Identification de la base moléculaire de l'antigène ...€¦ · 1.3. Les globules rouges.....3 1.4. Les groupes sanguins ... Figure 1.3.: Illustration de la disposition de certaines

Identification de la base moléculaire de l’antigène érythrocytaire de haute fréquence PEL

Mémoire

Corinne Nadeau Larochelle

Maîtrise en biochimie

Maître ès sciences (M.Sc)

Québec, Canada

© Corinne Nadeau Larochelle, 2013

iii

Résumé

En 2013, la Société internationale de médecine transfusionnelle (ISBT) reconnaît

33 groupes sanguins et 339 antigènes érythrocytaires différents, dont plus de 297

sont déjà associés à un groupe sanguin. Les autres antigènes sont classés dans des

séries et des collections en attendant la découverte de leur base moléculaire. En

1996, Geoff Daniels et collaborateurs identifiaient l’antigène PEL. À la suite de cette

découverte, des travaux ont démontré qu’il est présent chez plus de 99,9% de la

population en général et que le phénotype PEL négatif semble être spécifique à la

population québécoise. À la lumière des caractéristiques connues à propos de

l’antigène PEL, des analyses génomiques et protéomiques ont été effectuées dans

le but de découvrir sa base moléculaire. Cependant, l’analyse des ARN messagers

séquencés, ainsi que les résultats obtenus lors des expériences en protéomique,

n’ont pas permis d’identifier la base moléculaire de l’antigène PEL.

v

Avant-propos

Premièrement, je tiens à remercier ma directrice de recherche, Maryse St-Louis,

d’abord pour m’avoir accueillie au sein de son équipe, mais aussi pour m’avoir fait

bénéficier de son expérience et de sa grande disponibilité tout au long de mon

projet.

Merci également à Josée Perreault, Élaine Deschênes, Danny Brouard et

Josée Lavoie pour leur soutien et leur disponibilité. Merci aussi à

Maureen Thompson pour son aide lors du stage qu’elle a effectué au sein de

l’équipe.

Je veux aussi remercier les membres de mon comité d’encadrement :

Manon Couture, Louis Thibault et Michel Vincent, pour le temps qu’ils m’ont accordé

et pour tous leurs judicieux conseils.

Un merci particulier à Patrick Trépanier, Tony Tremblay et Annie Roy pour l’aide

fournie pendant certaines parties de mes travaux et au Laboratoire de référence et

des cellules souches (LRCS) d’Héma-Québec pour avoir fait toutes les expériences

de cartes-gel.

Merci à tous les employés du département de Recherche et Développement

d’Héma-Québec. Vous faites de la R&D un environnement enrichissant et stimulant,

où il est agréable de travailler.

Un merci spécial à mes deux collègues et amies Dominique Chabot et Lee-Ann

Mckinnon pour tous les fous rires et pour avoir contribué à rendre ces deux années

de travail une vraie partie de plaisir!

Merci à mon amoureux, aux membres de ma famille et à mes ami(e)s pour leur

appui inconditionnel et leurs encouragements.

Finalement, je veux remercier Héma-Québec, le CRSNG, ainsi que le FQRNT pour

le soutien financier reçu tout au long de ce projet.

vii

Tables des matières

Résumé.................................................................................................................... iii

Avant-propos ............................................................................................................. v

Tables des matières ................................................................................................ vii

Liste des tableaux ..................................................................................................... x

Liste des figures ...................................................................................................... xii

Liste des abréviations............................................................................................. xiv

1. Introduction ........................................................................................................... 1

1.1. Héma-Québec ................................................................................................ 1

1.2. Le sang ........................................................................................................... 1

1.3. Les globules rouges ........................................................................................ 3

1.4. Les groupes sanguins ..................................................................................... 4

1.5. Les antigènes érythrocytaires ......................................................................... 9

1.6. La sérologie érythrocytaire ............................................................................ 10

1.6.1. Les immunoglobulines ............................................................................ 11

1.6.2. Les immunoglobulines de type G ........................................................... 12

1.6.3. La liaison antigène-anticorps .................................................................. 14

1.7. Le génotypage sanguin ................................................................................. 16

1.8. L’antigène PEL ............................................................................................. 19

1.9. Contexte de recherche et hypothèse ............................................................ 20

1.10. Objectifs ...................................................................................................... 21

2. Matériel et méthodes ........................................................................................... 23

2.1. Analyses génomiques ................................................................................... 23

2.1.1. Échantillons ............................................................................................ 23

2.1.2. Extraction d’ARN .................................................................................... 23

2.1.3. Design d’amorces pour les RT-PCR ....................................................... 23

2.1.4. Amplification par RT-PCR ...................................................................... 24

2.1.5. Amplification des exons 1 à 5 du gène codant pour la glycoprotéine CD44

......................................................................................................................... 26

2.1.6. Amplification de la séquence codante de SMIM1 par PCR classique ..... 27

2.1.7. PCR nichée de l’amplicon de l’aquaporine-1 et PCR à demi nichée du

deuxième fragment de l’ARN messager du CD238 .......................................... 28

2.1.8. Purification et dosage des amplicons ..................................................... 28

viii

2.1.9. Clonage de l’amplicon correspondant à l’ARNm de CD47 ...................... 29

2.1.10. Séquençage et analyse des résultats ................................................... 30

2.2. Analyses protéomiques ................................................................................. 31

2.2.1. Préparation de globules rouges fantômes .............................................. 31

2.2.2. Traitement des globules rouges fantômes à la ficine .............................. 31

2.2.3. Électrophorèse SDS-PAGE et coloration des gels .................................. 32

2.2.4. Spectrométrie de masse ......................................................................... 32

2.2.5. Adsorption-élution des anticorps anti-PEL .............................................. 32

2.2.6. Purification des IgG totales du plasma PEL- par Fast Protein Liquid

Chromatography (FPLC) .................................................................................. 33

2.2.7. Fractionnement des IgG totales purifiées par focalisation isoélectrique .. 33

2.2.8. Tests d’agglutination en carte-gel ........................................................... 34

2.2.9. Immunobuvardages de type Western ..................................................... 36

2.2.10. Observation de l’expression des protéines CD55 et CD59 par

immunobuvardage de type Western ................................................................. 37

2.2.11. Immunoprécipitation en conditions non-dénaturantes ........................... 37

2.2.12. Immunoprécipitation avec crosslinking ................................................. 38

3. Résultats ............................................................................................................. 39


3.1.1. Amplification par RT-PCR des différents ARNm codant pour les protéines

d’intérêt ............................................................................................................ 39

3.1.2 Amplification des exons 2 à 5 du gène codant pour la glycoprotéine CD44

......................................................................................................................... 39


3.2.1. Traitement des globules rouges fantômes à la ficine .............................. 40

3.2.2. Coloration de gels SDS-PAGE et envoi de bandes en spectrométrie de

masse .............................................................................................................. 41

3.2.3. Envoi des globules rouges fantômes PEL+ et PEL- en solution pour être

analysés en spectrométrie de masse ............................................................... 44

3.2.4. Purification des IgG totales du plasma PEL- par FPLC ........................... 45

3.2.5. Séparation des IgG totales selon leur point isoélectrique par

chromatofocalisation ........................................................................................ 47

3.2.6. Tests d’agglutination sur les fractions d’IgG purifiées séparées par

chromatofocalisation ........................................................................................ 48

ix


3.2.8. Immunobuvardages de type Western ..................................................... 49



4. Discussion ........................................................................................................... 51



4.2.1. La purification des anticorps anti-PEL du plasma ................................... 53


4.2.3. Les immunobuvardages de type Western............................................... 55



4.2.5. Les immunoprécipitations avec et sans crosslinking ............................... 57

4.2.6. Les analyses en spectrométrie de masse ............................................... 58

4.2.7. Électrophorèses IEF ............................................................................... 59

4.2.8. Électrophorèses en deux dimensions (2D) ............................................. 60

5. Conclusion .......................................................................................................... 61

Bibliographie ........................................................................................................... 63

Annexe I .................................................................................................................. 66

x

Liste des tableaux

Tableau 1.1. : Classement des différents groupes sanguins, du nombre d’antigènes et du (des) gène(s) associé(s). ........................................................... 5

Tableau 2.2. : Description des protéines dont l’ARNm a été ciblé pour les analyses génomiques. ..................................................................................... 24

Tableau 2.3. : Conditions expérimentales pour l'amplification des exons 1 à 5 de l'ARNm de la glycoprotéine CD44 ..................................................... 27

Tableau A.1. : Paramètres utilisés pour l'amplification RT-PCR des ARNm des protéines ciblées. .............................................................................. 66

Tableau A.2. : SNP identifiés à la suite du séquençage des ARNm de différentes protéines membranaires érythrocytaires. .......................................... 67

xii

Liste des figures

Figure 1.1. : Visualisation des composantes du sang après centrifugation. .............. 2 Figure 1.2. : Processus qui mène à la maladie hémolytique du nouveau-né causée

par des anticorps anti-D. ....................................................................... 8 Figure 1.3. : Illustration de la disposition de certaines molécules porteuses

d'antigènes érythrocytaires. .................................................................. 9 Figure 1.4. : Structure d’une immunoglobuline. ....................................................... 12 Figure 1.5. : Fonctions et propriétés physiques des immunoglobulines humaines. . 13 Figure 1.6. : Concept d’affinité dans la liaison antigène-anticorps. .......................... 15 Figure 2.1. : Principe d'agglutination en carte-gel.. ................................................. 35 Figure 2.2. : Interprétation des résultats d'agglutination obtenus en carte-gel. ........ 36 Figure 3.1. : Résultat du traitement des globules rouges fantômes à la ficine en

immunobuvardage de type Western ................................................... 40 Figure 3.2. : Premier gel de polyacrylamide (12%) qui a permis l'envoi de bandes en

spectrométrie de masse.. .................................................................... 42 Figure 3.3. : Deuxième gel de polyacrylamide (12%) qui a permis l'envoi de bandes

en spectrométrie de masse.. ............................................................... 43 Figure 3.4. : Test d'efficacité de la purification des IgG totales effectuée par FPLC.

........................................................................................................... 46 Figure 3.5. : Séparation des IgG totales préalablement purifiées par FPLC en huit

fractions selon leur point isoélectrique. ............................................... 47 Figure 3.6. : Tests d’agglutination effectués en carte-gel effectués pour les huit

fractions obtenues lors de la chromatofocalisation. ............................. 48 Figure 3.7. : Exemple d'immunobuvardage de type Western effectué avec les

fractions 0 et 1 d'IgG purifiées par chromatofocalisation. .................... 50

xiv

Liste des abréviations

ADN : Acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire ARN : Acide ribonucléique ATP : Adénosine tri-phosphate CHUL : Centre hospitalier de l’Université Laval CH/RG : Système sanguin Chido/Rodgers CO2 : Dioxyde de carbone COST : Collection sanguine Cost CROM : Système sanguin Cromer DTT : Dithiothréitol ER : Collection sanguine Er ERMAP : Erythroid membrane-associated protein FPLC : Fast Protein Liquid Chromatography FY : Système sanguin Duffy GE : Système sanguin Gerbich GLOB : Système sanguin Globoside Glut-1 : Transporteur de glucose 1 GPI : Glycosylphosphatidylinositol H : Système sanguin Hh I : Système sanguin Ii IgG : Immunoglobuline G IN : Système sanguin Indian ISBT : La Société internationale de médecine transfusionnelle kDa : Kilodalton KEL : Système sanguin Kell

KN : Système sanguin Knops LRCS : Laboratoire de référence et des cellules souches LU : Système sanguin Lutheran LW : Système sanguin Landsteiner-Wiener NCBI : National Center for Biotechnology Information ng/ml : Nanogramme par millilitre nm : Nanomètre nmoles : Nanomoles pb : Paires de bases PBS : Phosphate buffered saline PEL- : Individus dont les globules rouges n’expriment pas l’antigène PEL PEL+ : Individus dont les globules rouges expriment l’antigène PEL PCR : Réaction en chaîne par polymérase PCR-AS : PCR allèle-spécifique PCR-RFLP : Restriction fragment length polymorphism PCR RT-PCR : Reverse-Transcriptase PCR SC : Système sanguin Scianna SDS-PAGE : Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate SNP : Single Nucleotide Polymorphism YT : Système sanguin Cartwright

1

1. Introduction

1.1. Héma-Québec

Héma-Québec est responsable de la gestion et de l’entreposage des produits sanguins au

Québec. Chaque année, l’entreprise livre environ 500 000 produits sanguins aux hôpitaux

de la province[1]. Aussi, en plus des produits sanguins, Héma-Québec prépare et gère la

distribution des cellules souches de sang de cordon et des tissus humains. Plus

récemment en 2013, le gouvernement québécois a donné son accord pour la mise sur

pied, par Héma-Québec, de la première banque publique de lait maternel au Canada.

En constante évolution, cette entreprise a su s’adapter, au fil du temps, aux nouvelles

réalités québécoises. Parmi celles-ci, il y a la présence grandissante des diverses

communautés culturelles à travers la province. Le défi pour Héma-Québec a été de

recruter des donneurs de sang au sein de ces communautés culturelles. Pour plusieurs

raisons, certaines communautés culturelles ne voient pas d’un très bon œil le don de

sang. Ainsi, Héma-Québec a dû redoubler d’ardeur pour recruter des donneurs, puisque

les gens de ces communautés ont, comme les Québécois de souche, parfois besoin de

transfusions.

Avant qu’il ne soit transfusé, le sang du donneur doit être compatible avec celui du

receveur. Puisqu’il existe plusieurs variants au sein des diverses communautés culturelles

et afin de fournir avec efficience et efficacité des produits sanguins à tous les Québécois,

Héma-Québec a créé, au fil des années, une banque de sang rare.

1.2. Le sang

Le sang est indispensable au corps humain à plusieurs niveaux. Aussi, il permet de

véhiculer tout ce qui est nécessaire à la survie des cellules : l’oxygène, les nutriments, les

vitamines, les électrolytes, ainsi que plusieurs autres molécules indispensables au bon

fonctionnement du corps humain[1]. Chez un adulte de taille moyenne, la quantité de sang

qui circule est de 5 à 6 litres[1].

2

Figure 1.1. : Visualisation des composantes du sang après centrifugation.

Le sang est un liquide biologique homogène qui, après avoir été centrifugé, est séparé en

trois phases distinctes : le plasma, la couche leuco-plaquettaire et le culot globulaire

(Figure 1.1.). Puisqu’aucune composante synthétique n’existe encore pour le remplacer,

les dons de sang sont d’une importance capitale en médecine. En fait, puisqu’un individu

en santé ne peut donner du sang qu’une fois tous les 56 jours, le traitement distinct de

chacune des trois phases du sang permet de traiter un plus grand nombre de patients.

Ainsi, chaque patient reçoit la composante sanguine dont il a besoin.

En fait, après avoir été centrifugé, le sang total est séparé en trois composantes distinctes.

À partir de la transformation d’un seul don de sang total, il est possible d’obtenir quatre

composés : le plasma, les plaquettes, le culot globulaire et le cryoprécipité[1]. Ce dernier

n’est pas obtenu directement après la centrifugation du sang, mais plutôt en congelant et

en décongelant le plasma[1]. Ensuite, ces quatre composés peuvent être donnés

séparément à quatre receveurs, d’où vient la possibilité de sauver quatre vies avec un

seul don de sang total[1].

3

La phase supérieure correspond au plasma. Il s’agit du liquide jaunâtre dans lequel

baignent les cellules sanguines : les globules rouges (érythrocytes), les globules blancs

(leucocytes) et les plaquettes (thrombocytes). À lui seul, le plasma occupe de 50 à 60% du

volume total du sang. En plus de servir à véhiculer les cellules sanguines, iI contient

plusieurs molécules utiles à toutes les cellules, comme des immunoglobulines, des

facteurs de coagulation, des lipides, des hormones et plusieurs protéines, dont la plus

abondante est l’albumine.

Sous le plasma, se trouve la couche leuco-plaquettaire contenant toutes les cellules

immunitaires appelées cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC). Ces cellules

jouent un rôle fondamental, autant dans l’immunité innée que dans l’immunité acquise.

Elles englobent, entre autres : les lymphocytes, les macrophages, les neutrophiles, les

cellules NK et les monocytes. La plupart du temps, à cause de leur pouvoir immunogène,

ces cellules sont retirées du don de sang total par filtration. En fait, ces cellules expriment

plusieurs antigènes, ce qui les empêche d’être transférables aisément d’une personne à

une autre sans causer de réactions néfastes.

Finalement, le culot globulaire occupe la phase inférieure tout au fond du tube et contient,

comme son nom l’indique, les globules rouges.

1.3. Les globules rouges

Les globules rouges sont des cellules de forme biconcave, qui mesurent de 8 à 9 μm et

qui sont dépourvues de noyau. Ainsi, à maturité, les globules rouges ne contiennent pas

de matériel génétique. Dans le corps humain, ils circulent pendant environ 120 jours avant

d’être éliminés dans la rate. Par contre, in vitro, la durée de conservation des culots

globulaires est de 42 jours lorsqu’ils sont conservés à 4ºC[2]. Après cette période, les

paramètres biochimiques au sein des culots globulaires sont trop altérés pour que ces

derniers soient transfusés. La couleur conférée aux globules rouges est due à

l’hémoglobine, une protéine composée de quatre chaînes polypeptidiques, deux chaînes α

et deux chaînes β, qui contiennent chacune une molécule d’hème. Cette protéine permet

aux globules rouges de remplir leur principale fonction au sein du corps humain, c’est-à-

dire le transport de l’oxygène.

4

Du point de vue structural, les globules rouges sont entourés d’une membrane plasmique

qui contient un nombre impressionnant de protéines et de molécules diverses. À ce jour, le

nombre de protéines que contiendrait le globule rouge est évalué à 2289[3]. Notamment,

les dernières avancées en spectrométrie de masse ont permis d’atteindre ce nombre au fil

des ans. Bien que les techniques d’analyses soient de plus en plus sensibles,

l’hémoglobine, qui forme à elle seule 98% du protéome érythrocytaire, reste un

contaminant majeur lors des études protéomiques[4]. Comme l’ont décrit Singer et

Nicolson en 1972, la membrane plasmique des globules rouges est une mosaïque fluide

où toutes les composantes sont en mouvement constant[5]. Ces diverses protéines et

molécules sont à la base des groupes sanguins et, sont d’une importance capitale en

médecine transfusionnelle.

1.4. Les groupes sanguins

La médecine a été révolutionnée par la découverte du groupe sanguin ABO par

Karl Landsteiner en 1900[6]. Depuis cette découverte, la Société internationale de

médecine transfusionnelle (ISBT) reconnaît 33 groupes sanguins distincts, qui sont tous

codés par un (des) gène(s) différent(s)[6]. Les groupes sanguins sont définis par

l’expression et l’exposition des antigènes érythrocytaires à la surface des globules rouges

de chaque individu. Bien que les antigènes érythrocytaires soient les mêmes pour tous et

que leur expression varie au sein des différentes populations, l’expression de certains

d’entre eux est spécifique à l’ethnicité des individus[7]. Parmi tous les groupes sanguins,

deux sont davantage connus de la population en général : l’ABO et le Rh.

5

Tableau 1.1. : Classement des différents groupes sanguins, du nombre d’antigènes et du (des) gène(s)

associé(s). Information tirée de [6].

En ce qui concerne le groupe sanguin ABO, une personne est dite de groupe sanguin A

lorsque ses globules rouges expriment l’antigène A. Pareillement, les individus de groupe

sanguin B expriment l’antigène B et ceux de groupe AB expriment à la fois les antigènes A

et B. Pour leur part, les globules rouges des individus de groupe O n’expriment aucun des

deux antigènes A et B. Les antigènes A et B ne sont pas produits directement par

l’expression d’un gène, mais sont plutôt définis par des sucres (GalNAc pour l’antigène A

et Gal pour l’antigène B), attachés à un ou jusqu’à quatre différents types de chaînes

d’oligosaccharides, qui elles sont portées par des glycosphingolipides et des

glycoprotéines[7].

Pour chaque antigène érythrocytaire, il existe un anticorps correspondant. Les anticorps

du groupe sanguin ABO ont la particularité d’être des anticorps naturels réguliers; c’est-à-

dire que les cellules immunitaires de chaque individu produisent des anticorps dirigés

contre le ou les antigènes qui ne sont pas exprimés à la surface des globules rouges. Par

exemple, le plasma d’une personne de groupe O contiendra à la fois des anti-A et des

anti-B et à l’opposé, celui d’une personne de groupe AB ne contiendra aucun anticorps

dirigé contre les antigènes du groupe ABO. Bien que les anticorps du groupe ABO soient

présents systématiquement dans l’organisme, ce n’est pas le cas pour la plupart des

anticorps de groupes sanguins.

6

Le Rh est le deuxième groupe sanguin le plus connu, mais a été le quatrième à être

découvert. Contrairement à l’ABO qui n’a que deux antigènes (A et B), le Rh en possède

jusqu’à 54. Lorsqu’une personne est dite « positive » ou « négative » à la suite de

l’énonciation de son groupe sanguin ABO, il s’agit en fait de la présence ou non de

l’antigène D à la surface de ses globules rouges. Environ 85% de la population

caucasienne exprime l’antigène D et ces personnes sont dites D positif[1]. Contrairement à

celle d’autres antigènes érythrocytaires, l’expression de l’antigène D ne résulte pas de la

mutation d’un seul acide aminé au sein de la protéine (SNP) qui porte cet antigène, mais

bien de la présence ou de l’absence du gène RHD[7]. Donc, l’absence du gène RHD chez

l’autre 15% de la population est responsable du phénotype D négatif. Aussi, il est à noter

que l’antigène D est une mosaïque de différents épitopes et que l’absence de certains de

ces épitopes peut mener au phénotype D partiel[7]. Quant à lui, le phénotype D faible est

caractérisé par une expression moins élevée de tous les épitopes de l’antigène D[7].

Tout comme les antigènes A et B, l’antigène D est très immunogène[7]. Les antigènes de

groupes sanguins immunogènes ont la capacité de déclencher une réaction immunitaire

lorsqu’ils sont reconnus par des anticorps spécifiques (ex : l’antigène D qui est reconnu

par des anticorps anti-D). Cette mise en branle du système immunitaire amène des

réactions post-transfusionnelles. Ces dernières sont, la plupart du temps, causées par la

reconnaissance d’un ou de plusieurs antigènes présents sur les globules rouges du

donneur par les anticorps présents chez le receveur. La gravité des réactions post-

transfusionnelles immunes, c’est-à-dire celles qui sont causées par une incompatibilité

antigène-anticorps, est variable et elle dépend de plusieurs facteurs. La réaction

hémolytique immédiate, par exemple, se caractérise par la destruction rapide des globules

rouges transfusés et elle est la forme la plus grave de réaction transfusionnelle[8]. Elle peut

se produire lorsqu’il y a une incompatibilité antigène-anticorps pour certains groupes

sanguins (ABO, Kidd, Kell, Duffy et Lewis), ce qui entraîne, entre autres, l’activation du

complément[8]. Dans le cas d’une incompatibilité ABO par exemple, qui correspond à 90%

des cas, cela peut entraîner la mort du receveur[8, 9].

Heureusement, tous les groupes sanguins n’ont pas la même importance clinique en

médecine transfusionnelle. Les plus immunogènes sont l’ABO, le Rh, le Kell, le Kidd et le

Duffy[8]. La raison qui explique leur importance clinique est que certains de leurs antigènes

7

respectifs peuvent mener à l’immunisation du receveur, c’est-à-dire à la production

d’anticorps chez ce dernier. Exceptionnellement, l’immunisation se fait naturellement chez

un individu qui développe des anticorps contre ses propres antigènes[10]. Ces anticorps

sont appelés autoanticorps. Ce phénomène d’immunisation est plus souvent observé chez

les personnes âgées, mais la cause de celui-ci est toujours inconnue à ce jour. Dans la

plupart des cas, l’immunisation se produit lors de transfusions sanguines ou de

grossesses[11, 12].

L’immunisation d’un individu peut compliquer de manière significative le processus de

transfusion et entraîner certaines complications, notamment dans le cas où la personne

immunisée est une femme enceinte[13]. Tout comme ceux du système sanguin Rh, les

anticorps dirigés contre les antigènes du système sanguin Kell peuvent causer la maladie

hémolytique du nouveau-né (Figure 1.2.)[7]. Cependant, outre ceux-ci, d’autres antigènes

de groupes sanguins peuvent aussi causer cette maladie.

8

Figure 1.2. : Processus qui mène à la maladie hémolytique du nouveau-né causée par des anticorps anti-D.

Adaptée de [14].

La maladie hémolytique du nouveau-né est caractérisée par la reconnaissance des

antigènes présents à la surface des globules rouges du fœtus par les anticorps présents

dans le sang de la mère. Pour causer cette maladie, les anticorps produits par la mère

doivent être de type IgG, puisque seul cet isotype a la capacité de traverser la barrière

placentaire[15]. En fait, le transport sélectif des IgG de la mère vers le fœtus se fait grâce à

une protéine de transport des IgG du placenta, FcRn, qui reconnaît la partie Fc des IgG[15].

Lorsque la mère est D négatif et que le père est D positif, le fœtus a 50% ou 100% de

chances d’être D positif selon le génotype du père (Dd ou DD). Dans ces cas, la mère

peut produire des anticorps dirigés contre l’antigène D. Ce phénomène survient, dans la

plupart des cas, lorsqu’il y a contact entre le sang de la mère et celui du bébé. Lorsque

cela se produit, c’est le plus souvent lors de l’accouchement. Ainsi, les grossesses

subséquentes d’un fœtus D positif sont plus à risques d’être problématiques pour une

femme D négatif, puisque les anti-D sont encore la cause principale de la manifestation de

la maladie hémolytique du nouveau-né[16].

En résumé, lorsqu’il y a eu un premier contact entre le sang de la mère D négatif et celui

du fœtus D positif, les cellules sécrétrices d’anticorps anti-D de la mère peuvent être

activées pour en produire lors des grossesses subséquentes. Donc, ces anticorps en

circulation chez la mère peuvent traverser la barrière placentaire et détruire les globules

rouges D positif du fœtus. Puisque les femmes D négatif qui possèdent des anti-D ont un

9

suivi de grossesse à fréquence élevée, l’apparition de cette maladie est plutôt rare de nos

jours[16]. Cependant, dans certains cas graves, les médecins doivent procéder à une

plasmaphérèse chez la mère ou, dans les cas extrêmes, transfuser le fœtus de manière

intra-utérine.

1.5. Les antigènes érythrocytaires

L’ISBT répertorie tous les antigènes érythrocytaires et ce nombre est de 339 à ce jour[6].

D’une part, environ 297 antigènes sont déjà associés à un groupe sanguin. D’autre part,

les autres sont classés dans des séries et des collections en attendant la découverte de

leur base moléculaire. D’un côté, la série 901 regroupe les antigènes de haute fréquence

exprimés par plus de 90% de la population et dont le phénotype négatif a été déterminé

comme étant hérité génétiquement[6]. À l’inverse, la série 700 regroupe les antigènes de

faible fréquence exprimés par moins de 1% de la population et dont la transmission

héréditaire a été démontrée et ce, pour au moins deux générations[6]. Finalement, les

différentes collections regroupent chacune au moins deux antigènes, qui sont liés de

manière sérologique, biochimique ou génétique et qui ne peuvent pas être classés dans

l’une ou l’autre des séries[6].

Figure 1.3. : Illustration de la disposition de certaines molécules porteuses d'antigènes érythrocytaires[17]

.

Les antigènes érythrocytaires sont portés par différentes molécules présentes au sein de

la membrane plasmique des globules rouges (Figure 1.3.). Ces molécules peuvent être

des chaînes glucidiques, attachées ou non à un lipide ou à une protéine, des protéines

10

transmembranaires ou des protéines liées à un ancrage GPI[18]. En fait, les protéines

codées par les gènes se combinent à des polypeptides, à des lipides ou à des

oligosaccharides pour former les molécules qui seront porteuses de ces différents

antigènes érythrocytaires[8]. Bien que la majorité des antigènes érythrocytaires soient

portés par des molécules membranaires, certains ont, en plus, des composantes

hydrosolubles. Par exemple, les antigènes du groupe sanguin Lewis ne sont pas

intrinsèques à la membrane des globules rouges, mais ils sont plutôt localisés sur des

glycosphingolipides, qui eux sont adsorbés par les globules rouges à partir du plasma[7].

Ces dernières sont en circulation dans l’organisme et elles possèdent des déterminants

antigéniques semblables à ceux retrouvés dans la membrane plasmique.

Les protéines membranaires peuvent avoir plusieurs fonctions. Notamment, celles qui sont

liées à un groupe sanguin et qui sont les plus abondantes (>200 000 copies par cellule)

contribuent aux fonctions essentielles de la cellule, soit en étant des transporteurs

membranaires (Bande 3, RhAG, aquaporine-1, SLC14A1, Kx), soit en fournissant une

structure qui permet l’ancrage au cytosquelette, ou encore en facilitant l’assemblage des

complexes protéiques dans la membrane (RhD, RhCE, glycophorines A et B, CD151)[17].

Ces complexes membranaires ont la fonction de lier la membrane plasmique au

cytosquelette, aidant ainsi à garder la structure des globules rouges intacte[17]. Les

protéines moins abondantes à la surface des globules rouges, mais dont le lien avec un

groupe sanguin a déjà été démontré, ont des fonctions qui ne sont pas très bien connues

à ce jour. Cependant, bien que les protéines qui servent de base moléculaire aux groupes

sanguins remplissent diverses fonctions, seule l’absence de la protéine Kx, du groupe

sanguin du même nom, a été identifiée comme étant la cause d’une pathologie[17].

1.6. La sérologie érythrocytaire

En sérologie érythrocytaire, les antigènes présents à la surface des globules rouges

doivent être reconnus par un anticorps spécifique[6]. Cette liaison antigène-anticorps

permet l’agglutination des globules rouges et ainsi, il est possible de détecter la plupart

des antigènes érythrocytaires. Les anticorps spécifiques aux antigènes érythrocytaires

sont de type immunoglobuline G (IgG), IgM et dans de rares cas, IgA[19]. Particulièrement,

la structure des IgM leur permet de former des pentamères et d’offrir dix sites de liaisons

11

antigéniques. Ainsi, les IgM ont la capacité de faire agglutiner les globules rouges dans les

conditions sérologiques standards, c’est-à-dire dans une solution saline 0,85%[8]. À

l’opposé, les IgG et les IgA sont le plus souvent retrouvées sous forme de monomères

dans le plasma, mais les IgA peuvent aussi s’associer sous forme de dimères[8]. Ainsi,

l’agglutination des globules rouges dans les conditions sérologiques standards par les

isotypes IgG et IgA nécessite un nombre important de sites antigéniques. Dans les autres

cas, l’ajout d’un anti-IgG commercial est nécessaire pour visualiser l’agglutination. Ce

réactif permet le pontage des IgG fixées spécifiquement à la surface des globules rouges

pour créer l’agglutination. La sérologie érythrocytaire permet de détecter, de manière

rapide et spécifique, quel(s) antigène(s) est ou sont présent(s) sur les globules rouges et

quel(s) anticorps est ou sont présent(s) dans le sang des individus.

1.6.1. Les immunoglobulines

Un des outils grandement utilisé en sérologie demeure les anticorps ou immunoglobulines

(Ig). Dans le corps humain, elles sont sécrétées par les plasmocytes et elles sont à la

base de l’immunité humorale. Chaque Ig possède au moins un site de liaison spécifique à

un antigène. Le nombre de sites de liaison antigénique dépend, entre autres, du type d’Ig.

Chez l’humain, il existe cinq classes d’Ig : les IgM, IgG, IgD, IgE et IgA. La structure de

chaque classe d’Ig est très semblable et elle se définit par la structure de sa chaîne

lourde[15]. Il s’agit d’une molécule en forme de « Y », formée de deux chaînes lourdes (H

pour heavy) et de deux chaînes légères (L pour light). Chacune de ces chaînes est formée

de peptides dont les séquences en acides aminés sont plus ou moins variables. Les

régions déterminant la complémentarité (CDR) des domaines variables des chaînes

lourdes et légères contribuent au site de liaison antigénique, c’est-à-dire que c’est

l’association de la chaîne légère et de la chaîne lourde, et non une seule des deux, qui

détermine la spécificité antigénique[15].

12

Figure 1.4. : Structure d’une immunoglobuline[20]

. Structure type en «Y», où les deux chaînes lourdes sont liées

par deux ponts disulfures et où chaque chaîne lourde lie une chaîne légère avec un seul pont disulfure.

Chaque classe d’Ig est conçue pour assurer une fonction principale et leur quantité varie

considérablement en fonction du tissu ou du liquide biologique étudié. Chez l’humain, les

IgG sont distribuées également dans le sang et les tissus et ce sont les plus abondantes

dans le sérum[21]. Ainsi, elles sont souvent impliquées dans les interactions avec les

antigènes érythrocytaires. Les anticorps dirigés contre des antigènes de haute fréquence

peuvent parfois causer des problèmes aux gens qui les développent puisqu’il devient

parfois très difficile de trouver du sang compatible à leur transfuser[22].

1.6.2. Les immunoglobulines de type G

Les IgG représentent 75% des anticorps du sérum humain. Elles sont formées de quatre

chaînes de peptides : deux chaînes lourdes dites gamma (γ) et deux chaînes légères dites

kappa (κ) ou lamba (λ). Les chaînes légères sont κ ou λ, jamais les deux à la fois. La

fonction de chaque type, κ ou λ, est toujours inconnue à ce jour et le ratio κ sur λ est de

deux pour un chez l’humain[21]. La masse moléculaire d’une IgG est d’environ 150 kDa

(50 kDa par chaîne lourde et 25 kDa par chaîne légère). Du point de vue structural, les

deux chaînes lourdes sont liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne

lourde lie une chaîne légère par un seul pont disulfure.

13

Dans le sérum, les IgG sont retrouvées majoritairement sous forme de monomère et

chacune possède deux sites de liaison à l’antigène. Ces sites se trouvent aux extrémités

supérieures du « Y », là où se trouvent les régions hypervariables des chaînes lourdes et

légères. La région constante est composée d’une partie des deux chaînes lourdes et ce

fragment interagit avec les molécules effectrices et les autres cellules[21].

Il existe quatre sous-classes d’IgG et elles sont nommées ainsi en fonction de leur

concentration relative dans le sérum humain : IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4[23]. Les sous-

classes diffèrent aussi selon leur fonction (Figure 1.5.), mais aussi selon d’autres

propriétés biologiques, comme leur temps de demi-vie. La figure 1.5. démontre aussi que

plusieurs sous-classes d’IgG peuvent remplir la même fonction. En général, les IgG

agissent, d’une part, directement sur la réponse immunitaire en neutralisant les virus et les

toxines et d’autre part, indirectement en activant le complément ou d’autres cellules

impliquées dans l’immunité.

Figure 1.5. : Fonctions et propriétés physiques des immunoglobulines humaines[15]

.

14

1.6.3. La liaison antigène-anticorps

La liaison entre l’anticorps et l’antigène peut être comparée à une clé qui permet d’ouvrir

spécifiquement une serrure. Chaque anticorps est conçu pour lier spécifiquement un seul

épitope. En fait, certains anticorps reconnaissent un épitope unique, mais qui est formé

par l’association de plusieurs molécules sous forme de complexe. Étant donné que

chaque anticorps est conçu pour reconnaître et lier de manière spécifique un seul épitope

antigénique, plusieurs anticorps différents peuvent reconnaître le même antigène en liant

des épitopes différents. La spécificité de liaison d’un anticorps à un seul ou à plusieurs

épitope(s) sur un antigène permet de différencier les anticorps monoclonaux des anticorps

polyclonaux. Les anticorps monoclonaux vont reconnaître tous le même épitope d’un

antigène, alors que les anticorps polyclonaux vont reconnaître le même antigène, mais en

ne se liant pas tous au même épitope, donc au même endroit sur l’antigène. Le sérum

humain est un mélange d’anticorps polyclonaux. Ainsi, la purification biochimique d’un seul

type d’anticorps monoclonal est très difficile, en partie parce que la concentration de

n’importe quel anticorps dans l’organisme est très faible[24]. La préparation d’anticorps

monoclonaux nécessite, dans un premier temps, l’isolement de plasmocytes qui sécrètent

spécifiquement cet anticorps[25]. Cette cellule doit ensuite être mise en culture, puis

fusionnée avec une cellule immortelle, dérivée d’un myélome par exemple. Ensuite, les

anticorps sécrétés sont récoltés du milieu de culture, puis purifiés. Plusieurs réactifs

utilisés en sérologie sont des anticorps monoclonaux fabriqués en laboratoire.

Les réactions antigène-anticorps peuvent être caractérisées selon deux facteurs : l’affinité

et l’avidité. D’une part, l’affinité représente la force de liaison entre un site antigénique et

un seul site de liaison sur l’anticorps (Figure 1.6.). Cette force de liaison est dépendante

de la somme des forces attractives et répulsives qui sévissent entre l’anticorps et

l’antigène[8].

15

Figure 1.6. : Concept d’affinité dans la liaison antigène-anticorps.

Puisque la liaison antigène-anticorps est non-covalente, les forces impliquées sont celles

de Van der Waals, les liaisons électrostatiques et hydrophobes, ainsi que les liaisons

hydrogènes.

D’autre part, l’avidité représente la force totale de la liaison entre un anticorps et un

antigène. L’avidité d’un anticorps pour un antigène dépend de l’affinité de chacun des sites

de fixation de l’anticorps aux différents déterminants antigéniques[26]. Par exemple, une

affinité moindre entre une IgM et un site de liaison antigénique pourrait être compensée

par le fait que les IgM, lorsqu’elles sont associées en pentamères, offrent dix sites

identiques de liaison à l’antigène. Ce phénomène permet d’augmenter considérablement

l’avidité. Les concepts d’affinité et d’avidité dans la réaction antigène-anticorps sont à la

base des tests sérologiques effectués dans les banques de sang.

Héma-Québec teste et répertorie le phénotype sanguin de chacun des donneurs de sang.

Ce registre s’avère essentiel dans la recherche de sang compatible à chaque receveur.

Dans la plupart des cas, les tests effectués en sérologie érythrocytaire permettent le

typage sanguin d’un individu. Cependant, comme chaque technique d’analyse, elle a ses

limites. Par exemple, lorsqu’un donneur ne peut pas être phénotypé avec les tests

sérologiques standards ou que des résultats divergents sont observés à la suite de ces

16

tests, d’autres méthodes doivent être envisagées. Le génotypage sanguin en est un

exemple.

1.7. Le génotypage sanguin

Dans le cas des patients récemment transfusés ou greffés de moelle osseuse, le

phénotype sanguin est impossible à établir de manière traditionnelle. En fait, les individus

récemment transfusés ont en circulation, en plus de leurs propres globules rouges, ceux

qui proviennent du (des) donneur(s). À cause de la présence simultanée de ces deux

populations cellulaires dans l’organisme, il est impossible de procéder aux tests

sérologiques standards. En fait, il n’est pas possible d’isoler les globules rouges

intrinsèques du receveur. Dans le même sens, avant d’être greffés de moelle osseuse, les

patients sont tous irradiés. Cette irradiation altère de façon majeure les fonctions des

cellules souches, lesquelles sont les cellules progénitrices des cellules sanguines[27]. Une

fois irradié, le receveur est greffé des cellules souches saines du donneur dans le but de

reconstruire son système immunitaire et sanguin. Lorsque la greffe est un succès, les

cellules sanguines du receveur deviennent de manière intrinsèque celles du donneur, et

ce, pour le restant de sa vie. Ainsi, l’ADN retrouvé dans les cellules sanguines du receveur

sera différent de celui retrouvé dans ses autres types de cellules. Cependant, pendant la

prise de greffe, le receveur exprime une mosaïque hétérogène d’antigènes sanguins,

c’est-à-dire qu’il exprime à la fois les siens et ceux du donneur. Ainsi, à cause de la

présence des deux populations de cellules sanguines, les tests d’agglutination

sérologiques standards sont très difficiles à effectuer.

Ces deux exemples démontrent bien l’utilité du génotypage sanguin. Il existe cependant

un bémol au génotypage sanguin dans les cas de prise de greffe. En fait, pendant celle-ci,

il est difficile de génotyper les patients puisque les cellules du donneur sont encore

présentes dans leur organisme. À mesure que la greffe s’implante, de moins en moins de

cellules sanguines vont exprimer le génotype intrinsèque du receveur, mais elles vont

plutôt exprimer celui du donneur. Donc, lorsque la prise de greffe est terminée, le

génotypage sanguin permet de confirmer le fait que le receveur exprime bel et bien les

antigènes érythrocytaires du donneur.

17

Le génotypage sanguin est apparu au début des années 1990[6]. Cette technique

d’analyse permet de prédire le phénotype par l’analyse du génotype. En fait, la majorité

des antigènes érythrocytaires sont définis par des polymorphismes observables dans

l’ADN génomique, qui affectent la plupart du temps un seul nucléotide (SNP)[28]. Ces SNP

codent spécifiquement certains acides aminés dans la portion extracellulaire des protéines

membranaires érythrocytaires.

Les protéines membranaires, comme toutes les autres protéines, sont synthétisées à la

suite de la traduction des codons des ARNm en acides aminés. Les ARNm sont transcrits

par l’ADN polymérase II et correspondent à une version simple brin de l’ADN qui sert de

matrice. Chaque codon est composé de trois bases azotées et l’enchaînement de ces trois

bases code pour un seul acide aminé. En fait, l’ARNm mature contient seulement les

séquences codantes de l’ADN, c’est-à-dire les exons. Les introns sont transcrits dans le

pré-ARNm, mais sont ensuite retirés par un processus nommé épissage. Chez les

eucaryotes, les ARNm contiennent une coiffe en 5’ et une queue de poly-A en 3’.

Contrairement à la transcription de l’ADN en ARNm qui a lieu dans le noyau, le processus

de traduction des ARNm en protéines a lieu dans le réticulum endoplasmique. En fait, les

ribosomes enchaînent les acides aminés l’un à la suite de l’autre jusqu’à ce qu’ils aient

formé une protéine complète.

Selon la structure des atomes qui composent les acides aminés, ces derniers forment des

chaînes qui se replient pour former d’abord des structures secondaires en hélices α et en

feuillets β, puis des structures tridimensionnelles. Dans la plupart des cas, la protéine sera

fonctionnelle seulement dans sa structure tridimensionnelle. Cependant, il arrive que

certaines protéines se regroupent entre elles pour former des structures quaternaires et

ainsi, elles peuvent former une nouvelle protéine avec une tout autre fonction. En général,

la structure des protéines renseigne beaucoup à propos de leur(s) fonction(s). Par

exemple, celles qui traversent de part et d’autre la membrane plasmique des cellules

peuvent avoir une fonction de canal ou de pompe, ou encore avoir un rôle purement

structural.

Une quantité importante de maladies sont causées par une ou des mutations dans une

protéine en particulier. C’est notamment le cas de la fibrose kystique[29]. Dans l’ADN, une

18

quantité importante de mutations s’accumulent au fil du temps. La substitution des bases,

surtout des transitions de cytosine à thymine, est la mutation somatique la plus fréquente,

mais des insertions/délétions, des duplications, des réarrangements chromosomiques et

des translocations peuvent aussi avoir lieu[30].

De la même manière, les mutations dans les protéines membranaires des globules rouges

définissent les antigènes érythrocytaires qui eux, sont à la base des groupes sanguins. En

fait, plus de 90% des antigènes de groupes sanguins sont codés par un seul

polymorphisme (SNP), qui n’altère pas la fonction de la protéine porteuse de ces

antigènes[31]. Cependant, bien que la plupart des SNP n’affectent pas la fonction première

des protéines, certains peuvent avoir un effet majeur sur la structure de celles-ci, selon

l’acide aminé touché et surtout de sa position au sein des protéines. Donc, comme

structure rime avec fonction, la mutation d’un seul acide aminé dans une protéine peut

avoir comme effet de l’inactiver complètement.

À défaut d’éliminer complètement la fonction d’une protéine, certaines mutations vont

seulement l’altérer. Au fil des ans, plusieurs SNP ont été identifiés et associés à des

maladies. Par exemple, l’anémie falciforme est une maladie qui atteint deux individus sur

mille de souche africaine et elle est causée par une mutation faux-sens dans le codon 6

de la protéine normale par un résidu valine dans la protéine mutée[24]. Ce changement

d’acide aminé altère profondément la structure de l’hémoglobine, ce qui entraîne une

rigidité plus importante des globules rouges et ultimement, des lésions tissulaires[24].

Cependant, l’effet réel de ces SNP sur la transcription génique est difficile à connaître

puisqu’un seul SNP peut modifier la transcription d’autres gènes[32]. Il a été observé

maintes fois dans la littérature que plusieurs des fonctions vitales au sein des cellules

peuvent être gérées par plus d’une protéine. Ceci serait le résultat de l’évolution, qui avait

pour but de garder en vie les cellules, même dans le cas de l’apparition de certaines

mutations[33]. En fait, ensemble, les mutations épigénétiques et génétiques amènent un

nombre élevé de variations au sein des cellules, des variations sur lesquelles une

sélection peut avoir lieu. C’est la raison pour laquelle la majorité des mutations délétères,

celles qui affectent la survie de la cellule, vont être éliminées par le principe de la sélection

naturelle[30]. Donc, chez les eucaryotes, chaque protéine est conçue pour remplir un ou

19

plusieurs rôle(s) et à ce jour, ce(s) rôle(s) est (sont) inconnu(s) pour une grande quantité

d’entre elles. Heureusement, plusieurs méthodes de protéomique et de biologie

moléculaire sont utilisées afin d’élucider la fonction des protéines.

Les méthodes de biologie moléculaire utilisées pour génotyper les groupes sanguins

peuvent être classées en deux catégories : celles à faible-moyen débit (PCR, PCR-RFLP,

PCR-SSP ou PCR-ASP, PCR en temps réel, séquençage de l’ADN et le pyroséquençage)

et celles à haut-débit, qui regroupent tous les systèmes basés sur les puces[28]. En plus de

permettre la résolution des cas complexes en sérologie érythrocytaire traditionnelle,

l’apparition des plates-formes automatisées de génotypage sanguin a permis d’augmenter

considérablement l’efficacité à créer les registres de donneurs de sang.

1.8. L’antigène PEL

L’antigène érythrocytaire PEL a été identifié pour la première fois en 1996 par l’équipe du

chercheur Geoff L. Daniels en Angleterre[22]. Depuis ce jour, il a été classé dans la série

901 par l’ISBT, celle qui regroupe tous les antigènes de haute fréquence[6]. Il a été nommé

PEL en l’honneur de la femme dénommée Pelletier chez qui les anticorps anti-PEL ont été

découverts. Cette femme de 29 ans passait des tests sérologiques lors de sa deuxième

grossesse lorsqu’ils ont identifiés les anticorps. À la suite de différents tests sérologiques,

ils sont parvenus à la conclusion que ces anticorps étaient spécifiques à un nouvel

antigène, inconnu jusque-là. Les mêmes anticorps anti-PEL ont été identifiés chez une

autre femme, elle aussi d’origine québécoise. Aussi, ils ont identifié, chez deux autres

québécoises, des globules rouges qui exprimaient l’antigène PEL, mais en très faible

quantité. Ces deux femmes avaient développé des anticorps, mais contrairement à ceux

qui avaient été identifiés précédemment, ceux-ci ne réagissaient pas avec les cellules

PEL-. Pour cette raison, ils ont été nommés anti-MTP[22].

Même si l’antigène PEL a une importance clinique, il n’a jamais été démontré que ses

anticorps spécifiques peuvent causer la maladie hémolytique du nouveau-né[22]. Le sérum

des deux femmes identifiées comme étant PEL- a réagi avec des antiglobulines

polyspécifiques et avec des anti-IgG. De plus, l’analyse sérologique des enfants de ces

deux femmes a démontré que le phénotype PEL- était hérité de manière récessive.

20

Puisque la base moléculaire de l’antigène PEL n’a pas été découverte, très peu de

caractéristiques sont connues à son sujet. Outre le fait qu’il s’agit d’un antigène de haute

fréquence présent chez plus de 99% de la population, le phénotype PEL- semble être

spécifique à la population québécoise. Aussi, il a été démontré qu’il résiste au traitement

des globules rouges par ces enzymes protéolytiques : ficine, papaïne, trypsine, alpha-

chymotrypsine, pronase, sialidase ainsi que par le DTT[7]. De plus, des tests

d’agglutination en cartes-gel effectués en sérologie ont permis de déterminer que les

anticorps anti-PEL étaient des IgG.

1.9. Contexte de recherche et hypothèse

En 1996, Goeff Daniels et son équipe ont fait la découverte d’anticorps anti-PEL dans le

sérum de deux femmes d’origine québécoise[22]. Bien qu’ils soient parvenus à déterminer

que ces anticorps reconnaissent un antigène qui diffère de tous ceux qui ont été identifiés

jusqu’à maintenant, la base moléculaire de l’antigène PEL demeure inconnue à ce jour. La

découverte de la base moléculaire des antigènes érythrocytaires permettrait de les

associer à un groupe sanguin déjà existant ou d’en créer un nouveau. En fait, pour qu’un

nouveau groupe sanguin soit nommé, la base moléculaire de l’antigène érythrocytaire doit

être codée par un gène qui n’est pas déjà associé à un autre groupe sanguin[6]. Lorsque la

base moléculaire est connue, il devient possible de connaître le génotype de ces individus

concernant cet antigène, en complément du phénotype qui a été préalablement identifié

en sérologie. Récemment, au mois de février 2012, le groupe de Lionel Arnaud publiait la

découverte de la base moléculaire des antigènes Lan et Jra, qui sont deux antigènes de

haute fréquence, tout comme l’antigène PEL[34, 35]. Par exemple, dans le cas de l’antigène

Lan, la création d’un anticorps monoclonal spécifique a permis d’identifier un complexe

immun par immunobuvardage. La bande correspondant au complexe immun a été

envoyée en spectrométrie de masse et c’est ainsi qu’ils ont lié l’antigène Lan au

transporteur d’ATP ABCB6. En sachant que la protéine ABCB6 est la base moléculaire de

l’antigène Lan, l’analyse du gène ABCB6 de certains individus de phénotype Lan+ versus

ceux de phénotype Lan-, a permis d’identifier divers SNP responsables de ce

phénotype[34].

21

Les résultats obtenus par l’équipe de L. Arnaud démontrent bien que la découverte de la

base moléculaire d’un antigène de haute fréquence peut se faire selon deux types

d’analyses, soient par des analyses génomiques, soient par des analyses protéomiques.

Puisqu’il n’y a qu’un seul article publié à ce jour à propos de l’antigène PEL et qu’il a été

démontré que les anticorps anti-PEL sont des IgG, l’hypothèse émise est que la base

moléculaire de cet antigène est de nature protéique. Des analyses génomiques et

protéomiques ont été effectuées sur des échantillons PEL+ et PEL- pour tenter de

découvrir la base moléculaire de l’antigène PEL.

1.10. Objectifs

Ce projet de maîtrise avait pour but d’identifier la base moléculaire de l’antigène PEL. Pour

tenter d’y parvenir, plusieurs analyses génomiques et protéomiques ont été envisagées en

fonction des caractéristiques déjà connues à propos de cet antigène. Tout d’abord, les

analyses génomiques consistaient en l’analyse des séquences codantes des ARNm de

certaines protéines déjà connues comme étant la base moléculaire de certains groupes

sanguins. En fait, bien qu’il soit possible que l’antigène PEL soit porté par une protéine qui

n’est pas déjà associée à un groupe sanguin, il se peut aussi qu’il soit la manifestation

d’une ou de certaine(s) modification(s) transcriptionnelle(s) au sein d’une protéine déjà

associée à un groupe sanguin.

Les protéines à analyser ont été sélectionnées selon le fait que leur(s) antigène(s)

réagissait(ent) de la même manière que l’antigène PEL aux enzymes protéolytiques[23].

Aussi, en sachant que les anticorps anti-PEL sont des IgG et que cet isotype reconnaît

souvent des antigènes protéiques, l’hypothèse du projet était que la base moléculaire de

l’antigène PEL est de nature protéique. Ainsi, il a été envisagé d’isoler l’antigène par des

méthodes de capture et de reconnaissance des protéines.

L’objectif principal de la recherche était d’identifier la base moléculaire de l’antigène

érythrocytaire de haute fréquence PEL.

22

Pour arriver à atteindre l’objectif principal de la recherche et dans le but de vérifier

l’hypothèse, voici l’objectif de la recherche en ce qui concerne les analyses génomiques :

Séquencer la partie codante de différents ARNm de plusieurs protéines, associées

ou non à un groupe sanguin, dans des échantillons PEL+ et PEL- afin de les

comparer

Parallèlement, voici les objectifs de la recherche en ce qui concerne les analyses

protéomiques :

Faire des électrophorèses SDS-PAGE avec des échantillons PEL+ et PEL- pour en

comparer le motif de migration

Envoyer des échantillons PEL+ et PEL- en spectrométrie de masse pour en

comparer le protéome érythrocytaire respectif

Isoler les anticorps anti-PEL du plasma par diverses méthodes de purification

Identifier un complexe immun par immunobuvardage de type Western en utilisant

diverses préparations biologiques contenant des anticorps anti-PEL comme

anticorps primaires

23

2. Matériel et méthodes

2.1. Analyses génomiques

2.1.1. Échantillons

Tous les échantillons PEL+ (ceux dont les globules rouges expriment l’antigène PEL) et

tous les échantillons PEL- (ceux dont les globules rouges n’expriment pas l’antigène PEL)

ont été obtenus après la signature d’un formulaire de consentement éclairé et leur

utilisation a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche d’Héma-Québec. Les

deux échantillons sanguins PEL- et les deux échantillons contrôles PEL+ provenaient tous

deux d’individus caucasiens et d’origine québécoise. Préalablement, le Laboratoire de

référence et cellules souches (LRCS) d’Héma-Québec a confirmé, en sérologie, les

phénotypes PEL+ et PEL- des échantillons. De plus, de précédentes analyses

sérologiques ont démontré la présence d’anticorps anti-PEL dans le plasma des deux

individus PEL-.

2.1.2. Extraction d’ARN

L’ARN des échantillons PEL+ et PEL- a été extrait à partir du sang total préalablement

congelé à -20ºC dans du RNA Later (Life Technologies Inc., Burlington, Ontario). Le

protocole d’extraction d’ARN provenait de la trousse commerciale RiboPure™-Blood Kit

(Life Technologies Inc.) et il a été suivi à la lettre selon les instructions du fabricant. L’ARN

purifié était dosé au NanoDrop® (Thermo Scientific, Delaware, États-Unis), un

spectrophotomètre qui mesure l’absorbance à 260 nm. Une fois dosé, l’ARN était aliquoté,

puis congelé à -80ºC pour toute la durée du projet.

2.1.3. Design d’amorces pour les RT-PCR

Pour les ARNm dont le laboratoire ne possédait pas encore d’amorces spécifiques à

utiliser en RT-PCR, des amorces ont dû être sélectionnées. La sélection des amorces

s’est faite avec l’application Primer3 intégrée dans le logiciel Geneious (Biomatters Ltd,

Nouvelle-Zélande) à partir de la séquence complète des ARNm. Une fois sélectionnées,

les amorces étaient recherchées dans une base de données pour s’assurer de leur

24

spécificité. Un total de 25 nmoles de chaque amorce a été commandé chez Integrated

DNA Technologies Inc. (San José, Californie).

2.1.4. Amplification par RT-PCR

La majorité des amplifications par RT-PCR ont été faites avec la trousse commerciale

OneStep RT-PCR kit (Qiagen, Toronto, Canada). Les réactions PCR étaient effectuées

dans un volume final de 50 µl qui contenait de 75 ng à 170 ng d’ARN, 10 µl de tampon 5X,

0,4 mM de dNTP (Qiagen), 40 U d’inhibiteur de RNAse (Life Technologies Inc.), 0,6 µM de

chacune des amorces et 2 µl du mélange d’enzymes (Qiagen) provenant de la trousse.

L’amplification des ARNm avait lieu dans les thermocycleurs GeneAmp® PCR system

9700 (Life Technologies Inc.). Les protéines ciblées pour l’amplification de leur ARNm sont

présentées dans le tableau 2.2..

Tableau 2.2. : Description des protéines dont l’ARNm a été ciblé pour les analyses génomiques[6, 36]

.

25

Les programmes des thermocycleurs variaient selon les ARNm amplifiés. Les ARNm des

molécules : aquaporine-1, CD55, CD59, RhD, ERMAP, FLOT-1, GBGT1, Kx et Oka ont été

amplifiés dans les conditions suivantes :

}

Pour leur part, les ARNm des molécules : bande 3, CD47, GLUT-1, SLC14A1 et RhAG

étaient amplifié dans les conditions suivantes :

}

L’ARNm de RhCE était amplifié dans les conditions suivantes :

}

}

L’ARNm de la glycophorine A était amplifié dans les conditions suivantes :

}

L’ARNm de la glycophorine B était amplifié dans les conditions suivantes :

}

}

26

Finalement, l’amplification de l’ARNm de la protéine CD238 était faite dans les conditions

suivantes :

}

Puis, pour le séquençage, une PCR semi-nichée a été nécessaire à la suite de la RT-PCR

pour la protéine CD238. La PCR semi-nichée, tout comme la PCR nichée, consiste à faire

deux amplifications PCR successives, en utilisant, lors de la deuxième amplification PCR,

une ou deux amorce(s) différente(s) de celle(s) utilisée(s) lors de la première amplification.

Donc, la PCR semi-nichée, dans ce cas, s’est faite dans les conditions suivantes :

}

Les détails concernant ces amplifications, notamment la séquence des amorces utilisées,

sont présentés en annexe (Tableau A.1.).

2.1.5. Amplification des exons 1 à 5 du gène codant pour la glycoprotéine CD44

Puisque l’amplification en une seule étape de la séquence codante de l’ARNm de la

protéine CD44 s’est avérée infructueuse, les exons 2 à 5 ont été amplifiés par PCR

classique selon le protocole décrit dans l’article de Poole et collaborateurs à partir de

l’ADN génomique[37]. Étant donné l’échec de l’amplification de l’exon 1 basée sur le

protocole décrit dans l’article, d’autres amorces ont été sélectionnées selon la même

méthode que celle décrite précédemment. Seuls les exons 1 à 5 ont été ciblés pour être

amplifiés et séquencés, puisque ceux-ci codent pour les parties extramembranaires de la

glycoprotéine CD44.

27

Tableau 2.3. : Conditions expérimentales pour l'amplification des exons 1 à 5 de l'ARNm de la glycoprotéine

CD44.

Protéine Groupe sanguin

Gène Exon Tm des

amorces (°C)

Amorce sens 5'→ 3'

Amorce anti-sens 5'→ 3'

Taille du fragment

(pb)

CD44 Indian IN

1 - GGACAGATGGGA

AATGAGTGG GTTTAGCGCAAAT

CCCAGCCC 1445

2 65 TGTTAACCAGGCT

GGTCTTGAG AGTTCTAAGCCCA

GCTGCCTG 430

3 60 TAACTCGGTTGTT

GAAACCTCCG AGCTGAGCTCCA

AAGACCAGG 341

4 60 GCTTCCACAGTG

CCTGATATAG TACCACAGAGAA

CACACCTGAG 427

5 60 TCTCCCACCACTGGATAGATAGG

GTGCAATGCTCAGGAAGGTCAG

439

Sauf pour la Tm (qui correspond à X°C dans l’équation ci-dessous) qui change selon l’exon

amplifié, l’amplification PCR de chaque exon était faite selon la méthode suivante :

}

Pour des raisons techniques, l’exon 1 n’a pas été amplifié.

2.1.6. Amplification de la séquence codante de SMIM1 par PCR classique

Étant donné que la séquence codante de l’ARNm de la protéine SMIM1 du groupe

sanguin Vel était de petite taille (237 pb), il était possible de l’amplifier par PCR classique

en utilisant l’ADN génomique. Les réactions PCR étaient effectuées dans un volume final

de 50 µl qui contenait de 75 ng à 170 ng d’ADN, 5 µl de tampon PCR 10X (Roche,

Mississauga, Ontario), 0,2 mM de dNTP (Life Technologies Inc.), 0,6 µM de chacune des

amorces et 2,5 U d’enzyme AmpliTaq® Gold (Celera, Alameda, Califonie). Le programme

d’amplification PCR était le suivant :

}

28

2.1.7. PCR nichée de l’amplicon de l’aquaporine-1 et PCR à demi nichée du

deuxième fragment de l’ARN messager du CD238

Dans deux cas, parce qu’il s’agissait de plus longs fragments (>1000 pb), une autre PCR

était faite à partir de l’ADN complémentaire provenant de l’amplification précédente de

l’ARNm. Dans le cas de l’ARNm de l’aquaporine-1 du groupe sanguin Colton, la PCR

nichée était faite selon la méthode suivante :

}

Pour ce qui est du deuxième fragment de l’ARNm de la protéine CD238, la PCR à demi

nichée était faite selon la méthode suivante :

}

Ces amplifications permettaient d’obtenir assez d’ADN pour la purification et l’envoi au

séquençage.

2.1.8. Purification et dosage des amplicons

À la suite des amplifications RT-PCR et PCR, les divers amplicons devaient être purifiés

avant d’être envoyés au séquençage. Lorsqu’il n’y avait qu’une seule bande sur le gel

d’agarose, les amplicons étaient purifiés par RapidTip® (D-Mark Biosciences, Toronto,

Canada) selon les instructions du fabricant. Dans les cas où les amplifications ne se

traduisaient pas en une seule bande sur le gel, les amplicons étaient purifiés à l’aide du

MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen) selon les instructions du fabricant. En résumé, les

bandes correspondant aux fragments d’intérêt étaient découpées au scalpel, puis l’ADN

était libéré lors de la fonte de l’agarose. Ensuite, l’ADN était purifié dans un système de

colonne. La colonne est conçue pour retenir l’ADN, alors que ce dernier est purifié lors

d’une étape de lavage et finalement recueilli lors d’une étape finale d’élution. Ces deux

étapes sont effectuées par centrifugation.

29

Le dosage des amplicons non purifiés était effectué avec le marqueur de masses

moléculaires Low DNA mass ladder (Life Technologies Inc.). Une quantité de 235 ng de

ce marqueur était déposée sur un gel d’agarose 1%. La création d’une courbe standard à

partir du marqueur permettait de doser 1 µl de chaque amplicon et d’obtenir la

concentration de chaque échantillon. Le dosage sur gel d’agarose avait comme avantage

de prouver la présence d’un seul fragment d’ADN et de s’assurer que ce dernier

correspondait bel et bien au fragment d’intérêt.

Par souci d’économie de temps, les amplicons précédemment purifiés par RapidTip®

étaient dosés au NanoDrop®.

2.1.9. Clonage de l’amplicon correspondant à l’ARNm de CD47

Afin d’améliorer la qualité des séquences obtenues à la suite de la RT-PCR, la séquence

de l’ARNm du CD47 a dû être clonée. Le vecteur utilisé, le pDrive Cloning Vector

provenait de la trousse commerciale PCR CloningPlus kit (Qiagen).

Tout d’abord, le clonage était précédé d’une amplification de la séquence à cloner par RT-

PCR dans les conditions énoncées précédemment. Le programme du thermocycleur était

le suivant :

}

Ensuite, les produits PCR étaient dosés sur gel d’agarose 1% avec le marqueur de

masses moléculaires Low DNA mass ladder afin de s’assurer que la quantité d’amplicons

soit suffisante pour procéder au clonage. Une fois dosés, les amplicons étaient purifiés

avec les RapidTip®. Pour faciliter la réaction de ligation, il y avait ajout de queues poly-A

aux produits PCR selon la méthode suivante : 4 µl de produits PCR purifiés (environ

250 ng d’ADN), auxquels sont ajoutés 0,5 µl de tampon Taq 10X (Life Technologies Inc.),

1 mM de dATP (Life Technologies Inc.) et 2,5 U de Taq polymérase (Life Technologies

Inc.). Le volume total de la réaction était de 5,5 µl. L’ajout de queues poly-A se faisait à

72°C pendant 10 minutes, suivi d’un refroidissement à 4°C.

30

La réaction de ligation de l’insert (la séquence de l’ARNm du CD47) dans le vecteur, ainsi

que celle de la transformation dans les EZ Competent Cells (Qiagen) étaient toutes les

deux effectuées selon les instructions du fabricant. Les cellules compétentes,

précédemment incubées dans un bain-marie à 37°C pendant 1h avec de légères

agitations sporadiques, étaient mises en culture sur des géloses contenant le milieu Luria-

Bertani (LB), préparé de façon standard et contenant de l’ampicilline (Sigma-Aldrich,

Oakville, Ontario) à une concentration de 0,1 mg/ml. Les géloses étaient placées à 37°C

toute la nuit. La sélection des colonies recombinantes se faisait selon la méthode

colorimétrique standard des colonies bleues/blanches, basée sur l’hydrolyse du 5-bromo-

4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) en présence d’isopropyl β-D-1-

thiogalactopyranoside (IPTG), lorsqu’il y a présence du gène lacZ dans le plasmide.

Chacune des colonies recombinantes (blanches) était déposée dans 5 ml du même milieu

de culture LB-ampicilline et incubée à 37°C pendant 8 h sous agitation. Ensuite, 5 ml du

bouillon de culture était incorporé dans 45 ml du milieu LB-ampicilline et le 50 ml total était

incubé à 37°C sous agitation pendant toute la nuit.

La purification de l’ADN plasmidique était effectuée à l’aide la trousse commerciale

Hispeed™ Plasmid Purification Midi Kit (Qiagen) selon les instructions données par le

fabricant. L’ADN plasmidique purifié était dosé à 260 nm au NanoDrop®, puis envoyé au

service de séquençage.

2.1.10. Séquençage et analyse des résultats

Tous les amplicons purifiés étaient séquencés à la Plate-forme d’analyses génomiques de

l’Université Laval. Les amorces utilisées pour le séquençage étaient les mêmes que celles

utilisées lors des amplifications RT-PCR et PCR. Une fois reçues, les séquences étaient

analysées avec le logiciel Geneious et comparées avec les séquences standards

retrouvées sur le site du National Center of Biotechnology Information[38].

31

2.2. Analyses protéomiques

2.2.1. Préparation de globules rouges fantômes

Afin de faciliter les analyses protéomiques, des globules rouges fantômes, c’est-à-dire des

globules rouges dépourvus d’hémoglobine, ont été préparés selon le protocole suivant.

Tout d’abord, un tube de sang total, recueilli dans un tube contenant de l’EDTA, était

centrifugé à 1430 x g pendant 20 minutes afin d’isoler les globules rouges. Un culot de

300 µl de ces derniers était prélevé et lavé 5 fois avec de la saline (NaCl 0,9%).

Ensuite, le culot était suspendu dans du tampon phosphate de sodium 5 mM pH 8,0

jusqu’à un volume final de 15 ml. La suspension était incubée 30 minutes sur glace, puis

centrifugée pendant 20 minutes à 10 000 x g avec le frein activé. Cette étape, qui

commençait par la suspension du culot dans le tampon sodium phosphate, était répétée 2

fois et effectuée entièrement sur glace.

Les globules rouges fantômes étaient ensuite suspendus dans un volume final de 1 ml de

tampon sodium phosphate et 2 µl de cette suspension était dosée au NanoDrop® pour

avoir une idée de la concentration en protéines. Finalement, 10 µl d’EDTA 0,5 M (Thermo

Scientific) et 10 µl d’Halt™ Protease Inhibitor (Thermo Scientific) étaient ajoutés avant que

les globules rouges fantômes soient aliquotés et congelés à -80°C pour la durée du projet.

2.2.2. Traitement des globules rouges fantômes à la ficine

Le protocole était celui effectué de manière standard par le LRCS d’Héma-Québec.

Premièrement, afin de procéder au traitement enzymatique, le sang total était centrifugé à

1430 x g pendant 20 minutes afin d’isoler les globules rouges. Ensuite, ces derniers

étaient lavés avec de la saline jusqu’à l’obtention d’un surnageant clair. Une suspension

de globules rouges à 1%, toujours dans la saline, était ensuite préparée. La ficine

concentrée à 10X (fournie par le LRCS) était préalablement diluée à une concentration

finale de 1X dans du tampon phosphate salin (PBS : 0,8 M Na2HPO4 et 0,2 M KH2PO4 à

pH 7,4, 145 mM NaCl, pH total 7,3). L’enzyme était ajoutée à un volume 3 fois supérieure

à celui du culot de globules rouges et la réaction était incubée dans un bain-marie à 37°C

32

pendant 15 minutes. Les globules rouges traités étaient ensuite lavés 3 fois avec de la

saline en centrifugeant à 600 x g pendant 10 minutes chaque fois.

2.2.3. Électrophorèse SDS-PAGE et coloration des gels

Dans le but d’observer le motif de migration des protéines des globules rouges fantômes

PEL- versus celui des globules rouges fantômes PEL+, environ 20 μg de protéines de

globules rouges fantômes étaient déposés sur gel de polyacrylamide à 12%, en conditions

réductrices ou non. Les conditions non-réductrices consistaient à omettre le DTT du

tampon d’échantillon et à ne pas faire bouillir les échantillons avant que ces derniers

soient déposés sur gel. Toutes les électrophorèses SDS-PAGE étaient faites à l’aide du

montage Mini-PROTEAN® Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, Ontario). Selon

l’analyse à effectuer, les colorants utilisés pour les gels étaient le Bio-Safe Coomassie

Stain (Bio-Rad) ou le SYPRO® Ruby Protein Gel Stain (Life Technologies Inc.). Les deux

colorants étaient utilisés selon les instructions données par le fabricant. Les gels étaient

visualisés et analysés avec l’appareil Alpha Imager (Proteinsimple™, Santa Clara,

Californie) ou le ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare, Baie d’Urfe, Québec).

2.2.4. Spectrométrie de masse

Toutes les analyses en spectrométrie de masse étaient effectuées à la Plate-forme de

protéomique du Centre de génomique de Québec, situé au Centre hospitalier de

l’Université Laval (CHUL). L’appareil utilisé était le TripleTOF 5600 (AB SCIEX, Concord,

Ontario). Une fois reçus, les résultats étaient analysés à l’aide du logiciel Scaffold3

(Oregon, États-Unis).

2.2.5. Adsorption-élution des anticorps anti-PEL

Le but de cette méthode était de fixer de manière spécifique les anticorps anti-PEL sur des

globules rouges PEL+, puis d’éluer ces anticorps afin de les utiliser comme anticorps

primaires en immunobuvardage. Afin de procéder à l’adsorption-élution des anti-PEL, la

trousse commerciale ELU KIT™ PLUS (Immucor Inc., Géorgie, États-Unis) a été utilisée

selon les instructions du fabricant. Pour faciliter l’adsorption et encourager la spécificité de

33

la liaison à l’antigène PEL, les globules rouges utilisés étaient O-. Ainsi, les antigènes A, B

et D étaient absents de la surface des globules rouges. Avant de procéder à l’élution, le

test de Coombs était effectué pour tester l’efficacité de l’adsorption. Ensuite, 2 µl des

protéines adsorbées étaient dilués dans 20 µl de saline. Puis, deux gouttes d’anti-IgG-C3d

(Immucor Inc.) étaient ajoutées et la réaction était centrifugée pendant 20 secondes avant

d’observer l’agglutination des globules rouges au microscope. Finalement, l’éluat final

contenant les anticorps anti-PEL était aliquoté, puis congelé à -80°C.

2.2.6. Purification des IgG totales du plasma PEL- par Fast Protein Liquid

Chromatography (FPLC)

Afin d’isoler les anticorps anti-PEL de deux échantillons de plasma, les IgG totales

contenues dans ceux-ci étaient purifiées par Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC).

Les deux plasmas, congelés à -80°C après avoir été isolés du sang total, ont été obtenus

après le consentement et l’approbation du comité d’éthique d’Héma-Québec. Les deux

échantillons de plasma provenaient du même individu, mais ont été prélevés à des temps

différents, soit en 2001 et en 2008. D’abord, un volume de 1 ml de chaque plasma était

ajouté à 1 ml de PBS avant d’être filtré à 0,22 µM. Les deux échantillons filtrés étaient

injectés dans une colonne de protéine G (HP SpinTrap, GE Healthcare) et cette dernière

était lavée avec du PBS jusqu’à ce que toutes les IgG aient été fixées sur la colonne.

Ensuite, les IgG étaient éluées avec de la glycine (100 mM, pH 2,3), puis immédiatement

neutralisées avec du Tris (tris(hydroxyméthyl)aminométhane)-HCl (1 M, pH 9,0).

Finalement, les IgG purifiées étaient envoyées au LRCS pour être testées en cartes-gel.

Ce test permettait de confirmer l’efficacité de la purification des anticorps anti-PEL du

plasma.

2.2.7. Fractionnement des IgG totales purifiées par focalisation isoélectrique

Dans le but d’isoler plus spécifiquement les anticorps anti-PEL, un échantillon des IgG

préalablement purifiées par FPLC a été soumis à une focalisation isoélectrique. Cette

méthode permettait de séparer les IgG selon leur point isoélectrique (pI). La focalisation

isoélectrique était effectuée à l’aide de l’appareil automatisé ÄKTA FPLC™ system (GE

Healthcare). Afin de générer un gradient de pH entre 6,0 et 9,6, la colonne Polybuffer

34

Exchanger 94 (GE Healthcare) était équilibrée avec le tampon de départ (25 mM

éthanolamine, pH 9,6). L’échantillon d’IgG purifiées était dilué dans ce même tampon

avant d’être injecté dans la colonne. L’élution était faite avec le tampon Polybuffer 96

ajusté à pH 6,0 (Ge Healthcare). Au final, huit fractions d’IgG ont été recueillies. Chaque

fraction a été testée en carte-gel par le LRCS dans le but d’identifier celle(s) où la réaction

d’agglutination entre les anticorps anti-PEL et les globules rouges PEL+ avait lieu.

2.2.8. Tests d’agglutination en carte-gel

Afin de tester l’efficacité des différentes méthodes de purification des IgG totales du

plasma, effectuées dans le but d’isoler les anticorps anti-PEL, des tests d’agglutination ont

été faits par le personnel du LRCS. Contrairement aux tests d’agglutination faits en tubes,

ceux effectués dans le cadre de ce projet étaient faits à l’aide des cartes-gel 1D-Micro

Typing System (Ortho Clinical Diagnosis, Markham, Canada). Chaque carte-gel contenait

cinq microtubes où il était possible d’observer une seule réaction d’agglutination à chaque

fois.

Tout d’abord, une suspension de globules rouges PEL+ à 2% était incubée avec 25 μl des

diverses préparations biologiques contenant les IgG totales pendant 1 heure à 37ºC dans

la chambre de réaction.

35

Figure 2.1. : Principe d'agglutination en carte-gel. Adaptée de [8]. D’abord, les globules rouges sont placés

dans la chambre de réaction en présence du liquide qui doit être testé (plasma ou autre). Ensuite, le tout est

incubé pendant une certaine période de temps à 37°C. Ensuite, la carte-gel est centrifugée et les globules

rouges, agglutinés ou non, passent ou non au travers de la colonne. Finalement, l’intensité de l’agglutination

peut être visualisée par le fait que les globules rouges ont été plus ou moins retenus à travers le gel (Figure

2.2.).

À la suite de l’incubation des globules rouges PEL+ avec le plasma contenant les

anticorps anti-PEL ou avec les IgG purifiées par FPLC et de la centrifugation de la carte-

gel, il était possible d’observer, s’il y avait lieu, l’agglutination des globules rouges PEL+

avec les anticorps anti-PEL. La colonne contenait des billes d’acrylamide et de

l’antiglobuline anti-IgG dans une solution LISS (Low Ionic Strenght Saline) tamponnée.

Cette solution permettait de neutraliser, en partie, la charge négative présente à la surface

des globules rouges et ainsi, favoriser l’agglutination de ces derniers[6]. Alors que les

globules rouges qui n’étaient pas agglutinés se déposaient au fond de la colonne et

formaient un culot bien défini, ceux qui avaient agglutiné restaient coincés dans le gel.

.

36

Figure 2.2. : Interprétation des résultats d'agglutination obtenus en carte-gel. Adaptée de [39].

La force de la réaction d’agglutination était variable et elle était interprétée selon une

échelle de réactivité qui allait de 0 (aucune agglutination) à 4+ (tous les globules rouges

semblaient avoir agglutiné) (Figure 2.2.). Ce test permettait de s’assurer que les anti-PEL

étaient bel et bien conservés à la suite des diverses purifications.

2.2.9. Immunobuvardages de type Western

Dans le but d’identifier un complexe immun de manière spécifique avec des préparations

biologiques contenant des anti-PEL, 20 µg de globules rouges fantômes PEL+ et PEL-,

préalablement dosés en protéines (en mesurant l’absorbance de ces dernières à 280 nm

en utilisant le coefficient d’absorption de l’albumine bovine) étaient déposés et migrés sur

gel de polyacrylamide à 12%. Les conditions réductrices et non-réductrices ont toutes les

deux été testées. Par la suite, les globules rouges fantômes étaient transférés sur une

membrane de PVDF (EMD Millipore, Massachusetts, États-Unis) à 100 V pendant 1 heure

à 22°C. La membrane était préalablement bloquée avec la solution commerciale

StartingBlock™ (TBS) Blocking Buffer (Thermo Scientific) et cette même solution était

utilisée pour diluer les anticorps primaire et secondaire. Les anticorps primaires, toujours

utilisés dans une dilution 1 :1000, étaient : le plasma contenant les anti-PEL, les IgG

purifiées par FPLC et certaines fractions d’IgG purifiées fractionnées selon leur point

isoélectrique. Les anticorps secondaires utilisés étaient des anti-IgG humains spécifiques

37

à certaines chaînes d’anticorps (spécifiques aux fragments Fc ou Fab, ou aux chaînes

lourde et légère), provenant de souris ou de chèvre (Jackson ImmunoResearch,

Pennsylvanie, États-Unis). De plus, ils étaient tous couplés à une peroxydase. L’analyse

des bandes obtenues au terme de la réaction de chimiluminescence était effectuée à

l’aide de l’appareil ImageQuant LAS 4000. Les bandes obtenues étaient comparées pour

tenter d’identifier un complexe immun reconnu sur les globules rouges fantômes PEL+,

mais absent des globules rouges fantômes PEL-.


immunobuvardage de type Western

Dans le but de visualiser le niveau d’expression des protéines CD55 et CD59 à la surface

des globules rouges fantômes PEL- et de comparer celui-ci avec celui à la surface des

globules rouges fantômes PEL+, un immunobuvardage de type Western a été tenté. Les

anticorps primaires utilisés étaient un anti-CD55 (Cedarlane, Burlington, Ontario) et un

anti-CD59 (Cedarlane), dilués selon les recommandations du fabricant. Les anticorps

secondaires utilisés étaient tous couplés à une peroxydase et dilués dans les mêmes

conditions que celles énoncées précédemment pour les autres immunobuvardages de

type Western. Ces deux immunobuvardages ont été tentés en conditions réductrices et

non-réductrices.

2.2.11. Immunoprécipitation en conditions non-dénaturantes

Dans le but d’isoler l’antigène PEL et d’en identifier la base moléculaire en spectrométrie

de masse, une immunoprécipitation en conditions non-dénaturantes a été tentée. Le but

de procéder en conditions non-dénaturantes était de préserver le plus possible la structure

de l’antigène, ainsi que celle des anticorps anti-PEL. Le protocole d’immunoprécipitation a

été adapté d’un protocole déjà existant[40]. Les solutions utilisées étaient toutes à 4ºC et

les centrifugations se faisaient aussi à cette température. De plus, toutes les

manipulations se faisaient sur glace. Tout d’abord, un culot de 500 μl de globules rouges

était lavé trois fois dans du PBS 1X en centrifugeant à 16 000 x g pendant une minute.

Ensuite, 1 ml d’une suspension de globules rouges à 2% (environ 1,5 x 108 cellules) était

centrifugé à 2200 x g pour éliminer ensuite le surnageant. Les globules rouges étaient

38

lysés (tampon de lyse non-dénaturant, fraîchement préparé : 1% Triton X-100, 50 mM

Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,02% sodium azide, 10 mM iodoacétamide,

1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), inhibiteur de protéases 1X (Thermo

Scientifics)) pendant 30 minutes. Afin de recueillir les fractions membranaires, le lysat était

ensuite lavé par centrifugation pendant 15 minutes à 16 000 x g. Les étapes de lyse et de

lavage étaient effectuées une seconde fois. Le culot de membranes de globules rouges

était ensuite gardé sur glace.

Le support utilisé pour l’immunoprécipitation était des billes de protéines G (GE

Healthcare) diluées dans du PBS. Les billes étaient conjuguées avec 5 μl d’IgG totales

provenant du plasma contenant des anti-PEL, purifiées précédemment par FPLC. Les

billes et les IgG étaient incubées pendant 2 h 30 à 4ºC sur un portoir rotatif. Les IgG qui

n’étaient pas fixées aux billes étaient ensuite récoltées en centrifugeant le mélange

pendant deux secondes à 16 000 x g. Finalement, les billes conjuguées aux anti-PEL

étaient suspendues dans du tampon de lyse.

Pour l’immunoprécipitation, du sérum d’albumine bovine (BSA) concentré à 10% était

ajouté aux billes conjuguées aux anti-PEL en même temps que le culot de membranes de

globules rouges resuspendu était ajouté. Ce mélange était incubé pendant 2 h à 4ºC sur

un portoir rotatif. Par la suite, le culot était centrifugé pendant cinq secondes à 16 000 x g

afin de recueillir, dans le surnageant, les protéines non fixées. Ensuite, les billes étaient

lavées huit fois avec 1 ml de tampon de lavage (0,1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl

pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,02% sodium azide), en centrifugeant pendant deux

secondes à 16 000 x g. Encore dans les mêmes conditions, les billes étaient lavées deux

fois avec 1 ml de PBS. Une fois le surnageant recueilli, les billes de protéines G couplées

à l’antigène étaient envoyées telles qu’elles en spectrométrie de masse.

2.2.12. Immunoprécipitation avec crosslinking

Afin de lier de manière covalente l’antigène PEL aux anticorps spécifiques anti-PEL, une

immunoprécipitation avec un agent permettant le crosslinking a été tentée. Le protocole,

ainsi que la préparation des solutions, ont été adaptés de l’article de Hamada et

collaborateurs[41]. Il est à noter que les solutions étaient préparées avec le détergent Igepal

39

CA-630 (Sigma-Aldrich) en remplacement du Nonidet-40 proposé dans l’article. Les billes

utilisées étaient les mêmes que celles utilisées lors de l’immunoprécipitation en conditions

non-dénaturantes. À la fin de l’expérience, les billes étaient envoyées telles qu’elles en

spectrométrie de masse.

3. Résultats


3.1.1. Amplification par RT-PCR des différents ARNm codant pour les protéines

d’intérêt

Les résultats du séquençage de la partie codante des différents ARNm sont résumés dans

l’annexe I (Tableau A.2.). Les résultats pour les protéines de la bande 3 et du GLUT-1 ne

sont pas présentés. Cependant, les résultats obtenus pour ces deux protéines, bien qu’ils

ne soient pas complets, ne laissent pas croire qu’elles soient associées à l’antigène PEL.

Comme le démontrent les résultats, certains SNP n’étant pas répertoriés dans la littérature

ont été identifiés. Cependant, en comparant ces SNP entre les individus PEL- et PEL+,

aucun lien n’a pu être fait entre ceux-ci et le phénotype PEL-.

3.1.2 Amplification des exons 2 à 5 du gène codant pour la glycoprotéine CD44

Les exons 2 à 5 du gène codant pour la glycoprotéine CD44 ont été séquencés et

analysés pour l’individu PEL-. Ces séquences ont été comparées à celles d’un individu

PEL+, ainsi qu’aux séquences de référence[38]. Finalement, aucune mutation particulière

n’a pu être identifiée dans l’ADN de l’individu PEL-.

40


3.2.1. Traitement des globules rouges fantômes à la ficine

La ficine est une enzyme protéolytique fréquemment utilisée en sérologie érythrocytaire.

Elle permet, notamment, d’éliminer certaines composantes extramembranaires des

antigènes des glycophorines A et B. Éliminer ces antigènes de la surface des globules

rouges PEL+ permet d’augmenter, lors des immunobuvardages, les chances de détecter

des protéines de plus faible abondance qui pourraient être masquées par celles présentes

en plus grande quantité. En fait, la glycophorine A et la bande 3 sont les protéines les plus

présentes à la surface des globules rouges avec chacune 1 000 000 copies par cellule.

Figure 3.1. : Résultat du traitement des globules rouges fantômes à la ficine en immunobuvardage de type

Western. Puits 1 : Globules rouges fantômes non traités à la ficine (30 µg). Puits 2 : Globules rouges fantômes

traités à la ficine (30 µg). 2A, AB, 2B, A, B : Portions extramembranaires des antigènes érythrocytaires des

glycophorine A (A) et glycophorine B (B). Anticorps primaire utilisé : Monoclonal Anti-Glycophorin A,B (α, δ)

(Sigma).

41

Le traitement des globules rouges fantômes à la ficine a été confirmé par

immunobuvardage. Comme le démontre la Figure 3.1, le traitement enzymatique a

fonctionné puisque la majorité des épitopes reconnus par les anticorps anti-glycophorine A

et anti-glycophorine B ont disparu. Ainsi, ces globules rouges fantômes ont pu être utilisés

parallèlement avec ceux non traités à la ficine.

3.2.2. Coloration de gels SDS-PAGE et envoi de bandes en spectrométrie de masse

Les motifs de migration des gels colorés au SYPRO® Ruby ont été observés, puis

comparés (Figures 3.2. et 3.3.). Le but était d’identifier des bandes différentes entre les

puits contenant les globules rouges fantômes PEL+ et celui contenant les globules rouges

fantômes PEL-. Dans un premier gel, cinq bandes ont été identifiées. Comme le démontre

la Figure 3.2., les bandes 1 et 3 présentes dans les puits contenant les globules rouges

fantômes PEL+ sont, bien qu’à la même masse moléculaire, beaucoup plus intenses que

la bande 2 retrouvée dans le puits contenant les globules rouges fantômes PEL- et qui se

trouve à la même position, soit à un peu moins de 25 kDa. Comme il était prévu au départ,

les globules rouges fantômes PEL+ traités à la ficine (puits C) montrent deux bandes qui

sont absentes des puits A et B. En tenant compte du fait qu’il pouvait s’agir de protéines

de plus faible abondance qui pourraient être masquées dans le puits A, les bandes 4 et 5

ont été découpées et envoyées pour être analysées en spectrométrie de masse.

42

Figure 3.2. : Premier gel de polyacrylamide (12%) qui a permis l'envoi de bandes en spectrométrie de masse.

Puits A : Globules rouges fantômes PEL+ non traités à la ficine (20 µg). Puits B : Globules rouges fantômes

PEL- non traités à la ficine (20 µg). Puits C : Globules rouges fantômes PEL+ traités à la ficine (20 µg). Bandes

1, 2, 3, 4 et 5 : Bandes découpées et envoyées en spectrométrie de masse. Colorant utilisé : SYPRO® Ruby.

Les résultats obtenus en spectrométrie de masse n’ont pas permis de cibler de manière

spécifique une protéine qui pourrait être la base moléculaire de l’antigène PEL.

Cependant, certaines protéines étant la base moléculaire de certains groupes sanguins

ont été identifiées : la glycoprotéine CD44 du groupe sanguin Indian, le transporteur d’ATP

ABCB6 du groupe sanguin Langereis, la protéine CD55 du groupe sanguin Cromer et

celle ERMAP du groupe sanguin Scianna. À la lumière de ces résultats et considérant que

l’antigène PEL pourrait aussi être le résultat d’une mutation dans une protéine déjà

identifiée comme étant la base moléculaire d’un groupe sanguin, les ARNm de ces

protéines ont été ciblés pour être séquencés et analysés.

Lors d’un deuxième essai d’électrophorèse SDS-PAGE effectué dans les mêmes

conditions, d’autres protéines ont pu être identifiées (Figure 3.3.). Comme le démontre la

figure, les protéines identifiées sont toutes différentes de celles identifiées dans le gel

précédent. Les bandes A et C semblent être identiques dans les puits 1 et 3 contenant les

43

globules rouges fantômes PEL+. Cependant, la bande D identifiée dans le puits 2

contenant les globules rouges fantômes PEL- est plus intense et il n’y a aucune bande ni

au-dessus ni en dessous, contrairement aux bandes A et C. Pour ces raisons, elles ont

toutes été envoyées pour être analysées en spectrométrie de masse. Finalement, la

bande B a été découpée puisqu’elle semblait être plus intense dans les puits 1 et 3 que

dans le puits 2.

Figure 3.3. : Deuxième gel de polyacrylamide (12%) qui a permis l'envoi de bandes en spectrométrie de

masse. Puits 1 : Globules rouges fantômes PEL+ non traités à la ficine (20 µg). Puits 2 : Globules rouges

fantômes PEL- non traités à la ficine (20 µg). Puits 3 : Globules rouges fantômes PEL+ traités à la ficine

(20 µg). Bandes A, B, C et D : Bandes découpées et envoyées en spectrométrie de masse. Colorant utilisé :

SYPRO® Ruby.

Tout comme lors du premier essai, les résultats obtenus en spectrométrie de masse n’ont

pas permis d’identifier spécifiquement une protéine candidate à porter l’antigène PEL. Les

motifs de migration observés, différents lors de chaque essai, étaient probablement dus à

la variabilité de l’abondance des protéines trouvées dans chacun des aliquots

d’échantillons. À la suite des résultats obtenus pour la coloration des gels de

polyacrylamide, une autre approche a été tentée.

44

3.2.3. Envoi des globules rouges fantômes PEL+ et PEL- en solution pour être

analysés en spectrométrie de masse

Afin d’avoir une idée du protéome complet des globules rouges fantômes PEL+ et PEL-,

ceux-ci ont été envoyés directement en solution pour être analysés en spectrométrie de

masse. Le nombre de protéines identifiées était d’environ 80 pour chaque échantillon.

Après une analyse approfondie de chaque protéine identifiée, seules celles qui avaient

une composante membranaire et qui étaient exprimées intrinsèquement sur les globules

rouges ont été considérées. Après la comparaison des protéines identifiées dans les

globules rouges fantômes PEL+ versus celles identifiées dans les globules rouges

fantômes PEL-, une seule protéine candidate est ressortie du lot : la flottilin-1. Cette

dernière était présente dans l’échantillon des globules rouges fantômes PEL- et absente

de celui des globules rouges fantômes PEL+. La flotillin-1 est une protéine membranaire

exprimée par plusieurs types de cellules et elle est impliquée dans la formation des

calvéoles au sein de ces mêmes cellules[36]. Malheureusement, l’analyse de la séquence

codante de son ARNm chez l’individu PEL- a permis d’éliminer la flotillin-1 des protéines

candidates à porter l’antigène PEL, car aucun polymorphisme n’a pu être identifié.

45

3.2.4. Purification des IgG totales du plasma PEL- par FPLC

L’efficacité de la purification des IgG totales du plasma contenant des anti-PEL a été

testée en carte-gel par le LRCS. Les résultats obtenus démontrent que la purification a été

efficace (Figure 3.4.). En fait, l’intensité de l’agglutination des anticorps anti-PEL sur les

globules rouges PEL+ dans les échantillons purifiés était la même que celle observée

avec le plasma, donc avant la purification. D’une part, le gel LISS fait référence au fait que

pour cet essai, les globules rouges PEL+ ont été traités préalablement dans la solution

LISS. D’autre part, le gel papaïne fait référence au fait que pour cet essai, les globules

rouges PEL+ ont été traités à la papaïne, une enzyme protéolytique qui clive les liens

disulfures entre les acides aminés basiques et aussi, entre les résidus leucine et

glycine[42].

46

Figure 3.4. : Test d'efficacité de la purification des IgG totales effectuée par FPLC. Méthode effectuée par le

LRCS selon les procédures standards en sérologie érythrocytaire. 2001 : Échantillon découlant du don de

plasma PEL- prélevé en 2001. 2008 : Échantillon découlant du don de plasma PEL- prélevé en 2008. Avant

purification : Utilisation directe du plasma PEL-. Après purification : Utilisation des IgG purifiées par FPLC. Le

volume de chaque échantillon testé était le même dans chaque colonne.

47

3.2.5. Séparation des IgG totales selon leur point isoélectrique par

chromatofocalisation

Les résultats de la séparation des IgG totales précédemment purifiées par FPLC sont

illustrés à la figure suivante. Les résultats obtenus démontrent que les IgG ont été éluées

majoritairement selon quatre points isoélectriques (Figure 3.5.). Ces derniers

correspondent à la valeur de l’axe des ordonnés à chaque maximum de la courbe. Il est à

noter que le premier maximum illustre l’élution de quelques IgG à pH 8,5, mais qu’il

contient surtout du tampon d’élution et que la hauteur de ce pic est caractéristique de la

méthode. En résumé, les IgG ont été éluées principalement à des pH variant de 8,5 à 6,5.

Les 8 fractions recueillies ont été envoyées au LRCS pour être testées en cartes-gel.

Figure 3.5. : Séparation des IgG totales préalablement purifiées par FPLC en huit fractions selon leur point

isoélectrique. Les huit fractions sont indiquées en rouge.

48

3.2.6. Tests d’agglutination sur les fractions d’IgG purifiées séparées par

chromatofocalisation

Les huit fractions obtenues lors de la chromatofocalisation ont été testées en carte-gel par

le LRCS dans le but de voir si les anticorps anti-PEL n’auraient pas été isolés à un pI

particulier. Les résultats des tests d’agglutination sont montrés à la Figure 3.6. Il y a

présence d’agglutination pour toutes les fractions, sauf pour la dernière. De plus, le

nombre de globules rouges agglutinés est supérieur dans les fractions 0, 1 et 2. Pour ce

qui est des fractions 3 à 6, l’intensité de l’agglutination semble être la même. Ces résultats

démontrent que les anti-PEL n’ont pas été isolés spécifiquement selon un pI, mais qu’ils

sont plutôt répartis dans les sept premières fractions (fraction 0 à 6). Comme le nombre

d’anticorps anti-PEL isolés dans chaque fraction devrait être directement proportionnel à

l’intensité de la réaction d’agglutination, ce sont les fractions 0, 1 et 2 qui ont été utilisées

pour les immunobuvardages de type Western.

Figure 3.6. : Tests d’agglutination effectués en carte-gel pour les huit fractions obtenues lors de la

chromatofocalisation. La méthode a été effectuée par le LRCS selon les procédures standards en sérologie

érythrocytaire. Un volume égal de chaque fraction a été utilisé dans chaque colonne. La concentration en IgG

de chaque fraction est inconnue.

49


Le test de Coombs a été effectué sur des globules rouges PEL+ avec le plasma PEL-

précédemment déplété en anticorps anti-PEL. Un plasma négatif provenant d’un don de

sang total d’un individu de groupe AB+, dont le plasma ne contient pas d’anti-A, d’anti-B et

d’anti-D, a été utilisé comme contrôle négatif. En utilisant la méthode des tubes, les

résultats obtenus démontrent une agglutination de niveau 1+ pour les globules rouges

PEL+ mis en présence du plasma contenant des anti-PEL et aucune agglutination n’est

observée lorsque ces mêmes globules rouges sont mis en présence du plasma négatif.

3.2.8. Immunobuvardages de type Western

Bien que plusieurs échantillons biologiques aient été utilisés comme anticorps primaire

dans cette technique, aucune tentative n’a permis d’identifier un complexe immun

susceptible d’être lié à l’antigène PEL. Outre le bruit de fond important lors de l’utilisation

du plasma, les IgG purifiées par FPLC n’ont rien reconnu de manière spécifique. Des

immunobuvardages ont été effectués plusieurs fois avec les mêmes échantillons, avec

plusieurs anticorps primaires et secondaires différents et en conditions réductrices et non-

réductrices. Dans toutes les conditions testées, aucun résultat concluant n’a été obtenu,

comme le montre en exemple la Figure 3.7.

50

Figure 3.7. : Exemple d'immunobuvardage de type Western effectué avec les fractions 0 et 1 d'IgG purifiées

par chromatofocalisation. Fraction 0 : Première fraction recueillie lors de la chromatofocalisation qui a été

utilisée comme anticorps primaire. Fraction 1 : Deuxième fraction recueillie lors de la chromatofocalisation qui

a été utilisée comme anticorps primaire. Marqueur : Precision Plus Protein™ Dual Color Standards (Bio-Rad)

(10 µl). PEL+ non réduits et PEL- non réduits : Globules rouges fantômes PEL+ ou PEL-, déposés sur gel

sans avoir été bouillis et dont le tampon d’échantillon ne contient pas de DTT (20 µg). PEL+ réduits et PEL-

réduits : Globules rouges fantômes PEL+ ou PEL-, qui ont été bouillis avant d’être déposés sur gel et dont le

tampon d’échantillon contient du DTT.



Puisque les érythrocytes expriment tous les protéines CD55 et CD59 et que ces dernières

avaient été identifiées dans les échantillons PEL+ et PEL- lors des analyses en

spectrométrie de masse, CD55 et CD59 ont été ciblées pour être candidates à porter

l’antigène PEL. Les résultats obtenus à la suite des immunobuvardages étaient identiques

dans les deux conditions testées, soit en conditions réductrices et non-réductrices. En fait,

aucune des deux protéines CD55 et CD59 n’a été reconnue de manière spécifique, que ce

51

soit dans les échantillons de globules rouges fantômes PEL+ ou dans ceux PEL- (résultats

non montrés).

4. Discussion


Les résultats obtenus lors des analyses génomiques n’ont malheureusement pas permis

d’identifier une quelconque mutation qui aurait pu expliquer la présence de l’antigène PEL.

Cependant, ces résultats n’écartent pas la possibilité que l’antigène PEL soit la

conséquence d’une mutation dans une protéine déjà associée à un groupe sanguin. En

fait, certaines mutations situées ailleurs que dans les exons, notamment dans les

promoteurs des gènes, peuvent indirectement affecter la reconnaissance d’un antigène

exprimé par une protéine. En fait, les promoteurs des gènes sont des séquences très

conservées qui régulent l’expression des gènes par la liaison à des facteurs de

transcription[43]. Les SNP présents dans ces régions conservées diminuent l’activité

transcriptionnelle des gènes et la quantité d’ARNm est en corrélation directe avec la

sévérité du phénotype et dépend du type de séquence qui a été mutée, ainsi que de sa

position par rapport au codon d’initiation[43]. Ainsi, les SNP retrouvés dans les promoteurs

des gènes peuvent amener certaines protéines à être produites en très faible quantité, ce

qui a un impact direct sur la reconnaissance de l’antigène par les anticorps. Aussi, des

mutations sont possibles dans les introns des gènes. En fait, les introns commencent et se

terminent par des sites d’épissage contenant des séquences GT et AG respectivement[44].

Des mutations dans ces sites d’épissage peuvent provoquer, d’une part, une diminution de

la reconnaissance des exons, ce qui peut entraîner la perte de cet exon dans l’ARNm

final, ou d’autre part, produire de nouveaux sites d’épissage et ainsi, incorporer de

nouveaux nucléotides aux exons, donnant ainsi des pseudos-exons[44]. Par exemple,

l’antigène Del résulte de la mutation 1226G>A qui entraîne de nouveaux transcrits

d’ARNm auxquels est ajoutée une séquence de 170 paires de bases provenant de

l’intron 7 du gène RHD[45].

52

Dans le cadre de ce projet de recherche, c’est seulement la partie codante des ARNm qui

a été séquencée et analysée. Bien qu’aucune mutation non répertoriée n’ait été identifiée

de manière spécifique chez les individus PEL-, certaines ont été identifiées chez les trois

individus d’origine québécoise. Il est possible que ces mutations soient de nouveaux

variants, sachant que plusieurs d’entre eux sont spécifiques à certaines populations.

Cependant, pour prouver la présence de nouveaux variants au sein de la population

québécoise, l’analyse de la séquence d’ARNm provenant d’individus PEL- et PEL+ de

différentes origines sera nécessaire.

Dans le cadre de ce projet, les études protéomiques effectuées laissent croire que les

anticorps anti-PEL peuvent reconnaître plusieurs épitopes sur une seule protéine, ou

encore un épitope formé de plusieurs protéines assemblées sous forme de complexe,

comme c’est le cas avec les protéines du groupe sanguin Rh. En fait, l’assemblage des

protéines RhD, RhCE et celui de la glycoprotéine RhAG sous forme de complexe dans la

membrane plasmique des globules rouges semble être essentielle à l’expression des

antigènes du groupe sanguin Rh[7]. Le complexe formé est un tétramère composé de deux

molécules RhAG et de deux molécules RhD ou RhCE stabilisées par l’association des

domaines N- et C-terminal[7]. Étant donné que l’analyse des complexes protéiques dans

leur forme native est une tâche ardue, les analyses génomiques ont plutôt été effectuées

en fonction de l’hypothèse qui veut que les anticorps anti-PEL reconnaissent une protéine

déjà identifiée comme étant la base moléculaire d’un groupe sanguin, mais qui aurait subi

des modifications dans la séquence codante de l’ARNm. Ainsi, la protéine codée lors de la

traduction présenterait au moins un épitope différent qui pourrait être la cible des anticorps

anti-PEL. À la suite de la comparaison des séquences codantes des individus PEL- avec

ceux PEL+, il a été observé qu’aucune mutation n’est susceptible d’être liée à l’antigène

PEL. Comme il a été mentionné précédemment, les effets des SNP sur la structure de la

protéine dépendent de la nature des acides aminés touchés, ainsi que de leur position au

sein de la protéine. La décision d’analyser seulement la séquence codante des ARNm a

été prise principalement en fonction du temps alloué pour compléter le projet de

recherche. En fait, bien que les séquences des promoteurs et des introns auraient pu être

analysées, il aurait été beaucoup trop long de séquencer entièrement chaque gène. Tout

de même, l’analyse de la séquence codante des ARNm a permis d’identifier les mutations

potentielles qui pourraient avoir un impact direct sur la structure des protéines codées par

53

ces ARNm. Une fois de plus, les résultats provenant des analyses génomiques n’illustrent

pas les modifications post-traductionnelles possibles chez la potentielle protéine porteuse

de l’antigène PEL.


4.2.1. La purification des anticorps anti-PEL du plasma

Diverses méthodes ont été employées pour purifier et isoler les anticorps anti-PEL

provenant du plasma de l’individu PEL- : l’adsorption-élution, la purification des IgG totales

par FPLC, la chromatofocalisation et les immunoprécipitations, avec et sans crosslinking.

Le but premier de purifier les anticorps anti-PEL du plasma était de procéder à des

immunobuvardages de type Western plus spécifiques que ceux effectués en utilisant le

plasma comme anticorps primaire. Le problème rencontré avec l’utilisation du plasma

comme anticorps primaire était un bruit de fond trop important sur les films lors de la

révélation. Même en diluant davantage le plasma et l’anticorps secondaire, le bruit de fond

demeurait problématique. Ce résultat s’explique par le fait que le plasma contient

beaucoup de molécules autres que les IgG et que celles-ci peuvent se fixer de manière

non spécifique à certaines protéines ou autres molécules présentes à la surface des

globules rouges fantômes.

Tous les échantillons résultant des techniques de purification des anticorps anti-PEL ont

été testés en cartes-gel par le LRCS pour en observer l’agglutination et ainsi, pour

déterminer l’efficacité de chacune de ces techniques. Dans ce cas-ci, les tests

d’agglutination étaient la meilleure technique envisageable, étant donné que c’est

seulement par ce principe qu’il est possible d’observer la présence des anticorps anti-PEL,

lorsque ceux-ci se fixent à l’antigène PEL.


Dans le cadre de la méthode d’adsorption-élution, les tests d’agglutination ont été faits en

tubes et analysés au microscope. Bien que la méthode en tubes soit encore utilisée dans

54

les laboratoires de sérologie érythrocytaire, la méthode en cartes-gel permet une

interprétation des résultats beaucoup plus facile. Contrairement à l’autre méthode, elle

n’est pas dépendante de la force appliquée par l’expérimentateur lorsqu’il brasse les

tubes. S’ils sont brassés trop vigoureusement, les globules rouges agglutinés peuvent se

séparer les uns des autres et le résultat peut être faussé.

Le résultat d’agglutination de 1+ obtenu lors du premier test de Coombs démontre que les

anticorps anti-PEL ont bel et bien été fixés sur les globules rouges PEL+. Par contre, le

résultat obtenu à la suite du test d’agglutination effectué avec l’éluat final s’est avéré

négatif. Une cause probable qui pourrait expliquer ce résultat est que le protocole

d’adsorption-élution nécessite une élution acide. Bien que l’éluat d’anti-PEL soit neutralisé

tout de suite après l’élution et non en temps réel comme lors de l’élution en FPLC, il n’en

demeure pas moins que les anticorps ont pu être dénaturés en présence de l’acide. Ainsi,

la dénaturation des anti-PEL empêcherait toute forme d’agglutination avec l’antigène. Une

autre cause possible à ce résultat est que la durée de l’incubation des globules rouges

PEL+ avec l’éluat final n’était peut-être pas assez longue. La période de temps pendant

laquelle l’agglutination se produit peut varier en fonction des anticorps et des antigènes

impliqués dans la réaction. Ainsi, l’incubation de 15 minutes à 37ºC n’était peut-être pas

suffisante pour permettre aux anti-PEL de se fixer à l’antigène. Aussi, le ratio entre le

nombre d'anticorps présents dans l’éluat et le nombre de sites antigéniques présents à la

surface des globules rouges sont tous les deux inconnus. Ainsi, il se peut que

l’agglutination n’ait pas pu avoir lieu ou qu’elle ait été tellement faible qu’elle n’a pas pu

être observée au microscope. En effet, le protocole demande de secouer légèrement les

tubes avant d’observer le résultat d’agglutination. Cependant, des globules rouges

agglutinés très faiblement auraient pu être séparés à la suite du mouvement des tubes.

L’intensité d’agglutination observée de 1+ est faible, considérant qu’un résultat de 3+ avait

été obtenu avec les mêmes échantillons cinq ans auparavant. Le résultat de 1+ peut aussi

s’expliquer par la durée de congélation des échantillons, soit douze ans et cinq ans. Même

si les échantillons sont congelés à -80ºC et que ces conditions sont propices à leur

conservation, la structure des anticorps du plasma a pu être altérée durant toutes ces

années. Ainsi, la spécificité de la liaison entre les anticorps anti-PEL et l’antigène peut être

diminuée, ce qui pourrait expliquer les résultats obtenus. Puisque ces échantillons de

55

plasma étaient les seuls échantillons disponibles, l’éluat final provenant de l’adsorption-

élution a quand même été utilisé comme anticorps primaire pour les immunobuvardages

de type Western.

4.2.3. Les immunobuvardages de type Western

Les immunobuvardages de type Western ont été effectués avec plusieurs préparations

biologiques contenant des anti-PEL. Ces dernières ont été utilisées comme anticorps

primaire.

Le premier anticorps primaire testé a été le plasma congelé provenant d’un individu PEL-.

Les deux échantillons de plasma disponibles ont été prélevés chez le même individu, mais

à des temps différents, soit en 2001 et en 2008. Les deux échantillons de plasma ont été

testés comme anticorps primaire et les résultats obtenus n’ont pas été satisfaisants. Bien

qu’il n’ait pas été possible de détecter un complexe immun, le bruit de fond présent sur les

films à la suite de la révélation était trop important pour tirer une conclusion. Bien qu’aucun

complexe immun n’ait été reconnu spécifiquement par les anti-PEL présents dans le

plasma, le bruit de fond était un obstacle majeur.

Le deuxième anticorps primaire testé a été les IgG totales purifiées du plasma par FPLC.

L’efficacité de la purification a été testée en cartes-gel. Comme le démontrent les résultats

obtenus, les IgG purifiées par FPLC avaient la même force d’agglutination que le plasma.

Finalement, les anticorps secondaires étaient tous couplés à une peroxydase, mais ils

différaient à reconnaître certaines parties des anticorps. Les parties reconnues étaient soit

les chaînes légère et lourde, le fragment Fc ou les fragments F(ab). L’utilisation d’une

gamme différente d’anticorps secondaire, en parallèle avec le même anticorps primaire,

donnait comme avantage de cibler la spécificité des anticorps anti-PEL lorsqu’ils étaient

fixés à l’antigène.

Les raisons pouvant expliquer le manque de résultats concluants sont multiples. Tout

d’abord, les plasmas contenant les anticorps anti-PEL avaient été congelés en 2001 et en

2008. Bien qu’ils aient été conservés à -80°C tout ce temps, il n’y a aucune information

56

disponible à propos du titre de l’anticorps. En fait, la proportion d’anticorps polyclonaux

anti-PEL présents dans le plasma est peut-être trop faible pour qu’il soit possible de

percevoir un signal lors des immunobuvardages.



Dans le cas des protéines CD55 et CD59, celles qui ont été ciblées avec des anticorps

monoclonaux spécifiques, les résultats obtenus sont difficiles à interpréter. Les protéines

CD55 et CD59 avaient été identifiées lors des analyses en spectrométrie de masse.

L’absence de reconnaissance des deux protéines dans les échantillons de globules

rouges fantômes est surprenante[36]. En fait, bien que tous les globules rouges expriment

ces deux protéines, il est possible que leur structure tridimensionnelle ait été modifiée lors

de la préparation des globules rouges fantômes. L’anticorps anti-CD55 a été utilisé contre

les globules rouges fantômes selon un protocole déjà publié, donc il s’agissait d’un

anticorps qui avait déjà été testé avec ce type de cellules. D’une part, l’efficacité de

l’anticorps anti-CD55 a été confirmée en utilisant ce dernier pour cibler d’autres types de

cellules, par exemple des cellules HeLa, qui sont connues pour exprimer la protéine

CD55. D’autre part, l’anticorps anti-CD59 n’a pas été testé avec les autres types de

cellules. Les résultats obtenus lors des différents essais et le fait que la séquence codante

de l’ARNm de la protéine CD59 avait été analysée ont été la raison de l’abandon de la

mise au point des immunobuvardages ciblant cette protéine. Il en a été de même pour la

protéine CD55.

Plusieurs essais ont été effectués avec les deux anticorps et les résultats ont été les

mêmes à chaque fois. L’hypothèse la plus probable est que les globules rouges fantômes

aient subi d’importantes modifications au sein de leur membrane plasmique lors de leur

préparation, ce qui aurait entraîné plusieurs changements dans la structure de certaines

protéines membranaires, dont CD55 et CD59. En fait, la procédure implique plusieurs

inversions de la membrane, ce qui aurait pu entraîner l’exposition des protéines

membranaires du côté cytoplasmique.

57

4.2.5. Les immunoprécipitations avec et sans crosslinking

Tout d’abord, la première immunoprécipitation a été envisagée pour tenter d’isoler

l’antigène PEL. L’accès à des anticorps anti-PEL et des globules rouges PEL+ étaient les

réactifs nécessaires pour procéder à cette méthode. Bien que plusieurs protocoles soient

disponibles pour effectuer ce type d’expérience, celui décrit en conditions non

dénaturantes cadrait mieux dans ce projet. Ces conditions permettaient de préserver le

plus possible l’intégrité de l’antigène, ainsi que celle des anticorps.

Les résultats obtenus à la suite de l’analyse en spectrométrie de masse ont permis de

cibler une protéine en particulier, la flottilin-1. Malheureusement, la séquence de l’individu

PEL- ne différait en rien de la séquence normale. Ainsi, la flottilin-1 a pu être éliminée de

la liste des protéines candidates.

L’immunoprécipitation avec crosslinking a été envisagée dans le but de lier de manière

covalente les anticorps anti-PEL à l’antigène PEL. En fait, lors d’une immunoprécipitation

classique, lorsque la liaison antigène-anticorps n’est pas très solide, les lavages qui

précèdent l’élution finale peuvent faire décrocher l’antigène lié aux anticorps spécifiques,

qui eux sont liés au support utilisé, donc aux billes de protéine G dans ce cas-ci. Puisque

les liaisons covalentes sont plus puissantes que celles normalement impliquées dans les

liaisons antigène-anticorps, en créer une entre les anticorps PEL et l’antigène aurait dû

avoir comme effet d’augmenter les chances de capter l’antigène PEL lors de

l’immunoprécipitation, et ainsi de pouvoir le détecter lors des analyses subséquentes en

spectrométrie de masse. Les résultats obtenus à la suite de l’immunoprécipitation avec

crosslinking n’ont pas comblé les attentes. En fait, aucune protéine n’a été identifiée

comme étant susceptible d’être la base moléculaire de l’antigène PEL. Ces résultats

peuvent démontrer qu’une liaison covalente ne s’est pas formée entre les anticorps et

l’antigène. Sinon, ils peuvent laisser un indice à propos du fait que la base moléculaire de

l’antigène PEL n’est peut-être pas une protéine.

58

4.2.6. Les analyses en spectrométrie de masse

Dans la découverte de nouvelles protéines, la spectrométrie de masse s’avère souvent

l’étape ultime[46]. Dans le cadre de ce projet de recherche, cette technique a été utilisée

maintes fois. Puisque la spectrométrie de masse permet d’identifier une quantité

importante de protéines dans un seul échantillon et que certaines peuvent provenir de

contaminants, les protéines potentielles à porter l’antigène PEL devaient avoir une

composante membranaire et être exprimées à la surface des érythrocytes.

La spectrométrie de masse a été utilisée notamment lorsque des bandes susceptibles de

contenir l’antigène PEL ont été découpées dans les gels de polyacrylamide. Cette

approche a été la première à être employée. Il s’agissait de comparer les motifs de

migration des globules rouges fantômes PEL+ traités ou non à la ficine et les globules

rouges fantômes PEL-. Les bandes qui différaient dans l’un ou l’autre des échantillons

étaient découpées, puis envoyées en spectrométrie de masse pour identifier les protéines

qu’elles contenaient. Évidemment, cette technique a été la première à être employée

parce qu’elle est très limitée. Étant donné que la quantité de globules rouges fantômes

déposée sur gel était d’environ 20 μg, il est possible que, à cause de sa faible abondance,

que la protéine portant l’antigène PEL ne soit pas identifiable à l’œil nu. En fait, la quantité

de bandes qu’il est possible de voir sur un gel d’acrylamide est inférieure au nombre de

protéines totales contenues dans la membrane plasmique des globules rouges. De plus,

parce que les globules rouges fantômes sont des globules rouges dont la membrane est

percée à plusieurs endroits, les protéines exposées sur gel ne sont pas seulement des

protéines membranaires. En fait, lors de la préparation des globules rouges fantômes, les

trous faits dans la membrane plasmique pour évacuer l’hémoglobine des cellules amènent

l’inversion de la membrane plasmique à certains endroits, exposant ainsi des protéines

intracellulaires à la surface de la membrane[33]. Ces dernières sont considérées comme

des contaminants dans ce cas-ci, puisqu’il est impossible que l’une de ces protéines soit la

base moléculaire de l’antigène PEL. Ce propos découle du fait que les réactions antigène-

anticorps font intervenir seulement des protéines qui ont une composante extracellulaire.

Pour contrer cette limite et dans le but d’avoir une idée du protéome complet d’un globule

rouge transformé en globule rouge fantôme, des globules rouges fantômes PEL+ et PEL-

en solution ont été envoyés tels quels pour être analysés en spectrométrie de masse.

59

Aussi, les résultats des immunoprécipitations ont été envoyés intégralement en

spectrométrie de masse. Dans tous les cas sauf un, aucune protéine susceptible de porter

l’antigène PEL n’a été identifiée. Cependant, comme il a été mentionné précédemment,

l’analyse génomique de la flottilin-1 a permis de l’éliminer de la liste des protéines

candidates.

Finalement, les résultats non concluants obtenus en spectrométrie de masse sont peut-

être causés par le fait qu’avant qu’elles soient détectées par l’appareil, les protéines

contenues dans un échantillon doivent être coupées en peptides par l’action de la trypsine.

La trypsine est une enzyme qui clive les chaînes d’acides aminés après les résidus lysine

et arginine[47]. Puisqu’elle permet de former plusieurs peptides à partir d’une protéine, c’est

l’enzyme qui est la plus utilisée en spectrométrie de masse. Cependant, dans le cas de

l’antigène PEL, il est possible que ce dernier soit résistant au traitement enzymatique par

la trypsine. Notamment, c’est ce qui s’est produit lors de la découverte de la base

moléculaire de l’antigène Vel du groupe sanguin du même nom, la protéine SMIM1.

L. Arnaud et collaborateurs ont démontré que les peptides présents dans SMIM1 étaient

très résistants à la trypsine lors des analyses en spectrométrie de masse[48]. Ainsi, en

faisant digérer la protéine reconnue de manière spécifique par immunobuvardage avec la

chymotrypsine plutôt que la trypsine, ils ont obtenu des résultats concluants[48]. S’il s’avère

que c’est ce qui se produit avec l’antigène PEL, il est normal qu’aucun peptide n’ait été

détecté lors des analyses en spectrométrie de masse. Cependant, étant donné les coûts

de ces analyses et les résultats peu satisfaisants obtenus avec les autres enzymes selon

les spécialistes de la plate-forme, aucune autre enzyme que la trypsine n’a été testée

dans le cadre de ce projet.

4.2.7. Électrophorèses IEF

Dans le but d’identifier la base moléculaire de l’antigène PEL, d’autres méthodes de

protéomique ont été testées. Les résultats obtenus à la suite de ces méthodes ne sont pas

présentés dans les résultats.

60

À la suite des électrophorèses SDS-PAGE et de l’envoi de bandes de gels en

spectrométrie de masse, des électrophorèses IEF ont été tentées. Cette méthode permet

de séparer les protéines selon leur point isoélectrique. Dans le cadre de ce projet, la

migration des globules rouges fantômes à travers le gel n’était pas optimale et de plus, il

n’était pas possible de tirer une quelconque conclusion quant aux résultats obtenus.

L’électrophorèse IEF est plus efficace lorsque les échantillons à séparer sont des

protéines purifiées. Dans ce cas-ci, puisque le but était d’identifier la base moléculaire de

l’antigène PEL, il n’était pas possible d’utiliser des échantillons qui avaient un taux de

pureté aussi élevé. Puisque les résultats obtenus n’étaient pas concluants, les

électrophorèses IEF ont été abandonnées après quelques tentatives.

4.2.8. Électrophorèses en deux dimensions (2D)

L’électrophorèse en deux dimensions est en fait deux électrophorèses effectuées l’une à

la suite de l’autre. Il s’agit d’une électrophorèse IEF suivie d’une électrophorèse SDS-

PAGE. Donc, tout comme les deux méthodes employées séparément, l’électrophorèse en

2D permet de séparer les protéines, d’une part selon leur point isoélectrique et d’autre

part, selon leur masse moléculaire. Contrairement aux deux électrophorèses effectuées

séparément, cette méthode permet la visualisation d’une plus grande quantité de

protéines sur un seul gel. Cependant, comme le nombre de protéines présentes au sein

du protéome du globule rouge a été chiffré à 2289 récemment, il demeure impossible de

toutes les voir sur un seul gel[49]. Malgré ce fait, l’électrophorèse en 2D est, à ce jour,

encore utilisée pour visualiser en entier le protéome des globules rouges[40, 46].

Dans le cadre de ce projet de recherche, quelques tentatives infructueuses ont été faites.

L’équipement disponible pour effectuer les gels 2D a été le principal obstacle à l’obtention

de résultats concluants. La première électrophorèse, l’IEF, était effectuée dans des

capillaires de gel. Ensuite, ces capillaires devaient être coupés aux extrémités pour que

les carottes de gel puissent migrer dans le puits du gel d’électrophorèse SDS-PAGE.

Cette méthode n’est plus la méthode employée. Maintenant, les électrophorèses en 2D

sont faites en bandes, de manière à ce qu’aucune protéine ne soit perdue lors du

changement de type d’électrophorèse.

61

5. Conclusion

Bien que la base moléculaire de l’antigène PEL n’ait pas été élucidée, ces travaux de

maîtrise ont permis de toucher à un grand nombre de méthodes d’analyses différentes,

que ce soit en biochimie, en biologie moléculaire ou en protéomique. Étant donné les

types d’échantillons PEL- disponibles et leur nombre, des études génomiques, effectuées

en parallèle de nouvelles études protéomiques, restent la voie à suivre pour découvrir la

base moléculaire de l’antigène PEL. Actuellement, l’obstacle principal à cette découverte

est l’absence d’un anticorps monoclonal spécifique à l’antigène PEL. La création de cet

anticorps nécessiterait d’abord l’isolement de plasmocytes qui sécrètent l’antigène PEL

chez un individu PEL-. Cependant, dans le cadre de ce projet de maîtrise, l’accès à ces

cellules était impossible et le temps alloué était un facteur limitant.

Au final, la découverte de la base moléculaire de l’antigène PEL pourrait permettre le

développement d’un test de génotypage sanguin automatisé et l’élaboration d’une banque

de donneurs PEL-, qui sont répertoriés au nombre d’environ dix à ce jour au Québec. De

ce fait, les individus connus comme étant PEL- doivent faire des dons autologues pour

être en mesure d’être transfusé éventuellement.

L’analyse des séquences codantes des divers ARNm a permis, du moins en ce qui a trait

aux protéines déjà liées à un groupe sanguin, d’éliminer plusieurs d’entre elles qui étaient

candidates à porter l’antigène PEL. Cependant, les analyses génomiques effectuées dans

le cadre de ce projet ne sont que la pointe de l’iceberg, étant donné que certaines

mutations peuvent se trouver aussi bien dans les promoteurs des gènes que dans les

introns. De plus, certaines protéines subissent des modifications post-traductionnelles.

Outre toutes les modifications possibles d’une protéine déjà associée à un groupe

sanguin, il est aussi probable que l’antigène PEL soit porté par une protéine membranaire

qui est totalement inconnue à ce jour.

Les résultats obtenus tout au long de ce projet de maîtrise démontrent la difficulté

d’effectuer des études protéomiques, en particulier lorsque très peu de renseignements

sont disponibles à propos de la molécule recherchée, qui était, selon l’hypothèse, une

protéine dans ce cas-ci.

62

Plusieurs méthodes différentes ont été testées, mais toujours avec les mêmes échantillons

et il n’a pas été possible d’identifier un quelconque complexe immun et ce, avec tous les

échantillons biologiques disponibles contenant des anticorps anti-PEL. Il serait primordial

de reprendre les immunobuvardages de type Western avec comme anticorps primaire,

des IgG totales purifiées du plasma d’un individu qui montre un titre d’anticorps élevé par

rapport aux anticorps anti-PEL. Aussi, la mise au point de la technique qui permet de

visualiser la liaison de l’antigène PEL avec les anticorps anti-PEL en cytométrie en flux

pourrait permettre d’identifier l’isotype d’immunoglobuline des anticorps. Cependant, la

création d’un anticorps monoclonal serait ce qui permettrait d’obtenir le plus d’indices par

rapport à ce qu’est la base moléculaire de l’antigène PEL.

Finalement, la découverte de la base moléculaire des antigènes érythrocytaires sera

toujours d’une importance capitale en médecine transfusionnelle puisqu’elle est à la base

du génotypage sanguin. En constante évolution depuis quelques années, cette méthode

permet entre autres d’expliquer plusieurs cas complexes rencontrés en sérologie

érythrocytaire. De plus, le génotypage de masse permet d’identifier les variants au sein

des différentes populations et de créer des banques de donneurs de sang rare. Ainsi, il

devient possible de fournir efficacement les diverses populations qui, partout dans le

monde, sont de plus en plus multiculturelles.

63

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66

Annexe I

Tableau A.1. : Paramètres utilisés pour l'amplification RT-PCR des ARNm des protéines ciblées.

Tm des amorces Amorce sens Amorce anti-sens Taille du fragment

(°C) 5'→3' 5'→3' (pb)

Aquaporine -1 Colton CO 1* 55 AGCATGGCCAGCGAGTTCAA GTGTCTACAGTATGGATTTCAC 897

1 55 ATGGAGGAGCTGCAGGATGA GGATGAGCCAGAAGCCGATC 1494

2 55 CATCTACTTTGCTGCACTGT ATGGCCACTTCGTCGTATTC 1474

CD47 CD47 1 60 GTCCTGCCTGTAACGGCGGC CCCCAACAGTGAATCATCAAGGCCA 972

CD55 Cromer CROM 1 57 CCACGAGGCTTCTGCTTACT ATGTGATTCCAGGACTGCCTT 1429

CD59 CD59 1 57 GAGGCTGGAAGAGGATCTTGG GCTGCAGAGAACCCACTCAA 908

CD147 (Oka) OK OK 1 61 AATCATGGCGGCTGCGCTGT GTGCTGCCCGCTGCTCTTCA 769

1 59 TTTCCTGGACCCCAGTCCTCC GTCTGAGGGGACCAGTCCCTG 588

2* 59 AGATAGACAGATGGAAGGTG CTGTGGCATCTTTGGTAACC 2232

Ce RH RHCE 1 65/60† CACAGGATGAGCTCTAAGTAC CAAATCTGTCTCTGACCTTGTTTC 1398

D RH RHD 1 55 CACAGGATGAGCTCTAAGTAC TAAATGGTGAGATTCTCCTC 1446

ERMAP Scianna SC 1 63,5 ATGCGCTTGCCTGCTCCCTG GGTTGGGCCAGGCGACTGAA 1611

FLOT-1 FLOT1 1 57 AGGAAAGCTGGTCTGCGAG CCCCTTCAAGACAAGGCACA 1558

1 55 CAATGCATCGCCGGAGACTGG[50] GGTCAGCTCCTCAGGCAGCTG[50] 1046

2 59 GCGAGGGGACAGCCTCATCCG GACAGGGCTGGTCTGCACGC 1202

GLUT-1 SLC2A1 1 55 AGCCCAGCAGCAAGAAGCTG TGCTCCTGAGAGATCCTTAG 1533

Glycophorine A MNS GYPA 1 54 CTCATGATCTCAGGATGTAT TGCTCCTGAGAGATCCTTAG 482

Glycophorine B MNS GYPB 1 64/55† CTCATGATCTCAGGATGTAT AAGATCAGGCAGCATGCAG 276

RhAG RHAG RHAG 1 60 GCCTGTGAAGCTCTCAGTGTGCC GGTTCCAGCTGGCTGTGGTCA 1298

SLC14A1 Kidd SLC14A1 1 64 CCACTGCCTTCTGCTGCCAGG GGGAGGGTGAAGACGGGGAGG 816

XK Kx XK 1 55 TTCGTGGCCGAGACAACGGC GTGATGCCTTGGGTTGCCCC 1511

SMIM1 Vel SMIM1 1 62 GGAATTCTCGCTTGGTCCC AGAGAGGAGGCTGTAGCTG 1155

*Le fragment a nécessité une PCR supplémentaire.†Contraitement aux autres qui ont 40 cycles pour chaque température, la première température est pendant 10 cycles et la deuxième, 30 cycles.

CD238 Kell KEL

GBGT1 Forssman GBGT1

Protéine Groupe sanguin Gène Fragment(s)

Bande 3 Diego DI

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Tableau A.2. : SNP identifiés à la suite du séquençage des ARNm de différentes protéines membranaires érythrocytaires.

Position Base* A.a. codé(s) Commentaire Position Base* A.a. codé(s) Commentaire Position Base* A.a. codé(s) Commentaire

Colton Aquaporine-1 494 G/G (Ho) Gly 494 G/G (Ho) Glycine 494 G/A (Hé) Gly/Asp

Kx Kx x x x I.S.N. x x x I.S.N. x x x s/o

Kidd Jk 475 A/A (Ho) Ile N.R. 475 A/G (Hé) Ile/Val N.R. 475 A/A (Ho) Ile N.R.

568 G/G (Ho) Ala N.R. 568 G/T (Hé) Ala/Ser N.R. 568 G/G (Ho) Ala N.R.

588 A/G (Ho) Pro 588 A/G (Ho) Pro 588 A/G (Hé) Pro

688 G/G (Ho) Val N.R. 688 G/T (Hé) Val/Phe N.R. 688 G/G (Ho) Val N.R.

838 G/A (Hé) Asp/Asn 838 G/A (Ho) Asp/Asn 838 G/A (Hé) Asp/Asn

MNS GYPA 38 A/C (Ho) Glu/Ala N.R. 38 A/C (Ho) Glu/Ala N.R. 38 A/C (Ho) Glu/Ala N.R.

59 T/C (Hé) Leu/Ser 59 T/T (Ho) Leu 59 T/C (Hé) Leu/Ser

71 A/G (Hé) Glu/Gly 71 A/A (Ho) Glu 71 A/G (Hé) Glu/Gly

72 G/T (Hé) Glu/Asp 72 G/G (Ho) Glu 72 G/T (Hé) Glu/Asp

93 T/C (Ho) Thr N.R. 93 T/C (Ho) Thr N.R. 93 T/C (Ho) Thr N.R.

GYPB 143 C/T (Hé) Thr/Met 143 C/C (Ho) Thr 143 C/T (Hé) Thr/Met

251 C/G (Hé) Thr/Ser 251 C/G (Ho) Ser 251 C/G (Hé) Thr/Ser

Ok Oka 195 C/C (Ho) Asp 195 C/T (Hé) Asp N.R. 195 C/T (Hé) Asp N.R.

234 C/C (Ho) Ser 234 C/G (Hé) Ser N.R. 234 C/G (Hé) Ser N.R.

327 T/C (Hé) Ala 327 T/T (Ho) Ala 327 T/T (Ho) Ala

537 T/T (Ho) Asp 537 T/C (Ho) Asp N.R. 537 T/C (Ho) Asp N.R.

684 C/T (Hé) Ile 684 C/C (Ho) Ile 684 C/C (Ho) Ile

Rh CE x x x s/o 676 G/C (Hé) Ala/Pro x x x s/o

D 907 C/T (Hé) Leu

x CD47 100 A/G (Ho) Asn/Asp x x x I.S.N. x x x s/o

899 A/G (Ho) Gln/Arg

RhAG RhAG x x x I.S.N. x x x I.S.N. x x x s/o

Scianna ERMAP 54 C/C (Ho) Leu 54 C/T (Hé) Leu 54 C/C (Ho) Leu

76 C/C (Ho) His 76 C/T (Hé) His/Tyr 76 C/C (Ho) His

587 A/A (Ho) Asn 587 A/A (Ho) Asn 587 A/A (Ho) Asn

600 C/G (Ho) Asp/Glu N.R. 600 C/C (Ho) Asp 600 C/C (Ho) Asp

Cromer CD55 x x x I.S.N. x x x I.S.N. x x x s/o

x CD59 x x x I.S.N. x x x I.S.N. x x x s/o

x FLOT1 x x x I.S.N. x x x I.S.N. x x x s/o

Vel SMIM1 x x x I.S.N. x x x I.S.N. x x x s/o

Légende

A : adénine C : cytosine GYPA : glycophorine A Ile : isoleucine Phe : phénylalanine Thr : thréonine

Ala : alanine G : guanine GYPB : glycophorine B I.S.N. : identique à la séquence normale Pro : proline Tyr : tyrosine

Asn : asparagine Gln : glutamine Hé : hétérozygote Leu : leucine Ser : sérine Val : valine

Asp : aspartate Glu : glutamate His : histidine Met : méthionine s/o : messager non séquencé

A.R. : à reprendre Gly : glycine Ho : homozygote N.R. : non rapporté dans la littérature T : thymine

Individu contrôle (PEL+) Individu 2 (PEL-) Individu 3 (PEL-)Système sanguin Protéine

Documents

Identification de la base moléculaire de l'antigène ...€¦ · 1.3. Les globules rouges.....3 1.4. Les groupes sanguins ... Figure 1.3.: Illustration de la disposition de certaines