle pousse sur milieu synthétique et d'autre part son taux de croissance n'est

pas accru par la présence de l'extrait de levure. Par contre, une source d'azote

assimilable est indispensable à son développement (figure 9), ce qui confirme

l'opinion de Starkey (33) suivant laquelle cet organisme ne fixe pas l'azote

atmosphérique. Cependant, le pH des cultures sans azote fixe (courbe 4) diminue

sensiblement, ce qui indique que la levure oxyde ·quand même le glucose en acides.

Nous avons calculé le temps de génération des cultures sur ammonium

en traçant les courbes de croissance sur papier semi-logarithmique. Le taux de

croissance (nombre de générations à l'heure) est égal à l'inverse du temps de

génération. La pente des droites obtenues ne varie pas sensiblement suivant la

source de carbone utilisée : nous obtenons des temps de génération de 6,9 heures

sur mannitol, 7 heures sur glucose, et 7,2 heures sur glucose plus extrait de

levure, donc une moyenne de 7 heures environ qui représente un taux de croissance

de 0,143 génération à l'heure.

Nous avons dosé le glucose et mesuré la densité optique dans les cul­

tures. A partir des résultats obtenus on trace la courbe donnant la masse de

levure en fonction de la quantité de glucose consommé (figure 10). La pente de la

droite obtenue nous permet de calculer le rendement pondéral de la croissance.

Pour une culture sur glucose avec ammonium, ce rendement est de 28 % ; pour une

culture carencée en azote il n'est que de 3 %environ.

32

T------i 6 ::I:

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Figure 9 - Croissance de 1. starkeyi cultivé sur glucose en aérobiose.

Culture avec ammonium. (1) densité cellulaire. (2) pH.

Culture sans ammonium. (3) densité cellulaire. (4) pH.

33

- r -

"'--------~- L I L 1 _

2 3 4 5 6GLucose consommé: mg

CI1,5~--r--- --1 --­

EencuL-::J>cu->' cu

"cu~too~

0,5

Figure 10 - }~sse cellulaire en fonction de la masse de glucose métabolisé.

(1) avec du phosphate d'ammonium. (2) sans aliment azoté.

34

Senez (30) indique une nouvelle façon de traduire ce paramètre en

l'exprimant sous forme de rendement des phosphorylations ; cette valeur est

obtenue en divisant le rendement moléculaire de la croissance par YATP

qui repré­

sente la quantité de matériel cellulaire synthétisé par une molécule d'ATP. YATP

a été trouvé constant dans un très grand nombre de cas et sa moyenne évaluée à

10.5. La valeur que l'on obtient de cette façon représente le gain net d'ATP par

molécules de glucose métabolisé. Pour ~. starkeyi. le rendement moléculaire est :

0.28 x 180 • .50.4. ce qui indique un gain net de 4.8 ATP par molécule de glucose.

IV - RESPIRATION DE L'OXYGENE

a) En présence de différents métabolites carbonés

A l'aide de la technique manométrique de Warburg. nous avons mesuré la

vitesse de consommation de l'oxygène. en présence de divers métabolites carbonés.

par des cellules provenant de cultures aérobies sur glucose de~. starkeyi. Les

cellules centrifugées et lavées sont remises en suspen~ion peu dense dans le

tampon phosphates et incubées 2 heures à 32°. Ce jeûne a pour but de réduire le

métabolisme endogène. Chaque système contient : substrat. 100 ~moles (diverttcule;

cellules 9 à 10 mg (poids sec) tampon phosphates MIlS pH • 6. quantité suffi­

sante pour compléter le volume à 3 ml ; KOH à 20 7.. 0.1 ml (puits central)

phase gazeuse. air. La température est de 32°. Un système ne contenant pas de

substrat est utilisé pour mesurer la respiration endogène.

Comme l'ont noté Heick et Stewart (12) pour ~. lipofer. la consommation

d'oxygène devient linéaire 20 à 30 minutes après le temps zéro dans le cas du

glucose. 60 minutes après le temps zéro dans le cas des autres sources de car­

bone. En opérant toujours dans les mêmes conditions et en calculant les - Qo

entre 60 et 90 minutes. la reproductibilité est satisfaisante comme nous le 2

montre le Tableau l qui donne les résultats obtenus lors de deux expériences

effectuées avec des cellules provenant de cultures différentes. Les sources de

carbone donnant les activités respiratoires les plus élevées sont le glucose.

l'acétate, le xylose. le mannitol et le succinate ; par contre nous n'avons pas

observé d'oxydation du pyruvate et du lactate.

TABLEAU 1.- Mesure de la respiration de l'oxygène en présence

de différents métabolites carbonés par 1. starkeyi

Il

Substrat Activités respiratoires (- QO )2

Exp. nO 1 Exp. nO 2 Moyenne

Endogène 5,6 5,7 5,65.:!:. 0,05

Glucose 31,2 32,9 32,0 .:!:. 0,8

Mannitol 12,8 15,6 ,14,2 .:!:. 1,4

Citrate 3,2 1,8 2,5.:!:. 0,7

Succinate 15,2 13,6 14,4 .:!:. 0,8

Acétate 21,6 24,3 22,9 .:!:. 1,3

Pyruvate 2,0 2,0 2,O.:!:. 0,0

Lactate 1,6 1,4 1,5 .:!:. 0,1

Xy10se 17,6 17,1 17,4 .:!:. 0,3

Les valeurs des - Q02 pour les différents substrats ont

été corrigées pour la respiration endogène.

Les - Q02 sont exprimés en ~1 d'02 consommé par heure

et par mg (poids sec) de levure.•

35

36

b) Action des inhibiteurs

Nous avons recherché si la respiration de l'oxygène en présence de

glucose est sensible à l'azothydrate de sodium. à l'arsénite et au fluoracétate.

Nous avons employé la même technique que précédemment; l'inhibiteur est placé

dans la coupe avec les cellules. Nous avons également étudié l'action de ces

inhibiteurs sur la respiration endogène. Pour cela on s'est servi de systèmes

ne contenant pas de glucose. Le Tableau II présente les résultats obtenus. La

respiration endogène est fortement inhibée par l'azothydrate et le fluoracétate ;

par contre elle est insensible à l'arsénite. La respiration mesurée en présence

de glucose est également fortement inhibée par l'azothydrate. mais. contrairement

à la respiration endogène. elle est insensible au fluoracétate et fortement

inhibée en présence d'arsénite.

Le fait que la respiration endogène soit fortement inhibée par le

fluoracétate semble indiquer que le métabolisme endogène emprunte surtout le~

cycle de Krebs pour oxyder les substances de réserve ; ceci est vraisemblable.-puisque les principales réserves cellulaires sont constituées par des acides gras

dont l'oxydation est liée à cette voie métabolique. Il est également normal que

la respiration en présence de glucose soit inhibée par l'arsénite qui empêche

la décarboxylation oxydative du pyruvate en acétyl-CoA. et entraîne l'accumula­

tion de pyruvate. Le fait que la respiration en présence de glucose soit insen­

sible au fluoracétate peut s'expliquer de la manière suivante: cet inhibiteur

bloque le fonctionnement du cycle de Krebs. mais laisse inchangée l'oxydation

du NADH2 ou du NADPH2 produits en dehors de celui-ci.

v - CONCLUSIONS

Nous n'avons pas décelé de besoin en facteur de croissance pour

~. starkeyi C 79. Le taux de croissance est faible : 0.143 génération par heure.

Le rendement de croissance est également bas : 28 %. Ce dernier paramètre est

sensiblement le même avec le glucose et le mannitol. Ce sont le glucose. l'acé­

tate. le xylose. le mannitol et le succinate qui fournissent les activités

respiratoires les plus élevées ; par contre. avec le lactate. le pyruvate et le

citrate les valeurs obtenues sont très faibles. Ceci est peut-être lié à un

37

TABLEAU II.- Pourcentages d'inhibition de la respiration de l'oxygène

chez,b.. starkeyi.

Pourcen tage d'inhibitionInhibiteur

Glucose Endogène

Azothydrato de Na •••• 4 mH 81 61

Arsénite de Na •••• 2 mU 46 0

Arsénite de Na •••• 4 mM 64 0

Fluoracétate ••••O.8 mM 0 25.5

Fluoracétate •••• l mM 0 50

Chaque résultat représente la moyenne d'au moins deux détermi­

nations faites avec des cellules provenant de cultures différentes.

38.

problème de perméabilité cellulaire. La respiration endogène correspond vraisem­

blablement à l'utilisation des réserves lipidiques, et en particulier à l'oxyda­

tion des acides gras. Nous ne savons pas si le cycle de Krebs fonctionne en

présence de glucose. Par contre, l'arsénite inhibe l'oxydation de ce substrat

carboné. On devrait donc observer une accumulation de pyruvate à partir du

glucose en présence de cet inhibiteur ; ceci sera étudié par la suite.

Le faible rendement de la croissance, ainsi que la forte acidification

du milieu suggèrent que des acides s'accumulent dans les cultures. Nous revien­

drons sur ce point au chapitre suivant.

39 ,

CHAPITRE IV

. ," ,ACCUHULATION DES ACIDES ORGANIQUES

DANS LE MILIEU DE CULTURE

l - ACIDE GLUCURONIQUE

Slodki et Wickerham (31) ont extrait du milieu de culture de~. starkeyi

et~. 1ipofer les polysaccharides synthétisés sur milieu riche contenant du

glucose comme source de carbone et d'énergie. Ils ont obtenu un rendement d'en­

viron 20 % en polysaccharides par rapport au glucose consommé. Ces polymères

sont composés pour un tiers d'acide glucuronique. Nous avons dosé cet acide pro­

duit dans les milieux de culture et suivi son accumulation afin de savoir à quel

moment sont synthétisés les polysaccharides. Pour cela nous avons utilisé la

méthode au carbazo1e qui, rappelons-le, permet de doser les acides uroniques sous

ses formes libre et conjuguée. Comme le glucose interfère, nous avons emp10yé t des

cultures sur mannitol avec ou sans source d'azote. Les courbes de production

d'acide glucuronique et de densité des cultures se trouvent sur la figure 11.

L'identité des spectres d'absorption des produits fournis par l'action du carba­

zole sur un échantillon d'acide glucuronique pur et sur le surnageant de culture

indique que l'on a bien affaire à un acide uronique et non à un sucre réducteur.

Pour les cultures sur mannitol avec azote, nous obtenons 750 mg d'acide

glucuronique pour 10 g de polyol utilisé, ce qui correspond à un rendement de 7 %.

Ceci est en accord avec les résultats de Slodki et Wickerham (31) qui indiquent

pour ~. starkeyi un rendement de 20 % en polysaccharides dont un tiers, soit

6,8 %, est composé d'acide glucuronique. Pour les cultures sans azote, seulement

42 mg de cet acide sont formés et cela tout au début de l'incubation; cette

phase de développement, très courte, s'explique par l'utilisation des faibles

traces d'azote contaminant le milieu. Ensuite, la croissance et la production

d'acide glucuronique s'arrêtent. Nous avons dosé l'acide dans le milieu de cul­

ture sur glucose en fin de croissance lorsque le sucre est épuisé. On trouve des

quantités comparables à celles obtenues à partir du mannitol.

40

..... -----·T·-------r--~~l .....E E-... -...en 1 enE 3.0 0,8 EIII CIlCIl :J'- ...-------e-r- C":J

== 2,5 /"" œ c0

:J '-U , :J

III, r6

!,CIl ,'02.0

,,,'cu ,... • '0, .-III , UC

, Ccu

, ,\5 , 0,4 '0Q ,, c,

.~,~

...c'-

\0, ..., c,,

qJ cu,0.2 g,, 0

OS0

.,

._---------------'

Figure 11 - Accumulation de l'acide glucuronigue dans le milieu de culture de

1. starkeyi cultivé sur mannitol avec ou sans source d'azote.

Culture avec ammonium. (1) densité cellulaire. (2) accumulation

d'acide glucuronique.

Culture sans ammonium (3) densité cellulaire. (4) accumulation

d'acide glucuronique.

41

Il est intéressant de noter que l'accumulation des polysaccharides

extracellulaires se produit pendant la phase exponentielle de croissance. Cela

explique les faibles rendements de croissance observés. puisqu'une grande partie

de l'aliment carboné sert à la production de ces polysaccharide~. En effet. si

on inclue les polysaccharides dans le matériel cellulaire synthétisé. le rende­

ment pondéral s'élèvc alors à 48 % par rapport au glucose consommé. ce qui est

compatible avec les rendements obtenus avec d'autres levures. En l'absence d'une

source d'azote assimilable. 1. starkeyi est incapable d'accumuler des polysaccha­

rides dans le, milieu.

II - ACIDES VOLATILS

a) Dosagc de l'acidité volatile dans les surnnGcants

Nous avons étudié l'accumulation des acides volatils pendant la crois­

sance sur glucose ou surllmannitol. avec ou sans àmmonium. Nous avons mesuré la

densité optique. la concentration de glucose le cas échéant. et l'acidité vola­

tile par entraInement à la vapeur. dans les échantillons prélevés au cours de la

croissance. La figure 12 présente les résultats obtenus avec les cultures sur

glucose. Nous avons obtenu des résultats comparables avec les cultures sur

mannitol.+Dans le cas des cultures avec NH4 • la courbe d'accumulation des acides

volatils suit la courbe de croissance. et il s'accumule environ 5.3 milliéquiva­

lents (m.éq.) d'acide pour 7.5 g de glucose utilisé; donc 7.7 millimoles de

glucose fournissent 1 m.éq. d'acide volatil dans le milieu de culture. Avec le

mannitol on obtient 1 m.éq. pour 7.3 millimoles. Par contre. dans le cas des

cultures carencées en azote. le rendement est plus élevé: 1 m.éq. d'acide

volatil pour 3 millimoles de glucose.

b) Identification des acides volatils

On effectue des chromatographies sur les résidus obtenus à partir des

surnageants acidifiés de cultures et soumis à l'entratnement à la vapeur. Dans

un premier stade. on fait une chromatographie sur papier. On voit apparattre une

seule tache qui pourrait correspondre à l'acide acétique ou à l'acide formique.

. ou bien à un mélange de ces deux acides qui ont le même Rf dans les systèmes de

solvant utilisés. On procède alors à une chromatographie de partage sur colonne

42.

ut

5=o6Jo-'o

4 >utcu"0.-

3 g,"0

C2.~

o6JoL.

o6J

1 ;ucoU"'-------I- 'L ---::::!I=-- --L. - ...J

25 50 75 100 125'''',Temps: heures

11

11

11

1 "1"

~'1

"""~_ ...",,,

ut~ 1,5::J

o6J-'::JU

ut

~ 1,0

-' 2,0 ,-------.---------.------r------.--:==---------,E 1.........C)

E

'cuo6J

utCcucO,5

,--- -----------------"

Figure 12 - Accumulation des acides volatils dans le milieu de culture de

~. starkeyi cultivé sur glucose.

Culture avec ammonium (1) densité cellulaire. (2) acides volatils.

Culture sans ammonium (3) densité cellulaire. (4) acides volatils.

43

de gel de silice. La courbe de titration de l'acidité en fonction du volume

d'éluat recueilli est comparée à celle obtenue à partir d'un mélange d'acides

acétique et formique purs (figure 13). Notre échantillon contient seulement de

l'acide acétique.

L'acide acétique étant un produit intermédiaire dans l'oxydation du

glucose, son accumulation pourrait s'expliquer par le fait qu'il est produit

plus rapidement qu'il n'est oxydé. L'ion ammonium n'est pas indispensable à cette

accumulation ; au contraire le rendement est deux fois plus faible en sa présence.

III - ACIDE PYRUVIQUE

lleick et Stewart (11) ont trouvé des céto-acides (pyruvato, glyoxylate

et cétomalonate) dans le milieu de culture de~. lipofer. Les expériences quo

nous avons faites avec L. starkeyi ont donné des résultats comparables. Mais ces

produits ne sont présents qu'à l'état de traces; on trouve par exemple 10 à

15 mg d'acide pyruvique par litre.

Nous avons étudié l'accumulation d'acide pyruvique par des suspensions

cellulaires placées en présence d'arsénite qui, nous l'avons vu, inhibe la res­

piration de l'oxygène en présence de glucose. Pour cela on effectue deux essais

parallèles en erlenmeyers, l'un avec et l'autre sans arsénite. Le système avec

inhibiteur a la composition suivante glucose, 4 mM ; cellules, 4,2 mg (poids

sec) par ml ; arsénite de sodium, 5 mM j tampon phosphates pH • 6, 25 mM. La

température est de 32° et les récipients sont aérés par agitation. Le glucose

est ajouté au temps zéro. On prélève des échantillons de 3 ml auxquels on ajoute

4 volumes d'acide trichloracétique à 10 i.. Les cellules sont éliminées par cen­

trifugation, puis l'acide pyruvique est dosé dans le surnageant (figure 14).

Des quantités élevées de pyruvate s'accumulent seulement en présence

d'arsénite. On ne trouve que des traces de cet acide dans les témoins sans inhi­

biteur. Les quantités d'acide pyruvique formées en présence d'arsénite (0,6 mg/ml)

sont suffisamment élevées pour qu'il soit possible de l'extraire et de le

purifier. Nous tirerons profit de ce fait au cours des expériences de marquage

au carbone 14.

,-- ---- ---- r-- -- ---1

1

1

-' 5E'0~Z

:I: 4ooZQI

"tJ

Ë 3

~J

1

------ ,

5

-~Acétate 1

~ Formiate 1

1

J1

44

Figure 13 - Diagrammes d'élution des chromatographies sur gel de silice.

Les fractions recueillies sont de 4 ml. (1) mélange d'acides acétique

et formique purs. (2) échantillon provenant du surnageant d'une

culture de 1. starkeyi.

45

.J

EQ6.......enE

~ 0.5.2">::l~

~

0.04.cu

't:J'ü0;, 0.3c0...,~ 0.2....ccu0c0u 0.1

2

50 100 150 200Temps: minutes

l _

Figure 14 - Production de pyruvate à partir de glucose par une suspension cellu­

laire de~. starkeyi.

(1) en présence d'arsénite de sodium' mtl. (2) en l'absence d'arsénite

'46

IV - CONCLUSIONS

Pendant la phase exponentielle des cultures de ~' starkeyi il s'accumule,

d'une part de l'acide glucuronique avec un rendement de 7 7., et d'autre part de

l'acide acétique à raison d'une mole pour 7,7 moles de glucose consommé. Cette

double production d'acide suffit à expliquer la forte acidification du milieu.

En effet, lors du dosage des acides orBaniques totaux produits pendant la crois­

sance, nous avons trouvé un résultat de l'ordre de 10 m.éq./l à partir de 10 Sil

de mannitol. Ceci est en accord avec les rendements observés en acides glucuro­

nique et acétique. Les quantités élevées de polysaccharides accumul~s dans le

milieu expliquent le faible rendement de la croissance de~. starkeyi. En l'ab­

sence d'une source d'azote l'acide glucuronique ne s'accumule pas, mais l'acide

acétique est produit en plus grande quantité.

Le problème qui se pose maintenant est de savoir de quelle façon le

glucose est transformé en pyruvate. Pour cela nous avons recherché, dans les

extraits acellulaires, les enzymes caractéristiques des voies métabo~iques

capables d'effectuer cette conversion.

'-'.

47

CHAPITRE V

EXISTENCE DE LA GLYCOLYSE ET DU CYCLE DES

PENTOSE-PHOSPHATES

l - INTRODUCTION

Les seuls travaux portant sur le fonctionnement des voies métaboliques

chez les Lipornyces sont ceux de McElroy et Stewart (24). Ces auteurs ont étudié

la biosynthèse des acides gras à partir de l'acétate chez~. lipofer. Nous

n'avons par contre aucun renseignement concernant les voies métaboliques utilisées

pour la dégradation du glucose. Nous avons dosé les enzymes de la glycolyse et

ceux du cycle des pentose-phosphates dans les extraits de~. starkeyi cultivé en

présence de glucose ou de mannitol (milieu C contenant du chlorure dO, ammonium).

Il nous a semblé intéressant de comparer les résultats obtenus à ceux fournis

par des extraits de !. cerevisiae.dont le métabolisme est mieux connu.

II - ASSUIILATION DU HANNITOL

La question se pose de savoir si le mannitol est oxydé en fructose-6-P

après avoir été phosphorylé. ou bien s'il est d'abord oxydé en fructose puis

phosphorylé. Nous avons recherché dans les extraits les enzymes responsables de

ces réactions. Notre attention s'est portée en premier sur les mannitol-déshydro­

génases à NAD ou NADP, enzymes, soulignons-le, qui peuvent présenter une spéci­

ficité assez large à l'égard de leur substrat et agir comme polyol-déshydrogénases

Les résultats figurant sur le Tableau III conduisent aux observations

suivantes

1) On ne décèle aucune activité en présence de NAD ou de NADP chez

2.. cerevis iae •

TABLEAU 111.- Activités mannitol-déshydrogénases des extraits de

~. cerevisiae et~. starkeyi.

Activités enzymatiquesSubstrat et Cofacteur

],. cerevisiae ~. starkeyi ~. starkeyi(glucose) (glucose) (mannitol)

Hannitol + NADP ° 0.064 0.0765

Nannitol + NAD ° ° 0.0775

Fructose + NADP ° 0.061 0.069

Fructose + NAD ° ° 0.0865

Fructose + NADP + NAD ° 0.062 0.158

Les résultats représentent les moyennes de deux déterminations faites

sur des extraits provenant de cultures différentes. En parenthèses

figure l'aliment carboné présent dans la culture.

48

49

2) Lorsque L. starkeyi est cultivé sur glucose, on trouve une activité

mannitol-déshydrogénase uniquement avec le NADP ;

3) Par contre, quand cette levure croIt sur mannitol, on retrouve

l'activité précédente en présence de NADP et l'on observe en plus une activité

mannitol-déshydrogénase avec le NAD. La réversibilité des réactions précédentes

a été vérifiée en mettant en évidence une réduction du fructose en présence de

NADH2 ou de NADPH2 •

Les deux activités mannitol-déshydrogénases mesurées, l'une en présence

de NAD, l'autre en présence de NADP, sont-elles dues à la même déshydrogénase ou

à deux enzymes distincts 1 Pour le savoir, nous avons fait des mesures avec des

systèmes contenant ces deux accepteurs d'électrons. On observe qu'il y a additi­

vité des activités mesurées dans le cas des systèmes contenant uniquement le NAD

ou le NADP. Ceci suggère l'existence de deux mannitol-déshydrogénases distinctes.

Nous avons vérifié que les extraits de cultures sur mannitol de

~. starkeyi ne catalysent pas la réduction du fructose-6-P aux dépens du NADH2ou du NADPH2 , ce qui établit l'absence de mannitol-l-phosphate-déshydrogénase.

Les résultats précédents suggèrent que le mannitol subit les transfor­

mations suivantes :

mannitol---(déshydrogénation) + fructose---(phosphorylation) +

fructose-6-P---(isomérisation) + glucose-6-P

III - ENZYMES GLYCOLYTIQUES

Nous avons dosé l'hexokinase, la fructokinase, la fructose-diphosphate­

aldolase et la phosphofructokinase dans des extraits provenant de cultures sur

glucose. Dans le cas de 1. starkeyi nous avons obtenu des activités spécifiques

comparables pour des extraits provenant de cultures sur mannitol. Examinons les

résultats rapportés sur le Tableau IV. Nous remarquons que les niveaux des enzy­

mes intervenant dans la première partie de la chaIne glycolytique sont plus

élevés chez !. cerevisiae que chez~. starkeyi. La différence est particulière­

ment marquée dans le cas de la phosphofructokinase.

50

TABLEAU IV.· Enzymes glycolytiqu8s dans les extraits de cultures sur gl~cose.

"Activités spécifiques

En~ymes Rapport!. cerevisiae L. starkey~

Hexokinase 5,6 0,715 7,85

Fructokinase 2,8 0,375 7,45

Phosphofructokinase 0,06 0,004 15

Fructose-diphosphate-aldolase 0,165 0,07 2,36

Chaque valeur représente la moyenne d'au moins deux déterminations faites

sur des extraits provenant de cultures différentes. Dans la dernière colonne

figure le rapport de l'activité spécifique de l'extrait de S. cerevisiae à-celle de l'extrait de~. starkeyi.

51

Brady et Chambliss (4) ont mesuré l'activité phosphofructokinase de

diff~rentes levures ; ils ont calculé le rapport des activités glucose-6-phospha1

déshydrogénase et phosphofructokinase. Plus ce rapport est élevé. plus la phosph(

fructokinase fait défaut dans l'équipement enzymatique. Ils ont ainsi observé

l'absence de phosphofructokinase chez toutes les espèces de Rhodotorula examinéel

Ils ont obtenu des rapports de 466 et 1.4 respectivement pour ~. glutinis et

~. cerevisiae. En ce qui concerne~. starkeyi.ce rapport est en moyenne de 400

pour notre souche de S. cerevisiae il est de 9 environ. Nous en concluons qu'il

y a un défaut de phosphofructokinase chez L. starkeyi.

Le fait que nos extraits soient dépourvus d'activité phosphofructokinal

ne permet pas de conclure de façon catégorique à .l'absence de cet enzyme dans

les cellules. En effet. la phosphofructokinase risque d'être dénaturée lors de

la préparation des extraits. car elle est particulièrement labile.

L'absence d'activité phosphofructokinase. ainsi que le faible niveau

des autres enzymes glycolytiques dans les extraits de~. starkeyi. ne permettent

pas de conclure à l'absence de la glycolyse. mais constituent une présomption en

faveur d'une participation très faible de cette voie.

IV - ENZY~mS DU CYCLE DES PENTOSE-PHOSPliATES

Nous avons dosé les deux enzymes caractéristiques de la partie oxydati'

de cette voie : la glucose-6-phosphate-déshydrogénase et la 6-phosphogluconate­

déshydrogénase. Nous avons aussi dosé la t~anscétolase qui intervient dans la

. partie non-oxydative. En ce qui concerne ce dernier enzyme. comme nous l'avons

indiqué précédemment (MATERIEL et }Œ~HODES). l'activité mesurée fait intervenir

également les deux isomérases des pentose-phosphates. Que l'aliment carboné

présent dans la culture soit le glucose ou le manntiol. les activités spécifique

des extraits de~. starkeyi demeurent les mêmes.

Les activités glucose-6-phosphate-déshydrogénase et 6-phosphogluconate

déshydrogénase sont approximativement 5 fois plus élevées chez~. starkeyi que

chez ~. cerevisiae (Tableau V). Par contre. le niveau de la transcétolase est le

même chez les deux levures. Rappelons au passage que les niveaux des enzymes

représentatifs de la glycolyse sont 3 à 15 fois plus bas chez~. starkeyi que

chez ~. cerevisiae. Les résultats précédents suggèrent fortement que. contraire­

ment à ce qui se passe chez~. cerevisiae. le cycle des pentose-phosphates joue

TABLEAU V.- Enzymes du cycle des pentose-phosphates dans les extraits de

cultures sur glucose.

1

Enzymes Activités enzymatiques Rapport

.2.0 cerevisiae ,&• starkeyi

Glucose-6-phosphate-déshydrogénase 0,49 1,8 0,27

6-phosphogluconate-déshydrogénase 0.111 0,52 0,213

Transcétolase 0.328 0.276 1,19,

Mêmes remarques que celles qui ont été faites à propos du Tableau IV.

52

un rôle plus important que la glycolyse chez L. starkeyi.

v - FORHATION DE PYRUVATE A PARTIR DE DIFFERENTS ESTERS PHOSPHORIQUES

Hous avons recherché si les extraits enzymatiques de~. starkeyi et

1. cerevisiae étaient capables de transformer différents esters phosphoriques en

pyruvate. Pour mettre en évidence la production de ce composé, on opère en pré­

sence d'arsénite. On ajoute les cofacteurs nécessaires aux réactions. Chaque

système contient: extrait enzymatique (1 à 2 mg d'azote/ml) : 1 ml ; ester

phosphorique : 20 ~moles j arsénite de sodiu~ : 20 ~moles tampon phosphates

M/15 pH • 6, quantité nécessaire pour compléter le volume à 5 ml. On laisse

incuber pendant 2 heures à 37°, puis on ajoute 4 volumes d'acide trichloracétique

à 10 7. et l'on dose l'acide pyruvique dans le surnageant obtenu après centrifu­

gation.

Le Tableau VI présente les résultats obtenus. On constate que le

3-phosphoglycérate est converti en pyruvate chez les deux levures. Le fait que

le pourcentage de conversion trouvé soit plus faible chez S. cerevisiae que chez

~. starkeyi s'explique peut-être par une décarboxylation non oxydative du pyru­

vate en acétaldéhyde par les extraits de la première de ces deux levures.

Le fructose-l,6-diP est lui aussi transformé en pyruvate chez les deux

levures, mais la chute du pourcentage de conversion par 'rapport à celui observé

dans le cas du 3-phosphoglycérate est beaucoup plus importante chez ~. starkcyi

que chez~. cerevisiae. Ce phénomène est encore plus apparent lorsqu'on utilise

le glucose-6-P en présence d'ATP et en l'absence de NADP, conditions qui permet­

tent le fonctionnement de la glycolyse mais pas celui du cycle des pentose­

phosphates. Les dosages d'enzymes laissaient prévoir une activité glycolytique

faible chez~. starkeyi. Les observations précédentes confirment cette prévision.

Les extraits de 1. starkeyi transforoent également le glucose-6-P et

le ribose-5-P en pyruvate par l'intermédiaire de la voie des pentose-phosphates.

Au cours de la conversion en pyruvate du premier de ces deux esters phosphoriques,

le cycle des pentose-phosphates joue un rôle deux fois plus important que la

glycolyse chez 1. starkeyi et deux fois plus faible chez ~. cerevisiae.

Nous venons de montrer que le cycle des pentose-phosphates et la gly­

colyse coexistent dans les extraits de L. starkeyi, et que la première de ces

deux voies y est nettement plus active que la seconde.

c'

tABLEAU VI.- Formation de pyruvate à partir d'esters phosphoriques par des extraits-en présence d'arsénite.

Quantité de pyruvate Pourcentage de conversionSubstrat Cofacteurs <umoles)

1

S. cerevisiae L. starkeyi S. cerevisiae L. starkeyi

3-P-glycérate ADP + NAD 8,3 14,7 41,5 73

Fructose-l,6-diP ADP + NAD 13,21 6,8 33 17

Glucose-6-P ADP + NAD + ATP 5,65 1,1 14,2 2,7

Glucose-6-P ADP + NAD+ NADP + TPp· 1,6 1,2 8 6

Ribose-5-P ADP + NAD + TPP 4,3 3,8 21 19

Chaque valeur représente la moyenne d'au moins 2 déterminations faites sur des extraits provenant de

cultures différentes. Pourcentage de conversion: proportfon de l'ester phosphorique transformé en

acide pyruvique, compte tenu du rendement de la voie utilisée.

\11W

54

VI - CONCLUSIONS

Nous avons établi que la première réaction intervenant dans le méta­

bolisme du mannitol chez ~. starkeyi est une oxydation en fructose, suivie d'une

phosphorylation en fructose-6-P, et non une phosphorylation en mannitol-l-P,

suivie d'une déshydrogénation en fructose-6-P. Rappelons que la dégradation du

mannitol par Acetobacter aceti met en jeu un mécanisme identique (8). Les extraits

de cultures sur glucose de k. starkeyi contiennent une mannitol-déshydrogénase à

NADP. Enfin, il apparaît en plus une mannitol-déshydrogénase à NAD lorsque

cette levure est cultivée sur mannitol.

Nous avons vu que tous les enzymes nécessaires au fonctionnement de

la glycolyse et du cycle des pentose-phosphates sont présents à des niveaux

variables dans les extraits de~. starkcyi. Cependant, les dosages d'enzymes

et la mesure des pourcentages de conversion des esters phosphoriques en pyruvate

indiquent que la première de ces deux voies joue sans doute ici un rôle moins

important que la seconde.

55

CHAPITRE VI

H1PORTANCE RELATIVE DES DIFFERmiTES VOIES HETA130LIQUES

PARTICIPA1~T A LA DEGRADATION DU GLUCOSE

l - INTRODUCTION

1. starkexi possède un équipement enzymatique qui lui permet de trans­

former le glucose en pyruvate par la voie des pentose-phosphates et la glycolyse.

Nous avons vérifié l'absence de la voie d'Entner-Doudoroff. Cependant, les

oesures d'activités enzymatiques des extraits ne nous permettent pas de savoir

si ces deux voies sont utilisées ~ vivo et dans quelles proportions. Pour répon­

dre à ces questions nous avons fait appel aux tecbniques fondées sur l'emploi du

glucose radio-actif.

Nous avons fait des expériences sur des suspensions cellulaires incu­

bées en présence de glucosc-l-c14 , _2_c14 , _6_c14 , ou _U_C14 et d'arsénite; la

radio-activité spécifique du pyruvate accumulé dans le milieu est mesurée. En

utilisant la méthode de Katz et Wood, décrite au début de cet exposé, nous avons

déterminé la part prise par chacune des voies dans le métabolisme du glucose.

Les résultats seront aussi exprimés en pourcentages d'activité, ce qui nous per­

mettra de connaître les proportions de glucose oxydé par la voie des pentose­

phosphates et la glycolyse, comme dans le cas de l'estimation selon Dawes et

Holms •

II - EXPERIENCES REALISEES AVEC DES CELLULES NON CARENCEES

a) 1. s tarkcyi

Après leur récolte, les cellules cultivées sur glucose sont remises

en suspension dans du tampon phosphates, puis on les met en incubation avec le

glucose spécifiquement marqué dont on a mesuré la radio-activité spêcifique

aprùs dilution dans le glucose froid. Chaque système contient: cellules: 2S0 mg

(poids sec) ; glucose~: 72 ~moles ; arsénite de sodium: 100 ~moles ; tampon

phosphates MilS pH • 6, quantité nécessaire pour compléter le volume à 18 ml.

56

L'aération est réalisée par agitation. On laisse incuber pendant une heure à 32°,

puis on centrifuga les cellules. On dose le glucose et le pyruvate dans le sur­

nageant et l'acide pyruvique est isolé sous la forme de sa 2,4-dinitrophénylhy­

drazone. La radio-activité du pyruvate est mesurée sur ce composé.

On indique sur le Tableau VII les quantités de glucose consommé et de

pyruvate formé dans nos conditions expérimentales. Le Tableau VIII présente les

radio-activités spécifiques du glucose et du pyruvate mesurées au cours de l'une

des trois expériences que nous avons faites dans les mêmes conditions. On y

trouve également le pourcentage d'activité du cycle des pentose-phosphates par

rapport à la glycolyse, 'calculé par la méthode graphique de Dawes et Holms

(chapitre I). Les valeurs ainsi obtenues donnent une idée de l'importance rela­

tive de ces deux voies, mais elles ne permettraient pas d'établir un bilan com­

plet de l'utilisation du glucose métabolisé dans le cas où il se produirait une

synthèse de polysaccharides. Pour pallier cette insuffisance, nous avons utilisé

le procédé de calcul plus général de Katz et Wood (Chapitre I). Notons que dans

ce cas il n'est pas nécessaire d'effectuer la correction due à la dilution

endogène du pyruvate.

On trouve que 25 7. du glucose est converti en pyruvate par la voie

des pentose-phosphates et 35,6 7. par la glycolyse; enfin 39,4 7. du glucose ne

fournit pas de pyruvate mais est orienté .vers des voies "non triose-phosphates".

Si on exprime ces résultats en pourcentages d'activité, on constate que, sur

100 molécules de glucose, la voie des pentose-phosphates et la glycolyse en oxy­

dent respectivement 50 et 23, alors que 27 sont orientées vers des voies "non

triose-phosphates". Si nous ne considérons que la fraction de glucose qui donne du

pyruvate, nous voyons que le pourcentage d'activité de la voie des pentose­

phosphates est de 68,S 7., valeur proche des 69 7. que fournit le calcul suivant

Da~es et Holms dans le cas où le glucose-6-C14 est le précurseur. Sur le Tableau

IX se trouvent représentés les résultats, exprimés en pourcentages d'activité,

correspondant à trois expériences effectuées à partir de cellules provenant de

cultures différentes. On voit que les valeurs obtenues diffèrent peu d'une expé­

rience à l'autre.

En résumé nous pouvons dire qu'en ce qui concerne le bilan final de

l'utilisation du glucose, 37 7. environ est mGtabolisé par les voies "non triose­

phosphates, le reste, soit 63 7., est transformé en pyruvate par la voie des

pentose-phosphates et la glycolyse. Les pourcentages d'activité relatives de ces

deux voies sont de 70 pour le cycle des pentose-phosphates et de 30 pour la

glycolyse.

TABLEAU VII.- Production de pyruvate en présence d'arsénite à partir

de glucose marqué, par une suspension cellulaire de~. starkeyi.

Position de marquage du glucoseConcentrationsmillimolaires

U_C14 l-c14 2-c14 6-C14

Glucose : début del'expérience 4,35 4,35 4,35 4,35

Glucose : fin del'expérience 0,025 0,016 0',02 0,018

1

Pyruvate : fin del'expérience 3,75 3,9 3,6 3,65

57

58

TABLEAU VIII.- Radio-activités spécifiques du. glucose et de la 2,4-dinitrophé­

nylhydrazone de l'acide pyruvique éhez L. starkeyi.

,QI li)

Radio-activités Radio-activité spécifique ..-4 Q)O,j,J

spécifiques molaire relative comparée 1 > IIIQI :s ..c:

du pyruvate ~ III P-b/) b/)~ li)III 0:s :s Iof..c:0- "ë1llP-lof

Pyruvate (1) Corrigée(2)Pol

~ ~ Glucose Observée QI Q)bD \Q) li)

0 III "ë 0QI (J .j.J ~,j,J"ë :s d d~ QI 0 Q)

QI bD (J PoPo lof QI

~~:s li) li)

o 0 Q)Pè(Joa

U_C14 11 222 5 000 0,445 0,5

l-C14 13 257 2 940 0,222 0,249 58

2-C14 11 599 4 270 0,368 0,413 66

6-C14 15 679 8 850 0,565 0,635 69

(1) Corrigée pour le gain ou la perte de marquage du carbone du groupement

carboxyle du pyruvate.

(2) Corrigée pour la dilution due au métabolisme endogène.

59

TABLEAU IX.- Pourcentages d'activité des différentes voies du métabolisme

du glucose chez ~. starkeli.

Pourcentages d'activitéExpérience

Voie des Glycolyse l' Voies nonpentose-phosphates triose-phosphates

N° 1 48,5 25,5· 26

N° 2 50 23 27

N° 3 60 19 211

Moyenne 52,8 22,5 24,7

60

b) ~. cerevisiae

. Nous avons fait une expérience semblable aux précédentes avec une sus­

pension de ~. cerevisiae. Dans ce cas les radio-activités spécifiques du pyruvate

comparées au glucose ont les valeurs suivantes : U_C14 : 0,5 ; l_C14 : 0,495 ;

2_C14

: 0,5 ; 6_C 14 : 0,51. Ceci indique que le pourcentage d'activité du cycle

des pentose-phosphates, calculé suivant Dawes et Holms, est compris entre 2 et

10 %.

La glycolyse représente donc ici de très loin la voie prédominante. La

valeur élevée trouvée peut s'expliquer en partie par une aérobiose imparfaite

due à une aération insuffisante des suspensions cellulaires utilisées qui sont

relativement denses. Dans le cas de~. starkeyi, cette difficulté n'était pas à

craindre puisque cette levure est aérobie stricte. Quoi qu'il en s~it, la valeur

trouvée est compatible avec ce que l'on sait sur le métabolisme de~. cerevisiae

(2), et montre que les techniques que nous avons utilisées pour les mesures des

radio-activités spécifiques sont valables.

III - EXPERIENCES REALISEES AVEC DES CELLULES CARErlCEES EN AZOTE

Pour savoir quelle est l'influence de la carence en azote, nous avons

soumis les suspensions de ~ starkeyi à un jeûne. Les cellules cultivées sur

glucose sont récoltées, lavées, mises en suspension dans un tampon phosphates et

incubées en présence d'un excès de glucose pendant 20 heures à 32°, après quoi

elles sont à nouveau centrifugées et lavées. Les suspensions cellulaires obte­

nues sont traitées comme il est indiqué au paragraphe précédent.

Le Tableau X présente les radio-activités spécifiques du glucose et

du pyruvate, ainsi que le pourcentage d'activité du cycle des pentose-phosphates

par rapport à la glycolyse, calculé suivant Dawes et Holms. Nous voyons, d'une

part que ce pourcentage est sensiblement le même que dans le cas de cellules non

carencées (68 %), d'autre part qu'il ne varie pas suivant le mode de marquage du

glucose contrairement à ce qui avait été observé dans le cas précédent. Ceci

semble signifier que pratiquement tout le glucose métabolisé fournit ici du

pyruvate. Pour le vérifier nous avons fait le calcul selon Katz et Wood : 40 et

57,S % du glucose est converti en pyruvate respectivement par la voie des

pentose-phosphates et la. glycolyse ; le pourcentage d'activité du cycle des

61

TABLEAU X.- Radio-activités spécifiques du glucose et de la 2,4-dinitrophényl­

hydrazone de l'acide pyruvique dans le ca. de suspensions cellulaires de

~. starkeyi carencées en azote.

Corrigée(2)Observée

Radio-activité spécifiquemolaire relative comparée

du pyruvate

Pyruvate (1)

Radio-activitésspécifiques

Glucose

\QIli) li)

a QIu'tJ;:1 li)

.-4 QI QI00 0 ,.,4 ~

;:Ig]I-------..,--------!---------,-------I 'tJ 0.Ils li)QI .-4 0llO ,.dIls ,., 0.~lISls:: 0. QIQI li)

U 'QI 0,., 'tJ ~

g .~ ilPol 0 0.

U-c14

l-C14

2-c14

6_C14

11 222

13 257

11 599

15 679

3 650

l 770

3 100

6 280

0,325

0,134

0,268

0,410

0,5

0,206

0,413

0,630

67

66

68

Mêmes remarques que celles faites à propos du Tableau VIII.

-

62

pentose-phosphates par rapport à la glycolyse est toujours de l'ordre de 70 %

(ici 68 %). Le reste. soit seulement 2.5 % est métabolisé par les voies "non

triose-phosphates".

Les observations précédentes confirment les résultats obtenus lors des

cultures carencées en azote de~. starkeyi. Nous avions en effet noté qu'il ne

s'accumule pas alors de polysaccharides. et que le glucose est transformé en

acétate avec un rendement plus élevé qu'en présence d'une source d'azote. Cette

dernière constatation s'explique peut-être par le fait que 97 et 63 % du glucose

utilisé est converti en pyruvate respectivement en l'absence et en présence

d'azote.

IV - CONCLUSIONS

Les expériences effectuées avec le glucose marqué fournissent le pour­

centage de participation des diverses voies métaboliques dans le cas de suspen­

sions cellulaires de~. starkeyi. Elles confirment les résultats obtenus par les

dosages d'enzymes et montrent que le glucose est transformé en pyruvate par

deux voies : le cycle des pentose-phosphates et la glycolyse. dont les pourcen­

tages d'activité relatives sont respectivement d'environ 70 et 30. Il apparaIt

donc que la voie des pentose-phosphates joue ici un rôle plus important que la

glycolyse. Cependant. la participation de la glycolyse est loin d'être négligea­

ble. bien que les activités enzymatiques relatives à cette voie soient peu éle­

vées dans les extraits.

Nous avons montré que 37 % du glucose est métabolisé par des voi~s

ne mettant point en jeu les triose-phosphates. Ceci s'explique vraisemblablement

par la production de polysaccharides extracellulaires ; quand les voies ne four­

nissant pas de glycéraldéhyde-3-P sont actives (cas des cellules non carencées

en azote). on observe une accumulation de ces polymères. comme en témoigne

l'accumulation d'acide glucuronique dans le surnageant des cultures (chapitre IV).

alors que. lorsqu'elles sont inactives (cas des cellules carencées en azote). la

levure n'excrète pratiquement pas de polysaccharides dans le milieu (chapitre IV).

63

CHAPITRE VII

CONCLUSIONS GENERALES

~. starkeyi C 79 n'exige aucun facteur de croissance, a un rendement de

croissance relativement faible (28 %) et possède un temps de génération voisin de

7 heures.

Les suspensions cellulaires oxydent le glucose, le xylose, le mannitol,

l'acétate et le succinate en présence d'oxygène. Les activités respiratoires sont

comprises entre 33 et 14 ~l dé O2 consommé par heure et par mg de cellules (poids

sec). L'arsénite inhibe de 64 7. la respiration en présence de glucose. Il en

résulte une accumulation importante de pyruvate. Grâce à l'étude de l'action

inhibitrice du fluoracétate et de l'arsénite, nou~ avons pu montrer que la respi­

ration endogène est due vraisemblablement en très grande partie à l'pxydation

des acides gras contenus dans les réserves lipidiques de la cellule.

Durant la phase exponentielle, il s'accumule dans le milieu des poly­

saccharides qui peuvent représenter jusqu'à 20 % en poids du glucose consommé.

Ceci explique sans doute en partie le faible rendement de croissance observé. De

l'acide acétique (4 % en poids du glucose consommé) apparaît également dans le

milieu. Les quantités élevées d'acide glucuronique (représentant le tiers des

polysaccharides extracellulaires) et d'acide acétique formées sont vraisemblable­

ment responsables de la forte acidification du milieu de culture.

Starkey (33) avait observé que l'ion ammonium entraîne une diminution

de la synthèse des réserves lipidiques. Nos expériences apportent ici quelques

éclaircissements. En présence d'ammoniaque, ~. starkeyi métabolise 37 % du glu­

c ose consommé par des voies "non triose-phosphates" conduisant à la synthèse de

polysaccharides. De ce fait la proportion de l'aliment carbonp susceptible de

servir à la production d'acides gras se trouve réduite.

Chez 1. starkeyi le mannitol est d'abord oxydé en fructose, lequel est

ensuite phosphorylé en fructose-6-P. Nous avons trouvé une mannitol-déshydrogé­

nase à NADP dans les extraits de cultures sur glucose. Il apparaît une mannitol­

déshydrogénase à NAD lorsque la levure est cultivée sur mannitol.

64

Les extraits de cultures sur glucose de~. starkeyi contiennent tous

les enzymes de la glycolyse et du cycle des pentose-phosphates. Toutefois, leur

activité phosphofructokinase est extrêmement faible.

Grâce à l'emploi du glucose spécifiquement marqué, nous avons pu déter­

miner la part prise par chacune des deux voies dans le métabolisme aérobie des

suspensions cellulaires. Les pourcentages de glucose oxydé par la voip des

pentose-phosphates et la glycolyse sont respectivement de 70 et 30 7.. Contraire­

ment à ce que laissaient prévoir les faibles activités phosphofructokinases des

extraits, la part prise par la seconde de ces deux voies est loin d'être négli­

geable. Les observations précédentes méritent d'être rapprochées de celles que

d'autres auteurs ont faites sur une levure aérobie stricte capable d'accumuler

des quantités importantes de lipides intracellulaires : Rhodotorula glutinis. En

effet, cet organisme, où le cycle des pentose-phosphates est plus actif que la

glycolyse (14), fournit des extraits enzymatiques dépourvus d'activité phospho­

fructokinase (4). On pense que la production par le shunt des hexose-monophospha­

tes de quantités élevées de NADPH2 favorise la synthèse des lipides par les

levures (5). L'activité élevée de cette voie chez ~ starkeyi est, par conséquent.

peut-être liée à son aptitude à accumuler des lipides.

On pourrait s'attendre à ce que~. starkeyi soit capable de croître

en anaêrobiose dans un milieu glucosé puisqu'elle possède la chaIne glycolytique.

Or, cette levure est aérobie stricte. Cela suggère l'explication selon laquelle

les enzymes nécessaires à l'oxydation anaérobie du NADH2 : l'éthanol-déshydro­

génase et la pyruvate-carboxylase, seraient absents.

Notre ,travail conduit à poser la question suivante : la voie des pen­

tose-phosphates prédomine-t-elle sur la glycolyse chez toutes les levures aéro­

bies strictes ? Avant de tirer une conclusion générale, il faudrait naturelle­

ment étendre ces recherches à d'autres espèces,

65

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TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

pages

l

CHAPITRE l - GENERALITES ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

l - Les levures fermentatives et les levures oxydatives ••••••

II - Croissance et énergie •••••••••••••••••••••••••••••••••••

III - Les différentes voies de dégradation du glucose ••••••••

a) Glycolyse ••••••••••••••••••••• ~ ••••••••••••••••••••••

b) Voie d'Entner-Doudoroff ••••••••••••••••••••••••••••••

c) Voie de Warburg-Dickens-Horecker •••••••••••••••••••••

IV - Assimilation du mannitol ••••••••••••••••••••••••••••••••

V - Synthèse des polysaccharides •••••••••••••••••••••••••••••

VI - Synthèse des lipides ••••••••••••••••••••••••••••••••••••.

VII - Utilisation du glucose radio-actif •••••••••••••••••••••

CHJPITRE II - ~~TERIEL ET ~ŒTHODES •••••••••••••••••••••••••••••••••

l - Organismes et cultures •••••••••••••••••••••••••••••••••••

II - Préparation des surnagean~s de cultures et des extraits •

III - Méthodes employées pour déterminer les bilans et lesrendements •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

a) Croissance des levures •••••••••••••••••••••••••••••••

b) Dosage du glucose ••••••••••••••••••••••••••••••••••••

c) Dosage des acides volatils •••••••••••••••••••••••••••

d) Dosage de l'acide glucuronique •••••••••••••••••••••••

e) Dosage du pyruvate •••••••••••••••••••••••••••••••••••

IV - Dosage des enzymes ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

a) }~nitol-déshydrogénase••••••••••••••••••••••••••••••

b) Mannitol-l-phosphate-déshydrogénase ••••••••••••••••••

c) Glucose-6-phosphate- et 6-phosphogluconate-déshydrogénase •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

d) Hexokinase. fructokinase •••••••••••••••••••••••••••••

e) Phosphofructokinase ••••••••••••••••••••••••••••••••••

f) Fructose-diphosphate-aldolase ••••••••••••••••••••••••

g) Transcétolase ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

3

3

3

4

4

4

7

7

9

11

, 13

21

21'-- 21

22

22

22

22

23

23

23

23

23

24

24

24

25

25

i) 6-phosphogluconate-déshydrase et 2-céto-3-désoxy-6­phosphogluconate-aldolase •••••••••••••••••••••••••••

j) Expression des résultats ••••••••••••••••••••••••••••

v - Expériences réalisées avec le glucose radio-actif •••••••

a) méthode de comptage •••••••••••••••••••••••••••••••••

b) }œsure de la radio-activité spécifique du pyruvate ••

c) Radio-activités spécifiques comparées au'glucose ••••

25

25

26

26

26

27

V - Conclusions •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

b) Action des inhibiteurs ••••••••••••••••••••••••••••••

a) En présence dé différents métabolites carbonés ••••••

IV - Respiration de l'oxygène •••••••••••••••••••••••••••••••

29

29

29

31

34

34

36

36

•••••••••••••••••••••••••

•••••••••••••••••••••••••••••••III - Rendement de croissance

l - Etude cytologique •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

II - Taux de croissance ••••••••••••••••••••••••• '••••••••••••

CHAPITRE III - CROISSANCE ET RESPIRATION

CHAPITRE IV - ACCUHULATION DES ACIDES ORGANIQUES DANS LE MILIEU

DE CULTURE •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

l - Acide glucuronique ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

II - Acides volatils ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ~

a) Dosage de l'acidité volatile dans les surnageants •••

b) Identification des acides volatils ••••••••••••••••••

III - Acide pyruvique •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

IV - CONCLUSIONS ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

39

39

_, 41

41

41

43

46

CHAPITRE V - EXISTENCE DE LA GLYCOLYSE ET DU CYCLE DES PENTOSE-

PHOSPHATES •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 47

l - Introduction •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 47

II - Assimilation du mannitol............................... 47

III - Enzymes glycolytiques ••••••••••••••••••••••••••••••••• 49

IV - Enzymes du cycle des pentose-phosphates •••••••••••••••• 51

V - Formation de pyruvate à partir de: différents estersphosphoriques ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 52

VI - Conclusions •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 54

CHAPITRE VI - I~œORTANCE RELATIVE DES DIFFERENTES VOIES METABOLIQUES

PARTICIPANT A LA DEGRADATION DU GLUCOSE ••••••••••••••••• 55

l - Introduction ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 55

II - Expériences réalisées avec des cellules non carencées ••••••• 55

a) ~. starkeyi •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 55

b) ~. cerevisiae •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 60

III - Expériences réalisées avec des cellules carencées en azote. 60

IV - Conclusions ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 62

CHAPITRE VII CONCLUSIONS GENERALES •••••••••••••••••••••••••••••••••• 63

BIBLIOGRAPHIE ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 65