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Introduction
Pr Eric Chabriere
beaucoup de séquences, peu de fonction
Nous sommes à l’ère post génomique
Une macromolécule c’est:Une séquence, une structure (dynamique), une (des) fonction(s)
La connaissance de la structure 3D est révolutionnaire pour l’étude du vivant
C’est souvent une interprétation directe
La structure:
-Informations précise sur le repliement
-détermination des interactions
protéine-protéine, protéines-substrat, protéines-cofacteur,…
-Mécanisme catalytique, reconnaissance moléculaire
-Révèle les liens fonctionnels et évolutifs
-Base pour les biotechnologies
Inhibiteurs, médicaments, mutants
Il faut intégrer les informations structurale avec les informations de génétiques, biochimie, biologie cellulaire, biologie moléculaire, bioinformatique…
La biologie structurale : le microscope moderne
Les échantillons biologiques sont de taille variée
Système à étudiere.g. solution aqueuse,
cristal
‘Sonde’e.g. faisceau de lumière
Signaux ‘émis’ parle système sous l’effet
de la ‘sonde’e.g. Transmission
Diffusion à ‘grands’ angles
Contiennent de l’informationsur les caractéristiques du
système
Principe :Soumettre le système à une excitation
et étudier ses réactions
Rayons IR : Spectro Infra rouge
Champ radiofréquence+ champ magnétique : RMN
Ionisation +champs E et B : spectro de masse
Rayons X : diffraction XNeutrons, électrons
La biologie structurale est un processus complexe et interdisciplinaire
Les différentes techniques
Radiocristallographieprincipe: interaction RX matière Avantages: positions précises des atomes, pas de limite de taille (ex ribosome).Inconvénients: cristal, problème de la phase, atomes d’hydrogène difficiles à voir
RMNprincipe: Interaction des spins des noyaux dans un champs
magnétique. Information sur l’environnement de chaque noyau.Avantages: En solution, Information sur la dynamique de la
macromolécule.Inconvénients: Limitation de taille (30kDa avec marquage), moins précis que la cristallographie, solution concentrée
Microscopie électroniqueprincipe: interaction électron matière Avantages: Pas de problème de phases (lentille) pas de limite de taille (ex virus).structure globaleInconvénients: basse résolution, dommage sur l’échantillon
Prion humain (1HJN)
PFOR (2PDA)
Virus coxsachie Cav21
Diffusion des rayon X : Small Angle X-ray Scattering (SAXS)principe: interaction RX matière Avantages: échantillon en solution, pas de cristalInconvénients: basse résolution
Neutrons (complément à la radiocristallographie)principe: interaction neutrons matière Avantages: les atomes d’hydrogène sont visiblesInconvénients: Gros cristaux
Bioinformatique (en très fort progrès)Principe: modélisation in silico, Avantages: peu cher, rapideinconvénients: précision, qualité des résultats
Chimie-physiqueprincipe: marquage, spectroscopie, biochimie, …Avantage: InformationsInconvénients: Mesure indirect, interprétation
Aucune technique n’est complète
tout est bon à prendre
the modular cellulase Cel48F
from Clostridium cellulolyticum
Dichroïsme circulaire
Ere de la génomique structurale
Comparaison des structures déposées (PDB) avec les différentes techniques
La cristallographie est le méthode la plus utilisée
1901 Wilhelm Conrad Röntgen Découverte des rayons X
1914 Max von Laue Méthode de détermination des structures cristallines grâce à la diffraction des rayons X
1915 Henri et Lawrence BraggFondements de la radiocristallographie moderne
1927 Arthur Holly Compton et Charles Thomson Rees WilsonDécouverte de l’effet Compton : diffusion des rayons X.
1937 Clinton Joseph Davisson et Sir George Paget ThomsonConfirmation de la théorie ondulatoire de Louis de Broglie par diffraction sur un cristal.
1994 Bertram N. Brockhouse et Clifford G. ShullEtude de la structure et des propriétés des cristaux (diffraction de neutron)
La cristallographie une discipline récente
Prix Nobel de physique
1946 James Batcheller Sumnerdécouverte de la cristallisation des enzymes
1957 Lord Alexander R. Toddtravaux sur les nucléotides et les coenzymes nucléotidiques
1958 Frederick Sanger (2 prix + séquençage ADN)la structure des protéines, spécialement celle de l'insuline
1962 Max Ferdinand Perutz et John Cowdery Kendrew structure des protéines globulaires (hémoglobine et myoglobine)
1962 F.Crick et J.D.Watson M.Wilkins, R. Franklin structure de l’ADN
1964 Dorothy Crowfoot Hodgkina détermination par les techniques des rayons X de la structure d'importantes substances biologiques (cholesterol, vitamine B12, …)
1972 William H. Steinrelation structure fonction de la ribonuléase
1982 Aaron Klugmicroscopie électronique cristallographique structure des complexes acides-nucléiques protéines biologiquement importants
1985 Herbert A. Hauptman et Jerome Karlemise au point de méthodes directes de détermination des structures cristallines
1988 Johann Deisenhofer, Robert Huber et Hartmut Michel détermination de la structure tridimensionnelle d'un site de la réaction photosynthétique
2003 Roderick MacKinnonstructure de canaux ioniques (en particulier un canal potassium)
2006 Roger Kornberg pour ses travaux sur les bases moléculaires de la transcription chez les eucaryotes (ARN polymérase II)
Prix Nobel de chimie et médecine
De nombreux autres en biologie structurale. RMN, spectrométrie de masse,…
Autres étapes importante en biologie structurale
1978-1980 M Rossman et S. Harrisson
Première structures de virus
2000-2001
Structure des ribosomes 30S, 50S,70S
Etapes en biocristallographie
Expressionpurification cristallisation diffraction
phasage
modélisation
Interprétationbiologique
Biologie moléculaire
Structure de complexes
Biotechnologies
Gène d’intérêt
Echantillon biologique
BioinformatiqueAutres informations
2 étapes limitantes: cristallisation et phasage
Cout d’une structure
La purification.
Pour cristalliser, l’échantillon doit être le plus pur possible (>98%).Il en faut une quantité importante de protéine 5-10mg (concentration 5-20mg)
Vérifier systématiquement la qualité du lot:Gel SDS, coloration argentiqueactivité
La cristallisation
Obtenir un maximum d’information sur la stabilité de l’échantillons.
Connaître les conditions de cristallisations de protéine voisine
Plusieurs techniques.
-Goutte suspendue
-Goutte assise
-batch
Il existe des robots de cristallisation
Génomique structurale
La diffraction
Rayons XNeutrons
Transformée de Fourrier
Il faut que les cristal diffracte bien (résolution + monocristal)
Anode tournante (laboratoire)
SynchrotronESRF Réacteur à neutrons
ILL
A Grenoble
Les synchrotrons dans le monde
Le phasage
Pas de lentille de qualité pour les rayons X.
Plusieurs techniques
remplacement moléculaire on utilise les phase du modèle d’une protéine similaire (id seq >30%)
dérivé d’atome lourds (MIR)On fixe des atome lourds sur la protéine (Hg, U, Tb, …)
diffusion anomale (synchrotron)on utilise le propriété de diffusion anomale des atomes lourds (>Fe)Soit naturelle (ex agrégats 4Fe-4S)Soit fixé (Mir)Soit acide aminé modifié (ex Selenomethionine). (expression)
Méthodes DirectesSi reolution atomique (< 1,2Å) et petite protéine (<10Kda)
Modélisation
Rayons XNeutrons Transformée de Fourrier
En calculant la transformée de Fourier inverse on obtient la densité électronique de la molécule
On place les atomes
dans la densité électronique
Il faut connaître la séquence
Notion de résolution
Plus la résolution est faible plus on pourra voir des détails fin
d = 4 Å
Difficile de construire le modèle
d = 3 Å
On commence a reconnaitre les acides aminé
d = 2 Å
A cette résolution on peut voire les molécule d’eau
d = 1 Å
Résolution atomiqueOn voit chaque atome séparément
Facteur d’agitation thermique (facteur B)Entre 2 et 60 Å2
Plus il est élevé, plus l’atome est agitée
Le fichier PDB: les coordonnées de chaque atomes
N° atome -- type d'atome– résidu–chaine--N° séquence—X- Y- Z—occupation—Facteur B
On voit les zones agité(attention petite vibration)
Coloration en fonction du facteur B
Interprétation Biologique
Structure +
complexe
Mécanisme catalytique
RMN: résonance magnétique nucleaire.
Le noyau de certains atomes possède un spin. 1H, 13C, 15N, 31P.
Le spin (aimant s'oriente dans un champs magnétique)
B
Si on applique la bonne fréquence électromagnétique radiofréquence aux spin alignés (adapté en fonction du champs magnétique et de la nature de l'atome).Il y a résonance: les spins basculent. Il sont dans un état excité
Pour revenir à l'état stable, le spin va précesser (ex toupie)La vitesse de précession est dépendante de l'environnent chimique
Cette vitesse de précession nous renseigne. Sur les liaisons, la proximité spatiale, la géométrie …
Sur la structure
B
Appareille de RMN.
Doit générer un champs magnétique très intense (10-15 T)
Champs magnétique terrestre (47T)
L'échantillon doit être pur, concentré, soluble, stable (collecte plusieurs jours).
La macromolécule ne peut être trop grosse (max 30Kda, avec marquage isotopique)
Spectre 2D. Couplage scalaire, dipolaire.
Attribution + géométrie. Plusieurs spectres sont nécessaires
Spectre 1D.A chaque pic correspond un proton
En RMN, on obtient une série de modèles
RMN. Protons (ou N15).petit échantillon 10-20 kDapetits oligonucléotidesmesure des complexes.Dynamique des protéines
Microscopie électronique:
Les électrons sont des ondes (dualité onde particule)
= h/mv
h constante de Planck : 6.626 10-34 Js
Les lentilles sont des bobines magnétiques
Les électrons interagissent avec le potentiel électrostatique
Pb: contraste peu important, le flux d'électron détruit l'échantillon.On voit la projection du potentiel électrostatique
Coloration négative
Sur une coupe mince de l'échantillon (dizaine nm), on rajoute un solution contenant des atomes lourds (tetraoxyde d'osmium ou de l'acétate d'uranyl).
Ces atomes qui absorbent beaucoup les électrons vont se déposé en dehors de la macromolecules. Aini, la macromolécule apparaitra plus clair que ce qui l'entoure. (contraste négatif)
Cryo EM. L'échantillon est rapidement congelé dans la glace vitreuse
Reconstruction 3DResolution environ 10A
Faible contraste
L'échantillon est aléatoirement orienté
On place les modèles X-ray et RMN dans l'enveloppe obtenue par microscopie électronique
RX.On voit les électrons.Structure préciseIl faut des cristaux
RMN On voit les spins.Inadaptée au grosse macromolécule
Microscopie électroniqueProjection du potentiel électriqueFaible résolution (10Å)Reconstruction 3D, fastidieuse.Adapté à à les résolution de très gros complexeCombinaison avec structure RX et RMN
