L E T T R E S C I E N T I F I Q U E

Physiologie Cellulaire & Végétale 1

LysosomeAgnès JournetPage 4

Lettre n° 34 - Avril 2013

iRTSVRésultats scientifiques

Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivant Fonctions intégrées des protéines - Du vivant aux nanotechnologies

Biologie et µ-électroniqueManuel ThéryPage 1

AngiogenèseJean-Jacques FeigePage 3

Soufre en BiologieMohamed AttaPage 2

Direction des Sciences du Vivant

Une solution pourrait venir de l’intégration de la microélectronique en trois dimensions. En effet, les circuits micro-électroniques actuels sont plans. Empiler leurs composants les uns sur les autres est une solution pour continuer de les densifier, et améliorer ainsi leurs performances et réduire leur consommation énergétique. Se pose alors un nou-veau challenge : celui de connecter les composants entre eux une fois qu’ils sont empi-lés. Alors que leur fabrication et leur empilement repo-sent sur des tech-nologies matures, la réalisation de connections verti-cales pour les relier entre eux puis faire circuler un courant reste complexe. Si les techniques actuel-les de la micro-électronique 3D permettent de réaliser ces connections à haute densité, des tech-nologies alternatives sont intéressantes à évaluer.Des biologistes et des physiciens du CEA, du CNRS, de l’UJF et de l’Inra à Grenoble ont eu l’idée de mettre à profit les capacités extraordinaires d’auto-assemblage de certains composés biologi-ques pour que ces connexions se construisent tou-tes seules. Dans nos cellules, de nombreuses struc-tures complexes et régulières s’assemblent et se désassemblent en permanence. C’est notamment le cas des réseaux de filaments constitutifs du sque-

lette des cellules (cytosquelette). Ces filaments sont principalement constitués d’actine. Ils interagis-sent entre eux pour former des tresses, des fais-ceaux, des feuillets, des piliers dont l’architecture et les propriétés mécaniques régulent et contrôlent la forme des cellules. La formation de ces super-structures répond à des lois mécaniques et géomé-triques qui sont étudiées et maîtrisées par une

équipe du Labo-ratoire de Physio-logie Cellulaire & Végétale. Ces chercheurs ont mis au point une technique qui permet de con-trôler l’auto-as-semblage des filaments d’actine en 3D entre 2 plaques de verre. Grâce aux techno-logies du Labora-

toire des Technologies de la Microélectronique (CNRS/UJF) et du CEA-Leti, les plaques ont été placées à 30 microns l’une de l’autre et micro-structurées avec un faisceau laser. Les chercheurs ont alors injecté entre les deux surfaces une solu-tion contenant des monomères d’actine qui ont polymérisés en réponse à la géométrie des micro-structures. Des piliers d’actine de formes et de tailles contrôlées se sont ainsi auto-assemblés à partir des deux surfaces et rejoints pour établir des connexions. De la même manière, les chercheurs ont réussi à faire croître des piliers à partir d’une

surface, qui sont entrés dans des cylindres creux formés à partir de l’autre, à la façon d’une prise mâle/femelle. Puis, grâce au savoir-faire des cher-cheurs du CEA-Leti, ces connexions ont été métal-lisées avec des nanoparticules d’or, permettant le passage d’un courant électrique entre les deux surfaces.

Ces résultats montrent que ce procédé d’auto-as-semblage des filaments d’actine peut avoir des applications industrielles pour le moins inatten-dues. Ils illustrent la façon dont l’étude fonda-mentale de processus cellulaires élémentaires peut être une source d’inspiration extrêmement riche pour des processus d’ingénierie, y compris dans des domaines très éloignés.

RéférenceGalland R, Leduc P, Guérin C, Peyrade D, Blanchoin L and Théry M. Fabrication of three-dimensional electrical connections by means of directed actin self-organization. Nature Materials, 2012, 109(36): 14440-14445

Des connexions biologiques pour la micro-électronique

Contact : Manuel ThéryLPCV

Laboratoire Physiologie Cellulaire & VégétaleUMR 5168 - CEA - CNRS - UJF - Inra

Actine : protéine qui constitue le squelette des cellules vivantes et qui permet de réguler et contrôler leur forme.

D’année en année, nos ordinateurs et téléphones portables deviennent plus performants grâce à la densification des composants micro-électroniques qu’ils renferment. Cette densification résulte d’une miniaturisation de plus en plus poussée. Elle est en train d’atteindre une limite technique liée à la taille de certains composants qui se rappro-

che de celle de quelques atomes. L’industrie de la microélectronique fait donc face à une barrière physique pour augmenter la densité d’inté-gration des composants que seule une rupture technologique pourrait permettre de surmonter.

Visualisation en 3D d'un réseau de connexions réalisé à partir de micro-piliers d'actine (gris) ©CEA/R. Galland

Visualisation en 3D d'un réseau d'actine (vert) assemblé à partir d'une surface micro-patternée en forme de Logo CEA (rouge)

En brefFlexi-meccanoPage 5

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2 Chimie et Biologie des Métaux

Le Soufre, du fait de sa réactivité intrinsèque, confère aux molécules dans lesquelles il est inséré des propriétés uni-ques. C'est un élément essentiel pour tous les êtres vivants ; il intervient dans la formule de deux acides aminés naturels, la cystéine et la méthionine et, par conséquent, dans de nombreuses protéines. Cependant, la façon dont le Soufre est inséré dans les biomolécules est une question encore mal comprise en chimie bio-inorganique.

Les mécanismes d’incorporation du Soufre dans les biomolécules ne sont que partiellement compris et deux grandes voies réactionnelles sont propo-sées. La première, bien établie, est la substitution par le sulfure d’un précurseur oxygéné. La deuxième voie, mal comprise, consiste en l’inser-tion radicalaire directe d’un atome de soufre dans une liaison C-H. À ce jour, on ne connaît que 4 systèmes capables de réaliser ce type d’insertion. Il s’agit de la biotine synthase, de la lipoate synthase et de deux méthylthiotransférases, MiaB et RimO. Ces quatre systèmes sont des protéines à centres FeS capables de réaliser au mieux un seul turnover in vitro. Pour cette raison, il a été proposé et admis que ces systèmes étaient « sacrificiels », c'est-à-dire que le soufre constitutif des centres FeS était celui retrouvé dans le substrat. Ces quatre systèmes appartiennent à la classe des enzymes «  Radical SAM » avec comme particularité de contenir deux centres [4Fe-4S], chacun coordonné par 3 cystéines et laissant donc une position de coordination dis-ponible. Le premier centre FeS dit « centre RS » est coordonné par les trois cystéines d’un motif CysXXXCysXXCys caractéristique des enzymes « Radical SAM ». Son quatrième site de coordina-tion est occupé par la S-Adénosylméthionine (SAM). Le deuxième cluster (cluster II) est égale-ment lié à trois cystéines et présente lui aussi un quatrième site de coordination disponible.Afin de comprendre les mécanismes d’insertion du Soufre par voie radicalaire, des chercheurs de l’équipe Biocatalyse du laboratoire de Chimie et

Biologie des Métaux, se sont intéressés aux mé-thylthiotransférases MiaB et RimO. Ces enzymes modifient par méthylthiolation une adénine spéci-fique de certains ARNt ou un résidu aspartate d’une protéine ribosomale (Figure 1). Dans les deux cas, il s’agit d’une réaction chimiquement difficile qui fait intervenir des intermédiaires radi-calaires extrêmement réactifs que le système doit contrôler. Pour cette étude, les chercheurs sont partis de l’hypothèse que la fonction du cluster II était de fixer et d’activer un ion sulfure pour géné-rer un radical S• capable de se coupler au substrat lui-même activé sous forme de radical. De fait, les résultats montrent que MiaB et RimO fixent un ion sulfure sur le cluster II (Figure 2, réaction a), puis le méthylent grâce à une première molécule de SAM (Figure 2, réaction b). Enfin, elles transfèrent ce groupement méthylthio au substrat activé grâce à une seconde molécule de SAM fixée au premier cluster RS (Figure 2, réaction c). Dans ce scénario le cluster II est capable de fixer et d’activer plusieurs fois de suite un ion sulfure exogène pour, après méthylation, être transféré au substrat permettant d’obtenir un système catalytique et donc de réali-ser plus d’un turnover in vitro. Le mécanisme pro-posé par ces chercheurs est conforté par la struc-ture tridimensionnelle de RimO (Figure 3) qui révèle que les deux centres sont à 8 Å de distance ce qui suggère une forte synergie dans les trans-ferts électroniques impliqués dans ces réactions.

Ces résultats constituent une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes d’inser-tion du soufre dans les macromolécules biologi-ques.

Le Soufre en Biologie

Contact : Mohamed Atta LCBM

Laboratoire Chimie et Biologie des MétauxUMR 5249 - CEA - CNRS - UJF

RéférenceForouhar F, Arragain S, Atta M, Gambarelli S, Mouesca JM, Hussain M, Xiao R, Kieffer-Jaquinod S, Seetharaman J, Thomas B, Acton T, Montelione GT, Mulliez E, John F, Hunt JF and Fontecave M. Two Fe-S clusters catalyze sulfur insertion by radical-SAM methylthiotransferases. Nature Chemical Biology, 2013, 9(5): 333-338

Figure 1.Réactions catalysées par MiaB (a) et Ri-mO (b).

Figure 3. Structure tridimensionnelle de l’enzyme RimO.En bleu le domaine N-terminal UPF0004 avec le centre Fe-S II, en jaune le domaine Radical-SAM avec le centre Fe-S RS et en C-terminal le domaine TRAM en magenta.

Figure 2. Mécanisme proposé pour l’inser-tion radicalaire du soufre dans les ma-cromolécules biologiques.Cube bleu : centre RS ; cube blanc : cluster II.

a b

a b

c

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Biologie du Cancer et de l'Infection - Biologie à Grande Échelle 3

C’est dans cet esprit que l’équipe Angiogenèse du laboratoire Biologie du Cancer et de l’Infection a déposé un brevet, puis son extension internatio-nale, tous les deux portés par le CNRS, pour pro-téger des molécules chimiques à activité anti-an-giogénique et anti-tumorale ayant des applications potentielles pour le traitement des cancers, des rétinopathies vasculaires ou du psoriasis. En colla-boration avec la plateforme de Criblage pour des Molécules BioActives de l’iRTSV (CMBA), un test cellulaire d’angiogenèse a été miniaturisé puis robotisé. Une chimiothèque de l’Université Joseph Fourier de Grenoble composée de 1360 molécules originales, non accessibles à l’industrie, a ensuite été criblée. Une famille de molécules actives a été ainsi identifiée et les chimistes des Départements de Pharmacochimie Moléculaire et de Chimie Moléculaire de l’UJF l’UJF (Drs Demeunynck et Constant) ont synthétisé une trentaine d’analogues qui ont permis de définir des relations structure-

activité. La molécule la plus active a été ensuite testée par l’équipe Angiogenèse pour ses capacités anti-angiogéniques et anti-tumorales sur des mo-dèles in vivo de tumorigenèse chez la souris. La molécule s’est avérée efficace et non-toxique. La recherche du mécanisme d’action moléculaire de ce composé est en cours.

L’identification de la cible moléculaire de ce composé anti-angiogénique devrait permettre de trouver ensuite un partenaire industriel pour le développement futur de cette molécule d’intérêt thérapeutique.

Contact : Jean-Jacques FeigeBCI

Laboratoire Biologie du Cancer et de l'InfectionUMR_S 1036 - CEA - Inserm - UJF

RéférenceFeige JJ, Castan A, Quelard D, Demeunynck M, Constant JF and Barette C. Composés a n t i - a n g i o g é n i q u e s , c o m p o s i t i o n s pharmaceutiques les comprenant, et leur utilisation. Dépôt de brevet national INPI n° 11/00277 (31 janvier 2011) par le CNRS. Extension internationale n° PCT/IB2012/050452 déposée le 31 janvier 2012 par le CNRS.

L’angiogenèse, qui définit le processus de croissance de nouveaux vaisseaux sanguins, est une nouvelle cible thé-rapeutique qui a donné lieu au développement et à la mise sur le marché pharmaceutique à partir de 2005 de plu-sieurs médicaments. Ceux-ci sont utilisés en thérapie ciblée de plusieurs types de cancer et de rétinopathies vas-culaires (DMLA, rétinopathie du diabétique). Cependant, malgré l’efficacité de ces nouveaux composés (Bevaci-zumab, Sorafenib, Sunitinib, Pazopanib, Vandetanib, …), des phénomènes de résistance apparaissent chez les

patients traités par ces médicaments, ce qui implique la nécessité de trouver des molécules de deuxième génération ciblant le même processus mais par des mécanismes distincts.

Vers des inhibiteurs chimiques de l’angiogenèse

Les lysosomes sont des compartiments intracellulaires assimilables à une « déchetterie » cellulaire. Leur fonction première est la dégradation de particules ou macromolécules d’origine extracellulaire, après internalisation par la voie endocytaire, ou d’origine intracellulaire. La dégradation intralysosomale conduit à la production de molécules simples qui sont ensuite exportées dans le cytoplasme de la cellule et recyclées dans les multiples voies de biosyn-thèse. Des défauts en enzymes de dégradation, en protéines de transport ou dans des acteurs de la biogenèse lyso-somale sont responsables de maladies métaboliques héréditaires, caractérisées par l’accumulation intralysosomale

de substrats non dégradés ou de produits non évacués. Ces maladies, dont une cinquantaine environ est identifiée, sont souvent polyhan-dicapantes et nombre d’entre elles conduisent au décès prématuré des patients à des âges allant de la petite enfance à l’âge adulte.Afin d’identifier de nouvelles protéines pouvant être impliquées dans ces maladies, des chercheurs de l’équipe Étude de la Dynamique des Protéomes (EDyP) ont réalisé une analyse protéomique des lysosomes. À la suite d’études portant sur les pro-téines lysosomales solubles [1, 2], ils publient l’ana-lyse du répertoire des protéines présentes dans la membrane qui entoure les lysosomes [3]. En effet, du fait des difficultés techniques inhérentes à l’analyse des protéines membranaires, ce sous-compartiment reste mal connu malgré son rôle essentiel dans les échanges avec le cytoplasme, nécessaires au maintien de l'équilibre fonctionnel intracellulaire et au recyclage des molécules issues de la dégradation intralysosomale.Dans cette nouvelle étude, plus de 2 000 protéines ont pu être identifiées à partir de fractions enri-chies en lysosomes de foie de rat. Une analyse statistique fondée sur la comparaison des protéo-mes issus des fractions enrichies ou appauvries en lysosomes a permis de sélectionner une centaine de nouvelles protéines lysosomales potentielles. Parmi ces dernières, une cinquantaine présentant les caractéristiques de transporteurs transmem-branaires sont particulièrement intéressantes du

fait qu’elles pourraient être directement associées à l’étiologie de pathologies lysosomales. Ainsi, l’un des candidats transporteurs lysosomaux, la pro-téine PQLC2, également identifiée par une appro-che génétique chez la levure, a fait l’objet d’une étude fonctionnelle poussée [4]. Cette étude a per-mis d’expliquer l’efficacité du traitement médica-menteux fourni aux patients atteints d’une mala-die lysosomale appelée cystinose.

Cette analyse protéomique qui propose une liste de nouvelles protéines lysosomales potentielles, ouvre la voie à des études ciblées pouvant dé-boucher sur des problématiques de santé. Par ailleurs, ces approches d’analyse à haut débit vont maintenant être mises en œuvre pour étu-dier la dynamique de la voie endocytaire com-plète («  vidéoprotéome  »), dans le cadre d’une collaboration entre l’équipe Dynamique des Or-ganelles et Plasticité Cellulaire et l’équipe EDyP.

Analyse du protéome du lysosome

Contact : Agnès Journet BGE

Laboratoire Biologie à Grande ÉchelleUMR_S 1038 - CEA - Inserm - UJF

Références[1] Journet et al. Proteomic analysis of human lysosomes: Application to monocytic and breast cancer cells. Proteomics, 2002, 2(8): 1026-1040[2] Journet et al. Towards a human repertoire of monocytic lysosomal proteins. Electrophoresis, 2000, 21(16): 3411-3419[3] Chapel A, Kieffer-Jaquinod S, Sagne C, Verdon Q, Ivaldi C, Mellal M, Thirion J, Jadot M, Bruley C, Garin J, Gasnier B and Journet A. An extended proteome map of the lysosomal membrane reveals novel potential transporters. Molecular and Cellular Proteomics, 2013[4] Jézégou et al. Heptahelical protein PQLC2 is a lysosomal cationic amino acid exporter underlying the action of cysteamine in cystinosis therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109(50): E3434-3443

La cystinose est une affection liée à un défaut de transport de cystine (un acide aminé composé de deux unités cystéine liées par un pont disulfure) hors des lysosomes entraînant une accumulation lysoso-miale de cet acide aminé dans différents organes.

A. Bourgeonnement de sphéroïdes en présence d’un inducteur d’angiogenèse, le FGF-2.B. Inhibition du bourgeonnement des sphéroïdes induit par le FGF-2, en présence de la molécule COB223.

A B

4 Contacts : Pascal.Martinez@cea.fr

Les laboratoires de l’iRTSVDirecteur de la publicationDr. Jérôme Garin

Éditeur et format électroniquePascal Martinez — Pascal.Martinez@cea.fr

Comité de rédactionMohamed Atta, Jean-Jacques Feige, Agnès Journet, Manuel Théry.

Institut de Recherches en Technologies et Sciences pour le Vivanthttp://www-dsv.cea.fr/irtsvhttp://www-dsv.cea.fr/irtsv/lettresCEA Grenoble17 rue des Martyrs38 054 Grenoble cedex 09Responsable : Jérôme GarinTel. : 04 38 78 45 01Fax : 04 38 78 51 55

© CEA [2013]. Tous droits réservés. Toute reproduction totale ou partielle sur quelque support que ce soit ou utili-sation du contenu de ce document est interdite sans l’autorisation écrite préalable du CEA

En bref

BCIBiologie du Cancer et de l'InfectionUMR_S 1036CEA/Inserm/UJF

BGEBiologie à Grande ÉchelleUMR_S 1038CEA/Inserm/UJF

CBMChimie et Biologie des MétauxUMR 5249CEA/CNRS/UJF

PCVPhysiologie Cellu-laire & VégétaleUMR 5168CEA/CNRS/UJF/Inra

GPCGroupe Physiopa-thologie du Cytos-queletteiRTSV et UMR_S 836 UJF/Inserm/CEA/CHU

Près de 40% des protéines présentes dans une cellule sont prédites comme étant par-tiellement ou complètement désordonnées. Ces protéines sont impliquées dans des pro-cessus biochimiques aussi essentiels que la reconnaissance moléculaire, la transduction de signal ou dans des maladies neurodégéné-ratives. Ce désordre semble souvent être es-sentiel à l’accomplissement de leur fonction et la compréhension de ces protéines est de-venu un enjeu scientifique.

Afin d’élucider le fonctionnement de ces protéines désordonnées, le groupe Flexibilité et Dynamique des Protéines par RMN (FDP) de l'Institut de Biologie Structurale et le GIPSE de l’iRTSV ont développé « Flexible-meccano ». Ce logiciel permet de prédire la valeur de paramètres mesurables par Résonance Magnétique Nucléaire sur ces protéines, puis de les comparer aux données expérimentales mesu-rées sur la protéine étudiée.L’algorithme de Flexible-meccano mis au point par le groupe FDP, permet, sur la base de la séquence en acides aminés, de générer des ensembles de structures représentatives de l'état désordonné de

la protéine et de calculer les paramètres RMN correspondants. Des interfaces graphiques, déve-loppées par le GIPSE, permettent aux utilisateurs de comparer les valeurs calculées de ces paramè-tres RMN avec les valeurs expérimentales.

Flexible-meccano est disponible pour l'ensemble de la communauté. Flexible-meccano est téléchar-geable sur le site de l’IBS.

RéférenceOzenne V, Bauer F, Salmon L, Huang JR, Jensen MR, Segard S, Bernado P, Charavay C and Blackledge M. Flexible-meccano: A tool for the generation of explicit ensemble descriptions of intrinsically disordered proteins and their associated experimental observables. Bioinformatics, 2012, 28(11): 1463-1470

Flexi-meccano