OUSSAMA RIYAD

Impact de l’IL-1 et du TGF- dans la régulation du

KGF-1 par les fibroblastes : importance dans

l’asthme.

Mémoire présenté

à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval

Dans le cadre du programme de maitrise en Médecine Expérimentale

pour l’obtention du grade de Maitre ès sciences (M.Sc.)

DÉPARTEMENT DE MÉDECINE

FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

2012

© Oussama Riyad, 2012

http://www.google.fr/url?sa=t&rct=j&q=%C3%A0+&source=web&cd=2&ved=0CDYQFjAB&url=http%3A%2F%2Fwww.google.fr%2Fabout%2F&ei=I750T_neMcqChQf3nuylBQ&usg=AFQjCNGhftriGOJ7wK8S1COcd8FpRtYtlw&cad=rja

Résumé

Le maintien de l’intégrité et de l’homéostasie tissulaire se fait via une régulation et une

interaction continue entre les cellules qui constituent le réseau tissulaire. La compréhension

des mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ces interactions à l’état normal ou

pathologique est essentielle. Dans l’asthme, la fonction des cellules épithéliales bronchique

peut être régulée par les fibroblastes adjacents via des voies autocrines et paracrines. Ceci

constitue l’unité trophique. Cette unité est réactivée dans l’asthme. Cette réactivation serait

impliquée dans le remaniement de la structure bronchique. L’objectif de ce projet était

d’étudier les mécanismes impliqués dans ces changements. Notre hypothèse était que dans

l’asthme, les changements dans la fonction et le phénotype des fibroblastes maintiennent

l’altération de la fonction épithéliale. Plus spécifiquement l’équilibre entre le tandem KGF-

1/TGF- constitue un facteur important dans le maintien de l’homéostasie épithéliale dans la

bronche et la rupture de cet équilibre est un facteur déterminant dans le remodelage

bronchique observé dans l’asthme. Le but de mon étude était d’évaluer la régulation du KGF-

1 par le couple IL1-/ TGF- dans les fibroblastes bronchique provenant de sujet asthmatique

léger et de sujet contrôle sain.

Oussama Riyad

Candidat M. Sc.

Jamila Chakir Ph.D.

Directrice de recherche

TABLE DES MATIERES

Page

Résumé……………………………………………………………………………………...II

Table des matières………………………………………………………………………….III

Liste des figures……………………………………………………………………………IV

Liste des tableaux………………………………………………………………………….VI

Liste des abréviations……………………………………………………………………..VII

Chapitre 1 : Introduction

1. Généralités sur l’asthme…………………………………………………………...2

2. Asthme et inflammation allergique………………………………………………..7

3. Asthme et remodelage bronchique……………………………………………….10

4. Rôle de l’épithélium bronchique dans l’asthme………………………………….13

5. Rôle des fibroblastes bronchique dans l’asthme…………………………………15

6. Notion d’unité trophique epithelium-mesenchyme………………………………17

7. Facteurs de croissances…………………………………………………………..19

7.1. Facteur de croissance transformant (TGF-…………………………………. 19

7.2 La famille des FGF et FGFR…………………………………………………...24

7.2.1. Facteur de croissance des Kératinocytes (KGF-1) : FGF-7………………….27

7.2.1 Fonctions du KGF-1………………………………………………………….29

7.2.3. Etudes de souris KO pour le KGF-1 et le KGFR……………………………30

8. Les Cytokines…………………………………………………………………….31

8.1. L’interleukine 1 :

(IL1 )……………………………………………………..31

9. Modulation du KGF-1…………………………………………………………...35

9.1. Effet du TGF-………………………………………………………………...35

9.2. Effet des Protéines de la matrice extracellulaire……………………………….37

9.3. Rôle de l’ miRNA-155………………………………………………………....39

Chapitre 2 : Hypothèses et objectifs de l’étude……………………………………………40

Chapitre 3 : Matériels et méthodes………………………………………………………...44

1. Culture des fibroblastes bronchiques……………………………………………..45

2. Extraction et dosage des ARNs…………………………………………………..45

3. Reverse Transcriptase Polymérase Chain Réaction (RT-PCR)…………………..46

4. Polymérase Chain Réaction en temps réel (PCRtr)………………………………46

5. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Elisa)…………………………………..48

6. Analyses statistiques……………………………………………………………...48

Chapitre 4 : Résultats……………………………………………………………………….49

1- Expression de l’ARNm du KGF-1 dans les fibroblastes………………………………….50

2- Expression de la protéine du KGF-1 dans les fibroblastes………………………………..51

3-Effet de l’IL-1 sur l’expression de l’ARNm du KGF-1 dans les fibroblastes……………52

4- Expression du récepteur activateur de l’IL-1 dans les fibroblastes………………………54

5- Effet de l’IL-1 sur l’expression de la protéine du KGF-1 dans les fibroblastes…………55

6- Effet du TGF-sur l’expression de l’ARNm du KGF-1 dans les fibroblastes…………...57

7- Effet du TGF- sur l’expression de l’ARNm de l’IL1R1 dans les fibroblastes…………..59

8- Effet du TGF- sur l’expression de l’ARNm de l’IL1R1 dans les fibroblastes…………..60

9- Effet du TGF-sur l’expression de l’ARNm de l’IL-1 dans les fibroblastes……………62

Chapitre 5 : Discussion……………………………………………………………………...63

Références …………………………………………………………………………………..69

LISTE DES FIGURES

Page

Figure 1 : sections histologiques de muqueuses bronchiques normales et asthmatiques……..4

Figure 2 : Facteurs influençant l’équilibre entre une réponse immunitaire Type Th1 ou Th2..8

Figure 3 : Caractéristiques histopathologiques du remodelage bronchique dans l’asthme….11

Figure 4: l’interaction bidirectionnelle entre l’épithélium bronchique et les cellules du

Mésenchyme……………………………………………………………………….18

Figure 5 : Effet pleotropique du TGF-

Figure 6 : Voie de signalisation du TGF-…………………………………………………..22

Figure 7 : schéma représentant la structure des FGFRs……………………………………..25

Figure 8 : Epissage alternatif responsable de la création des isoforms

FGFRIIIb et FGFRIIIc……………………………………………………………28

Figure 9 : voie de signalisation de l’IL1

Figure 10 : Régulation de l’activité de l’IL1 par l’IL1Ra, l’IL1R2 et par l’association de

l’ILR2 et l’IL1RAcP…………………………………………………………… 34

Figure 11 : l’interaction bidirectionnelle de l’unité trophique epithelio-mesenchymale

au niveau de la peau………………….. ………………………………………... 36

Figure 12 : le mode d’action de la protéine FGFBP…………………..…………………......38

Figure 13 : séquences des amorces utilisées pour les RT-PCR……………………………...47

Figure 14 : Expression du KGF-1 (ARNm) dans les fibroblastes bronchiques……………...50

Figure 15 : Expression du KGF-1 (Protéine) dans les fibroblastes bronchiques…………….51

Figure 16: Effet de l’IL-1 sur l’expression du KGF-1 (ARNm) dans les fibroblastes……..53

Figure 17: Expression de l’IL1R1 (ARNm) dans les fibroblastes bronchiques……………..54

Figure 18 : Effet de l’IL-1 sur l’expression de la protéine du KGF-1……………………..56

Figure 19: Effet du TGF- sur l’expression de l’ARNm du KGF-1 ………………………. 58

Figure 20: Effet du TGF- sur l’expression de la protéine du KGF-1 …………………….. 58

Figure 21: Effet du TGF- sur l’expression de l’IL1R1 dans les fibroblastes ……………...59

Figure 22: Expression de l’IL1RA/IL1R2 (ARNm) dans les fibroblastes ………………….61

Figure 23: Effet du TGF- sur l’expression de l’IL1RA dans les fibroblastes ……………..61

Figure 24: Effet du TGF- sur l’expression de l’IL-1 dans les fibroblastes ………………62

Liste des TABLEAUX

Page

Tableau 1 : Prévalence de l'asthme chez les enfants âgés de 0 à 11 ans……………………...3

LISTE DES ABBREVIATIONS

ADN : Acide désoxyribonucléique

ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire

ARN : Acide ribonucléique

ARNm : Acide ribonucléique messager

AP-1 : Activateur de protéines

BMP : Bone morphogenetic protein

DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium

dNTP : Désoxyribonucléotide triphosphate

ECM : Matrice extracellulaire

ECP : Eosinophil cationic protein

EGF : Epidermal Growth Factor

EGFR : Epidermal growth factor receptor

ELISA : Enzyme-linked Immunosorbent Assay

EMTU : Unité trophique épithélium-mésenchyme

FBS : Fetal Bovine Serum

FEV1 : Forced Expiratory Volume in 1 second

FGF : Fibroblasts Growth Factor

FGF-BP : The Fibroblast Growth Factor-binding Protein

HP : Heparin

GAPDH : Glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase

GM-CSF : Granulocyte macrophage-colony stimulating factor

HSPG : Heparan Sulfate Proteoglycan

ICAM-1 : Inter-Cellular Adhesion Molecule 1

Ig : Immunoglobuline

IL-1Interleukine

IL-1Ra : IL-1 Receptor Antagonist

IPF : Idiopathic Pulmonary Fibrosis

IRAK-I : Interleukin-1 receptor-associated kinase 1

kDa : Kilodalton

KGF : Keratinocyte Growth Factor

KO : Knockout

MAPK : Mitogen Activated Protein Kinase

MBP : Eosinophil granule major basic protein

MCP-1 : Monocyte chemotactic protein 1

MMP : Matrice Metalloproteinase

MYD88 : Myeloid differentiation primary response gene (88)

NF-B : Nuclear Factor-B

PAF : Platelet-activating Factor

PDGF-BB : Platelet-derived Growth Factor (polypeptide B-chains)

PGE2 : Prostaglandine E2

PI3K : Phosphoinositide-3 kinase

PKC : Protéine Kinase C

P21 : cyclin-dependent kinase inhibitor 1

RANTES : regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted

RIS : RNA-Induced Silencing Complex

RT-PCR : Reverse Transcriptase - polymerase Chain Reaction

STAT : Signal Transducer and Activators of Transcription

TAB2 : TAK1 binding protein 2

TGF- : Transforming growth factor

TIMP : Tissue Inhibitor of Metalloproteinases

TNF : Tumor Necrosis Factor

Tollip : Toll interacting protein

TRAF-6 : TNF receptor associated factor 6

TSLP : Thymic Stromal Lymphopoietin

VCAM-1 : Vascular Cell Adhesion Molecule 1

VEGF : Vascular endothelial growth factor

SMA : α-smooth muscle actin

CHAPITRE 1

INTRODUCTION

1. Généralités sur l’asthme :

L’asthme est une maladie inflammatoire chronique des voix aériennes. Touchant 5 à 10 % de

la population mondiale, cette maladie affecte toutes les classes sociales et tous les pays, à

différents degrés (1)

. Elle est l’une des maladies chroniques les plus courantes au Canada.

L’asthme peut apparaître à tout âge et son évolution peut varier d’une personne à l’autre. La

prévalence de l’asthme ne cesse d’augmenter au Canada, Statistique Canada estimant que

13% des enfants entre 0 à 11 ans ont été diagnostiqués asthmatiques (Tableau 1). Il est

important de souligner que les garçons sont significativement plus susceptibles d’être déclarés

asthmatiques que les filles (16% des garçons versus 11% des filles) (2)

.

La physiopathologie de l’asthme est complexe et encore mal définie, ce qui rend difficile la

prise en charge de cette maladie. Dans l’asthme le désordre de la fonction pulmonaire se

manifeste souvent par (3)

:

1- L’hyperréactivité bronchique entrainant un rétrécissement du diamètre bronchique.

2- La limitation du débit pulmonaire, causée par plusieurs facteurs dont la broncho-

constriction aigüe, l’épaississement de la paroi bronchique, l’augmentation de la

sécrétion du mucus bronchique et le remodelage bronchique (Figure 1).

3- L’augmentation de la toux et de l’oppression thoracique suite à une stimulation

neuronale.

L’intensité, la durée et la fréquence de ces symptômes donnent une idée sur le degré de

sévérité de la maladie.

Les études épidémiologiques montrent que la susceptibilité individuelle à l’asthme est due en

grande partie à l’interaction entre les facteurs génétiques et les facteurs environnementaux (4)

.

D’ailleurs, il existe de nombreux facteurs qui augmentent le risque de développer cette

maladie. Ces facteurs de risque peuvent être classés en trois catégories :

Premièrement, les facteurs de prédisposition regroupant l’atopie, l’influence du sexe et de la

race et les prédispositions génétiques. L’atopie est l’aptitude de certain patient à produire une

quantité anormalement élevé d’anticorps IgE sérique en réponse à une exposition à des

allergènes environnementaux ainsi qu’une réponse exagérée dans les tests d’allergies

cutanées (5)

. Malgré que l’atopie concerne seulement une fraction de sujets asthmatiques elle

représente le facteur le plus important des facteurs prédisposant, en effet la prévalence de

l’asthme augmente avec le taux d’IgE(5)

.

Tableau 1 : Prévalence de l'asthme chez les enfants âgés de 0 à 11 ans, Canada,

territoires non compris, 1994-1995 à 2000-2001. Cette étude fait état d’une hausse

significative de la prévalence des diagnostics d’asthme, mais seulement pour les enfants

présentant des symptômes légers. En dépit de cette augmentation de l’asthme chez les enfants,

la prévalence des crises d’asthme a diminué.

Figure 1 : sections histologiques de muqueuses bronchiques normales (A) et

asthmatiques (B). Comparé aux sujets normaux, les sujets asthmatiques présentent un

épaississement de la membrane basale, une desquamation de l’épithélium bronchique ainsi

qu’une infiltration de cellules inflammatoires. (Busse WW Lemanske RF Jr. 2001. Asthma. N

Engl J Med. 344 :350-62 (5))

Les prédispositions d’ordre génétique (inné) liées à l’interaction de plusieurs gènes situés sur

des chromosomes différents, comme par exemple les gènes des cytokines pro inflammatoires

(IL13) localisés sur le chromosome 5 et les gènes d’atopie sur le chromosome 11(6, 7)

.

Le sexe et la race ont une influence sur l’asthme, en effet l’asthme de l’enfant est plus

fréquent chez les garçons que chez les filles et la prévalence de la maladie est élevée dans

certaines populations que d’autre(8)

.

Deuxièmement, les facteurs causals dont font partie les allergènes inhalés domestiques

(acariens, poils d’animaux) et d’extérieur (pollens, moisissures), la fumée de cigarette

(passive ou active), les polluants atmosphériques et les infections respiratoires.

Troisièmement, les facteurs déclenchant, provoquant l’asthme en induisant une inflammation

bronchique (telles les infections virales) ou une hyperréactivité bronchique (tel l’air froid, les

changements de température).

On distingue différents Types d'asthme : l'asthme allergique, l’asthme non allergique et

l’asthme professionnel.

L’asthme allergique est le type d’asthme le plus fréquent. Il est associé à un déclenchement de

l’inflammation bronchique suite à une réponse aux allergènes environnementaux. L’asthme

non allergique et quand à lui déclenché par de nombreux stimuli comme l'effort (asthme lié à

l’exercice physique), le froid ou encore des médicaments (asthme sensible à l'aspirine).

L’asthme professionnel est caractérisé par une obstruction bronchique causée par des stimuli

spécifiques sensibilisant (isocyanates, désinfectant, formaldéhyde), présents uniquement dans

un environnement professionnel (milieu du travail).

Il existe quatre classes d’asthme basées sur la sévérité des symptômes et l’intensité de

l’inflammation bronchique à l’origine des crises (9)

.

1- L’asthme léger intermittent dont les symptômes sont observés au maximum 2 fois par

semaine avec des sujets ayant un VEMS supérieur ou égale à 80%.

2- L’asthme léger persistant dont les symptômes sont observés plus que deux fois par

semaine mais moins d’une fois par jour. Affectant ainsi l’activité et la qualité du

sommeil des patients ou Le VEMS est entre 60 et 80%.

3- L’asthme modéré persistant dont les symptômes sont observés plus d’une fois par jour.

4- L’asthme sévère persistant dont les symptômes sont permanents avec des aggravations

fréquentes. L’activité physique de ses sujets est limitée et ils ont un VEMS inferieur à

60%.

2. Asthme et inflammation allergique :

L’asthme peut être décrit comme un état inflammatoire chronique des voies respiratoires

caractérisé par une infiltration de cellules immunitaires au niveau de la muqueuse

bronchique. Nous trouvons principalement des éosinophiles, des lymphocytes T et des

mastocytes (10)

. Cette inflammation est responsable en partie des dysfonctions pulmonaires

observées dans l’asthme, notamment l’hyperréactivité bronchique, la limitation des voies

respiratoires, ainsi que la présence d’œdème dans les voies respiratoires (11)

.

Suite à une exposition allergique, l’allergène est capté par les cellules dendritiques qui sont

des cellules présentatrices d’antigène. Ces cellules migrent vers les ganglions lymphatiques,

puis présentent l’antigène aux lymphocytes T helper. Sous l’influence du microenvironnement

local qui favorise le développement d’une réponse immunitaire type Th2, ces cellules

s’activeront, se différencieront et sécréteront un ensemble de cytokines et chimiokines, qui

participent directement à la propagation de l’inflammation observée dans l’asthme. Des

études ont montré l’existence accrue de cytokines et chimiokines dans le lavage broncho

alvéolaires de sujets asthmatiques (12)

. Ces derniers montrent également une forte

concentration de cytokines type Th2 tels que l’interleukine -4, -5, -6 et -13 par apport aux

cytokines type Th1 tels l’interféron-Y et l’IL-2 (13)

. Ce déséquilibre dans la balance entre les

lymphocytes Th1 et Th2 aurait un rôle clé dans le développement de l’asthme (Figure 2). En

effet, l’ensemble des cytokines et chimiokines libérées par les lymphocytes Th2 sont

impliquées dans l’activation et le recrutement des éosinophiles, ainsi que la production des

anticorps IgE par les lymphocytes B (14, 15)

. En effet la sécrétion de l’IL-5 stimule la libération

des éosinophiles dans la circulation et prolongent leur survies. D’ailleurs il y a une corrélation

directe entre la concentration d’IL-5 et le degré des éosinophiles dans les voies respiratoires

en réponse à un allergène (16)

. La sécrétion de chimiokines, comme RANTES (la chimiokine

régulé à l'activation des cellules T normales exprimées et sécrétées) et l’éotaxins ont un rôle

clé dans la délivrance des éosinophiles au niveau des voies respiratoires dans l’asthme (17)

. La

production d’IgE dépend également de l’activation des Lymphocytes B par l’IL-4 et l’IL-

13(18)

.

Les éosinophiles jouent un rôle très important dans la physiopathologie de l’asthme, car ils

sont présents dans le liquide broncho alvéolaire de sujets asthmatiques. De plus, il y a une

corrélation entre leur nombre et la sévérité de la maladie (19)

. Les éosinophiles sont des

cellules dont le cytoplasme contient des granules remplis de protéines toxiques comme par

exemple la protéine basique Majeure (MBP) et la protéine cationique (ECP) (20)

. Les

Figure 2 : Facteurs influençant l’équilibre entre une réponse immunitaire de Type Th1

ou Th2. La théorie de l’hygiène stipule qu’une faible activation du système immunitaire

pendant les premières années de la vie mènerait à une déviation de la réponse immunitaire

vers un profil type Th2, et au développement de l’asthme. (Busse WW Lemanske RF Jr. 2001.

Asthma. N Engl J Med. 344 :350-62 (5))

éosinophiles libèrent également des enzymes et des radicaux libres ainsi que le leucotriene C4

et le facteur activant les plaquettes (PAF) (21)

. Suite à leur libération, ces médiateurs sont

responsables des différentes lésions de l’épithélium bronchique qui précipite la desquamation

des cellules épithéliales observée dans les biopsies bronchiques de sujets asthmatiques (22)

.

Les produits secrétés par les éosinophiles (leucotriene C4) sont également responsables de

l’activation et la contraction du muscle lisse bronchique (23)

.

Une étude a montré que le fait d’utiliser des anticorps anti-IL5, afin de bloquer le recrutement

des éosinophiles au niveau des voies aériennes, induit une diminution d’éosinophiles, de la

production de protéines de la matrice extracellulaire (24)

.

Le recrutement et l’infiltration des cellules inflammatoires, plus particulièrement les

éosinophiles et les lymphocytes T, semblent jouer un rôle clé dans la pathophysiologie de

l’asthme en provoquant la propagation de l’état inflammatoire ainsi que les lésions de

l’épithélium bronchique observées dans l’asthme.

3. Asthme et remodelage bronchique :

En plus du processus inflammatoire, l’asthme est souvent accompagné d’un ensemble de

changement morphologique qu’on appelle remodelage bronchique (25, 26)

. L’analyse histo-

pathologique de biopsies bronchiques effectuées sur des personnes souffrant d’asthme, montre

plusieurs éléments caractéristiques (Figure 3) : la desquamation de l'épithélium bronchique,

l'épaississement de la membrane basale, l'hypertrophie et l'hyperplasie des cellules

musculaires lisses, le dépôt de protéines de la matrice extracellulaire notamment le collagène

I, III et V, la ténascine et la fibronectine au niveau de la membrane basale (accompagnée

d’une fibrose sous-épithéliale), et l’hyperplasie des myo-fibroblastes et des fibroblastes (26)

.

Ce remodelage a été considéré comme étant le produit d’un état inflammatoire persistant des

voies aériennes. Cependant, il a été observé dans la morphogenèse du poumon pendant le

développement fœtal et également pendant la réparation des dommages de l’épithélium

bronchique causés par différents facteurs tels les virus, les allergènes à activité protéolytique,

la fumée de cigarette et les produits chimiques) (27)

. De plus, plusieurs équipes ont révélé la

présence d’une restructuration et d’un remodelage des tissus avant même l’apparition des

symptômes de l’asthme sur des biopsies bronchiques de jeunes enfants (28)

. Ce qui pourrait

indiquer que ce processus commence à un stade précoce du développement de la maladie et

qu’il pourrait être impliqué dans l’établissement et le maintien de l’inflammation.

Il a été proposé qu’un déséquilibre dans les processus qui contrôlent la survie, la prolifération

et l’apoptose des cellules impliquées dans le remodelage bronchique (notamment les

éosinophiles, les cellules épithéliales, les cellules musculaires lisses et les fibroblastes) puisse

favoriser le maintien de cet état de remodelage dans l’asthme (29)

. En effet, un excès

d’apoptose, associé à un défaut de prolifération des cellules épithéliales bronchiques, pourrait

favoriser un déficit de réparation épithéliale, ce qui provoquerait une absence de protection

des tissus sous épithéliales, induisant par la suite des lésions tissulaires et un état

inflammatoire. A l’inverse une réponse proliférative importante, associée à un défaut

d’apoptose en l’occurrence des fibroblastes et des cellules musculaires lisses, pourrait être à

l’origine de la fibrose sous-épithéliale et l’hyperplasie des cellules musculaires lisses(30)

.

Figure 3 : Caractéristiques histopathologiques du remodelage bronchique dans

l’asthme. En (A) biopsie effectuée sur le sujet sain, on note que l’épithélium est intact,

absence d’infiltrat de cellules inflammatoires au niveau de la muqueuse bronchique, absence

de fibrose sous-épithéliale. Sur les biopsies bronchiques de patients asthmatiques (B-E), on

note des lésions au niveau de l’épithélium ainsi qu’un épaississement de la membrane basale.

On note également une hypertrophie et hyperplasie des cellules musculaires, et une infiltration

de la muqueuse bronchique par les cellules inflammatoires, les fibroblastes et les

myofibroblastes source de collagène. (Laurent Benayoun et Marina Pretolani. Le remodelage

bronchique dans l’asthme : mécanismes et enjeux thérapeutiques. Médecine sciences, vol. 19,

n° 3, 2003, p. 319-326)

Deux interventions récentes ont montré que l’utilisation des corticostéroïdes (CS) inhalés chez

des enfants n’a pas d’effet ni sur l’épaississement de la membrane basale ni sur le déclin de la

fonction respiratoire chez ces dernier (31, 32)

. De plus l’utilisation de doses élevées de

fluticasone pendant 8 semaines réduit l'inflammation bronchique, mais n’a pas d’effet sur le

dépôt de collagène sous-épithélial (33)

. La prise de CS par voie orale n'a pas diminué le facteur

de croissance transformant (TGF-) et les collagènes de types I et III dans l'asthme modéré et

sévère (34)

.

Cependant d’autres études montrent que les CS ont un effet antiprolifératifs sur le muscle

lisse (ASM) (35)

ainsi qu’un effet anti-apoptotique sur les cellules épithéliales issus de sujet

asthmatiques (36)

et suggèrent un effet sur la fibrose sous épithéliales (37)

. La contradiction de

ces résultats serrait probablement lié à la variation de la dose des CS utilisée ainsi qu’à la

variabilité de la durée du traitement. Toute fois la dose des CS ne peut pas expliquer

l’ambivalence de ces études, en effet il existe des patients asthmatiques qui sont cliniquement

insensibles au traitement (38)

malgré l’utilisation de forte dose de CS.

Le fait de considérer le remodelage bronchique comme un processus indépendant, non

secondaire à l’inflammation bronchique expliquerait les résultats des CS sur la fonction

respiratoire (39)

des patients asthmatiques.

Suite aux faibles preuves de l’effet thérapeutiques des Corticostéroïdes sur le processus

déterminant la progression de l’asthme d’un état initiale intermittent vers un état chronique,

les CS sont donc utilisés comme thérapie contre l’état inflammatoire, leur utilisation

prolongée supprime les symptômes liés à l’inflammation.

D’ailleurs jusqu'à présent il n’y a pas de traitement ou de médication efficace afin de prévenir

ou renverser le remodelage bronchique.

4. Rôle de l’épithélium bronchique dans l’asthme :

Le dommage de l'épithélium bronchique constitue une des principales caractéristiques patho-

physiologiques de l'asthme (40)

. En effet, l’épithélium normal a une structure stratifiée,

constituée d’une couche de cellules prismatiques (formée de cellules ciliées et sécrétrices) qui

repose sur une couche de cellules basales. L’intégrité de cette structure est maintenue via les

interactions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire. Cela implique l’intervention de

protéines d’adhésion, des jonctions serrées, des desmosomes et des hemidesmosomes.

L’épithélium assure la protection des muqueuses sous-jacentes de l’environnement externe,

par sécrétion du mucus ou par interaction avec le système immunitaire adaptatif, ou en jouant

un rôle de barrière dynamique, empêchant ainsi l’entrée des virus et des produits toxiques

inhalés (41, 42)

. L’épithélium contribue également au processus de réparation visant à la

reépithélialisation des surfaces bronchiques dénudées suite à une lésion. Ceci est une étape

essentielle à la restauration de l’architecture et la fonction des tissus (43)

. En effet, après le

détachement des cellules épithéliales, ces dernières migrent vers le point de lésion. Pour ce

faire, les cellules épithéliales avoisinant la lésion, libèrent un ensemble de protéines de la

matrice extracellulaire (ex : fibronectine) ainsi qu’un ensemble de facteurs chimiotactiques

pour attirer les cellules épithéliales. Par la suite, les nouvelles cellules adhéreront et

proliféreront grâce à la matrice extracellulaire avoisinant le site de la lésion.

Il est évident que les cellules épithéliales bronchiques sont les premières cellules exposées à

l’allergène inhalé. Suite à cette interaction, les cellules épithéliales seront activées et

participeront à l’induction de la réponse inflammatoire allergique, en libérant un ensemble de

facteurs comme l’IL-1, l’IL-8, l’IL-6, l’IL-5, l’éotaxine et la lymphopoietine stromale

thymique (TSLP) et RANTES (44)

.

Une fois libérés, ces facteurs peuvent favoriser la création d’un microenvironnement local

propice à l’activation des lymphocytes T (Th2). En effet, il a été montré que l’activation

prolongée des cellules épithéliales bronchiques jouait un rôle clé dans la sensibilisation et le

développement d’une réponse immunitaire type Th2. De plus, ces cellules jouent un rôle dans

le maintien de l’inflammation allergique (45)

.

L’épithélium bronchique de sujets asthmatiques présente des cellules épithéliales qui se

détachent en grappes, laissant la couche de cellules basales exposée au milieu externe. Cette

desquamation, liée à un clivage au niveau des desmosomes, est corrélée avec le degré

d’hyperréactivité bronchique (46)

. Montefort et al, a montré une hyperplasie des cellules

sécrétrices du mucus, ce qui contribuerait à l’état d’hypersécrétion du mucus observé dans

l’asthme (47)

. Cet état général des cellules épithéliales pourrait être expliqué par une

fragilisation et une sensibilisation de l’épithélium bronchique asthmatique. Assurément,

l’épithélium issu des sujets asthmatiques montre une perturbation des jonctions serrées et une

diminution d’expression de molécules d’adhésion, expliquant le détachement des cellules et

l’augmentation de perméabilité (démontrée par mesure de la résistance trans-épithéliale) (48)

.

Une sensibilité au stress oxydatif est également observée dans l’épithélium asthmatique, dû à

un défaut dans les voies anti-oxydatives comme celle de la superoxide dismutase (49, 50)

.

Devalia et al, ont montré que les cellules épithéliales asthmatiques sont plus sensibles au

stress oxydatif et plus perméables après exposition aux particules du diesel, sécrétant ainsi

plus de cytokine (IL-8, GM-CSF) comparé aux cellules normales (51)

.

Plusieurs évidences montrent que l’épithélium asthmatique présente des signes d’activation

accrus dans l’asthme, liés à un état de stress, comme le facteur de transcriptions NF-kB, la

voie de STAT-6 et STAT-1 qui jouent des rôles importants dans la voie pro-inflammatoire et

le remodelage bronchique (52, 53)

. Il y a également une augmentation de la translocation

nucléaire de l’inhibiteur du cycle cellulaire le P21waf (qui est corrélé à la sévérité de la

maladie) ainsi qu’une réduction du marqueur de prolifération cellulaire le Ki67 (54)

. Une

augmentation de l’expression de l’EGFR est également observée dans l’épithélium des sujets

asthmatiques (55)

et cette expression corrèle avec la sévérité de la maladie, mais elle n’est pas

modifiée par le traitement aux corticostéroïdes. Cependant, cette expression de l’EGFR n’est

pas liée à un niveau de prolifération des cellules épithéliales in vivo (56)

.

Ces évidences montrent qu’il y a, dans l’asthme, une réparation aberrante de l’épithélium

bronchique suite aux lésions et aux différents cycles de réparation-dommage liés à

l’inflammation. Ce défaut de réparation pourrait être impliqué dans le maintien de

l’inflammation bronchique ainsi que dans l’installation d’un état de remodelage observé dans

l’asthme.

5. Rôle des fibroblastes bronchique dans l’asthme:

Les fibroblastes bronchiques jouent un rôle important dans le poumon. En effet, ils participent

à la génération d’un réseau structural, au processus inflammatoire et au remodelage

bronchique. Ils assurent leurs fonctions en proliférant et en produisant des médiateurs solubles

et des protéines de la matrice extracellulaire (ECM) (57)

. En outre, les fibroblastes sont les

cellules principales responsables de la synthèse et de la régulation de l’ECM. Une

perturbation dans cette fonction provoquer une désorganisation de l’ECM.

Une étude effectuée dans notre laboratoire a montré que les fibroblastes asthmatiques

subissent des altérations fonctionnelles et phénotypiques qui sont conservées même après

plusieurs passages en culture ex vivo. En effet les fibroblastes asthmatiques montrent une

grande capacité à contracter le collagène alors qu’ils ont un faible niveau basal de

prolifération comparé aux fibroblastes issus de sujets sains (58, 59)

.

Par ailleurs, l’une des caractéristiques de l’asthme est le dépôt de collagène (I, III) interstitiel

en dessous de la membrane basale (60)

. Ce dépôt est probablement dû aux fibroblastes activés

qui acquièrent le phénotype des myofibroblastes (61)

. Notons que plusieurs études ont montré

une augmentation de l’activité des myofibroblatses sous la membrane basale (61)

. Ce

phénotype correspond à l’expression de l’actine (SMA) et à l’acquisition du caractère

contractile (propre aux cellules musculaire) par les fibroblastes activés, ce qui favoriserait

l’augmentation de dépôt des protéines de l’ECM (contraction rapide et soutenue des

myofibroblastes). Le traitement d’une culture de fibroblastes avec le TGF- et l’IL4

augmente le niveau d’expression de l’SMA et la synthèse du procollagène III (62)

. Il a été

montré que le nombre de myofibroblaste corrèle avec le degré de la fibrose sous épithéliale

observée dans l’asthme, et que l’augmentation du nombre des myofibroblastes est corrélée

avec l’épaississement de la membrane basale ainsi qu’à une augmentation du collagène 1 et 3

(63,64).

En plus de la synthèse protéique, les fibroblastes asthmatiques dégradent moins le collagène

comparé aux fibroblastes normaux(65)

. Ceci est dû à la baisse de la production de la MMP-2 et

à une augmentation de la production de la TIMP-2 par les fibroblastes asthmatiques. Les

fibroblastes asthmatiques sont également plus sensibles aux facteurs de croissance notamment

le TGF- qui provoque une augmentation de la synthèse du procollagène I chez ces derniers,

par apport aux fibroblastes issus de sujets sains (66)

.

Une étude effectuée dans un modèle d’allergie chez le rat a montré que le recrutement des

fibrocytes CD34+ (expriment l’-SMA et le collagène I) de la circulation vers la membrane

basale des voies respiratoires après exposition à un allergène ce qui pourrait être une

explication à l’augmentation des myofibroblastes dans ces tissus (67)

. De plus une étude sur

des biopsies bronchiques de patients asthmatiques montre une augmentation dans le nombre

de cellules CD34+/SMA

+ et CD34

+/procollagène I

+ 24h

après une stimulation par un

allergène (68)

. Dans l’asthme, les myofibroblastes peuvent être issus à partir des fibroblastes,

grâce à l’effet de stimulation par le TGF-, mais aussi à partir des cellules épithéliales (la

transition épithélium mésenchyme) ou encore à partir des cellules musculaires lisses (69)

.

A part leurs rôles dans le dépôt de protéine de la matrice extracellulaire, les fibroblastes

peuvent également jouer un rôle dans la réaction inflammatoire. En effet, suite à une

stimulation par différents cytokines comme l’IL4, l’IL6 et l’IL13 (libérés par les tissus

bronchiques dans l’asthme), les fibroblastes produiront des facteurs comme l’éotaxine ainsi

que l’expression d’un ensemble de gènes de chimiokine (par exemple MCP-1), capables

d’activer les éosinophiles et de recruter les macrophages ainsi que les basophiles (70)

. Les

fibroblastes sont également capables de produire une grande panoplie de cytokines comme

l’IL8 et le TGF-, des chimiokines et des prostanoïdes par exemple la Prostaglandine E2

(PGE2) qui influenceront le comportement des cellules avoisinantes à la fois inflammatoires et

structurales (71)

.

Grâce à la panoplie de cytokines, protéines et facteurs de croissance libérés, les fibroblastes

participent activement au maintien de l’état inflammatoire. Par conséquent, elles participent à

la fois au recrutement des cellules inflammatoires qui s’infiltrent au niveau de la muqueuse

bronchique, et à l’état de remodelage bronchique observé dans l’asthme.

En résumé, la plupart des études citées ci-dessus montrent que la structure et la fonction des

fibroblastes sont modifiées dans l'asthme. Ceci aurait un effet direct sur le remodelage

bronchique et l’inflammation chronique. Nous pouvons en conclure que les fibroblastes

jouent un rôle clé dans la pathophysiologie de la maladie.

6. Notion d’unité trophique epithelium-mesenchyme:

L'interaction entre cellules épithéliales et fibroblastes sous-jacents joue un rôle important dans

la régulation du développement, de la réparation et de l'homéostasie cellulaire. Il a été montré

que l'épithélium joue un rôle clé dans la coordination de la réponse au dommage (72)

.

En effet suite à une lésion de l’épithélium bronchique, des stimuli sous forme de molécules

pro-inflammatoires, des cytokines et des facteurs de croissance seront libérés et activeront les

cellules du mésenchyme sous-jacent, notamment les fibroblastes. Une fois activé les

fibroblastes proliférerons et se transformerons en myofibroblastes tout en libérant un

ensemble de facteurs de croissance (FGF, KGF, TGF-…) ainsi que des protéines de la

matrice extracellulaire essentiels à la migration et à la prolifération des cellules épithéliales

conduisant à la réparation de l'épithélium bronchique. Tous ces facteurs de croissance sont

impliqués dans le processus de morphogenèse du poumon au cours de l’embryogenèse (73)

, et

jouent un rôle primordial dans ce processus dans ou à la fois les cellules épithéliales et les

celles du mésenchyme sont activées. Cette interaction bidirectionnelle est à la base de l'unité

trophique épithélio-mésenchymale (EMTU) (Figure 4). Des anomalies de l’expression et/ou

de la fonction de ces facteurs et de leurs récepteurs favoriseraient la persistance des lésions

épithéliales, en empêchant le déroulement du processus de réparation menant ainsi à

l’apparition du remodelage bronchique.

Dans l'asthme, cette interaction entre les deux types cellulaires est perturbée; probablement à

cause de l’inflammation et des lésions répétitives subies par l’épithélium. Ainsi, un

fonctionnement anormal de cette unité trophique a été proposé pour jouer un rôle central dans

la pathophysiologie de l’asthme. On parle alors, d’une réactivation de l’EMTU. Deux

hypothèses sont proposées pour expliquer cette réactivation. Soit la EMTU reste active après

la naissance soit elle est réactivée chez les individus prédisposés à l’asthme (74)

.

Figure 4: Schéma représentant l’interaction bidirectionnelle entre l’épithélium

bronchique et les cellules du mésenchyme sous-jacents, notamment les fibroblastes. Les

interactions qui sont à la base de l’unité trophique epithelio-mesenchymale. Adaptée de

‘Stephen T. Holgate, MD, DSc. Epithelium dysfunction in asthma. J Allergy Clin Immunol.

2007;120:1233-44’

7. Facteurs de croissances :

Dans l’asthme, les voies respiratoires montrent des caractéristiques de lésion chronique, à la

suite aux dommages. Un ensemble de médiateurs solubles sera libéré par les cellules

épithéliales bronchiques (en première ligne) puis par les cellules inflammatoires, dans un

microenvironnement local. Ces médiateurs stimulerons les cellules mésenchymateuses, leurs

permettant de participer au processus de réparation cellulaire en libérant un ensemble de

facteurs de croissance (75)

comme par exemple le TGF-, le KGF-1, les FGFs, l’EGF, VEGFs.

Facteurs importants pour le remodelage bronchique et la vascularisation.

Parmi ces facteurs, je m’intéresserais spécifiquement au TGF- et au KGF-1.

7.1. Facteur de croissance transformant ( TGF- :

Le TGF- est un membre de la superfamille des TGF- incluant un large nombre de

cytokines, notamment le TGF- avec ses 5 isoformes (TGF-1, 2,3 qui sont exprimés chez

les mammifères). Les activines et les protéines morphogénétiques osseuses (BMPs) font

également parties de cette superfamille (76)

.

Le TGF-est un facteur de croissance pléïotropique (Figure 5), il contrôle la prolifération, la

différenciation cellulaire, et d'autres fonctions dans la plupart des cellules. Il joue un rôle dans

l'immunité et le cancer. Le TGF-est produit de façon ubiquitaire par de nombreux types

cellulaires (les cellules épithéliales, les cellules mésenchymateuses, les plaquettes, les

mononucléaires phagocytes, les mastocytes et les éosinophiles).

Le TGFest synthétisées sous forme d’un précurseur qui sera clivé dans le trans Golgi avant

sa sécrétion sous forme latente appelée le grand complexe latent du TGF- (LLC) (77)

. Ce

complexe est formé de trois composants: le TGF-β, une glycoprotéine liant le TGF- latent

(LTBP) et un peptide associé à la latence (LAP). La LTBP permet l’interaction avec la

matrice extracellulaire et le LAP inhibe la bio-activité du TGF-

La libération et l’activation de la forme latente sont des évènements clés dans la régulation de

la réponse au TGF-β et nécessite donc l’action de certains enzymes comme la plasmine, les

cathepsines, les glycosidases, les métalloprotéinases matricielles (MMP-2, MMP-9) et la

thrombospondine qui protéolysent la forme latente(79)

.

Figure 5 : Effet pleïotropique du TGF-. Le TGF- est un facteur clé dans l’asthme, il induit

différents effets sur plusieurs types cellulaires. Son effet le plus marquée dans l’asthme est l’induction

de fibrose sous épithéliale. (Makinde T, Murphy RF, Agrawal DK. The regulatory role of TGF- in

airway remodeling in asthma. Immunol Cell Biol. 2007 Jul;85(5):348-56)

Pour induire ses effets, le TGF-peut se lier à trois différents récepteurs transmembranaires

que l’on appelle : TGFRTGFRqui font partie de la famille des récepteurs

sérine/thréonine kinase (80)

En absence de ligand ces récepteurs se trouvent sous forme

d’homodimères à la surface cellulaire. Le TGF-β1 se lie au TGF-βR-II permettant le

recrutement du TGFRcet hétérodimérisation sera à l’origine de latransphosphorylation

du TGFR par le TGF-βR-II. Le récepteur ainsi phosphorylé induira La propagation du

signal jusqu’au noyau via la voie des Smads (81)

(par formation de complexe avec les protéines

Smad 2, Smad 3 et Smad 4).

Ce complexe sera transloqué vers le noyau cellulaire, induisant la régulation d’un ensemble

de gènes par liaison directe avec l’ADN, en recrutant un ensemble de co-activateurs ou co-

répresseurs transcriptionnels. D’autres membres de la famille des Smads, par exemple Smad 6

et Smad 7, jouent un rôle inhibiteur (I-Smad) de la voie de signalisation du TGFen se liant

au récepteur activé, interférant de la sorte avec Smad2 et Smad3 (82)

(Figure 6).

Le TGF-régule la croissance, la différentiation cellulaire, le dépôt de protéines de la matrice

extra cellulaire ainsi que la réparation des tissus (83)

. En outre, le TGF- est capable de

stimuler la croissance et l’activation des fibroblastes en induisant la libération de protéines de

la matrice extracellulaire. Cependant, pour les cellules épithéliales, le TGF- a un effet plutôt

inhibiteur sur la croissance de ces dernières en bloquant les cellules dans la phase G1 du cycle

cellulaire (84, 85)

.

Le TGF-est reconnu pour son double effet sur le système immunitaire. Assurément, le TGF-

est vital pour l’initiation et la résolution de la réponse inflammatoire, grâce à son rôle pro-

inflammatoire et immunosuppresseur (86)

. Le TGF- peut agir comme un ligand

chimiotactique pour les monocytes, les neutrophiles, les lymphocytes T qui libérant un

ensemble de médiateurs inflammatoires comme le TNF et l’IL-1 contribuant à l’amplification

de la réponse inflammatoire.

Figure 6 : Voie de signalisation du TGF-. Le TGF- est secrété sous forme latente complexé

avec la protéine LAP. Son activation nécessite l’intervention de protéases qui va lui permettre de se

lier à son récepteur et d’induire ses effets via la voie des Smad. Le TGF- peut également activer des

voies indépendantes des Smad comme par exemple la voie des MAPK. (Königshoff M, Kneidinger N,

Eickelberg O. TGF- signaling in COPD: deciphering genetic and cellular susceptibilities for future

therapeutic regimen. Swiss Med Wkly. 2009 Oct 3;139(39-40):554-63)

Le TGF- participe également au processus de congestion microvasculaire, processus associé

à l’angiogénèse au niveau des tissus bronchiques. Le TGF- induit son effet en améliorant la

production et la sécrétion de plusieurs facteurs pro-angiogénique y compris le facteur de

croissance vasculaire endothéliale (VEGF) et d’autres facteurs de croissance anti-

angiogéniques (87)

. D’ailleurs une étude a démontrée l’augmentation de vascularisation au

niveau des voies aériennes dans des biopsies bronchiques de patients asthmatiques.

L’intérêt pour le TGF-vient du fait que c’est un facteur clé dans l’asthme, jouant un rôle

important dans la fibrose sous épithéliale (88)

. Le TGF-induit la synthèse du procollagène 1

par les fibroblastes et provoque la transformation des fibroblastes en myofibroblastes, et la

transformation des cellules épithéliales en myofibroblastes (transformation épithéliale

mésenchymale) (89)

.

Minshall et al a démontré qu’il y a une corrélation entre le niveau d’expression du TGF-la

fibrose sous épithéliale et la sévérité de l’asthme (90)

. Aussi, il a été montré que le TGF-peut

inhiber la prolifération des cellules épithéliales par différents mécanismes. Nous avons

démontré que les cellules épithéliales issues de sujets asthmatiques prolifèrent moins

comparées aux cellules contrôles, et que le TGF-voit son niveau de base augmenté dans le

liquide broncho alvéolaire de sujet asthmatique (91, 92)

. De plus, les cellules épithéliales

asthmatiques produisent plus de TGF-1 actif et latent comparées aux contrôles. Nous avons

démontré que le TGF-agit négativement sur la voie de l’EGFR chez ces cellules épithéliales

(92), effet qui pourrait expliquer le défaut de prolifération des cellules épithéliales asthmatiques

même si elles sur expriment l’EGFR.

Il est donc probable qu’un déséquilibre entre les voies prolifératives et les voies anti

prolifératives, comme celles du TGF-pourrait expliquer l'incapacité de l'épithélium

asthmatique à se réparer normalement.

7.2 La famille des FGF et FGFR :

Les facteurs de croissance fibroblastiques (Fibroblast growth factor) sont des facteurs de

croissance polypeptidiques, ayant diverses activités biologiques et divers profiles

d'expressions (93)

. La famille des FGF se compose de 23 membres qui sont désignés de FGF-1

à FGF- 23. Ces membres sont divisés en six sous-familles. La région centrale des FGF se

compose de 120-130 acides aminés qui forment 12 feuillets β antiparallèles flanqués par une

extrémité amino et carboxy-terminale. La variation dans la séquence primaire de l’extrémité

N-terminal et C-terminal des FGF est responsable des différences biologiques entre les

ligands (94)

. Tous les FGFs, sauf les FGF1, FGF2, FGF9, FGF16 et FGF20, ont un peptide

signal. Les FGF9, FGF16 et FGF20 sont sécrétés par la voie de sécrétion classique (réticulum

endoplasmique-Golgi), tandis que les sous familles FGF1 et FGF2 sont sécrétées de façon

alternative.

Les FGF sont exprimés exclusivement durant le développement embryonnaire comme les

FGF- (3, 4, 8, 15, 17, 19), alors que d’autres s’expriment à la fois durant le développement

embryonnaire et dans le tissu adulte comme les FGF- (1, 2, 5-7, 9-14, 16 18 et 20-23) (95)

.

Il a été rapporté que les FGF régulent des processus biologiques complexes comme le

développement embryonnaire, l'angiogénèse, la cicatrisation des plaies, la régénération des

nerfs, l’inflammation chroniques et le cancer (96)

. Ces processus nécessitent la coordination de

plusieurs réponses cellulaires comme par exemple : la prolifération, la migration, l'invasion, et

la différenciation cellulaire. Toutes ces réponses sont induites par l'interaction des FGF avec

leurs récepteurs tyrosine kinase (FGFR), au niveau des cellules cibles.

Il existe quatre classes de FGFR (FGFR-1 à FGFR-4) qui partagent des motifs structuraux

communs (Figure 7). En effet, ils se composent de trois domaines extracellulaires

immunoglobuline-Type (D1-D3), un peptide signal qui permet l’adressage du FGFR à la

surface cellulaire, une région acide, un domaine transmembranaire et un domaine tyrosine

kinase cytoplasmique.

Figure 7 : schéma générale représentant la structure des FGFRs. Incluant les quatre

membres FGFR1, FGFR2, FGFR3 et FGFR4. (Galzie Z, Kinsella AR, Smith JA. Fibroblast

growth factors and their receptors. Biochem Cell Biol. 1997;75(6):669-85)

Les ligands FGF se lient principalement au domaine D2 et D3 des FGFR alors que le domaine

D1 et la région acide ont une fonction auto-inhibitrice (97)

.

Il existe plusieurs isoformes des FGFR, certaines générées par un saut d'exon éliminant le

domaine D1 et / ou la boîte acide dans les FGFR1-FGFR3, d'autres proviennent à la suite

d'épissage alternatif dans la deuxième moitié du domaine D3 des FGFR1-3, ce qui donne à la

fois des isoformes : FGFR-1b, 2b et 3b, et les isoformes FGFR-1c, 2c et 3c. Les isoformes b

sont localisés principalement au niveau des cellules épithéliales alors que les isoformes c sont

présents au niveau des cellules mésenchymateuses (98)

. Chaque FGF se lie et active soit un

FGFR épithélial ou mésenchymal, à l'exception de FGF1, qui active les deux isoformes à la

fois.

Contrairement aux autres facteurs de croissance, les FGF ont généralement une région

chargée positivement liant l'héparine permettant une forte affinité pour l’heparan-sulfate

protéoglycanes (HSPG) (99)

disponible dans la matrice extracellulaire (ECM) et à la surface

cellulaire proche des récepteurs des FGF. La liaison des FGF et HSPG au domaine

extracellulaire du ligand de FGFR induit la dimérisation du récepteur, l'activation et l’auto-

phosphorylation de multiples résidus tyrosine kinase, dans le domaine cytoplasmique du

récepteur, suivie d'une cascade de phosphorylations conduisant à l'activation de plusieurs

voies de signalisation, tels que les MAPK, PI3K, et PKC (99)

.

L'interaction des FGF avec leurs récepteurs est responsable du trafic cellulaire. En effet, la

plupart des FGFs sont importés ou exportés à l’intérieur et à l’extérieur des cellules, et sont

internalisés par endocytose dans le cytoplasme complexés avec leurs récepteurs. Les FGF-

FGFR peuvent translocer dans le noyau cellulaire. L’internalisation et la translocation

nucléaire des récepteurs, semble impliquer des voies de signalisation spécifiques et

différentes, en effet l’endocytose est un mécanisme dépendant des lipid/caveolin (100)

, alors

que la translocation implique la présence d’une séquence de localisation dans le noyau (NLS).

Cette séquence peut contrecarrer le signal peptide de sécrétion et donc promouvoir une

internalisation au lieu d’une sécrétion du FGF. Ce qui est intéressent c’est que la forme

secrété et la forme nucléaire d’un même FGF peut avoir des effets opposé sur la prolifération

cellulaire (101)

.

La plupart des FGFs agissent sur les cellules ciblent de manière autocrine, paracrine et

endocrine (102)

.

7.2.1. Facteur de croissance des kératinocytes (KGF-1) : FGF-7

Parmi plusieurs facteurs libérés par les fibroblastes pulmonaires, le KGF-1 ou FGF7, membre

de la famille des FGF, a été identifié comme facteur mitogène pour de nombreuses cellules

épithéliales d’origines diverses (103)

. Le KGF-1 est exprimé par une large variété de cellules

mésenchymales comme par exemple les fibroblastes dermiques, les cellules endothéliales

vasculaires, les cellules musculaires lisses et les lymphocytes Tγδ activées, alors qu’il n’est

pas exprimé dans les cellules épithéliales (104)

. Son ARNm code pour une protéine pro-KGF

qui est clivée pour former la protéine KGF-1 mature de poids moléculaire avoisinant 26-28

KDa.

Le KGF-1 active spécifiquement sur son récepteur le KGFR, également désigné comme

FGFR2IIIb un des variants d’épissage alternatif du FGFR2 (l’autre isoforme étant le

FGFR2IIIc) (105)

(Figure 8). La spécificité de la liaison du KGF-1 à son récepteur dépend

uniquement de la région d’épissage qui se trouve au niveau de la deuxième moitié du domaine

extracellulaire D3 (domaine semblable aux immunoglobulines) proche du domaine

transmembranaire, qui est régulé de manière tissue spécifique. En effet, le FGFR2IIIb est

présent uniquement au niveau des cellules d’origine épithéliale comme les cellules

épithéliales, les hépatocytes, les kératinocytes, les pneumocytes de type II.

Appart KGF-1, Le KGFR lie le FGF-1, FGF-3, FGF-10 (KGF2) et le FGF22 (106)

.

Il est évident que cette distribution du KGF-1/KGFR2IIIb laisse penser à un mode d’action

paracrin de ce facteur de croissance. Comparé à d’autres FGFs qui peuvent lier plusieurs

FGFRs à la fois sur les cellules épithéliales et les cellules mesenchymales, le KGF-1 est un

facteur unique qui a un rôle important dans la communication épithélium-mésenchyme (107)

,

permettant la régulation de la prolifération et la croissance des cellules épithéliales.

Figure 8 : Epissage alternatif responsable de la création des isoforms FGFRIIIb et

FGFRIIIc. (Eswarakumar VP, Lax I, Schlessinger J. Cellular signaling by fibroblast growth

factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev. 2005 Apr;16(2):139-49)

7.2.1 Fonctions du KGF-1:

Le KGF-1 a plusieurs effets sur les cellules épithéliales. Effectivement, son expression durant

le développement embryonnaire de la souris suggère un rôle dans la myogenèse et

l’interaction épithéliale-mésenchyme (108)

. Le KGF-1/KGFR est également impliqué dans la

régulation du branchement pulmonaire (109)

. Il induit la prolifération, la protection et la survie

des cellules épithéliales mais également la prolifération des pneumocytes de type 2 (110, 111)

.

Le KGF-1 a aussi un rôle anti-apoptotique en protégeant les cellules épithéliales pulmonaires

par l’inhibition de l’apoptose médiée par le couple Fas/Fas ligand et par augmentation du

niveau d’expression de Bcl-2 (qui est un médiateur anti-apoptotique) (112)

.

L’induction significative de l’expression d’ARNm du KGF-1 a été observée suite à des

expériences de lésion cutanée. Cette expression est supérieure à ceux d’autres facteurs de

croissance notamment le FGF-1, FGF-2 et le FGF-5 (113)

. La stimulation d’une blessure avec

du KGF-1 accélère la re-épithélialisation et l’épaississement de l’épithélium (114)

.

L’administration du KGF-1 recombinant a un effet cyto-protecteur sur les cellules épithéliales

et augmente la survie dans un modèle animal de fibrose pulmonaire (115, 116)

.

L’expression du KGF est significativement augmentée durant l’inflammation chronique dans

de nombreuses maladies (117, 118)

comme celle de Crohn, le psoriasis et les maladies

parodontales, ce qui suggère que le KGF1 a probablement un rôle dans le maintien d’un état

hyper prolifératif des kératinocytes dans ces maladies. Il a été montré que le prétraitement des

souris avec du KGF-1 réduit le recrutement des neutrophiles au niveau des muqueuses

bronchiques par réduction de l’expression de ICAM-1 VCAM-1 dans les cellules épithéliales

bronchiques (119)

. Le KGF1 pourrait également avoir un rôle au niveau de la régulation des

cytokines inflammatoires, à la fois en modifiant le ratio des cellules Th1/Th2 (120)

.

Toutes ces expériences montrent que le KGF-1 est requis au développement normal, de plus

ce dernier a un important effet au niveau des cellules épithéliales à la fois au niveau de la

réparation des blessures et dans l’inflammation chronique.

7.2.3. Etudes de souris KO pour le KGF-1 et le KGFR:

Les souris déficientes en KGF-1 ne montrent pas de défaut dans la réparation des lésions ni

dans la croissance épidermique mais montrent une réduction au niveau de la croissance

folliculaire (121)

. Alors que les souris déficientes pour le KGFR2IIIb montrent un défaut dans

le développement pulmonaire (122)

. L’utilisation de dominant négatif du KGFR ciblant les

cellules kératinocytes de la peau provoque une atrophie épidermique accompagnée d’un

défaut de re-épithélialisation suite à une blessure (123)

.

Ces résultats montrent que le KGF1 et le KGFR joue un rôle important dans la réparation des

lésions. Le fait d’avoir des phénotypes différents entre les souris déficientes en KGF qui

montrent peu de défaut de fonction par rapport aux souris déficientes pour le KGFR, met en

évidence l’existence d’autres ligands qui compenseront l’effet du KGF-1, comme par exemple

le FGF10.

8. Les cytokines :

Les cytokines sont des médiateurs peptidiques impliqués dans l’inflammation. Elles sont

libérées par un ensemble de cellules notamment les cellules inflammatoires, les lymphocytes,

les neutrophiles, les éosinophiles mais également les cellules épithéliales (124)

. Leurs actions se

font par l’intermédiaire de leurs récepteurs présent sur les cellules cibles en induisant

l’activation des différents facteurs de transcription tels le NF- κB, la voie des STAT et AP1.

Les cytokines ont un mode d’action qui peut être paracrine, endocrine, juxtacrine, ou

autocrine. Elles ont un large spectre d’activité et peuvent avoir une certaine redondance entre

elles. Il est probable que les cytokines jouent un rôle dans la physiopathologie de l’asthme en

régulant l’inflammation chronique des voies aériennes (125)

. Dans mon projet, je m’intéresse

plus spécifiquement à l’interleukine-1 (IL-1

8.1. L’interleukine 1 : (IL-1

L’IL-1 est une cytokine pro-inflammatoire produite par plusieurs types cellulaires

(monocytes, macrophages, lymphocytes B, cellules épithéliales, cellules dendritiques). Sa

sécrétion représente une des premières réactions de l'organisme suite à une agression. Cette

cytokine est produite aux sites inflammatoires et permet la stimulation, la synthèse et la

sécrétion de chimiokines et d'autres cytokines (IL-2, IL-4 et IL-6) par les cellules

environnantes (126)

. L’IL-1 permet l'activation du système immunitaire et la prolifération des

Kératinocytes et des fibroblastes, et induis ces effets en se liant à son récepteur activateur

l’IL-1R1 (127)

(Figure 9).

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L’IL-1 est synthétisé sous forme de protéine mature à partir de son précurseur le pro-IL1

composé 269 acides aminés et de poids moléculaire 31 KDa (128)

. En effet, le précurseur de

l’IL-1 et clivé par une cystéine protéase menant à un fragment de 153 acides aminés qui

correspond à l’IL-1, ce dernier sera exporté dans le milieu extracellulaire (128)

.

Figure 9 : voie de signalisation de l’IL1. (Martin MU, Wesche H. Summary and

comparison of the signaling mechanisms of the Toll/interleukin-1 receptor family. Biochim

Biophys Acta. 2002 Nov 11;1592(3):265-80). L’IL-1se lie à son récepteur activateur l’IL-

1R1 et forme un complexe de signalisation hétérodimèrique avec l’IL-1RAcP. MyD88 et

Tollip viennent s’associer au complexe formé, recrutant par la suite IRAK-1 qui sera

autophosphorylé. IRAK-1 lie une protéine adaptatrice TAB2 et se dissocie du complexe

récepteur. IRAK-1, probablement sous forme de dimère, induit la dimérisation de TRAF6.

Ceci active TRAF6 qui devient ubiquitinylée. Dans cette forme active, TAK1se lie à TAB2 et

est activée par la forme polyubiquitinylé de TRAF6 .Cette autophosphorylation active TAK1,

qui phosphoryle par la suite les kinases en aval de différentes voies de signalisation.

Il existe un antagoniste naturel de l’IL-1 qui s’appelle l’IL-1Ra (129)

, c’est une protéine de 23

KDa qui est secrétée par la voie classique du réticulum-Golgi. L’IL-1Ra possède 26%

d'homologie avec l’IL-1 et il est secrété par plusieurs types cellulaires comme : les

monocytes, les Kératinocytes, les cellules épithéliales, et les fibroblastes (130, 131)

. L’IL-1Ra

agit en liant le récepteur activateur de l’IL-1, et puisqu’il ne possède pas d’activité

signalétique, il bloque ainsi la transmission du message à la cellule (Figure 10).

L’IL-1 peut se lier à deux types de récepteurs de la famille des immunoglobulines, le

récepteur activateur l’IL-1R1 et le récepteur non fonctionnel l’IL-1R2 (récepteur leurre), ainsi

qu’avec une protéine accessoire IL-1RAcP (132, 133)

. L’IL-1R1 a un poids moléculaire de 80

KDa est exprimé par les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, les cellules

épithéliales, les fibroblastes, les kératinocytes ainsi que les lymphocytes T. L'IL-1R2 est une

glycoprotéine transmembranaire de 68 kDa qui possède un domaine intracellulaire très court

comparé à l'IL-lRl, du coup il ne peut pas transmettre de signal intracellulaire (134, 135)

. L’IL-

1R2 agit comme un régulateur négatif de la réponse à l'IL-l. L’IL-1R2 est exprimé par les

lymphocytes B, les lymphocytes T, les cellules hématopoïétiques, les Kératinocytes, les

cellules endothéliales (136)

.

L’IL-1 induit également l’expression d’une panoplie de gènes impliqués dans

l’inflammation, ce qui participe au maintien et à l’amplification de l’état inflammatoire. Il

induit aussi l’expression de facteurs de croissance comme par exemple le KGF-1, forte

expression d’ARN messager et de la protéine du KGF-1 dans des fibroblastes de différentes

origines (137, 138)

Plusieurs évidences montrent que l’IL-1 contribue directement à la pathologie de l’asthme,

notamment l’augmentation du niveau de base d’IL-1 dans le liquide broncho alvéolaire

(BAL) de sujets asthmatiques (139, 140, 141)

.

Figure 10 : Régulation de l’activité de l’IL1 par l’IL1Ra, l’IL1R2 et par l’association

de l’ILR2 et l’IL1RAcP. (Sims JE, Smith DE. Regulation of interleukin-1 activity is

enhanced by cooperation between the interleukin-1 receptor type II and interleukin-1 receptor

accessory protein. Eur Cytokine Netw. 2003 Apr-Jun;14(2):77-81)

A. IL-1Ra se lie au récepteur activateur et bloque son activation par IL-1 ou IL-1.

B. Le récepteur membranaire non activateur IL-1RII lie IL-1 à forte affinité et neutralise son

activité.

C. Le complexe IL1RII-IL1 peut également lier l’AcP et la rendre moins disponible pour le

récepteur activateur.

D. La forme sécrété d’IL-1RII (sIL-1RII) lie IL-1 à forte affinité et neutralise son activité.

E. sIL-1RII peut former un complexe avec IL-1 et la forme soluble d’AcP (sAcP) et la

rendre moins disponible pour le récepteur activateur.

F. sIL-1RII et sAcP peuvent également lier IL-1 à forte affinité.

9. Modulation du KGF-1 :

Le KGF-1 est modulé positivement par l’IL-1, d’ailleurs une étude a révélé l’existence d’un

défaut de production du KGF-1 au niveau des fibroblastes issus des sujets atteins de la fibrose

pulmonaire idiopathique (IPF) (142)

. En effet ce défaut de production a été corrélé à un

problème dans la voie de signalisation d’IL-1, causé par un déséquilibre dans les facteurs c-

Jun et JunB, facteurs jouant un rôle important dans la régulation du KGF-1 (143)

(Figure 11).

Ce déséquilibre et dû à un défaut d’expression et d’activation de c-Jun, alors que le niveau de

JunB est normal. Sachant que JunB a un rôle inhibiteur de l’expression du KGF-1 alors que

c-Jun a un rôle activateur, un équilibre entre ces deux facteurs est essentiel à une bonne

régulation du KGF-1.

Même si l’IL-1 est un puissant inducteur du KGF-1, il n’est pas le seul régulateur de ce

dernier. En effet, l’inhibition de l’IL-1 ne supprime pas entièrement l’expression du KGF-1

au niveau des fibroblastes. De plus, d’autres facteurs ont la capacité d’induire l’expression du

KGF-1 comme l’hormone parathroid (PTHrP) ainsi que d’autres cytokines (IL-1, PDGF-

BB, IL-6) (144,145)

. Des études ont également montré que les glucocorticoïdes peuvent aussi

réguler négativement l’expression du KGF-1 au cours d’expériences de blessures et de

cicatrisation (146)

en diminuant le taux de transcription et en déstabilisant l’ARNm du KGF-1.

Il a été montré que les récepteurs aux corticoïdes peuvent inhiber la synthèse des facteurs de

transcription appartenant à la famille AP-1 notamment c-Jun (147)

, ce qui pourrait expliquer

leurs effets sur l’expression du KGF-1.

9.1. Effet du TGF-:

Le KGF-1 est également modulé par le TGF-. Il a été montré que le TGF- peut inhiber la

prolifération des cellules épithéliales en interférant avec la voie de signalisation de l’EGFR

(92 ,148) et qu’il peut inhiber l'effet prolifératif du KGF-1 sur des cellules alvéolaires de type 2

(149). Le TGF- a aussi un effet inhibiteur direct sur l’expression du KGF-1 et ceci requiert la

phosphorylation des Smad (facteurs impliqués dans la voie de signalisation du TGF-) et

l’activation de la Tyrosine kinase c-Abl (une protéine qui agit dans le noyau pour stimuler

l'apoptose cellulaire) (150)

. Une autre étude a montré que le traitement des cellules musculaires

avec du TGF-augmente de 20 fois l’expression de JunB (151)

comparé à c-Jun (2,5 fois) donc

on pourrait supposer qu’il a un effet similaire sur les fibroblastes bronchiques.

Figure 11 : l’interaction bidirectionnelle de l’unité trophique epithelio-mésenchymale au

niveau de la peau. Cette interaction implique la sécrétion d’IL1 qui va induire la production

du KGF et du GM-CSF par les fibroblastes. (Werner S, Smola H. Paracrine regulation of

keratinocyte proliferation and differentiation. Trends Cell Biol. 2001 Apr;11(4):143-6. (116))

9.2. Effet des Protéines de la matrice extracellulaire :

Le KGF-1 peut être régulé par des molécules comme l’héparine (HP) et les HSPGs (Heparan

Sulfate Proteoglycans) (152)

. Cependant, les études dans ce domaine montrent des résultats

contradictoires. Certains résultats montrent que l’HP / HSPGs ne sont pas impliqués dans

l’interaction et la formation du complexe KGF-1 / KGFR. Il est donc probable que leur

présence pourrait avoir un effet inhibiteur sur la formation du complexe KGF-1 / KGFR par

blocage du site de liaison au niveau du récepteur (153)

. Alors que d’autres, mentionnent

l’implication d’HP HSPGs dans la formation du complexe récepteur, surtout à une faible

dose, ce qui augmente l’affinité du KGFR alors qu’à forte dose elle inhibe cette interaction

(154). Une étude intéressante a montrée l’existence d’une corrélation entre l’hyper réactivité

bronchique et la production des proteoglycans par les fibroblastes bronchiques issus de sujet

sain et asthmatique (155)

.

Le KGF-1 peut également être régulé comme plusieurs membres de la famille des FGF par

des protéines extra cellulaires qui ont pour rôle de mobiliser ce dernier à partir de la matrice-

extracellulaire (156, 157, 158)

. Pour que le KGF soit accessible pour les cellules épithéliales, deux

molécules doivent intervenir : la première c’est l’héparinase qui coupe la liaison du KGF-1

avec les HSPGs et la deuxième est la protéine FGF-BP (the fibroblast growth factor-binding

protein) qui sert comme protéine porteuse pour le KGF-1 (Figure 11). Cette dernière est

fortement exprimée suite aux dommages des cellules épithéliales et peut lier le KGF-1. A

faible dose, le FGF-BP augmente l’affinité du KGFR pour son ligand. FGF-BP peut être

régulée positivement par l’EGF et la catenine. Cependant, elle peut être régulée

négativement par l’acide rétinoïque (159)

. Une étude a montrée que TGF- est également

capable d’inhiber cette protéine (160)

.

Figure 12 : schéma montrant le mode d’action de la protéine FGFBP. (Abuharbeid S,

Czubayko F, Aigner A. The fibroblast growth factor-binding protein FGF-BP. Int J Biochem

Cell Biol. 2006;38(9):1463-8).

Dans ce schéma l’FGF-BP (fibroblast growth factor-binding protein) est sécrété par une

cellule tumorale, et se lie au FGFs immobilisés au niveau de la matrice extracellulaire de la

même cellule ou des cellules voisines. L’FGF-2 est par la suite libéré (sous forme soluble et

active) de sa liaison à l’heparan sulfate proteoglycane. Sous sa forme active le FGF-2 peut

induire ses effets en se liant à son récepteur membranaire au niveau des cellules cibles

(stimulation de la prolifération des cellules tumorale et activation de l’angiogénèse).

9.3. Rôle du miRNA-155

Une étude effectuée sur des fibroblastes pulmonaires a montré que l’IL-1 et le TNF- sont

capables d’activer l’expression d’un miR-155 en même temps que l’activation du KGF-1 (161)

.

Les miRNA sont des ARN non codant de 22 nucléotides qui ont comme fonction la régulation

négative de l’expression génique (162)

. L’miRNA-155 induit ces fonctions en formant un

complexe avec RIS (RNA-induced silencing complex) et en guidant ce complexe vers une

région de complémentarité 3’UTR d’un ARNm cible. Selon le degré de complémentarité

entre l’miRNA et l’ARNm cible, nous pouvons assister à la dégradation ou à l’inhibition de la

translation de ce dernier (161)

. L’miR-155 est détecté dans différents types cellulaires comme

les macrophages, les cellules dendritiques, les fibroblastes synoviaux et les fibroblastes

pulmonaires (162)

. Parmi plusieurs cibles de ce miRNA-155, il y a le KGF-1 qui est une cible

intéressante pouvant faire du miRNA-155 un régulateur crucial du KGF durant la

communication épithélium-mésenchyme (161)

. Dans l’asthme ainsi que dans d’autres maladies

où il y a un défaut de prolifération, des cellules épithéliales comme dans la fibrose

idiopathique pulmonaire, nous pourrions supposer qu’une dérégulation ou une surexpression

de ce miRNA-155 induirait un défaut de production de KGF-1, ce qui pourrait rompre

l’équilibre et l’homéostasie des cellules épithéliales.

CHAPITRE 2

Hypothèses et objectifs de l’étude

Mon projet de recherche tire son origine de plusieurs observations. La première c’est que dans

l’asthme notre équipe de recherche a montré que les fibroblastes subissent de nombreuses

altérations qui sont maintenus même après plusieurs cycles de culture cellulaire (65)

. Par

conséquent ces altérations peuvent jouer un rôle clé dans la manifestation de l’asthme.

La deuxième observation vient d’une expérience de co-culture de fibroblaste avec des cellules

épithéliales. Dans cette expérience où on a mesuré la prolifération des cellules épithéliales, on

a remarqué que le fait de mettre des fibroblastes sains dans le système de co-culture favorise

le développement et la prolifération des cellules épithéliales normales, alors que le fait de

mettre des fibroblastes provenant de sujets asthmatiques réduit la prolifération des cellules

épithéliales. Le résultat de cette expérience suggère que les fibroblastes sains sont capable de

délivrer un signal qui favorise la prolifération de cellules épithéliales, alors qu’une altération

ou absence de ce signale pourrait expliquer le défaut de prolifération des cellules épithéliales.

Parmi plusieurs facteurs libérés par les fibroblastes bronchiques en réponse à une stimulation

provenant de l’épithélium, le KGF-1 ou FGF7, membre de la famille des FGF, est un acteur

unique qui a un rôle important dans la communication épithélium-mésenchyme, permettant la

régulation de la prolifération et la croissance des cellules épithéliales.

La dernière observation vient du fait que le KGF-1 est plus exprimé dans de nombreuses

maladies inflammatoires chroniques (117, 118)

. Cependant, dans la fibrose pulmonaire

idiopathique (IPF) (142)

ou l’altération de la production et de la régulation du KGF-1 laisse

penser que probablement ce dernier est impliquée dans le défaut de prolifération des cellules

épithéliales observé dans cette maladie.

Etant donné l’importance du KGF-1 dans la communication épithélium-mésenchyme et son

rôle primordial dans la régulation de la prolifération et la croissance des cellules épithéliales.

Nous poserons l’hypothèse selon laquelle une altération ou une dérégulation de ce facteur de

croissance serait impliquée dans la rupture de la communication épithélium-fibroblaste et

serrais donc impliquée dans le défaut de prolifération des cellules épithéliales (comme c’est le

cas des patients IPF).

Comme la desquamation des cellules épithéliales est une caractéristique patho-physiologique

majeure dans l’asthme, on supposera que le défaut de prolifération et de réparation de

l’épithélium bronchique serrait liée à une altération ou à l’absence d’un signal positif libéré

par les fibroblastes sous-jacents. Comme le rôle du KGF-1 n’a jamais était évalué dans

l’asthme, ça serait intéressant de voir si une dérégulation de ce facteur au niveau des

fibroblastes bronchiques issu de sujets asthmatiques serrais impliquée dans le défaut de

prolifération de l’épithélium bronchique.

Notre équipe a également montré que le TGF- joue un rôle central dans la pathophysiologie

de l’asthme. Les fibroblastes d’origine asthmatiques secrètent plus de TGF- actif, et elles

expriment plus de récepteur du TGF- que les fibroblastes contrôles. D’autres études ont

révélées l’effet inhibiteur du TGF- à la fois sur la production et l’expression du KGF-1 au

niveau des fibroblastes. De plus notre équipe a également montré que le TGF- avait un effet

inhibiteur sur la prolifération des cellules épithéliale en inhibant la voie de l’EGFR (92)

. Donc

à partir de ces études on supposera que le TGF- pourrait participer à l’altération et à la

dérégulation du KGF-1 dans les fibroblastes asthmatiques ou bien il pourrait agir directement

au niveau de la voie de signalisation du KGF-1 dans les cellules épithéliales.

Nous émettons l’hypothèse selon laquelle, un dysfonctionnement dans la boucle de régulation

de l’unité trophique, plus distinctement au niveau de la fonction des fibroblastes bronchiques,

pourrait être à l’origine d’un défaut de prolifération et de réparation de l’épithélium

bronchique observé dans l’asthme. Une dérégulation de l’expression et/ou la production du

KGF-1, impliquant le couple IL-1/TGF- -1, causerait une expression

anormale du KGF par les fibroblastes bronchiques, ce qui pourrait expliquer l’état de

l’épithélium bronchique dans l’asthme.

Les objectifs de ce projet était de:

Déterminer les niveaux de base d'expression du KGF-1 au niveau d’ARN messager et

de protéine chez les fibroblastes issus de sujets asthmatiques et de sujets sains.

Évaluer l’effet de l’IL-1sur l’expression du KGF-1 au niveau d’ARN messager et de

protéine chez fibroblastes issus de sujets asthmatiques et de sujets sains.

Évaluer l’expression des récepteurs de l’IL-1au niveaudes fibroblastes issus de

sujets asthmatiques et de sujets sains.

Étudier l’effet du TGF- sur l’expression du KGF-1 au niveau d’ARN messager et

de protéine chez les fibroblastes issus de sujets asthmatiques et de sujets sains.

Étudier l’effet du TGF- sur la régulation de l’expression de l’IL-1R1, IL-1Ra, IL-

1R2 chez les fibroblastes issus de sujets asthmatiques et de sujets sains.

Étudier l’effet du TGF-sur la régulation de l’expression d’IL-1 au niveau

d’ARN messager chez les fibroblastes issus de sujets asthmatiques et de sujets sains

CHAPITRE 3

Matériels et méthodes

1. Culture des fibroblastes bronchiques

Les fibroblastes primaires sont disponible d ans notre banque cellulaire et ont été isolés à

partir de biopsie bronchique de sujets asthmatiques légers et de sujets sains (58)

. Les sujets

asthmatiques qui remplissent parfaitement les critères de la société thoracique Américaine

(163). (Par exemple: méthacholine PC20 = 8 mg/ml), ont été recrutés à partir de la clinique

d’asthme de l’hôpital Laval (Québec, Qc, Canada). Les sujets asthmatiques n’utilisent pas de

corticostéroïdes inhalés ou systémiques, ils utilisent seulement des agoniste 2 sur demande,

ils ont en moyenne un FEV1 = 85 ± 3.1% et une PC20 = 4.0 ± 2.2 mg/ml. Tous les patients

asthmatiques sont atopiques, non fumeurs. Les sujets sains sont non atopiques, non-fumeurs

sans antécédent d’asthme ou de maladie systémique (ils ont en moyenne un FEV1 = 98.2 ±

5.1% et une PC20 = 99.46 ± 1.2 mg/ml. L'étude a été approuvée par le Comité d'éthique à

l'Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec.

Les fibroblastes ont été caractérisés par immunofluorescence et cytométrie de flux par des

anticorps spécifiques aux fibroblastes (l’anticorps de souris anti-vimentine, et l’anticorps de

souris anti-Ab1 (antigène de fibroblaste Humain)) (Calbiochem, San Diego, CA, USA) (58)

.

Les fibroblastes sont par la suite cultivés dans du milieu DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle

Medium) (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) supplémenté avec 20 U/ml de pénicilline-

streptomycine (Invitrogen), 12,5µg/ml de fungizone (invitrogen) et 10% de sérum de veau

fœtal inactivé (FBS, Hyclone, Logan, UT, USA) à 37°C et 5% de CO2 et utilisés à des

passages 4 ou 5. Une fois la confluence atteinte, les cellules sont détachées avec de la trypsine

à 0,025% pendant 3 minutes à 37°C. Ensuite, les fibroblastes sont transférés dans des plaques

de six / douze puits (Corning, Whitby, ON, Canada) à raison de 3x105 / 2,5x10

5 cellules par

puits respectivement et incubées pendant 24 heures pour leur permettre d’adhérer.

Les cellules sont par la suite stimulées dans du milieu DMEM 1% sérum, soit avec du TGF-

perpotechµg/ml à 5 ng/ml, ou avec de l’IL-1perpotech, 1mg/ml à différentes doses

(0,01. 0,1. 1. 10. 100 ng/ml) pendant 6h (ARN) ou 24h (surnagent)

2. Extraction et dosage des ARNs

L’acide ribonucléique (ARN) cellulaire total est obtenu pas la méthode suivante : les

fibroblastes bronchiques ont été lysés au moyen d’un tampon de lyse (RA1) puis, l’extraction

d’ARN a été effectuée au moyen de la trousse ‘RNeasy mini Kit’ (Qiagen, Mississauga, ON,

Canada) suivant les directives du manufacturier. Les concentrations des ARNs ont été

déterminées par fluorescence en utilisant le réactif Ribogreen (Invitrogen, Ontario, Canada)

dil