I l est d’usage d’entamer une nouvelle annéeen faisant le bilan de la précédente. Si nousregardons le travail accompli par le Conseil

d’Administration, notamment l’organisation desmanifestations scientifiques, nous ne pouvons quenous réjouir de leur succès. Notre congrès annuels’est tenu du 26 au 29 novembre 2007 à l’EcoleNormale Supérieure de Lyon, et était pour lapremière fois organisé autour d’une thématiqueciblée portant sur l’immunité, l’infection et lavaccination. Le résultat est très encourageant etmotivant pour le renouvellement de cettedémarche, en y intégrant néanmoins des sympo-siums couvrant des faits nouveaux de l’immuno-logie dans son ensemble. Nathalie BonnefoyBérard, à qui nous avions confié la tâched’organiser cette manifestation scientifique, a sus’entourer d’un comité scientifique exceptionnelet d’un comité local d’organisation efficace, faisantde ce congrès une vraie réussite, tant par saqualité scientifique et l’excellence des inter-venants que par le nombre important de parti-cipants très réactifs. Nous avons donné la paroleen session plénière aux étudiants en thèse afinqu’ils puissent présenter leurs travaux, et avonsattribué un prix aux plus brillants d’entre eux, etcela dans une atmosphère extrêmement convi-viale. Le 24ème Atelier Technologique organisé parSylvia Cohen-Kaminsky en partenariat avec NicolasPasqual de la Société de biotechnologie ImmunIDTechnologies a attiré un grand nombre departicipants et d’orateurs de notoriété scientifiqueincontestable sur le thème "Approche Globaledes Répertoires Immunitaires : de la recherche audiagnostic ex vivo".

Il s’agit là pour la SFI d’utiliser ces atelierstechnologiques comme tremplins afin d’établir etde renforcer des liens bilatéraux entre le mondeacadémique et les jeunes sociétés de biotech-nologie. Nous en avons fait une de nos priorités,car en tant que chercheurs, statutaires nouspouvons d’une part orienter des développementstechnologiques qui nous soient utiles pour nospropres travaux et d’autre part voir en cepartenariat un vivier de recrutement pour nosjeunes talents. De plus nous avons innové enassociant au congrès annuel la journée du ClubVaccinologie et en organisant une session"Formation Médicale Continue". Dernier point trèspositif, le bilan financier de cette manifestation aété plus que bénéficiaire, ce qui nous permettra

d’entreprendre des actions en direction des plusjeunes en attribuant plus de bourses pour laparticipation aux congrès afin que l’immunologiefrançaise soit bien représentée dans des mani-festations scientifiques internationales et nousdonner la possibilité d’envisager la création d’unesubvention de recherche ciblée pour un projet enimmunologie d’intérêt exceptionnel.

Pour finir avec le bilan, je voudrais mentionner lesuccès réel et grandissant du 3ème Cours Méditer-ranéen Supérieur d'Immunologie organisé parFathia Mami-Chouaib du 26 au 30 Octobre 2007 àMarrakech au Maroc. Il a répondu aux attentesexigeantes des participants et a donné unegrande satisfaction à notre Société, celle d’impul-ser la naissance de la Société Marocained’Immunologie.

Cette année l’activité de nos laboratoires va êtreévaluée par une nouvelle structure, l’Agenced’Evaluation de la Recherche et de l’Enseigne-ment, qui a pour objectif d’établir une évaluationunique pour l’ensemble des structures derecherche. Si l’on s’attache uniquement à larecherche d’excellence, je ne suis pas convaincuque cela soit la bonne façon de procéder. Larecherche universitaire ou hospitalière a descontraintes que n’a pas la recherche des EPST.Elles ont toutes leur utilité mais ne remplissent pasles mêmes fonctions. L’évaluation unique compa-rative ne va pas favoriser la recherche de hautniveau, nécessaire pour survivre aux défis quenous impose la compétition internationale. Elleaura au contraire tendance à tirer vers le bas lesénergies créatrices, et à décourager les plustalentueux d’entre nous. La seule façon de sauverce type de recherche est d’abord d’imaginer unsystème qui se renouvelle constamment sansgénérer de précarité, en établissant par exempledes passerelles entre l’enseignement, l’hôpital etla recherche, et surtout un système qui soitsusceptible d’attirer l’élite des générations à venir,ce qui fait défaut depuis déjà un certain temps.Cela à un coût, et notre pays doit être convaincuqu’il s’agit là d’une priorité nationale. Ceci est,bien entendu, une réflexion personnelle quin’engage que moi.

Je vous présente mes meilleurs vœux pour l’année2008, qu’elle soit bénéfique à vos activitésscientifiques.

ACTUALITÉS

ÉDITORIAL2008 est une année de tous les défis p. 1

SFIRapport Moral p. 2Rapport Annuel du Trésorier 2006 p. 4SFI - Assemblée Générale du 28/11/2007 p. 5

HOMMAGEHommage à Panayotis Liacopoulos p. 7

PRIX SFIPrix Jacques Oudin 2007 p. 8Prix Jeune Chercheur p. 10Prix Présentation Orale p. 15Prix Poster p. 25

BRÈVES1/ Les multiples visages des cellules NK p. 352/ Le contrôle du VIH parles lymphocytes T CD8+ : identifierdes corrélats de protection p. 383/ Identification dans la moelleosseuse humaine d’une population deprogéniteurs lymphoïdes capables decirculer et de coloniser le thymus p. 404/ Utilisation du potentiel immuno-suppresseur des Lymphocytes TCD4+CD25+Foxp3+ dans la préventiondes mécanismes de rejet aigus etchroniques après allogreffe de tissuset d’organes p. 42

COMPTE RENDUUn partenariat réussi entre la SFIet ImmunID p. 44

SFILa vie de la SFI en 2008 p. 48

S o c i é t é F r a n ç a i s e d ' I m m u n o l o g i e

S ommaire

Janvier 2008 N° 117

SFIEditorial

ISSN 0998 - 2000

2008 EST UNE ANNÉEDE TOUS LES DÉFISPar Armand Bensussan, Président de la SFI

L’ouverture de l’AssembléeGénérale a été faite par le PrésidentArmand Bensussan, qui a souhaité labienvenue aux nouveaux membres et a saluéle travail accompli par les sortants. Il asouhaité que chacun puisse continuer à sonniveau à la bonne santé de la société. Il aregretté une insuffisante participation desadhérents à ce moment important de la viede la Société qu'est l'Assemblée Générale.

Il a tout d’abord donné la parole à BrigitteAutran, Trésorière, qui devait participer à unpoint-presse portant sur l'action menée par laSFI sur "l'Immunologie et la vaccination”,thème retenu par la SFI pour célébrer le "Dayof Immunology". De manière argumentée,elle a très clairement présenté le rapportfinancier (voir document annexe) en prenantle soin de détailler les objectifs scientifiquesde chaque item et en insistant sur la volontéde la SFI de proposer des actions finan-cièrement équilibrées et correspondant aumieux à l'attente des adhérents. Elle a tenu àpréciser que les effectifs de la SFI étaient ànouveau en réelle progression et qu'il étaitimportant que chaque membre déclaré de laSFI paie sa cotisation chaque année. Le prixde celle-ci a été maintenu et les moins de

SFIACTUALITÉS 2

30 ans et étudiants bénéficient d'uneréduction conséquente. Néanmoins, pouralléger les charges de trésorerie, il estdemandé à chacun de payer le plusrapidement possible. De plus, suite au soldepositif du bilan financier du CongrèsEuropéen ECI 2006 organisé à Paris, la SFI adécidé de mener une politique plus dyna-mique en faveur des actions visant à mieuxassurer le développement de l'Immunologie(bourses de voyage, aides à la participationd'étudiants-doctorants au congrès nationald'Immunologie, partenariats à l'organisationde réunions, prix SFI d'Immunologie). Enfinun effort continu sera fait en faveur del'amélioration fonctionnelle du secrétariat etd'un développement adapté des outils decommunication de la SFI.

Le Président Armand Bensussan a ensuiterepris la parole pour dresser le bilan moral del'année écoulée. Rappelant que la SFI fondéeen 1966 par Pierre Grabar était composée àla fois de scientifiques, d'hospitalo-univer-sitaires et de cliniciens, il a commenté etexplicité les actions menées pour répondreau mieux à la diversité de notre communautéet assurer une meilleure reconnaissance del'Immunologie en France et à l'étranger. Il aaussi indiqué que dans le contexte actuel, laSFI se devait d'être dynamique et visible danstous les domaines où sa compétence étaitnécessaire et devait promouvoir toutesactions indispensables à la reconnaissancejustifiée de l'immunologie.

Tout d'abord il a mis en avant le succèsremporté par les trois clubs de la SFI. Le ClubCytokines, qui fêtait son 10e anniversaire sousforme de colloque, a réuni plus de 120participants du 14 au 16 Mai au Croisic. LeClub Autoimmunité/Immunopathologie,organisé en partenariat avec Club Rhuma-tismes et Inflammation a rassemblé au moins250 participants, le 25 Mai à l'Institut Pasteurde Paris. Enfin le Club Vaccinologie a faitvenir au moins 160 participants du 11 au 12Décembre 2006 à l'Institut Pasteur de Paris. Achaque fois les comités organisateurs ont misen place des programmes qui ont réellementséduit les personnes présentes. Dans chaquecomité, les membres du CA (respectivementHans Yssel, Nathalie Thiéblemont, JoëlPestel, Brigitte Autran, Nathalie Bonnefoy-Bérard) ont joué leur rôle de coordination.

Il a souligné l'importance des Cours d'Immu-nologie qui représentent une des actionsprioritaires de la SFI. En 2007, le CoursSupérieur Méditerranéen d'Immunologie a

RAPPORT MORAL

Fait conjointement parle Président de la SFIArmand Bensussanet le Secrétaire GénéralJoël Pestel

Rapport annuel

L ’Assemblée Générale s'esttenue à Lyon, le Mercredi 28Novembre entre 13h15 et

14h15, juste avant la session del'après-midi portant sur "InteractionsHôtes-Pathogènes"

Compte tenu de la plage horaireproposée, la participation àl'Assemblée Générale (AG) a étésupérieure à celle de l'annéeprécédente, mais est restée encorelimitée aux personnes habituées etsoucieuses du bon fonctionnementde la Société. Néanmoins comptetenu des procurations adresséesà la SFI et collectées par notresecrétaire Solange Gouëllain, lequorum a été atteint et l'AG a puse dérouler dans un réel climat deconvivialité et d'échange

SFIACTUALITÉS 3

mis principalement à contribution FathiaMami-Chouaib. En effet, le 3e Cours Méditer-ranéen Supérieur d'Immunologie a eu lieu auMaroc du 26 au 30 Octobre à la Faculté desSciences et Techniques de Marrakech. Il aporté sur le thème "De l'ImmunologieFondamentale à l'Immunologie anti-Parasitaire” et a réuni près de 90 étudiants engrande majorité du Maghreb. L'organisationdu cours a aussi mobilisé les Sociétésd'Immunologie Tunisienne et Algériennemais aussi la toute nouvelle Sociétéd'Immunologie Marocaine créée à cetteoccasion. D'un point de vue financier, il estimportant de souligner l'apport conséquentdu Réseau International des Instituts Pasteur(demande relayée par Jean-Luc Guesdon) etde l'aide significative de l’IUIS. La SFI, par cecours, contribue ainsi à promouvoir l'immu-nologie dans les pays francophones et enassurer son développement au travers denouvelles sociétés.

A signaler que cette année, le Cours Nationald'Immunologie animé par Michel Fougereauet Paul Guglielmi n'a pas eu lieu à Carry-le-Rouet ; il a été décidé de le déplacer au moisde Mars 2008 pour éviter d'être trop près ducours Méditerranéen.

Il a ensuite mis en avant certains pointsparticuliers du Congrès National quireprésente le point d'orgue des activités dela SFI. Il a souligné sa parfaite organisation àl'ENS de Lyon sous la responsabilité deNathalie Bonnefoy-Bérard. Il a précisé que,cette année, la thématique ciblée sur"l'Immunité, Infection et Vaccination” avaitpu être adossée à celle du Club deVaccinologie qui a été relancée depuis un anpar Brigitte Autran. Il a également remerciéles personnes qui se sont impliquées dans lasession de Formation Médicale Continue(Nathalie Bonnefoy-Bérard, Brigitte Autran,Jean-François Eliaou) du Congrès et dans lacélébration du "Day of Immunology" (BrigitteAutran).

Il a félicité la tenue d'un Atelier Technolo-gique “Approche globale des répertoiresimmunitaires : de la recherche au diagnosticex-vivo”, grâce à l'implication de SylviaCohen-Kaminsky. Ainsi, la SFI s'efforcevéritablement d'avoir un rôle prépondérantdans la diffusion des divers aspects del'immunologie.

Il a finalement présenté les grandes actionsde l'année à venir :• le 18e Cours d'Immunologie de la SFI quiaura lieu à Carry-le-Rouet du 12-15 mars2008 sur le thème : "Le système immunitaireà la jonction des pathologies" ;

• le Club Cytokines (5-7 mai, Le Croisic) ;• le Club Autoimmunité/Immunopathologie(29 Mai, Institut Pasteur, Paris) en partenariatavec le Club Rhumatismes et Inflammation,qui abordera la thématique “Lymphocytes Trégulateurs et maladies auto-immunes” ;

• le Congrès Annuel SFI qui aura lieu du 25 au28 Novembre au palais de l'UNESCO à Pariset qui fera le point sur les déficits immuni-taires et les pathologies des muqueuses ;

• le 4e Cours Méditerranéen Supérieurd'Immunologie qui aura lieu à l'InstitutPasteur de Tunis sur le thème de “Infectionet Immunité” avec la participation financièrede l’IUIS.

Pour conclure il a annoncé :• la poursuite des actions de FormationMédicale Continue pour laquelle la SFI esten cours d'agrément auprès de la HAS ;

• la participation à la Journée mondiale del’Immunologie (avec l’EFIS et l’IUIS) ;

• la création d’un nouveau poste de chargéde mission auprès des Sociétés deBiotechnologie ;

• le développement d'une politique d'attri-bution de bourses pour les cours organiséspar la SFI ainsi que pour la participation àdes congrès nationaux et internationaux ;

• la création du “Prix de la Société Françaised’Immunologie” d’un montant de 10 000 €.

La parole est donnée de nouveau auSecrétaire Général Joël Pestel. Au nom del'ensemble du Conseil d'Administration, il aadressé ses remerciements les plus chaleureuxaux membres sortants : Nathalie Bonnefoy-Bérard, Sylvia Cohen-Kaminsky, Fathia Mami-Chouaib, Michel Fougereau, Jean-LucGuesdon, Ali Ouaissi et Nathalie Thiéblemont.Il a proclamé ensuite les résultats des électionsqui valident la présence de nouveauxmembres élus au CA : Marc Dalod, James DiSanto, Jean-François Eliaou, Olivier Garraud,Thierry Idziorek, Jenny Valladeau, Hans Ysselet la réélection de Sophie Caillat-Zucman.

Il a souligné l'effort que la SFI voulait encorefaire pour développer sa politique decommunication. Actuellement, grâce autravail déterminant d’Hans Yssel, qui acontinué à oeuvrer efficacement en tant quechargé de mission, la SFI assure la réalisationde deux bulletins de liaison par année,

diffuse régulièrement des "Newsletters" trèsinformatives et possède un site Web(www.sfi-immunologie.com.fr) qui devient unesource permanente d'informations sur la viede la SFI et dont la fréquentation par lesadhérents augmente régulièrement. En plus,des informations sur la SFI, les bulletinscontiennent des articles scientifiques et desrésumés de congrès. Pour le site, la SFI aencore l'ambition de le rendre plus "onLine" : pour la transmission des "abstracts",pour des inscriptions sécurisées et pourl'élection des membres du CA.

Après avoir donné la liste des nouveauxadhérents (81) et de leurs parrains, il a insistéaussi sur la nécessité des adhérents àrespecter certaines règles inhérentes à la vied'une société savante. Il est demandé auxparrains de contribuer à mieux faire connaîtreles bonnes bases qui permettent à unesociété d'assurer son avenir. Dans cet esprit,et pour faciliter la prise de participation desplus jeunes au futur immédiat de la SFI, unréseau jeune sera mis en place. Desreprésentants des principales villes de Franceoù l'immunologie doit se maintenir et sedévelopper sont actuellement recherchés.Leur mission sera précisée dans uneprochaine Newsletter et sur le site.

Enfin, il a lancé la cérémonie de remise desprix. Le prix Jacques Oudin (Prix LFB/SFI)d'un montant de 10 000 € a été remis, àBahram Bodaghi (PU-PH au Service d’Ophtal-mologie, Pitié-Salpêtrière), par ArmandBensussan, Président de la SFI. Une présen-tation du Pr. Bodaghi a été faite par BenoîtSalomon avant que celui-ci n'exposesuccinctement son travail. Les deux prixjeunes chercheurs d'un montant de 500 € ontété remis par Joël Pestel, au nom de la SFI, àPierre Cavaillès (Grenoble) et Estelle Merck(Lausanne). Ces jeunes chercheurs ont alorsprésenté, en deux diapositives, leur parcoursscientifique.

Après approbation des rapports moraux etfinanciers à l'unanimité des membresprésents l'ensemble du CA a tenu à remerciervivement Solange Gouëllain, notre secrétairequi œuvre quotidiennement à la bonnemarche de la SFI et qui assure, jour aprèsjour, un lien permanent et indispensable avectous les membres de la SFI. En l'absence dequestions, l'Assemblée Générale a été levéeà 14 h20.

SFIACTUALITÉS 4

Rapport annuel suite

Rapport annueldu trésorier 2006

SFI

Comptes annuels de la S.F.I. - année 2006

Produits 194 557 € (2006)332 477 € (2005)

Charges 219 882 € (2006)343 878 € (2005)

Insuffisances - 25 325 € (2006)- 11 401 € (2005)

2005 2006

Clubs SFI Produits 43 457 70 452Charges 37 358 46 081Excédent 6 099 24 371

Cours Produits 43 958 44 340annuel SFI Charges 37 673 45 002

Excédent 6 285Insuffisance - 662

Congrès Produits 127 140annuel SFI Charges 133 213

Insuffisance - 6 073

Bioforma Produits 22 604 17 224Charges 16 675 16 395Excédent 5 929 829

Fonctionnement Produits 95 317 62 541Charges 118 958 112 404Insuffisance - 23 641 - 49 863

Résultat Produits 332 477 184 521d’exploitation Charges 343 878 219 882

Insuffisance - 11 401 - 25 325

Cotisations SFI

2002 2003 2004 2005 2006 2007Cotisants 700 700 712 746 714 798

Membres 50 60 60 62 65 6575 90 90 92 95 95

Juniors/Séniors 20 20 20 20 23 23

Budget prévisionnel 2007

• Clubs SFI : + 15 235 (2006: + 24 371 / 2005: + 6 099)

• Cours annuel : + 1 511 (2006: - 662 / 2005:+ 6 285)

• Congrès annuel : + 21 755 (2006: 0 / 2005: - 5 390 )

• Bioforma : + 2 379 (2006: + 829 / 2005: + 5 929)

• Administration : - 36 752 (2006: - 49 863 / 2005: - 23 642)

• Congrès ECI EFIS : + 57 855

SFIACTUALITÉS 5

Nouveaux Membres Parrains

ACHACHI Amine INSERM U 851 CERVI, Lyon Anca Hennino, Marc Vocanson

ADRIOUCH Sahil INSERM U519, IFR23 Rouen Oliver boyer, Michel Seman

ASHOUR HossamM. Dept Microbiologie/ImmunologieUniversité du Caire, Armand Bensussan, Joël Pestel

AYDIN Afrem Stagiaire M2 Immunologie, Paris 6 Brigitte Autran, Joël Pestel

BAGUET Joël INSERM U 851 CERVI, Lyon Christophe Arpin, Yann Leverrier

BEAUVILLAIN Céline INSERM U654, CHU Angers Alain Chevailler, Pascale Jeannin

BENNAR Amal Etudiante Master 2 BCM, Paris Brigitte Autran, Joël Pestel

BERROU Jeannig INSERM U662, Hôpital St-Louis, Paris Nuala Mooney, Antoine Toubert

BEYRATH Julien UPR9021 CNRS IBMC, Strasbourg Sylvie Fournel, Christopher Mueller

BISMUTH INSERM U567-Institut Cochin, Paris Armand Bensusssan, Salem Chouaib

BLIN WAKKACH Claudine GEPITOS,K2943, CNRS-UNSA Faculté Médecine, Nice Hans Yssel, Pascale Plence

BOUCHAUD Grégory INSERM U601, Institut de Biologie, Nantes Yannick Jacques, Anne Godard

BOUHLAL Hicham INSERMEO351 Faculté Médecine Amiens Kaïss Lassoued, Jean-Pierre Marolleau

BOURGEOIS Elvire CNRS UMR 8147Hôpital necker, Paris Herbelin André, Jöel Pestel

BRIZZI Fanny INSERMU841, Faculté deMédecine de Créteil Carole Elbim, Jérôme Estaquier

BURELOUT Chantal Fac Médecine Univ.Laval, Québec, Canada Lahlou Hadji, Aimé Vazquez

CHAIX Julie CIML, Marseille Marion Espelli, Stéphane Mancini

CHAUVINEAU Angélique Lab. Immunologie PBS- CHU, poitiers Jean-Marc Gombert, Anne Barra

COUPET Charles-Antoine INSERM U 851 CERVI, Lyon Yann Leverrier, Martine Tomkowiak

DEBEER Sabine INSERM U 851 CERVI, Lyon Marc Vocanson, Anca Hennino

DERCAMP Christophe INSERM U851, IFR 128 - Lyon Dominique Kaiserlian, Bertrand Dubois

DEVAUD Christel UMR 5164, Bordeaux Myrial Capone, Jean-Luc Taupin

DI DOMIZIO Jeremy EFS RA Service R&D INSER U823 La Tronche Caroline Aspord, Laurence Chaperot

DIANA Julien INSERMU561, Hôpital St-Vincent de Paul, Paris Agnès Lehuen, Jean Davoust

DUBOIS Bénédicte Etudiante, Immunotechnologie, Paris Brigitte Autran, Joël Pestel

DUMOUXMaud Institut Jacques Monod, Paris Brigitte Autran, Joël Pestel

FAVIER Benoit Rech Hémato/Immuno(CEA),Hôp.St-Louis Paris Edgardo D. Carosella, Nathalie Rouas-Freiss

FOURMENTRAUX Emmanuelle INSERM U 753, IGR, Villejuif Anne Caignard, Salem Chouaib

FOURNÈS Bénédicte LFB, Courtaboeuf Nadine Fernandez, Brigitte Autran

FRANCISZKIEWICZ Katarzyna INSERM U 753, IGR, Villejuif Salem Chouaib, Fathia Mami-Chouaib

FRANCOIS Stéphanie Immunologie, Fac Méd.Pharmacie Chu de Rouen François Tron, Olivier Boyer

GADZINSKI Adeline CEA iBiTec-S/Spi, Gif-sur-Yvette Armand Bensusssan, Brigitte Autran

GARCIA DE PACO Elvira IBBMC Université Paris-Sud, Orsay Jean Kanellopoulos, Rodolphe Auger

GAUTRON Anne-Sophie INSERMU561, Hôpital St-Vincent de Paul, Paris Agnès Lehuen, Sophie Caillat-Zucman

GHITTONI Raffaella INSERM U 851 CERVI, Lyon Yann Leverrier, Martine Tomkowiak

GIQUEL Benoît INSERM U561, Hôpital St-Vincent de Paul, ParisAgnès Lehuen, Gilles Chiocchia

GIRARDMarc Pr. Honoraires des Universités Paris 7,Paris Armand Bensussan, Joël Pestel

GOLDSTEIN Jérémie Etudiant Immunologie, Paris Brigitte Autran, Joël Pestel

HACINI-RACHINEL Feriel INSERM U851, IFR 128 - Lyon Dominique Kaiserlian, Bertrand Dubois

HANNANI Dalil EFS RA Service R&D INSER U823 La Tronche David Laurin, Françoise Gabert

HAZIOT Alain INSERM U662 IUH Hôpital Saint-Louis, Paris Antoine Toubert, Nuala Mooney

HUBERT Sandra Faculté Médecine Pharmarcie, Rouen Brigitte Autran, Joël Pestel

JEGOU Jean-François INSERM U 758, CERVI, Lyon Julien Marie, Branka Horvat

KANJARAWI Reem INSERM U851, IFR 128 - Lyon Dominique Kaiserlian, Nathalie Etchart

LAPRÉE Geneviève INSERMU841, Faculté deMédecine de Créteil Armand Bensussan, Andreas Tsapis

LATINNE Dominique Cliniques Universitaires St-Luc, Bruxelles Hervé Bazin, Michel Fougereau

LATOUR Sylvain INSERM U 768 Hôpital Necker, Paris Alain Fischer, Genevière de Saint Basile

LECLERC Céline Etudiantemaster 2 Immunotechnologie Paris 6 Brigitte Autran, Joël Pestel

LEPELLEY Alice INSERM U255 C. Rech. Biomédicales Cordeliers, Paris Brigitte Autran, Joël Pestel

LEVASSEUR Franck INSERMU561, Hôpital St-Vincent de Paul, Paris Agnès Lehuen, Sophie Caillat-Zucman

LOUIS Stéphanie INSERM U 567 Institut Cochin, Paris Michelina Nascimbeni, Anne Hosmalin

MAAROF Ghyath INSERM U764, Clamart Pierre Galanaud, Ali Dalloul

MANSUY Adeline INSERM U590, Centre Léon Bérard, Lyon Claudine Vermot-Desroches, Nathalie Bonnefoy-Bérard

MARIOTTE Delphine Lab.Immunologie, CHU Clémenceau, Caen Jean-Jacques Ballet, Elisabeth Comby

S F IAssemblée Générale,du 28 novembre 2007

L'ENS de Lyon

Assemblée générale

� � � suite page 6

SFIACTUALITÉS 6

Les membres du Conseild’Administration

Armand Bensussan - PrésidentInserm U841, Faculté de Médecine de Créteilarmand.bensussan@creteil.inserm.fr

Joël Pestel - Secrétaire GénéralUMR CNRS 8017, IFR 118, SN3 Université desSciences et Technologies de Lillejppestel@orange.fr

Sophie Caillat-Zucman - Secrétaire GénéralAdjointInserm U561, Pariscaillat@paris5.inserm.fr

Brigitte Autran - TrésorierPUPH, Université Paris VI Pierre et Marie Curiebrigitte.autran@psl.ap-hop-paris.fr

Conseillers

Michel CognéFaculté de Médecine, UMR CNRS 6101, Limogescogne@unilim.fr

Marc DalodCentre d’Immunologie de Marseille-Luminydalod@ciml.univ-mrs.fr

James Di SantoInserm U668-Institut Pasteur, Parisdisanto@pasteur.fr

Jean-François EliaouLaboratoire d’Immunologie-CHU St Eloi,Montpelliereliaou@montp.inserm.fr

Gilbert FaureCHU & Faculté de Médecine UHP UniversitéHenri Poincaré, NancyGilbert.Faure@medecine.uhp-nancy.fr

Olivier GarraudE.F.S. Auvergne-Loire, St Etienneolivier.garraud@efs.sante.fr

Noëlle GenetetFaculté de Pharmacie de Rennesnoelle.genetet@chu-rennes.fr

Paul GuglielmiCNRS FRE 3009 BIO-RADpguglielmi@sysdiag.cnrs.fr

Thierry IdziorekInserm U837, Lillethierry.idziorek@lille.inserm.fr

Jenny ValladeauInserm U590 - Centre Léon Bérard, Lyonvalladea@lyon.fnclcc.fr

Hans YsselInserm U844, CHU Saint-Eloi, Montpellieryssel@montp.inserm.fr

MARYANSKI Janet Lynn INSERM U 576, Hôpital de l'Archet, Nice Alain Bernard, Marcel Deckert

MERCIER Blandine INSERM U 851 CERVI, Lyon Nathalie Bonnefoy-Berard, Anne Cottalorda

MICHEL Marie-Laure CNRS UMR 8147 Hôpital Necker, Paris Michel Dy, Maria Leite de Moraes

NAVARRETE Ana Maria UMRS 872-UPMCCentre Recherche Cordeliers, Paris Sébastien Lacroix-Desmazes, Sophie Siberil

PARENT Isabelle INSERM U 567 Institut Cochin, Paris Michelina Nascimbeni, Anne Hosmalin

PIAGGIO Eliane UMR7087-UPMC/CNRS Hôpital Pitié Salpétriêre, Paris Benoît Salomon, José cohen

PICARD Capucine CEDI, Pav Kirmisson, Hôpital Necker Jean-François Eliaou, Frédéric Rieux-Laucat

POMBOGREGOIRE Isabel INSERM U 851 CERVI, Lyon Chantal Rabourdin-Combe, Mathias Faure

POYET Gaëlle INSERM U 851 CERVI, Lyon Anca Hennino, Marc Vocanson

RAPETTI-VACHIERI Laëtitia INSERM U591, Faculté Necker, Paris Corinne Tanchot, Elke Schneider

REA Delphine U.Thérapie Cellulaire Hôpital St-Louis, Paris Antoine Toubert, Joël Pestel

REMTOULA Natacha INSERM U841, Faculté de Médecine de Créteil Armand Bensusssan, Brigitte Autran

RENSON Patricia AFSSA U. Virologie et Immunologie,PloufraganGaëlle Kuntz-Simon, Joël Pestel

RODET Karen INSERM U 851 CERVI, Lyon Marc Vocanson, Anca Hennino

ROMAGNE François Dr Scientifique Innate-Pharma, Marseille Michel Fougereau, Armand Bensussan

ROY Edwige INSERM U653 Institut Curie, Paris Tafuri Anna, Faure Florence

SADAKA Charlotte INSERM U 653 Institut Curie, Paris Bénédicte Manoury, Ana Tafuri

SCOTET Emmanuel INSERM U601, Institut de Biologie, Nantes Francine Jotereau, Yannick jacques

SEMIRAMOTH Nicolas INSERM U 756, Faculté de Pharmacie, Chatenay Malabry Sylvie Chollet-Martin, Aude Gleizes

SLOMA Ivan INSERM U662, Hôpital St-Louis, Paris Catherine Gélin, Nuala Mooney

TORRES David INSERM U547-U774 Institut Pasteur de Lille Joël Pestel,Philippe Gosset

VANBERVLIET Béatrice INSERM U 851 CERVI, Lyon Anca Hennino, Marc Vocanson

VARTHAMAN Aditi UMRS 872-Equi16 Centre Recherche Cordeliers Paris Sophie Siberil, Sébastien Lacroix-Desmazes

WAKKACH Abdelilah GEPITOS,K2943, CNRS-UNSA Faculté Médecine, Nice Hans Yssel, Pascale Plence

WEISBUCH Sébastien CEA/DRDC/ImmunID, Grenoble Sylvia Cohen Kaminsky, Nicolas Pasqual

WINCKER Norma Orvacs Hôpital Pitié Salpêtrière, Paris Brigitte Autran, Béhazine Combadière

WINTER Nathalie Institut Pasteur, UGM Paris Christine Servet-Delprat, Béhazine Combadière

Démissions n°

DUMAZ Nicolas 3320ESPAGNOLLE Nicolas 3204GARRIGUE Jean-Luc 1800KAHI Sandrine 3064RIZZITELLI Alexandra 3026SAMMUT Bénédicte 1766

Retraités

BLYTHMAN Hildur 492KEROS Richard 665RUBIN Bent 1235

Décès

MACHY Patrick 1153GERMAN Albert 88

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SFIACTUALITÉS 7

L e Dr Panayotis Liacopoulos a mar-qué l’immunologie française etinternationale par l’originalité de ses

travaux et son implication dans la commu-nauté scientifique. Médecin Grec, sa passionpour la recherche, l’a conduit en 1951 dans leservice du professeur Pasteur Valérie-Radot àl’hôpital Broussais qu’il ne quittera qu’en1984 pour diriger l’Institut Pasteur d’Athènes.Le service de PVR était alors un service depointe en allergologie et sa contribution danscette discipline sous la direction duPr Bernard Halpern fut particulièrementremarquée. Après la création de l’Institutd’Immunobiologie-Unité 20 de l’Inserm,Panayotis Liacopoulos se consacra àl’immunologie fondamentale dans unepériode passionnante où l’immunologie, desérologique devenait cellulaire puis molé-culaire. Il s’est intéressé très tôt aux questionscentrales de la discipline, essentiellement latolérance immunitaire et la compétitionantigénique. Il a laissé son nom en démon-trant que, pendant la phase d’induction detolérance envers un antigène donné, il y avaitabsence de réponse immunitaire enversd’autres antigènes non apparentés àl’antigène tolérogène. Cette périoderéfractaire permettait notamment d’induireune tolérance de transplantation chez lesanimaux adultes.

La théorie clonale de Sir Macfarlane Burneten 1957 (un lymphocyte-un anticorps) trèsfructueuse pour expliquer beaucoup dephénomènes immunologiques, ne satisfaisaitpas totalement Liaco (nom familier pour sescollègues et collaborateurs), notamment pourmettre en évidence (avec les connaissancesde l’époque) la notion de compétitionantigénique. Les débats étaient passionnés(voire plus) entre clonalistes et anti-clonalisteset Liaco faisait partie de ces derniers. Je fus

son collaborateur à cette époque parti-culièrement controversée. Contre ce quidevint le dogme de Burnet il était particu-lièrement difficile de faire accepter les articlessur la bipotentialité des lymphocytes B dansles meilleures revues internationales, ce quimalgré tout fut fait. Ces travaux cependantpassaient pour "hérétiques". Il fallut attendreune célèbre revue de Fritz Melchers (un denos principaux contradicteurs à l’époque) en2004 dans «Nature» rendant compte destravaux de Matthias Wabl de la même année,pour admettre qu’un lymphocyte pouvaitproduire deux anticorps de spécificitésdifférentes avec des implications importantesconcernant l’autoimmunité par rupture de latolérance au soi et selon nous sur l’ampli-fication du répertoire B.

Panayotis Liacopoulos succéda au Pr BernardHalpern à la direction de l’Institut d’Immuno-biologie en 1977, mandat qu’il exercerajusqu’en 1984 pour diriger ensuite l’InstitutPasteur d’Athènes jusqu’en 1986. Il effectuasa carrière française au CNRS, participa auxcommissions scientifiques à l’Inserm et auCNRS en apportant une contribution signi-ficative aux différentes réformes de cesinstituts. Il publia 159 articles scientifiques etde nombreux ouvrages d’intérêt général. Ilfut éditeur aux Annales de l’Institut Pasteur etmembre fondateur de la Société Françaised’Immunologie aux côtés de Pierre Grabar.

Liaco est décédé le 27 septembre 2007 danssa quatre vingt-huitième année. J’adresse aunom de ses élèves et collaborateurs monsoutien à son épouse Monique, immuno-logiste également, chercheur CNRS et qui atravaillé à ses côtés à l’hôpital Broussais, ainsiqu’à ses enfants Hélène et Christophe qu’ilaimait tant.

JACQUES COUDERCREND HOMMAGEA PANAYOTISLIACOPOULOS

(30 Novembre 1919 -27 septembre 2007)

jamacou@libertysurf.fr

P rix JACQUES OUDIN

SFIACTUALITÉS 8

L es inflammations intraoculairesreprésentent la quatrième cause decécité dans le monde. D’étiologies

diverses, la majorité d’entre elles est enrapport avec une origine auto-inflammatoire,touchant des jeunes patients et entraînant unemorbidité importante. Une origine infectieuseest retrouvée dans 25% des cas et l’inflam-mation demeure idiopathique dans 33% descas (1). Malgré les avancées thérapeutiquesdurant les dix dernières années, la prise encharge actuelle de cette affection reposeessentiellement sur la corticothérapie généraledont les effets indésirables demeurentimportants. Des stratégies d’administrationintraoculaire de cette molécule ont été misesau point mais la fréquence des complicationscomme la cataracte et le glaucome corti-soniques est non négligeable. Ainsi, les essaiscliniques prometteurs portant sur lesdispositifs intraoculaires à libération prolongéed’acétonide de fluocinolone ont mis enévidence la survenue d’une cataracte dansplus de d’un glaucome dans 51,1% des caset d’une cataracte dans 19,8% des cas,34 semaines après l’implantation (2). La multi-plication des nouvelles stratégies immuno-modulatrices basées sur l’interféron alpha, lesanti-TNF-a et d’autres agents biologiques estune avancée certaine mais les indications, lesposologies et les rythmes d’administrationdoivent être mieux déterminées dans l’avenir(3). L’utilisation des immunosuppresseurs parvoie locale est un sujet en pleine expansion (4).Les insuffisances et les effets indésirables desthérapeutiques pharmacologiques nous ontencouragés à mettre au point une stratégieimmunomodulatrice plus ciblée basée sur lathérapie cellulaire dans cette indication.

La première étape de notre travail a consistéà développer un nouveau modèle expéri-mental d’inflammation oculaire chez la souris.En effet, les modèles d’uvéite disponiblesjusqu’à présent sont tous basés sur l’auto-immunité pure survenant après immunisationcontre les auto-antigènes rétiniens ou issusd’autres tissus oculaires (5-7). Un fondgénétique permissif est généralement requis.Nous avons mis au point un modèle d’uvéitechez la souris BALB/c, basé sur l’expressionde l’hémagglutinine (HA) du virus influenza auniveau des cellules de la rétine externe etinterne, après transfert de gène à l’aide devecteurs AAV (8). Cette expression peutintéresser les cellules des couches les plusinternes de la rétine après administrationsous-rétinienne ou les cellules ganglionnaires(couche externe) après injection intra-vitréenne. Il s’agit d’une expression stable

IMMUNO-MODULATION DESUVÉITES SÉVÈRESPARADMINISTRATIONDE CELLULES TRÉGULATRICES OUD’IMMUNOGLOBULINESINTRAVEINEUSES

Bahram Bodaghi

Service d’OphtalmologieUMR 7087,Université Pierre et Marie Curie, Paris

bahram.bodaghi@psl.aphp.fr

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LE PRIXJACQUES OUDIN2007 de rechercheen immunologieclinique

Le Pr Bahram Bodaghi, lauréat du PrixJacques Oudin 2007, pour son travail surImmunomodulation des uvéites sévères estProfesseur des Université et PraticienHospitalier à l'Assistance Hôpitaux Publiquede Paris au sein du Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière.

Le Prix Jacques Oudin de Recherche enImmunologie Clinique attribué par leLaboratoire Français du Fractionnement etdes Biotechnologies et la Société Françaised’Immunologie récompense un travail derecherche ayant des applications cliniquesdans les domaines de l'auto-immunité oudes déficits immunitaires. Le montant duprix est 10 000 €.

La remise du prix a eu lieu lors du Congrèsannuel 2007 de la Société Françaised'Immunologie à Lyon. La rédaction félicitetrès chaleureusement le Pr Bodaghi et leremercie d'avoir préparé un résumé de sestravaux pour cette édition du bulletin.

ou polyclonaux, afin de moduler l’intensité del’uvéite expérimentale. Cette administration aété réalisée soit par voie systémique soit parvoie intra-vitréenne, concomitamment ou àdifférents moments après l’induction del’uvéite. La réduction de l’inflammationoculaire a été évaluée par examen bio-microscopique, complétée par cytométrie deflux et analyse histopathologique. Nosrésultats indiquent un contrôle significatif desmécanismes inflammatoires intraoculaires etdes destructions tissulaires après admini-stration de lymphocytes T régulateurs spéci-fiques par voie systémique ou intraoculaire,mais aussi de LT régulateurs polyclonaux parvoie intravitréenne.

Nous finalisons actuellement les analysescomplémentaires portant sur cette immuno-modulation cellulaire afin de définir lenombre de cellules T régulatrices minimalesnécessaires. En effet, plusieurs points doiventêtre élucidés comme par exemple lameilleure voie d’administration, le nombre decellules nécessaires, le moment idéal pourl’injection, la durée d’efficacité de chaqueinjection. Cette étape demeure capitale pourdéfinir les conditions optimales d’un essaithérapeutique chez l’homme. Il faudraensuite évaluer l’innocuité de ce typed’injection chez l’homme. L’administration demolécules pharmacologiques au sein du vitréest devenue une stratégie thérapeutique àpart entière chez les patients atteints dedégénérescence maculaire liée à l’âge,d’occlusion de la veine centrale de la rétineet de rétinopathie diabétique. Les avantagesde ce type d’approche sont multiples. En

effet, la quantité de cellules nécessaires pourune injection intraoculaire est significa-tivement inférieure à celle utilisée en injectionsystémique. De plus, l’accès aux structuresintraoculaires est plus facile que pourd’autres organes et tissus. La biomicroscopie,les méthodes d’imagerie angiographique etde tomographie en cohérence optique sontfacilement réalisables.

Par ailleurs, nous utilisons ce modèle d’uvéiteafin d’évaluer l’effet thérapeutique dedifférentes molécules pharmaceutiquesclassiquement utilisées au cours de l’uvéitechez l’homme, incluant les corticoïdestopiques et systémiques mais aussi lesimmunoglobulines intraveineuses. L’efficacitédes IvIg a été rapportée chez les patientsatteints d’une forme strictement oculaired’uvéite qu’est la birdshot rétinochoroï-dopathie (9,10). Cette affection au pronosticvisuel réservé survient quasi exclusivementchez des patients HLA-A29 positifs (Figure 2).Les IvIg permettent, au moins dans la phaseinitiale de la maladie, d’éviter le recours à lacorticothérapie et aux immunosuppresseurs.En cas d’inflammation plus sévère, ellespourraient jouer un rôle d’épargne corti-sonique. Une autorisation de mise sur lemarché a été délivrée dans cette indication.Les données expérimentales actuellementdisponibles sur l’utilisation de ces moléculespourraient être revisitées grâce à ce modèle.De plus, l’effet des IvIg sur les cellules T

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durant plus de 3 mois. Nous avons ensuiteinjecté aux souris exprimant la molécule HAau niveau de la rétine, des lymphocytes TCD4+CD25– effecteurs issus de souristransgéniques exprimant un TCR spécifiquede HA. Un infiltrat de LT a été clairementidentifié au niveau de la rétine démontrant lefranchissement de la barrière hémato-rétinienne de façon spécifique. La quan-tification de l’infiltrat inflammatoire intra-oculaire a été réalisée par cytométrie de fluxet l’importance des lésions tissulaires a étéévaluée en histologie (Figure 1). L’intensitéde l’inflammation intraoculaire obtenue estplus modérée que celle observée avec lesautres modèles disponibles permettant ainsiune approche thérapeutique appropriée.L’inflammation oculaire survient dans plus de90% des cas après un délai de 14 jours. Cedélai est réduit si l’activation de la populationT effectrice est réalisée in vitro avec alors undélai de 4 à 8 jours.

Dans un second temps, nous avons utilisé leslymphocytes T régulateurs spécifiques de HA

RÉFÉRENCES

1. Bodaghi B et al 2001. Chronic severe uveitis:etiology and visual outcome in 927 patientsfrom a single center. Medicine 80:263-270.

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3. Imrie FR & Dick AD 2007. Biologics in thetreatment of uveitis. Curr Opin Ophthalmol18:481-486.

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9. LeHoang P et al 2000. Intravenousimmunoglobulin (IVIg) for the treatment ofbirdshot retinochoroidopathy. Ocul ImmunolInflamm 8:49-57.

10. Tellier Z 2007. Human immunoglobulins inintraocular inflammation. Ann N Y Acad Sci1110:337-347.

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Figure 1Destruction de l’architecture rétinienne etinfiltration inflammatoire après administrationsystémique de LT effecteurs spécifiques de HAchez la souris (EPR: épithelium pigmentaire dela rétine).

Figure 2Uvéite postérieure sévèreau cours d’une "birdshot"rétinochoroïdopathie.

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RÉGULATION DESRÉPONSESIMMUNITAIRES PARLES RÉCEPTEURS NKEXPRIMÉS PAR LESLYMPHOCYTES TCONVENTIONNELS

Estelle Merck

Institut Ludwig pour la Recherche surle Cancer, Lausanne, Suisse

Estelle.Merck@licr.unil.ch

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régulatrices a récemment été mis enévidence. Ainsi, l’administration prophy-lactique d’IvIg pourrait prévenir la survenuede l’encéphalomyélite allergique expé-rimentale. Nous pensons que ce modèlenous permettra d’évaluer les 2 approchesthérapeutiques dans l’indication de l’uvéite.Hormis l’épargne cortisonique obtenuegrâce aux IvIg, les corticoïdes pourraientaltérer la fonction des LT régulateurs in vivo.Nous espérons préciser ces questions grâceaux expériences complémentaires.

La perspective finale de ce travail estl’élaboration d’un essai de thérapiecellulaire chez les patients atteints d’uvéitesévère avec corticodépendance à seuilélevé. La prévalence de l’uvéite chezl’homme est de l’ordre de 200/100000habitants. La majorité de ces inflammationssont d’origine auto-inflammatoire. Plus de15% des patients nécessitent des fortesdoses de corticoïdes et d’immunosuppres-seurs pour contrôler l’inflammation. Nosdonnées précliniques semblent indiquerque l’approche T régulatrice polyclonalepourrait être proposée dans cette indi-cation, dans un avenir proche. Par ailleurs,certaines uvéites sont la conséquence d’uneinfection antérieure, entraînant des phéno-mènes inflammatoires secondaires endehors de toute réplication de l’agentpathogène. Le meilleur exemple est l’uvéitede reconstitution immunitaire chez lespatients atteints du SIDA avec un anté-cédent de rétinite à cytomégalovirus. Il estparfois difficile de contrôler l’uvéite chez cespatients malgré la reconstitution immuni-taire efficace et l’absence de réplicationvirale.

L’œil représente un organe facilementaccessible pour une stratégie de thérapiecellulaire au cours des pathologies inflam-matoires primitives ou secondaires. Lasurveillance de l’efficacité thérapeutique etde la tolérance est relativement aisée grâceaux méthodes d’imagerie moderne. Cetteapproche pourrait compléter l’arsenalthérapeutique actuellement disponible etaméliorer le pronostic visuel final de cespatients.

L'auteur tient à remercier vivement sescollègues Céline Terrada, Sylvain Fisson,Yvonne de Kozak, Phuc LeHoang, DavidKlatzmann et Benoît Salomon des unitésInserm UMRS872 et U598 au CentreBiomédical des Cordeliers à Paris.

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P rix jeune chercheur

PRIX "SFI"

L ors de son dernier congrès annuel2007 à Lyon, la SFI a décerné les deuxprix "Jeune Chercheur" de 500 €

chacun à Estelle Merck et Pierre Cavaillespour leurs études intitulées “Régulation desréponses immunitaires par les récepteurs NKexprimés par les lymphocytes T convention-nels” et “Toxo1, un locus majeur de pré-disposition à l'infection toxoplasmique”. Lescinq prix "Meilleure présentation orale"(250 €) ont été décernés à Claudine Blin-Wakkach (Différenciation des cellulesdendritiques en ostéoclastes, une voie aucœur des interactions ostéoimmunologiques),Christel Devaud (Étude du potentiel anti-tumoral de lymphocytes T gd réactifs contre lecytomégalovirus), Isabelle Isnardi (Lesrécepteurs dépendant de IRAK-4 et MyD88sont nécessaires à l’élimination des lympho-cytes B anti-nucléaires chez l’homme), JulienDiana (La coopération des cellules TNKinvariantes et des cellules dendritiquesplasmacytoides prévient le développement dudiabète viro-induit) et Franck Levasseur (Levirus de l’hépatite C échappe à la réponse NKdépendante de NKG2D en altérant l’équilibreIL-15/TGFb). Les six prix "Meilleur poster"(150 €) ont été décernés à Valérie Abadie(Induction différentielle de l'immunité àmédiation cellulaire induite par le "ModifiedVaccinia virus Ankara" administré par voieintradermique ou intramusculaire), MustaphaBerri (Clonage moléculaire et fonctionnelle dela chemokine CCL28: Implication possibledans la domiciliation des plasmocytes à IgAdans la glande mammaire), Blandine Mercier(L’engagement de TLR2 à la surface des lym-phocytes T CD8+ diminue leur seuil d’acti-vation), Roudaina Nasser (Anticorps mono-clonal 667 : plus qu'un effet neutralisant),Alexis Rossignol (Les lymphocytes iNKTHumains CD4+CD161-CCR7+ et CD4+CD161+CCR7- présentent respectivement desphénotypiques et des fonctions de type"Mémoire Centrale" et "Mémoire Effectrice")et Muriel Tahtouh (Caractérisation fonc-tionnelle de molécules homologues à desfacteurs du complément dans le systèmenerveux de la sangsue).

La rédaction félicite très chaleureusement leslauréats et les remercie d'avoir préparé unrésumé de leurs travaux pour cette édition dubulletin.

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De nombreuses études des réponses induitespar les récepteurs à ITAM et ITIM des cellulesNK ont souligné le rôle de ces récepteurs dansle déclenchement de la réponse immunitaire.Divers stimuli peuvent induire ce type designalisation : les composés venant depathogènes, la détection de changements dephénotype, les molécules dites de stress, lescellules tumorales ou les cellules infectées.L’expression de récepteurs inhibiteursappartenant à cette famille de récepteurs NK,en particuliers ceux des familles KIR chezl’homme et Ly49 chez la souris, connus pourreconnaître les molécules de CMH (ComplexeMajeur d’Histocompatibilité) de classe I, a étédétectée sur des sous-populations delymphocytes T périphériques. Les récepteursNK activateurs sont très rarement observés surles cellules T, mais semblent apparaître danscertaines pathologies et sont alors expriméspar les lymphocytes T auto-réactifs (4-9).L’activation des lymphocytes T via le TCR peutêtre modulée par les récepteurs NK (10), cesactivateurs sont généralement considéréscomme ayant un rôle de co-stimulation, maisla pertinence fonctionnelle de ces derniersrécepteurs est encore peu comprise.

Cependant, les résultats de certaines étudesrécentes soulignent le lien entre l’expressiondes récepteurs activateurs NK et les maladiesauto-immunes. L’expression de récepteurs NKactivateurs reconnaissant les molécules deCMH de classe I (i.e. KIR2DS2) a tout d’abordété décrite sur les cellules T CD4 CD28nulauto-réactives des patients atteints decomplications vasculaires liées à l’arthriterhumatoïde. L’engagement de KIR2DS2n’active pas directement les cellules T maisaugmente la prolifération et la productiond’IFN-g induites par des anticorps anti-CD3(4,5). Au contraire, des fonctions indépen-dantes de l’engagement du TCR peuvent êtredéclenchées par l’engagement de cerécepteur, KIR2DS2, par des cellules T CD4CD28nul auto-réactives infiltrant les plaquesd’artériosclérose des patients atteints desyndrome coronariens aigus (6). Les sous-populations de cellules T, qui expriment enparticulier la chaîne à ITAM DAP12, sontcapables de tuer des cellules cibles vial’engagement de KIR2DS2. De plus, dans lamaladie coeliaque, l’expansion oligoclonalemassive de lymphocytes cytotoxiques intra-épithéliaux est liée à de profond changementsgénétiques de ces cellules, qui expriment unnombre croissant de molécules NK, enparticulier de récepteurs NK activateurs etDAP12 (7-9). Ceci est d’autant plus marquéque la maladie progresse, et certains

A u sein du système immunitaire, labalance entre les signaux acti-vateurs et les signaux inhibiteurs

permet une réplique adéquate face à unpathogène, ainsi que la modération de laréponse effectrice, qui trop forte ou prolongéeest pourrait s’avérer délétère pour l’hôte. Eneffet, une activation excessive et persistantedu système immunitaire peut entraîner desdommages sévères aux tissus, des dys-fonctionnements circulatoires, des maladiesauto-immunes qui peuvent être fatales pour lepatient. Le système immunitaire a parconséquent développé des mécanismes decontrôle visant à obtenir une réponse auxpathogènes d’intensité et de durée appro-priées, évitant ainsi des réponses trop fortes.Un des mécanismes de régulation desréponses immunitaires est accompli par desactions enzymatiques, concertées maisopposées, de kinases et de phosphatases.C’est le cas de la famille des récepteurssignalant par les motifs ITAM (immuno-receptor tyrosine based activation motif) etITIM (immunoreceptor tyrosine basedinhibition motif). Ces récepteurs, tels que lesrécepteurs de reconnaissance antigénique descellules B et T (respectivement, BCR et TCR),les récepteurs de reconnaissance du soi descellules NK (KIR) ou les récepteurs desimmunoglobulines (FcR), contrôlent lesréponses des phagocytes, des cellules NK, etdes lymphocytes T et B. Les récepteursactivateurs sont généralement associés à deschaînes de signalisation, telles que FcRg, CD3zet DAP12, portant le motif ITAM.

Les activités de recherche que j’ai jusqu’àprésent menées s’inscrivent dans unemeilleure compréhension du déclenchementde la réponse immunitaire et de son contrôleminutieux défini par l’équilibre des signauxITAM et ITIM. Elles ont été concentrées surl’étude de récepteurs activateurs, signalant parles chaînes à ITAM, exprimés par les cellulesimmunitaires. Après m’être consacrée, lors dema thèse, à la caractérisation moléculaire etfonctionnelle de hOSCAR (1-3), récepteurassocié à la chaîne FcRg ayant un rôle dans laprésentation antigénique et l’activation descellules myéloïdes, mes recherches post-doctorales sont actuellement consacrées aurôle des récepteurs NK activateurs, signalantvia DAP12, qui peuvent être exprimés d’unemanière aberrante par les lymphocytes Tconventionnels des patients souffrant demaladies inflammatoires chroniques ou demaladies auto-immunes.

lymphocytes T sont alors capables de produiredes cytokines, de proliférer et de tuer descellules cibles, via l’engagement de récepteursactivateurs NK. Dans toutes ces pathologies, laréponse dépendante de l’antigène etl’environnement riche en cytokines inflam-matoires semblent être des pré-requis pourl’expression des récepteurs NK activateurs parles lymphocytes T et probablement pour leursfonctions. Ces études soulèvent la question durôle des récepteurs NK activateurs dans ledéclenchement de réponses indépendantesdu TCR, qui peuvent avoir de lourdesconséquences pour l’hôte. Peu de donnéessont disponibles sur les mécanismes et lesfonctions biologiques de cette expressionaberrante des récepteurs NK activateursreconnaissant le CMH de classe I, enparticulier sans environnement inflammatoireou auto-immun. A ce jour, aucune étude dansun modèle murin utilisant le transfert de gènestable n’a analysé directement le rôle desrécepteurs NK activateurs dans les réponsesimmunitaires excessives de l’hôte due àl’activation aberrante des lymphocytes T.

Les récepteurs NK de la famille Ly49,homologues fonctionnelles des KIR chezl’homme, sont des lectines de type C. Lesrécepteurs inhibiteurs Ly49 lient les moléculesde CMH de classe I murines. Les récepteursactivateurs Ly49 reconnaissent également lesmolécules de CMH de classe I, mais avec uneplus faible affinité, ainsi que des moléculeshomologues codées par les virus. Ly49D,récepteur activateur, est associé avec la chaîneà ITAM DAP12. (11). Les molécules de CMH declasse I souris H-2Dd ou hamster Hm1C4semblent induire l’activation cellulaire parl’engagement du récepteur Ly49D (12,13), alorsque certaines études ne détectent pas dereconnaissance de H-2Dd par Ly49D (13,14).

Les souris transgéniques exprimant lerécepteur Ly49D (Ly49D Tg), ainsi que lachaîne associée DAP12, sur les lymphocytes T(15), offrent la possibilité d’appréhender et demieux comprendre le rôle des récepteurs NKactivateurs et la signalisation à ITAM viaDAP12 dans la biologie des lymphocytes T.

L’utilisation de la lignée de hamster CHO, quiexprime la molécule de CMH de classe I dehamster Hm1-C4, connu pour être un ligand àforte affinité du récepteur Ly49D, permet detester in vitro les fonctions du récepteur NKsur les lymphocytes T ab conventionnels. Laco-culture de splénocytes Ly49D Tg avec des

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CHO et leur stimulation par des anticorpsimmobilisés anti-Ly49D permettent d’engagerles récepteurs Ly49D exprimés par leslymphocytes T. On peut alors observerl’acquisition d’un phénotype de cellulesactivées par les lymphocytes T CD4+ et CD8+(CD69+CD62L-CD69+). Les lymphocytes TLy49D+ sécrètent des cytokines (le TNF-a parles lymphocytes T CD4+ et les CD8+, l’IFN-gpar les lymphocytes T CD8+ mémoires).Toutes ces fonctions peuvent être abrogéespar la présence d’un anticorps solublebloquant anti-Ly49D, démontrant l’implicationdu récepteur Ly49D dans l’activation cellulaire.L’activation prolongée par CHO ou anti-Ly49Dpermet aux lymphocytes T CD4+ et CD8+ desurvivre et de proliférer en absence de facteurexogène de survie. L’engagement de Ly49D àla surface des lymphocytes T permet donc uneactivation et une prolifération comparables àcelles observées après l’engagement du TCRpar un peptide (i.e. peptide LCMV GP33). Lescellules T CD8 étant plus promptes à proliférersuite à l’activation via Ly49D, nous nous inté-ressons au rôle de Ly49D sur les lymphocytes TCD8+ cytotoxiques (CTL). En utilisant la lignéeCHO comme cible, nous pouvons démontrerque l’engagement de Ly49D déclenche la lysecellulaire. L’utilisation d’anticorps bloquantdémontre que cette lyse est dépendante durécepteur Ly49D et indépendante ducomplexe CD8/TCR. Une expérience de lyseredirigée avec l’anticorps anti-Ly49D permetde déterminer que le seul engagement durécepteur NK activateur déclenche l’activitécytolytique des cellules T CD8+ effectrices(CTL). Nous nous sommes ensuite intéressés àla capacité de Ly49D, de non seulementd’activer les cellules T naïves, mais égalementde permettre la génération de cellules Teffectrices. Comme les lymphocytes T CD8+sont particulièrement sensibles à l’activationvia Ly49D et prolifèrent fortement, nousétudions le phénotype des cellules T CD8+après 3 jours de stimulation avec les anticorpsimmobilisés anti-Ly49D. Les cellules T CD8+Ly49 Tg expriment fortement CD44 etfaiblement CD62L, mais il faut la présence derhIL-2 dans la culture pour que les cellulesstimulées par les anti-Ly49D présentent uneforme blastique (FSC haute). Ces cellules ontalors des capacités effectrices, commedémontré par leur forte capacité à sécréter del’IFN-g. La production d’’IFN-g par les cellulesLy49D Tg stimulées par anti-Ly49D et rhIL-2est comparable à celle observée avec descellules effectrices exprimant un TCR Tg (P14)et générées en présence de peptide (LCMVGP33). Il est à noter que pour ce dernier typede stimulation la présence de rhIL-2 n’est pas

requise pour obtenir des cellules T CD8+effectrices. De plus, ces cellules Ly49D Tgeffectrices sont bien capables d’induire la lysede cellules cibles suite à l’engagement duTCR, comme démontré par un test de lyseredirigée en présence d’un anticorp anti-CD3.Plus important, la génération de celluleseffectrices par l’engagement de Ly49D, dansun premier temps, permet également à cescellules de déclencher une lyse cellulaireenvers des cibles qui expriment un ligand pourle récepteur NK. En effet, les CTL Ly49D Tgdifférenciés en présence d’anti-Ly49D et derhIL-2 sont capables de lyser des CHO ou dedéclencher leur activité cytotoxique dans untest de lyse redirigée en présence d’anti-Ly49D. Le seul engagement de Ly49D estdonc capable de lier les fonctions des cellulesT naïve et effectrices, en permettant l’activa-tion cellulaire, la prolifération et la différen-ciation en cellules effectrices T CD8+, quigardent alors la capacité de déclencher la lysecellulaire suite à un engagement secondairedu récepteur NK.

La disponibilité, au sein du laboratoire, desouris transgéniques exprimant la molécule deCMH de classe I souris (H-2Dd Tg) permet demieux appréhender le rôle physiologique deLy49D. Le transfert adoptif de lymphocytes TLy49D Tg, isolés de la rate, dans des sourishôtes H-2Dd Tg permet d’étudier le rôle durécepteur Ly49D sur les lymphocytes T ab

conventionnels circulant en périphérie et dansles organes lymphoïdes secondaires. Lescellules retrouvées dans la rate et lesganglions ont proliférées. Comme dans lesexpériences in vitro, la capacité à proliférer estplus forte pour les cellules T CD8+. L’analysede leur phénotype indique qu’elles sontactivées, avec une augmentation transitoire de

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CD69, une diminution transitoire de CD62L etl’acquisition maintenue d’un fort niveaud’expression pour CD44. Seule la co-injectionde ligands de TLR ou de peptide, ou l’utilisa-tion de souris hôtes H-2Dd Tg sous-létalementirradiées, permettent aux lymphocytes TLy49D Tg injectés de circuler en périphérie etde s’accumuler dans la souris. L’analyse finedes facteurs nécessaires et suffisants pour ledéclenchement d’activités des lymphocytes Tpouvant être néfastes à l’hôte est actuellementà l’étude dans ce modèle souris.

Nos résultats démontrent qu’un large paneld’activités cellulaires peut être déclenché surles lymphocytes, en particulier CD8, par unrécepteur autre que le TCR, ouvrant donc lavoie de l’activation de ces cellules del’immunité adaptatrice par un autre méca-nisme qu’une reconnaissance antigénique(Figure). A côté de la reconnaissance desmolécules classiques de CMH de classe I parle complexe TCRab/CD8, le signal 1 d’activa-tion lymphocytaire peut être alors égalementobtenu par la reconnaissance de cesmolécules par un récepteur NK activateur, telque Ly49D. Ainsi l’engagement des récepteursNK activateurs à la surface des lymphocytes Tconstitue un mode d’activation autonome quipeut contourner la nécessité de la signalisationTCR pour activer les cellules T et déclencherleur activité cytotoxique, renforçant l’hypo-thèse que l’expression aberrante de ce typede récepteurs peut briser la tolérance au soi.Par l’expression des récepteurs NK activateurs,les lymphocytes T perdent leur alors dépen-dance à la reconnaissance antigénique, etpeuvent potentiellement répondre à desstimuli endogènes ou viraux. Ainsi, leslymphocytes exprimant d’une manièreaberrante les récepteurs NK activateurs de

RÉFÉRENCES

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TOXO1, UN LOCUSMAJEUR DEPRÉDISPOSITION A L'INFECTIONTOXOPLASMIQUE

Pierre Cavailles

LAPM, UMR 5163 CNRS-UJFGrenoble

pcavaill@ujf-grenoble.fr

2

P rix jeune chercheur suite

reconnaissance de molécules de CMH declasse I ou homologues, tels que ceuxprésents dans le cas de maladies auto-immunes ou de désordres inflammatoireschroniques, acquièrent des fonctionseffectrices semblables à celles des NK, serapprochant alors d’un mode de contrôle dela réponse immunitaire innée.

T oxoplasma gondii est un parasiteubiquitaire à développement intra -cellulaire obligatoire. L’infection se

fait par ingestion de kystes contenus dans lesviandes parasitées ou d’oocystes présents surdes légumes souillés par les fèces de chat. Latoxoplasmose touche la plupart des homéo -thermes. Habituellement asympto matique,cette parasitose persiste sous une formechronique, suite à l’enkystement de brady -zoïtes "dormants" dans les tissus de l’hôte,en particulier le cerveau (1). Elle menace lasanté dans deux situations : (1) au cours de lagrossesse, l’infection congénitale peutentraîner chez le fœtus des lésions oculaireset cérébrales sévères et irréversibles ; (2) chezdes sujets immunodéprimés, la réactivationd’une infection latente peut être responsabled’une encéphalite mortelle (2).

Les mécanismes de prédisposition à latoxoplasmose restent mal connus. Lesmodèles animaux sont utilisés pour lesétudier. Jusqu'à présent, les modèlesanimaux de toxoplasmose ont surtout étédéveloppés chez la souris. Cependant, latoxoplasmose chez la souris n'est pasreprésentative de la pathologie humainepuisque l'infection se traduit par une maladieaiguë pouvant conduire à la mort de l'animal.Le rat qui ne développe pas de maladieaiguë mais, comme l'homme, une maladiechronique avec induction d'anticorps anti-toxoplasme et apparition de kystes intracérébraux, représente un meilleur modèleexpérimental de la pathologie humaine (3).Le rat Lewis (LEW) se différencie des autressouches de rat par une résistance totale àl’infection. L’absence d’anticorps anti-toxoplasme et de parasite, suite à l’infection,indique que la dissémination parasitaire esttotalement prévenue (4). La résistance desrats F1 hybrides de première génération,issus du croisement de la souche réfractaireLEW et une souche susceptible BN, suggèrele caractère dominant de ce contrôle géné -tique. Le sexe, l'âge, la charge parasitaire, lesystème majeur d'histocompatibilité n'ontpas d'effet sur cette résistance. À l’aide dechimères hémato poïétiques, nous avonsmontré que la résis tance du rat LEW s’exercevia des cellules du système immunitaire (4).Une étude de liaison sur des rats hybrides dedeuxième génération a identifié sur lechromosome 10 une région contrôlant larésistance à l’infection toxo plasmique (5). Celocus a été baptisé Toxo1. Des lignéesréciproques LEW et BN congé niques pourdifférentes régions de Toxo1 ont étédéveloppées. Les études réalisées à l’aide deces lignées ont confirmé les résultats de

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l’étude de liaison et permis de localiserToxo1 dans un intervalle réduit. Surtout, ellesont montré que la résistance ou la suscep -tibilité à la toxo plasmose dépendentexclusivement de l’ori gine génomique deToxo1, quel que soit par ailleurs le reste dugénome (5). L’issue de l’infection toxo -plasmique apparaît donc con trôlée par Toxo1selon un mode mendélien.

Il est habituellement admis que la susce p-tibilité aux agents infectieux résulte d’inter -actions entre différents gènes et l’environ -nement. Le contrôle de l’infection est doncpar essence multifactoriel. Cependant, danscertains cas, l’issue d’une infection peut êtresous le contrôle d’un seul gène. Desmutations naturelles de la lignée germinaleaffectant le système immunitaire selon unmode de transmission mendélien, et asso -ciées à une sensibilité ou à une résistanceparti culière à un agent infectieux, ont pu êtreainsi identifiées chez l’homme et la souris (6).Par exemple, la résistance à l’infection parPlasmodium vivax est observée dans des casde mutations du gène DARC (Duffy antigenreceptor for chemokines) chez l’homme, et larésistance aux infections par des pathogènesintracellulaires est associée chez la souris àdes mutations du gène Nramp1 (natural resis -tance-associated macrophage protein 1, ouSlc11a1, solute carrier family 11 number 1).Cette approche de génétique directe apermis de mieux comprendre les méca -nismes immunitaires de défense contre lesagents infectieux et de découvrir la spécificitévis-à-vis d’agents pathogènes de certains deces mécanismes. L’identification du (des)gène(s) de Toxo1 contrôlant l’issue del’infection toxo plasmique fournit l’occasionde découvrir une nouvelle voie physio -pathologique.

Le mécanisme d’élimination du parasite chezle rat LEW est très efficace. Le toxoplasme atotalement disparu de l’organisme dès lespremiers jours de l’infection, et la réponseanticorps vis-à-vis du parasite est inexistante.Sachant que la résistance s’exerce via lescellules hématopoïétiques et que le macro -phage joue un rôle majeur dans la défensecontre Toxoplasma gondii, nous avonsanalysé le sort du parasite en présence desmacrophages péritonéaux in vitro et ex vivo.Les résultats montrent que Toxo1 contrôle laprolifération de T. gondii dans ces macro -phages. Une inhibition de 90% du taux decroissance du parasite est observée quandToxo1 est d’origine LEW en comparaisonavec le niveau de prolifération lorsque Toxo1est d’origine BN. Par contre, dans des cellulesnon hématopoïétiques, telles que lesfibroblastes, le niveau de prolifération du

parasite est identique quelle que soitl’origine génomique BN ou LEW de la régionToxo1. L’analyse des premiers stades del’infection indique que le parasite est capabled’envahir et de former une vacuole parasito -phore fonctionnelle dans les macrophagespermissifs comme dans les macrophages nonpermissifs. Les résultats obtenus indiquentque le contrôle de l’infection par Toxo1s’exerce après la phase d’invasion à travers laréponse du macrophage qui contrôle lamultiplication intracellulaire du parasite(Figure) .

T. gondii est connu pour ses propriétés anti-apoptotiques que le parasite utiliserait pourproliférer dans la cellule hôte (7). L’analyse, parincorporation d’iodure de propidium, de laviabilité des macrophages infectés a permisde montrer une induction de mort cellulairetrès rapide (4H) dans les macro phages nonpermissifs d’origine LEW. Cette induction demort par le parasite concerne 40 à 50% desmacrophages LEW alors que dans le cas desmacrophages BN ce phénomène reste mineur(environ 10 à 15% des cellules). L’analyse deslignées congéniques montre que ce phéno -type de mort cellulaire est contrôlé par le locusToxo1 et qu’il corrèle avec l’inhibition de laprolifération parasitaire. N’ayant pu mettre enévidence ni fragmen tation de l’ADN niactivation des caspases, il semble que cettemort cellulaire s’apparen terait à de la nécrose(Cavaillès et al en préparation).

Le taux d’invasion des macrophages parT.gondii étant d’environ 20%, la mortcellulaire concerne aussi bien les macro -phages infectés que non infectés. Desexpériences préliminaires indiquent que, lesurnageant des macrophages, et en parti -culier, la production de monoxyde d’azote(NO) ou de radicaux libres oxygénés, ne sontimpliqués ni dans l’inhibition de la prolifé -ration du parasite ni dans l’induction de mort.Ces deux phénotypes étant certainementliés, la poursuite de nos travaux vise àcomprendre les mécanismes responsables de

Figure. Modèle du mode d’action de Toxo1 surle contrôle de la prolifération parasitaire par lesmacrophages.Nous avons montré qu’à la suite d’un contactinitial parasite/macrophage, T. gondii estcapable d’envahir et de former une vacuoleparasitophore dans les macrophages, quel’origine génomique de Toxo1 soit celle de lasouche non permissive LEW (MØToxo1_LEW) oucelle de la souche permissive BN (MØToxo1_BN).En revanche, le parasite s’avère incapable deproliférer dans les macrophages MØToxo1_LEWalors qu’il prolifère normalement dans lavacuole parasitophore des MØToxo1_BN (5). Deplus, après 6 heures de contact avec T. gondii,nous avons observé une forte proportion decellules mortes chez les MØToxo1_LEWcontrairement aux MØToxo1_BN (Cavaillès et al.en préparation).

l’induction de mort des macrophages suite àl’infection parasitaire.

Toxo1 s’étend sur 1,5 mégabases en posi tionq24 sur le chromosome 10, dont la régionsynthénique chez l’homme est 17p13. Celocus contient plusieurs dizaines de gènesidentifiés chez le rat ou suspectés pargénomique comparative. L’identi fication dugène, ou groupe de gènes, impliqué dansl’issue de l’infection suit une double stratégie.Les études fonctionnelles visent à analyser,aux niveaux biochimique et moléculaire, lesmécanismes du contrôle de la proliférationdu parasite par les macrophages. Lesrésultats sur la mort des macrophages ontdéjà permis de sélec tionner des gènescandidats impliqués dans l’inflammation etdans l’induction d’une mort cellulaire.

Le travail de dissection génétique est parailleurs poursuivi. Nous sélectionnons desrats, issus de croisements en retour à partirdes lignées congéniques déjà créées,caractérisés d’un point de vue génomiquepar des recombinaisons dans Toxo1. L’étudede l’issue de l’infection chez ces ratspermettra de localiser le(s) gène(s) decontrôle dans un intervalle plus réduit en vuede son (leur) identification.

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En conclusion, ces études génétiques etfonctionnelles devraient révéler une voiephysiopathologique majeure de l’immunitéinnée dans le contrôle de maladies infec -tieuses. Le criblage des variants alléliquesassociés à la « susceptibilité » à la toxo -plasmose devrait permettre d’identifier chezl’homme, les sujets à risque (surveillance dela primo-infection chez les femmesenceintes ou les patients immuno-déprimés). En médecine vétérinaire, lasélection d’animaux d’élevage résistantspourrait diminuer d’une part, les perteséconomiques liées aux avortements etd’autre part, indirectement l’incidence de latoxoplasmose chez l’homme. Enfin, lacompréhension des mécanismes impliquésdans le contrôle de l’infection devraitpermettre le dévelop pement de nouveauxoutils pharmaco logiques pour prévenir ettraiter la toxoplasmose.

DIFFÉRENCIATIONDES CELLULESDENDRITIQUES ENOSTÉOCLASTES, UNE VOIE AU CŒURDES INTERACTIONSOSTÉOIMMUNOLO-GIQUES

Claudine Blin-Wakkach

GEPITOS, FRE2943, CNRSUniversité de Nice Sophia-AntipolisNice

blin@unice.fr

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PRIXPRÉSENTATIONORALE

“ 5 prix “présentation orale” (250 €)ont été décernés. Les lauréats sont :

Claudine Blin-Wakkach (Différenciationdes cellules dendritiques en ostéoclastes,une voie au cœur des inter actions ostéo-immunologiques),Christel Devaud (Étude du potentiel anti-tumoral de lymphocytes T gd réactifscontre le cytomégalovirus), Isabelle Isnardi (Les récepteurs dépendantde IRAK-4 et MyD88 sont nécessaires àl’élimination des lympho cytes B anti-nucléaires chez l’homme), Julien Diana (La coopération des cellulesTNK invariantes et des cellules dendri -tiques plasmacytoides prévient ledéveloppement du diabète viro-induit), Franck Levasseur (Le virus de l’hépatite Céchappe à la réponse NK dépendante deNKG2D en altérant l’équi libre IL-15/TGFb).

P rix présentation orale

L 'ostéoimmunologie est une disci -pline récente axée sur l'étude desinteractions entre systèmes immu -

nitaire et osseux. En effet, les infectionschroniques et les maladies autoimmunes etinflammatoires sont souvent associées à unelyse osseuse (pour revue réf. 1). Le systèmeimmunitaire participe à ce processus, via lasécrétion de cytokines produites au cours dela réponse immune et capables de moduler ladifférenciation et/ou l'activité des cellulesosseuses. Ainsi, les lymphocytes T CD4+activés produisent des cytokines inflam -matoires et ostéoclastogéniques pouvant

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affecter la différenciation des ostéoclastes(OCLs), cellules responsables de la dégra -dation de la matrice osseuse (2).

Depuis plusieurs années, nous nousintéressons aux relations entre le systèmeimmunitaire et les ostéoclastes. Les OCLs sontdes cellules géantes multinucléées qui sedifférencient à partir du même précurseurmonocytaire que les cellules dendritiques(DCs). Il existe donc également des liensdéveloppementaux entre systèmes osseux etimmunitaire. Deux facteurs sont indispen -sables à cette différenciation, le macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) et lereceptor activator of NF-KB ligand (RANK-L).Ces facteurs sont produits dans la moelleosseuse par les cellules stromales et lesostéoblastes. Cependant, les lymphocytes Tactivés sont capables moduler la productionde RANK-L via la secrétion de cytokines oud'exprimer directement du RANK-L (3).

RANK-L se lie sur son récepteur RANK,récepteur de la famille du récepteur du TNF(TNFR), exprimé essentiellement sur lesprécurseurs ostéoclastiques, les OCLsmatures et les cellules dendritiques (DCs).Cette liaison a pour conséquence l'activationde voies de signalisation qui sont essentiellesà la différenciation et l'activité des OCLs. MaisRANK-L intervient également dans la surviedes DCs et dans l'activation des cellules T parles DCs (pour revue réf. 1). De plus, il a étérécemment démontré que, lorsqu'elles sontcultivées en présence de RANK-L et de M-CSF, des DCs générées in vitro à partir demonocytes humains ou de précurseurs de lamoelle de souris, peuvent se différencier enOCLs fonctionnels (4,5).

Les DCs sont traditionnellement considéréescomme des cellules à demi-vie courte et à unstade final de différenciation. Cependant,elles ont une grande plasticité dévelop -pementale et fonctionnelle qui peut êtreinfluencées par leur environnement (6). Lescellules stromales de la rate induisent ladifférenciation des DCs matures en unepopulation de DCs ayant des propriétésrégulatrices et pouvant inhiber la proliférationdes cellules T (7). Cultivées en milieu condi -tionné par des cellules tumorales, des DCsgénérées in vitro peuvent donner des cellulesde phénotype endothélial (8). De plus, dansl'histiocytose langerhansienne, une patho -logie caractérisée par une proliférationclonale des DCs de la peau, appelées cellulesde Langerhans, et qui est associée à deslésions osseuses, la présence de cellulesmultinucléées a été rapportée (9). Ces cellulesmultinucléées sont localisées au niveau deslésions de la peau et expriment des

marqueurs des OCLs comme la TRAP, lacathepsine K, le récepteur de la vitronectineou la métalloprotéase 9. Bien que l’origine deces cellules ne soit pas définie, leur présenceest associée à une forte expression defacteurs ostéoclastogéniques dont TNFa, IL6,RANK-L et M-CSF. Une des hypothèsesavancées est que la surexpression de cesfacteurs pourrait favoriser la différenciationdes DCs de Langerhans en OCLs (9).

Ces données, ainsi que nos propres obser -vations, nous ont donc conduit à nousinterroger sur la possibilité que les DCs sedifférencient en ostéoclastes non seulementin vitro, mais également in vivo. Nous avonsanalysé le potentiel ostéoclastogénique dedifférentes sous-populations de DCs purifiéesà partir de la rate de souris. Nos résultats ontmontré qu'en présence de RANK-L et de M-CSF, les DCs conventionnelles CD11chighMHC-II+ se différencient de façon extrême -ment efficace en OCLs fonctionnels, in vitro(10). Ce potentiel de différenciation estconservé même après maturation des DCs.Les DCs plasmacytoïdes CD11clowB220+(pDCs) se différencient également en OCLsfonctionnels in vitro, mais de façon moinsefficace et sur des temps plus longs. Cesdonnées indiquent que, dans certainesconditions riches en facteurs ostéo clasto -géniques, les DCs se comportent donccomme des précurseurs d’OCLs.

Nous avons démontré que cette diffé -renciation est également possible in vivo enutilisant un modèle d'ostéopétrose, la sourisoc/oc. La souris oc/oc est un mutant spontanéprésentant des OCLs totalement différenciésmais inactifs. Cette absence d'activité est dueà une délétion de 1600pb dans le gène Tcirg1codant la sous unité a3 de l'ATPase vacuolaire,responsable de l'acidification nécessaire à ladissolution de la matrice osseuse (11). La sourisoc/oc est caractérisée par une espérance devie de moins de 3 semaines, une augmen -tation généralisée de la densité osseuse etune réduction très importante de la cavitémédullaire. Le transfert de DCs conven -tionnelles CD11chigh MHC-II+, purifiées à partirde la rate de souris normales. permet derestaurer une activité de résorption osseusechez la souris oc/oc (10). Cela se traduit parune augmentation de l'espérance de vie et parla présence d'une cavité médullaire partielle,indiquant que des OCLs actifs sont présentschez les souris oc/oc traitées avec les DCs. CesOCLs expriment la protéine a3 dont le gèneest muté chez la souris oc/oc. Ils ne peuventdonc dériver que des DCs injectées, non-porteuses de la mutation oc.

Nous avons éliminé la possibilité d'uneéventuelle contamination par des cellulesautres que des DCs, grâce au modèletransgénique CD11c-DTR/GFP. Ces souris ontdes DCs CD11c+ normales, mais qui sontsensibles à la toxine diphtérique (12). Enutilisant ces cellules, il est donc possible dedépléter spécifiquement les DCs CD11c+ parinjection de toxine diphtérique, sans altérerd’éventuelles cellules contaminantes quin'expriment pas CD11c. Aucune des souris,injectées avec des DCs issues de souris

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Figure. Mécanisme hypothétique contrôlant ladifférenciation des DCs en OCLs in vivo.Les cellules T CD4+ présentes dans la moelleosseuse de souris oc/oc expriment des fortsniveaux de RANK-L et d'IL-17, ce quicorrespond à un profil de cellules Th17. La production d'IL-17 par ces cellulesentraînerait une élévation importante de laproduction de RANK-L par les cellulesmédullaires stromales. Ce contexte fortementfavorable à la formation d'OCLs, induirait ladifférenciation des DCs dans cette voie ce quiparticiperait donc à une augmentation del'ostéoclastogenèse.

CD11c-DTR/GFP et la toxine dipthérique, nemontre de signe de reprise de résorptionosseuse ou d’amélioration de l’espérance devie (10). Ces résultats indiquent que ce sontbien les DCs qui se sont différenciées enOCLs actifs et qui sont donc responsables dela restauration de la résorption osseuse chezles souris oc/oc traitées.

La différenciation ostéoclastique a lieu dans lamoelle osseuse, et nous avons montré quechez la souris oc/oc, les DCs injectées sontcapables de migrer vers cet organe et de s'yaccumuler. Nous nous sommes donc inté -ressés à l'environnement de la moelle osseusepermettant la différenciation des DCs enOCLs. Nous n'avons pas mis en évidencecette différenciation chez la souris saine. Chezla souris oc/oc, le microenvironnementmédullaire est caractérisé par une très forteexpression de RANK-L et de M-CSF parrapport aux contrôles, ce qui induit uneaugmentation du nombre d'ostéoclastes,mais qui sont inactifs du fait de la mutation oc.Deux types cellulaires sont capablesd'exprimer RANK-L dans la moelle osseuse etd'induire l'ostéoclastogenèse : les lympho -cytes T CD4+ et les cellules stromales.

Nous avons donc cherché à savoir si lescellules T CD4+ pouvaient intervenir dans ladifférenciation des DCs en OCLs in vivo. Nousavons déplété in vivo les souris oc/oc enlymphocytes T CD4+ grâce à l’injectionrépétée d’un anticorps anti-CD4 déplétant.Chez ces animaux déplétés en cellules TCD4+, l'injection de DCs ne permet pasd’augmentation de la survie ni de modifi -cation du phénotype osseux (10). Les cellulesT CD4+ sont donc nécessaires à la formationd’OCLs à partir des DCs in vivo.

Afin de comprendre le rôle des lymphocytes TCD4+ dans cette différenciation in vivo, nousavons analysé, par PCR en temps réel, lesconséquences de la déplétion des cellules TCD4+ sur l’expression de RANK-L et M-CSFL’expression de ces 2 facteurs est fortementaugmentée dans la moelle des souris oc/ocpar rapport aux contrôles. Chez la souris +/+,la déplétion en cellules T CD4+ ne modifie nil’expression de M-CSF ni celle de RANK-Ldans la moelle osseuse. Chez la souris oc/oc,elle n'induit pas de changement d'expressionde M-CSF, mais elle induit une fortediminution de celle de RANK-L qui redevientéquivalente à celle observée chez la souris+/+. Ces données montrent que chez la sourisoc/oc, les cellules T CD4+ sont responsablesde l’augmentation d’expression du RANK-L etque cette expression élevée de RANK-L estnécessaire à la différenciation des DCs enOCLs.

Les cellules T CD4+ peuventcontribuer à la formation desOCLs à la fois en produisantdirectement du RANK-L eten induisant l'expression deRANK-L par les cellulesstromales de la moelle et lesostéoblastes via la sécrétionde cytokines pro-inflam -matoires (3). Parmi celles-ci,l'IL-17 induit une forteaugmentation de l'expres -sion de RANK-L par lescellules stromales (2,13).Nous avons donc caractériséles cellules T CD4+ purifiéesà partir de la moelle osseusede souris oc/oc. L’analysepar PCR en temps réelmontre que ces cellules expriment un niveaude RANK-L un peu plus élevé que celles desouris +/+, mais surtout qu'elles exprimentenviron 10 fois plus d'IL-17 que les cellules TCD4+ de souris +/+ (10). Ce profil d'expres -sion est cara ctéristique d'une sous-populationlympho cytaire T, les cellules Th17 impliquées,entre autres, dans l'ostéolyse induite parl'inflam mation (pour revue réf. 2). L'IL-17participe à l'inflammation en recrutant etactivant des cellules immunitaires et contribueà l'ostéolyse en augmentant l'expression deRANK-L dans les ostéoblastes et les cellulesstromales. Nous avons donc analysél'expression de RANK-L par les cellulesstromales de la moelle osseuse de sourisoc/oc et nos résultats montrent qu'elle estenviron 5 fois supérieure à celle observéedans les cellules stromales de souris +/+ (10).L'ensemble de ces résultats confirme quechez la souris oc/oc, les cellules T CD4+contrôlent l'expression de RANK-L par lescellules stromales, suggérant que l’envi -ronnement médullaire chez ces animaux estproche de celui décrit dans les pathologiesinflammatoires.

En conclusion, nos résultats montrent que lesDCs peuvent être des précurseurs d'OCLs,non seulement in vitro mais aussi in vivo.Cependant, aucun signe de différenciationostéoclastique des DCs n’a pu être mis enévidence chez la souris saine, ni par nous, nipar d’autres. Elle nécessite une expressionélevée de M-CSF et de RANK-L et unenvironnement de type inflammatoire(Figure). Les lymphocytes T CD4+ sontnécessaires à cette différenciation enmaintenant un niveau d'expression élevé deRANK-L dans les cellules stromales. Cetteinduction de l’expression de RANK-L pourraitpasser par l’IL-17 et donc impliquer lescellules Th17 (Figure). La différenciation desDCs en OCLs représenterait donc une

nouvelle voie de différenciation ostéo -clastique. Cette voie serait activée dans uncontexte inflammatoire et pourrait participer àune ostéoclastogenèse élevée, comme lesuggèrent les hypothèses émises dans le casde l’histiocytose langhérensienne ou del’arthrite rhumatoïde (4,9).

Ces données soulignent l'importance desmécanismes de régulation qui existent entrecellules immunitaires et ostéoclastes. Ellesouvrent de nouvelles perspectives pour labiologie des cellules dendritiques et desostéoclastes, mais également pour laphysiopathologie et la thérapie des maladiesostéolytiques inflammatoires.

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pathologie (5). Cette observation a étérécemment renforcée par une étudegénétique de 4 000 individus démontrantque le 3ème gène le plus associé au locus desusceptibilité au diabète de type 1 codepour le récepteur à l’ARN viral IFIH1 (6).Ainsi les virus pourraient induire des patho -logies auto-immunes en activant desréponses T CD8+ délétères. De nombreusesobser vations cliniques et des études demodèles murins suggèrent notamment queles lymphocytes T CD8+ jouent un rôlemajeur dans le diabète de type 1 (7).

Dans cette étude nous avons examiné lerôle des TNKi dans le développement dudiabète de type 1 après une infection viraleet plus précisément si la fonction anti-viralede ces cellules pouvait interférer avec leurfonction régulatrice des réponses auto-immunes. Pour répondre à cette problé -matique nous avons utilisé un modèle desouris transgénique RIP-NP-NOD dont lescellules pancréatiques b productricesd’insuline expriment la nucléo protéine (NP)du Lymphocytic Chorio Meningitis Virus(LCMV) (8). Ces souris développent undiabète une dizaine de jours aprèsl’infection virale, après la génération d’uneréponse anti-virale T CD8+ massive destru -ctrices des cellules b. Pour analyser le rôledes TNKi dans ce modèle, les souris RIP-NP-NOD ont été croisées avec des sourisdéficientes pour ce type cellulaire (CD1d-/-

ou Ja18-/-) ou avec d’autres souris trans -géniques contenant un nombre élevé deTNKi (Va14). Les TNKi des souris RIP-NP-NOD ont aussi été stimulés par l’injectiond’a-GalCer.

L es cellules TNK invariants (TNKi)participent à un grand nombre deréponses immunes innées. Elles

expriment à leur surface un récepteur Tcomposé d’une chaine a invariante Va14-Ja18 et sont restreintes à la molécule CD1dqui présentent des glycolipides (1). Les TNKiont également la particularité de produirerapidement après leur activation de grandesquantités d’IFN-g et/ou d’IL-4 contribuantainsi aux réponses innée et acquise.

Ces cellules ont un rôle dans de nombreusesréponses antimicrobiennes contre lesmycètes, les bactéries ou les virus (1). Pourexemple, après infection par l’HerpesSimplex Virus de type 2, les TNKi sécrètentde l’IFN-g participant ainsi à la réponseinnée (2); en réponse au Virus SyncytialRespiratoire ces mêmes cellules amplifient laréponse adaptative des lymphocytes T CD8+

(3).

Un autre aspect majeur des cellules TNK estleur capacité régulatrice des réponsesimmunes. L’augmentation de leur nombrepar transgénèse ou leur stimulation par desagonistes spécifiques comme l’a-Galacto-side Ceramide (a-GalCer), permet en effetde prévenir l’apparition de pathologiesauto-immunes dans différents modèlesanimaux de diabète ou de sclérose enplaques (4). Cette protection est géné -ralement direc tement associée à unerégulation des réponses Th1 auto-immunes.

Bien que les causes du diabète de type 1(insulinodépendant) restent à déterminer,des études épidémiologiques ont établit unlien entre des infections virales et la

LA COOPÉRATIONDES CELLULES TNKINVARIANTES ET DESCELLULESDENDRITIQUESPLASMACYTOIDESPRÉVIENT LEDÉVELOPPEMENT DUDIABÈTE VIRO-INDUIT

Julien Diana

Inserm U561Hôpital Cochin- Hôpital St-Vincent de PaulParis

julien.diana@paris5.inserm.fr

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P rix présentation orale suite

SFIACTUALITÉS 19

Nous avons donc mis à jour une nouvellevoie de régulation utilisée par les TNKi. Eneffet, après l’infection par le LCMV, les TNKiparticipent au recrutement des cellulesdendritiques plasmacytoïdes (pDC) spécifi -quement dans le tissu pancréatique etstimulent la production d’IFN-a par les pDC.Cette stimulation des pDC par les TNKipermet un contrôle efficace et précoce de laréplication virale dans le pancréas. Le faibletaux viral dans cet organe conduit alors àune réponse lymphocytaire T CD8+ faible,insuffi sante pour induire le développementdu diabète (Figure). De plus, nous démon -trons que les TNKi et les pDC interagissentvia les molécules OX40/OX40L spécifi -quement dans le tissu pancréatiquecontrairement à un tissu lymphoïde commela rate.

Le contrôle de la réplication virale du LCMVdans le pancréas est en accord avec lafonction innée des cellules TNKi et des pDC.D’autres études ont démontré le rôleprotecteur des TNK dans la réponse contrele virus encephalo myocarditis (EMCV), eneffet les souris déficientes en TNKiprésentent un titre viral et une incidence dediabète plus élevé que les souris contrôles(9). Dans notre étude nous démontrons quel’effet anti-viral des TNKi est médié par unestimulation de l’activité des pDC etnotamment leur production d’inter féron detype I, cytokine connu pour inhiber laréplication virale. Le rôle des pDC dans lecontrôle de la réplication du LCMV dans lepancréas a été confirmé par la déplétion dece type cellulaire par un traitement avecl’anticorps spécifique 120G8.

Pour la première fois, nous avons démontréin vivo le rôle critique de l’interactionOX40/OX40L dans l’activation des fonctionsdes pDC dans le pancréas. L’utilisationd’anticorps bloquant anti-OX40L in vivo et invitro ont permis de mettre à jour l’impor -tance de cette molécule pour la productiond’interféron de type I par les pDC. De plus,cette interaction pourrait permettrel’activation des TNKi comme précédemmentdécrit in vitro chez l’homme (10). Il estimportant de noter que l’expression d’OX40par les TNKi est observée uniquement dansle tissu pancré atique contrairement auxtissus lymphoïdes comme la rate ou lesganglions lympha tiques. Ainsi en coculturein vitro, seuls les TNKi triés à partir dupancréas peuvent induire la productiond’interféron de type I par les pDC. Cettecoopération entre deux types cellulaires dusystème inné permet ainsi de contrôlerefficacement la réplication virale et d’éviterla destruction du tissu infecté par une tropforte réponse adaptative.

En conclusion, cette étude démontre queles TNKi jouent un rôle primordial dans laprotection vis-à-vis du diabète viro-induitchez la souris. Ces résultats ont uneimplication majeure en pathologie humaineau regard de la différence de fréquence enTNKi observée entre individu (11) et auregard du rôle des infections virales dans denombreuses pathologies autoimmunes (12).En exemple, les patients SAP- ou XIAP-déficients qui présen tent une faiblefréquence de TNKi, dévelop pent desinfections sévères par le virus Epstein-Barrassociées à une réponse inflammatoiredélétère (13). Ainsi, l’ensemble de cesdonnées suggèrent qu’une stimulationexogène des TNKi pourrait permettre deprévenir des pathologies associées auxinfections virales en activant les fonctionsdes cellules dendritiques plasmacytoïdes.

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Figure. Représentation schématique de lacoopération des cellules TNKi et des cellulesdendritiques plasmacytoides dans le pancréas.Après l’infection virale, les TNKi favorisent lerecrutement des cellules dendritiquesplasmacytoides dans le pancréas. Les deuxtypes cellulaires interagissent via OX40/OX40Lce qui conduit à une stimulation de laproduction d’IFN-g de type I par les pDC. Letaux viral dans le pancréas reste faible ce quigénère une réponse adaptative T CD8+ defaible intensité. Les cellules b sont préservées etle développement du diabète est abrogé.

SFIACTUALITÉS 20

maladies auto-immunes (5). Dans la moelleosseuse, les TLRs exprimés par les lympho -cytes B pourraient ainsi leur permettre demieux percevoir les antigènes du soi etparticiper à l’élimination des lymphocytes Bexprimant des anticorps anti-nucléaires. Enpériphérie, le développement ou l’activationde cellules jouant un rôle dans la sélection deslymphocytes B autoréactifs pourraient égale -ment être modifiés par leur expression deTLRs.

Pour déterminer si l’élimination des lympho -cytes B exprimant des anticorps anti-nucléairesdépend de l’expression des TLRs, nous avonsanalysé le fonctionnement des étapes desélection des lymphocytes B chez 3 patientsdépourvus d’expression de la kinase IRAK-4 etun patient dépourvu d’expression de l’ada -ptateur MyD88 (6). En effet, la signa lisation partous les TLRs, excepté le TLR3, dépend descomplexes IRAK-4/MyD88 (7). Pour réalisercette étude, nous avons tout d’abord trié descellules B uniques, provenant de fractionscellulaires de B nouveaux émigrants, qui sontsimilaires aux lymphocytes B immatures de lamoelle osseuse, et de B matures naïfs. Nousavons ensuite cloné dans des vecteurs lesgènes des chaînes lourdes et des chaîneslégères des immunoglobulines, exprimés parces cellules uniques, puis transfecté cesvecteurs dans des fibroblastes afin de produiredes anticorps recombinants. Nous avons alorstesté la réactivité de ces anticorps par ELISA eten immuno fluorescence. Lorsque la réactivitéde ces anticorps est testée contre unensemble d’antigènes variés (LPS, insuline,ADN double brin ou ADN simple brin), onobserve que seulement une faible proportionde ces anticorps sont polyréactifs dans lesfractions de lymphocytes B nouveauxémigrants (5-8,3%) et matures naïfs (3,5-9,7%)de donneurs sains. Au contraire, chez lespatients déficients en IRAK-4 ou MyD88, laproportion d’anti corps polyréactifs estaugmentée de façon significative, à la foisdans les lymphocytes B nouveaux émigrants(23,1-56,1%) et matures naïfs (23,1-42,1%). Ilsemble donc que ces patients présentent desdéfauts de sélection centrale et périphérique.Les résultats d'une autre analyse par ELISA,dirigé cette fois contre un lysat de cellulesépithéliales humaines (les cellules HEp-2),montrent également une augmentationsignificative de la proportion d’anticorps HEp-2-réactifs chez les patients déficients en IRAK-4et MyD88, comparés aux donneurs sains. Cesrésultats confirment que IRAK-4 et MyD88 sontnécessaires à l’établissement de la tolérancecentrale et périphérique des lymphocytes B

A u cours des premières étapes dudéveloppement des lymphocytesB, la recombinaison aléatoire des

différents segments des gènes desimmunoglobulines génère la très grandediversité du répertoire primaire des anticorps.Cette recombinaison aléatoire peut conduire àla production d’anticorps autoréactifs, et enparticulier d’anticorps anti-nucléaires. Ceslymphocytes B autoréactifs peuvent êtreéliminés par apoptose (délétion clonale),inactivés par une incapacité de répondre à desstimulations antigéniques (anergie), ourecyclés en modifiant la réactivité de leursanticorps grâce à l’expression d’une nouvellechaîne légère résultant de réarrangementssecondaires des gènes des immunoglobulines(‘receptor editing’). Il a été montré que lamajorité des lymphocytes B autoréactifs quisont produits dans la moelle osseuse dedonneurs sains sont éliminés lors de deuxétapes du développement B (1). L’étape desélection centrale a lieu dans la moelleosseuse entre le stade lymphocytaire descellules B immatures précoces et des cellulesB immatures, et est principalement contrôléepar des mécanismes intrinsèques aux cellulesB, qui dépendent de la signalisation par leurrécepteur spécifique pour l’antigène ("B CellReceptor" ou BCR) (2). L’étape de sélectionpériphérique a lieu entre le stade des lympho -cytes B nouveaux émigrants et des lympho -cytes B matures naïfs, et semble plutôt êtrecontrôlée par d’autres types cellulairesinteragissant directement ou indirectementavec les cellules B, comme les lymphocytes Trégulateurs (3). Ces deux étapes sontresponsables de l’établissement de latolérance B chez l’homme.

Les lymphocytes B expriment cependantd’autres récepteurs non-spécifiques quipeuvent reconnaître des antigènes : les "Toll-like-receptors" (TLRs). Ces récepteurs ont étéoriginellement décrits comme reconnaissantdes antigènes provenant de pathogènes, maisdes travaux de plus en plus nombreux lesdécrivent également comme des récepteurscapables de fixer des antigènes du soi (4).Chez l’homme, les lymphocytes B exprimentles TLR7 et 9, qui fixent respectivement desantigènes contenant de l’ARN et de l’ADN,ainsi que le TLR10 qui forme des complexesavec les TLR1 et 6, et dont les ligands sontencore inconnus. Or, il a été montré qu’enpériphérie, la coactivation par un antigènenucléaire du TLR7 (ou 9) et d’un BCR auto -réactif exprimés par des lymphocytes B peutconduire à la sécrétion d’auto-anticorps ce quipourrait jouer un rôle dans l’induction de

LES RÉCEPTEURSDÉPENDANT DEIRAK-4 ET MYD88SONT NÉCESSAIRESA L’ÉLIMINATION DESLYMPHOCYTES BANTI-NUCLÉAIRESCHEZ L’HOMME

Isabelle Isnardi,Eric Meffre

Hospital for Special Surgery etWeill Medical College of Cornell UniversityNew York, USA

isabelle.isnardi@gmail.commeffree@hss.edu

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chez l’homme. Par ailleurs, la protéinetransmembranaire UNC-93B, exprimée dans leréticulum endoplasmique, a été récemmentdécrite étant nécessaire à la fonction des TLRsreconnaissant les antigènes nucléaires, lesTLR3, 7, 8 et 9 (8). Nous avons donc testé laréactivité des anticorps exprimés par leslymphocytes B nouveaux émigrants et maturesnaïfs de deux patients déficients en UNC-93B(9). De la même manière que dans les patientsdéficients en IRAK-4 ou MyD88, on observeune augmentation de la proportion d’anti -corps poly- et autoréactifs par rapport à desdonneurs sains, dans les deux fractionstestées. Les TLR, et en parti culier les TLRreconnaissant des antigènes nucléaires,semblent donc impliqués dans l’établissementde la tolérance B chez l’homme.

Nous avons aussi analysé la présence delymphocytes B exprimant des anticorps anti-nucléaires chez les patients n’exprimant pasde IRAK-4, MyD88 ou UNC-93B. Pour cela,nous avons regardé par immunofluorescenceindirecte, sur des cellules HEp-2 entières, lesantigènes qui sont reconnus par les anticorpsexprimés par les différents patients. Dans lesnouveaux émigrants, on constate uneaugmentation significative de lymphocytes Bexprimant des anticorps anti-nucléaires chezles patients IRAK-4 et MyD88 (7,9-34,1%)comparés aux donneurs sains (0-4%).Cependant, de façon surprenante, il n’y a pasd’augmentation de la proportion de lympho -cytes B nouveaux émigrants exprimant desanticorps anti-nucléaires chez les patientsdéficients en UNC-93B. Nous avons ensuiteconfirmé ces résultats en montrant que laproportion de cellules B exprimant desanticorps anti-chromatine (qui reconnaissent lematériel mitotique de cellules HEp-2 endivision), ou anti-ADN (qui fixent le kiné -toplaste, organelle de l’unicellulaire CrithidiaLuciliae, composé uniquement d’ADN doublebrin) était significativement augmentée chezles patients n’exprimant pas IRAK-4 ou MyD88par rapport aux donneurs sains, maisinchangée chez les patients n’exprimant pasUNC-93B. De façon para doxale, les TLRssemblent donc impliqués dans la contre-sélection des anticorps anti-nucléaires lors dudéveloppement B chez l’homme, maisapparemment pas les TLR qui reconnaissentles antigènes nucléaires, qui sont ceux quidépendent d'UNC-93B pour fonctionner.Plusieurs hypothèses peuvent expliquer cesrésultats : 1) IRAK-4 et MyD88 étant égalementnécessaires à la signalisation des récepteurspour l’IL-1/18/33, ces récepteurs pourraientêtre impliqués dans la sélection des

lymphocytes B. Cependant, nous avonsregardé l’expression de ces récepteurs, et ilsne sont pas exprimés dans les lymphocytes Bnouveaux émigrants ou matures naïfs, donc ilest peu probable qu’ils soient impliqués dansce processus ; 2) la fonction de UNC-93B n’estpas encore clairement connue, mais il sembleque cette molécule joue plus un rôle dans larelocalisation des TLR du réticulum endo -plasmique vers les endosomes, que dans leursignalisation. On peut donc imaginer que dansle cas de la sélection des lymphocytes B anti-nucléaires, le BCR transporte l’antigène auxTLR sans que ceux-ci aient besoin de serelocaliser. Ce processus pourrait poten -tiellement s’accomplir en absence de UNC-93B ; 3) Les TLR qui ne dépendent pas deUNC-93B pour fonctionner pourraient jouer unrôle dans la tolérance B. En effet, les ligandsdes complexes que forment TLR10 avec lesTLR 1 et 6 ne sont pas connus, et ce récepteurest le TLR le plus fortement exprimé par leslymphocytes B. Dans tous les cas, nos résultatssemblent montrer que le paradigme du

coengagement BCR/TLR ne serait pas valableuniquement pour l’activa tion et la proliférationdes lymphocytes B en périphérie, mais aussipour leur sélection dans la moelle osseuse.

Nous avons ensuite essayé de comprendre lesmécanismes à l’origine des défauts de contre-selection des lymphocytes B autoréactifs etanti-nucléaires chez les patients déficients enmolécules impliquées dans la fonction desTLR. Grâce à la technique de clonage d’anti -corps exprimés par des cellules B uniques quenous utilisons, nous pouvons analyser l’effi -cacité du "receptor editing" chez ces patients.Nous avons observé qu’aux deux locus deschaînes légères des immuno globulines kappaet lambda, les clones autoréactifs (y comprisles clones anti-nucléaires exprimant presqueexclusivement des chaines kappa) n’ont paseffectués de recombinaison secondaire, à ladifférence des clones autoréactifs (ou anti-nucléaires) issus de donneurs sains. Nouspouvons donc conclure que les lymphocytes Bdes patients n’expri mant pas de IRAK-4 ou deMyD88 présentent des défauts de "receptorediting". Par ailleurs, le processus de délétionne semble pas non plus être efficace, puisquel’on retrouve ces clones en périphérie. Ainsi,au moins deux des trois mécanismes majeursd’établissement de la tolérance B ne sont pasfonctionnels en absence de IRAK-4 et MyD88,et donc en absence de signalisation par lesTLR.

Enfin, il a déjà été observé que ces patients neprésentent pas de manifestations auto-immunes mais des infections bactériennes(chez les patients déficients en IRAK-4 etMyD88) et virales (chez les patients déficientsen UNC-93B), malgré une forte proportion delymphocytes B autoréactifs dans leur sang(6,9). Ces patients ne présentent pas d’anti -corps anti-nucléaires dans leur sérum ce quisuggère que leurs lymphocytes B autoréactifsne sont donc pas activés en périphérie.L’implication des TLRs, en particulier des TLR7et 9, dans les maladies auto-immunes avaientd’ailleurs été démontrée dans différentsmodèles murins (10). Ces observations ontconduit a considérer des antagonistes de cesTLR comme des molécules thérapeutiquespotentielles. Nos résultats montrent cepen -dant que ces molécules devront être utiliséesavec précaution, puisqu’elles pourraientinduire une accumulation de cellules Bautoréactives en périphérie, qui pourraientensuite être activées lors de l’arrêt dutraitement.

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SFIACTUALITÉS 22

circulant. Nous avons ensuite montré, par desexpériences de dégranulation par visualisationdu CD107a (Lamp-1) et des expériences demarquage intracellulaire d’IFN-g que la baissed’expression de NKG2D sur les NK s’accom -pagnait d’une altération de leurs fonctions.L'ensemble de ces résultats suggère donc quel’altération fonctionnelle des NK, résultant dela baisse d'expression du récepteur NKG2D,entraine une élimination moins efficace deshépatocytes infectés exprimant MIC.

A l’heure actuelle, deux mécanismes sontconnus pour provoquer une baisse del’expression de NKG2D. Le premier consisteen la production de molécules MIC solubles(résultant du clivage de la forme memb ranaire)capables de se fixer sur NKG2D et del'internaliser (6). Cependant, nous n'avons pasobservé de taux anormaux de molécules MICsolubles chez les patients infectés par rapportaux témoins. Le second mécanisme est lié à laprésence de TGF-b capable lui aussi deprovoquer la baisse d'expression de NKG2D(7). Nous avons observé une augmentationsignificative de la concentration de TGF-bdans les sérums des patients ainsi qu’une forteexpression du TGF-b dans les foies infectéscomparé aux foies contrôle. Cette augmen -tation de TGF-b pourrait donc expliquer la

L e virus de l’hépatite C (VHC) touche 2%de la population mondiale et conduit àune infection chronique chez environ

80% des sujets infectés. Le développement decomplications sévères comme des cirrhosesdu foie ou des carcinomes hépatocellulairesfont de cette infection un problème majeur desanté publique. De nombreux travaux ontdémontré que la persistance du VHC pouvaitêtre en partie expliquée par une altération desréponses immunes cellulaires et humoralesanti-VHC (1). Il existe en revanche beaucoupmoins de données concernant la réponseinnée au cours de cette infection. Les cellulesNK se caractérisent par leur capacité lytiquevis-à-vis des cellules infectées, via ladégranulation de molécules cytotoxique(granzymes, perforine), mais aussi par leuraction antivirale grâce à leur forte activitésécrétrice d’IFN-g (2). Ces cellules participentde plus à la mise en place de la réponseadaptative grâce à leur interaction avec lescellules dendritiques (3). Une anomalie de laréponse NK pourrait donc être un desmécanismes permettant au virus du VHCd’échapper à la réponse immune de l’hôte.L'activation des cellules NK est régulée parune balance entre des signaux induits soit pardes récepteurs activateurs soit par desrécepteurs inhibiteurs (4). Parmi les récepteursactivateurs, NKG2D est connu pour son rôlemajeur dans le contrôle des réponsesantivirales et anti-tumorales, lié à sa recon -naissance de molécules de stress (MIC, ULBP)exprimées à la surface des cellules infectéesou tumorales (5).

Notre travail a consisté dans un premier tempsà rechercher d’éventuelles altérations descellules NK chez les patients infectés par leVHC. Nous avons tout d'abord mis enévidence, par marquage immuno histo -chimique, une forte expression des moléculesMIC dans le foie des patients infectés par leVHC par rapport au foie de témoin non-infectés. L'analyse en immunofluorescence etmicroscopie confocale a montré quel’expression de MIC était localisée à la surfacedes hépatocytes, ces derniers devenant doncdes cibles potentielles des NK. Afin decomprendre pourquoi les hépatocytes MIC+ne sont pas éliminés par les NK qui exprimenttoutes NKG2D, nous avons étudié lephénotype des cellules NK de patientsinfectés. Nous avons observé une nettediminution de l’expression du réce pteurNKG2D sur les NK circulants des patientsVHC+ par rapport aux NK de sujets sains etdes patients infectés par le VHC mais guérisaprès traitement. L'analyse immunohisto -chimique de NKG2D dans le foie de patientsinfectés a confirmé que très peu delymphocytes intrahépatiques exprimentNKG2D. Ces résultats indiquent quel’altération phénotypique des NK intervientaussi bien dans le foie que dans le sang

LE VIRUS DEL’HÉPATITE CÉCHAPPE À LA RÉPONSE NKDÉPENDANTE DE NKG2D EN ALTÉRANTL’ÉQUILIBRE IL-15/TGF-bb

Franck LevasseurSène DamienSophie Caillat-Zucman

Inserm U561Hôpital St-Vincent de Paul, Paris

Franck.levasseur@paris5.inserm.fr

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diminution d’expression de NKG2D sur lescellules NK chez les patients VHC+.

Nous avons ensuite essayé de caractériser lesmécanismes pouvant expliquer l'augmen -tation de TGF-b et la diminution d'expressionde NKG2D au cours de l'infection par le VHC,et nous nous sommes intéressés au rôlepotentiel des protéines virales (core, gpE2,NS3, NS4, NS5A). Nous avons montré quel'incubation des lymphocytes périphériques enprésence de protéine NS5A recombinante (0,5 µg/ml) pendant 48 heures provoque unebaisse de l’expression de NKG2D sur les NK,similaire à celle induite par 10 ng/ml de TGF-b.Cette baisse d'expression est totalementinhibée en présence d’anticorps bloquant anti-TGF-b, confirmant que l’action de NS5A estmédiée par une sécrétion préalable de TGF-b.En revanche, l’apport d’IL-15, cytokine connuepour augmenter l’expression de NKG2D,restaure l’expression de NKG2D à des valeursnormales. Afin de déterminer quelle popu -lation cellulaire était responsable de cetteproduction de TGF-b en réponse à NS5A,différentes sous-populations ont été triéespuis incubées en présence de NS5A avant demesurer l’expression de NKG2D sur lescellules NK. Les résultats montrent clairementque seuls les monocytes sont responsables dela baisse de NKG2D sur les NK, via laproduction de TGF-b induite par NS5A.

Afin de mieux décrire l’effet de NS5A sur lesmonocytes, nous avons recherché la présenced’autres cytokines anti- et pro-inflammatoiresdans les surnageants de culture de monocytesstimulés par NS5A, et nous avons observé destaux élevés d’IL-10, mais pas ou peu d’IL-15 oud’IL-12. Puisque l’IL-10 n'induit pas direc -tement de baisse de NKG2D sur les NK, nousavons soulevé l’hypothèse que l’IL-10, sécrétéedans un premier temps par les monocytes,induirait une sécrétion secondaire de TGF-b.Nous avons mesuré la concen tration de TGF-bdans les surnageants de monocytes stimulésavec NS5A en présence d’anticorps bloquant

anti-IL-10 ou de récepteur soluble de l’IL-10, etnous avons observé que le blocage de l’IL-10inhibait totalement la sécrétion de TGF-b parles monocytes stimulé avec NS5A.

Les monocytes peuvent produire desquantités élevées d’IL-10 suite à l'interactionde différents produits dérivés de pathogènesavec les récepteurs TLR2 et TLR4 (8). En effet,nous avons observé que la production d'IL-10dans les surnageants de monocytes stimuléspar NS5A était inhibée en présence d'anti -corps neutralisants anti-TLR4 ou anti-CD14,suggérant que NS5A interagit avec lesmonocytes via le complexe CD14-TLR4.L'activation de TLR4 peut induire la sécrétiond’IL-10 via les voies de signalisation impliquantla PI3 kinase et la p38 MAP kinase (9). Nousavons donc répété ces expériences enprésence de différents inhibiteurs desmolécules de signalisation, et nous avonsobservé que la présence d’inhibiteur de p38ou de PI3K bloquait la sécrétion d’IL-10 induitepar NS5A, alors les inhibiteurs des moléculesJNK et MEK avaient très peu d’effet.

En conclusion, ces travaux nous permettentdonc de proposer le scénario suivant (figure) :la protéine virale NS5A, relarguée dans lacirculation par les hépatocytes infectés enapoptose, pourrait interagir avec lesmonocytes via le complexe membranaireTLR4-CD14. Ceci induirait une forte sécrétiond’IL-10 (et a contrario une très faible produ -ction d'IL-12) via les voies de signa lisation p38MAPK et PI3K. Ensuite, l’effet autocrine de l’IL-10 sur les monocytes provoquerait unesécrétion secondaire de TGF-b soluble, quicauserait la diminution de l’expression durécepteur activateur NKG2D à la surface descellules NK. Ces dernières deviendraient doncincapables d’éliminer efficacement leshépatocytes infectés exprimant MIC. Demanière intéressante, ce défaut d’activité desNK pourrait être contrebalancé par l’apportd’IL-15 exogène, qui pourrait ainsi représenterun traitement adjuvant dans l’infectionchronique par le virus de l’hépatite C.

SFIACTUALITÉS 23

ÉTUDE DU POTENTIELANTI-TUMORAL DELYMPHOCYTES T ggddRÉACTIFS CONTRE LECYTOMÉGALOVIRUS

Christel Devaud1

Franck Couillaud2

Myriam Capone1

1CIRID, UMR CNRS 5164 et 2IMF, UMR 5231 Université de Bordeaux 2

christel.devaud@etud.u-bordeaux2.fr

5

L es lymphocytes T gd sont deseffecteurs de l’immunité à l’interfacedes réponses innées et adaptatives.

Les propriétés uniques de ces cellules,suggèrent qu’elles exercent des fonctions nonredondantes de l’activité des lymphocytesT ab (1). Chez l’homme, les lymphocytes T gd

constituent une faible proportion deslymphocytes T dans le compartiment sanguin;ils y expriment majoritairement un récepteur àl’antigène (TCR) composé des chaînes Vd2 etVg9. En revanche, les lymphocytes T gd detoutes les autres sous-populations (Vd2négatifs, Vd2neg) peuplent les épithéliamuqueux où ils représentent jusqu’à 30% dela population lymphocytaire T.

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SFIACTUALITÉS 24

Nous avons ensuite testé le potentielmigratoire des clones T Vd2neg in vivo, en lesinjectant à distance du site tumoral, par voieintra-péritonéale (i.p). Nous avons observé unléger retard de croissance tumoraleconsécutif à une seule injection i.p de 2.106cellules de ce même clone. Cette inhibitionest amplifiée lors d’injections répétées declones T Vd2neg, suggérant qu’au moins unepartie de ces cellules a pu atteindre le sitetumoral. En revanche, des injections i.p d’unelignée T gd Vd2 contrôle, non réactive, n’ontaucun effet sur la croissance tumorale descellules HT29. Des analyses histologiques destumeurs prélevées sous la peau des souris àdifférents temps (7 et 12 jours) confirment cesrésultats. Elles montrent des tumeurs de taillenettement inférieure chez les animaux ayantreçu les injections répétées de clones TVd2neg par rapport aux animaux contrôles noninjectés avec les clones T Vd2neg. De plus onobserve sur ces coupes histologiques un étattrès « endommagé » du tissu tumoral (plusapoptotique) chez les souris ayant reçu lesinjections répétées de clones T Vd2neg. Unepreuve directe de la migration reste à êtreapportée (des expériences de PCR etd’immunohistochimie sur des tumeurs préle -vées à différents temps sont en cours).

Pour avoir une action sur la tumeur s.c, lesclones T Vd2neg doivent migrer jusqu’au sitetumoral. La migration implique plusieursprocessus et notamment un gradient chimio-attractif. Celui-ci dépend des interactionsentre des chimiokines, libérées par lescellules cibles (cellules tumorales), et leurrécepteurs spécifiques exprimés par leslymphocytes T (9). Nous avons déterminé leschimiokines produites par les cellules HT29en culture in vitro ou ayant formé une tumeursolide in vivo grâce à une membrane coatée avec des anticorps dirigés contre 38 chimiokines (Human Chemokine AntibodyArray (RayBio®)). Nous avons montré que lescellules HT29 produisent essentiellement leschimiokines Gro et IL8 (Interleukin 8) maisaussi en plus faible quantité, MIP 1d, MIP-3a(Macrophage Inflammatory Protein) et IP-10(Interferon inductible Protein). Nous avonsalors testé par cytométrie en flux si lesrécepteurs correspondants étaient expriméspar les clones T Vd2neg et nous avons mis enévidence que la grande majorité des clones(70 à 90%) expriment CXCR3 (CXC chemokineReceptor) (récepteur d’IP10) et CCR3(récepteur de MIP1d). D’autre part, les clonesT Vd2neg migrent in vitro, dans des tests deTranswell, sous l’effet de surnageant deculture des lignées HT29. L’implication d’IP10

et de MIP1d sera testée prochainement àl’aide d’anticorps bloquant anti CXCR3 etCCR3.

Récemment nous avons choisi d’élargir notreétude du potentiel anti-tumoral des clones TVd2neg à l’étude de leur action sur des cellulescirculantes et plus particulièrement lors de ladissémination de cellules cancéreusesdérivant d’une masse tumorale primaire. Eneffet, à l’heure actuelle aucune étude nedémontre clairement le rôle des lymphocytesT gd sur la formation des métastases et noussavions que les cellules HT29 utilisées dansnotre modèle murin ont la capacité demétastaser assez rapidement (10). Cepen -dant, la dissémination de cellules HT29 àpartir d’injection s.c étant rare nous avons misen place un modèle d’injection orthotopiquedes cellules tumorales au niveau du caecumdes souris. Ainsi, nous avons mis au point unmodèle in vivo où les cellules métastatiques « s’échappent » d’un site tumoral primaire. Deplus, de façon intéressante, la sensibilité destechniques d’imagerie en bioluminescencerend possible la détection de métastases surl’animal vivant (11). Nous avons produit, partransduction lentivirale, des cellules HT29exprimant la luciférase (luc) de façon à suivreleur devenir in vivo. Dans nos expériencespréliminaires, lorsque nous implantons lescellules HT29-luc dans le caecum des souris,nous pouvons détecter dans les premiersjours ces mêmes cellules sur le caecum desanimaux grâce à une caméra adaptée(Nightowl LB 981, Berthold). Des foyerssecondaires, dans les poumons et le foie sontdétectables au bout de 3 semaines grâce àcette technique. Nous pourrons par la suiteutiliser ce modèle d’implantation ortho -topique de cellules tumorales et injecter lesclones T Vd2neg afin d’étudier leur rôle sur ladissémination des cellules tumorales in vivo.L’utilisation de la caméra nous permettrad’obtenir de nombreux point sur les étapesde la dissémination tumorale à partir d’unmême groupe d’animaux. Elle permet dedonner de la fiabilité à nos expériences etnous donne la possibilité de réduire lenombre d’animaux utilisés.

En conclusion, notre modèle de sourishumanisée nous permet de conforter lestravaux montrant l’implication des lympho -cytes T gd dans la lutte anti-tumorale chezl’homme. La particularité de notre étude estqu’elle implique des lymphocytes T gd

(Vd2neg) réactifs contre le CMV qui auraient lacapacité non seulement de migrer vers unsite tumoral mais aussi d’y lyser les cellules

En raison de leur capacité à être autoréactiveet de leur spécificité antigénique large, lescellules T gd apparaissent comme dessentinelles qui peuvent intervenir à la foisdans l’immunité anti-infectieuse et anti-tumorale. Les lymphocytes T gd tissulairesinfiltrent en effet de nombreuses tumeursépithéliales et lysent in vitro des lignéestumorales d’origines diverses (2,3). De plus,des souris déficientes en lymphocytes T gd

ont une fréquence beaucoup plus élevée decancers cutanés (4).

Des données précédentes du laboratoiremontrent une expansion majeure etpersistante des cellules T Vd2neg dans le sangde receveurs d’une allogreffe rénale lorsqu’ilsdéveloppent une infection par le cytoméga -lovirus (CMV) (5,6). Des lignées ou clones T gd

Vd2neg isolés à partir des patients trans -plantés ayant développé une infection àCMV, lysent des fibroblastes infectés par leCMV et sont capables d’inhiber la réplicationvirale in vitro (7). Les ligands des cellules T gd

étant probablement ubiquitaires, les clonesVd2neg spécifiques du CMV ont été mis enprésence d’un large panel de ciblescellulaires. De façon intéressante, leslymphocytes T Vd2neg réactifs contre le CMVprésentent in vitro une réactivité croisée vis-à-vis de cellules épithéliales tumoralesintestinales (comme HT29) mais pas contredes cellules épithéliales normales. Nousavons cherché à examiner plus en détail cettepropriété anti-tumorale de clones T Vd2neganti-CMV in vivo.

Les souris immunodéficientes RAG KO/g(c)KO (dépourvues en lymphocytes T, B etcellules NK) étant connues pour tolérerl’implant de tumeurs d’origine humaine (8),nous avons utilisé ce modèle murin. Destumeurs solides se développent sur les flancsde ces animaux suite à l’implantation decellules HT29 en sous-cutanée (s.c). Nousavons pu montrer qu’un faible nombre decellules HT29 implantées en s.c suffit audéveloppement d’une tumeur solidemesurable rapidement. Une courbe decroissance tumorale peut être établie par desmesures successives de la masse tumorale(masse (mm3)=longueur (mm) x largeur2(mm)/2).

Nos premières expériences montrent uneinhibition de la croissance tumorale lorsque2.106 cellules d’un clone T Vd2neg sontinjectées sous la peau, au même endroit que1.105 cellules HT29 ; ce qui suggère uneactivité anti-tumorale de ces clones in vivo.

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SFIACTUALITÉS 25

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tumorales. Nos résultats pourraient avoirdes implications importantes chez les trans -plantés rénaux (d’où sont issus nos clonesT gd) qui contractent fréquemment desinfections à CMV et ont un risque 100 foisplus élevé que la population normale dedévelopper un cancer.

INDUCTIONDIFFÉRENTIELLE DE L’IMMUNITÉ À MÉDIATIONCELLULAIRE INDUITEPAR LE MODIFIEDVACCINIA VIRUSANKARA ADMINISTRÉPAR VOIEINTRADERMIQUE OUINTRAMUSCULAIRE

Valérie AbadieBéhazine Combadière

Inserm U543, Paris

abadie@chups.jussieu.fr

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PRIXPOSTER

“ 6 prix “meilleur poster" (150 €)ont été décernés. Les lauréats sont :

Valérie Abadie (Induction diffé rentielle del'immunité à médiation cellulaire induitepar le "Modified Vaccinia virus Ankara"admini stré par voie intradermique ou intra -musculaire), Mustapha Berri (Clonage moléculaire etfonctionnelle de la chemokine CCL28:Implication possible dans la domiciliationdes plasmocytes à IgA dans la glandemammaire), Blandine Mercier (L’engagement de TLR2à la sur face des lym phocytes T CD8+diminue leur seuil d’acti vation), Roudaina Nasser (Anticorps mono clonal667 : plus qu'un effet neutralisant), Alexis Rossignol (Les lymphocytes iNKTHumains CD4+CD161-CCR7+ et CD4+CD161+CCR7- présentent respectivementdes phénotypiques et des fonctions de type "Mémoire Centrale" et "MémoireEffectrice") et Muriel Tahtouh (Caractérisation fonction -nelle de molécules homologues à desfacteurs du complément dans le systèmenerveux de la sangsue).

P rix poster

D e nombreux vaccins ont étéélaborés et utilisés de manièreempirique sans que soient

déter minés les paramètres immunologiquesimpliqués dans l’induction de l’immunitéprotectrice. De nos jours, le développementde nouvelles stratégies vaccinales est affaiblipar ce manque de connaissances. Lesmécanismes précoces mis en place in vivo àla suite d’une immunisation ont été peucaractérisés et sous-estimés par rapport àl’évaluation des réponses immunitaireshumorales et cellulaires. En particulier, nous

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Des travaux récents suggèrent en effet quela voie d’administration du MVA affecte i) labiodistribution de l’antigène (6) ; ii) la loca -lisation des interactions entre les cellulesprésentatrices d’antigène et les lymphocytesT (processus de « priming») (7) ; iii) les modesde présentation de l’antigène (présentationdirecte ou croisée) (8), et pourrait ainsiprofon dément influencer la qualité desréponses immunitaires induites (9). Cepen -dant, les mécanismes exacts mis en jeu àl’interface entre immunité innée et immunitéadaptative pouvant expliquer ces obser -vations n’ont pas été caractérisés.

C’est pourquoi, dans cette étude réaliséedans un modèle murin C57Bl/6, nous avonsévalué les mécanismes cellulaires etimmunitaires mis en place très précocementaprès immuni sation intradermique (voieclassique de vaccination par VV) et intra -musculaire par le MVA (majoritairementutilisée dans les stratégies actuelles).

Nous avons tout d’abord comparé l’efficacitéd’induction des réponses lymphocytaireseffectrices en mesurant la production d’IFN-gpar les lymphocytes T isolés des ganglionsdrainant 7 et 14 jours suivant l’inoculation de5.106 PFU de MVA. Nous avons constaté quela réponse cellulaire T est notablement plusintense lorsque les souris reçoivent le MVApar voie intradermique.

Nous avons ensuite étudié les évènementscellulaires mis en place très précocementaprès administration de l’antigène. Grâce àl’utili sation d’une souche de MVA recom bi-nante exprimant le gène rapporteur gfp(green fluorescent protein), nous avonsétudié la distribution des particules viralesfluore scentes in vivo à l’aide d’une techniquede microscopie confocale à fibre optique(Cell Vizio®, Mauna Kea Technologies). Les

particules virales restent principalementlocalisées dans le derme, mais sontégalement détectées dans les ganglionslymphatiques drainant la peau dès 4 heuresaprès injection du MVA par voie intra -dermique. En revanche, nous n’avons pasdétecté par cette méthode de particulesfluorescentes dans les ganglions drainant lemuscle. Ces observations ont été confirméespar la technique de cytométrie en flux qui nous a permis d’estimer qu’environ 4000 cellules ayant capturé des particulesfluorescentes étaient présentes transi -toirement par ganglion drainant la peau dès4 heures suivant l’injection, alors queseulement 200 cellules positives pour la GFPsont retrouvées par ganglion drainant le

comprenons mal comment la capture del’antigène sur le site d’immuni sation, sontransport vers les organes lympho ïdessecondaires, sa présentation aux lymphocytesT, ainsi que les circonstances d’activation deslymphocytes spécifiques de l’antigèneinfluencent quantitativement et qualita -tivement les réponses immunitaires effec -trices et mémoires. Un des meilleursexemples est l’immunisation avec le virus dela vaccine (VV) qui protège contre le virus dela variole. En effet, la variole a été éradiquéeavec succès alors que l’on possède très peud’infor mations sur les mécanismes conduisantà l’immunité protectrice induite par VV.

L’absence de circulation des deux virussmallpox et vaccinia bouleverse les donnéesclassiques de maintien à long terme de cetteimmunité vaccinale les régions du Nord. Cecipose de nombreuses questions liées aumaintien et à l’efficacité de la réponseimmunitaire mémoire. La vaccination anti-variolique est une vaccination par voiedermique utilisant un vaccin vivant réplicatif.Cette méthode de vaccination induit uneimmunité humorale et cellulaire dans les 50 années après la première immunisation (1).De plus, nous avons démontré que lenombre de vaccinations n’a aucune influencesur la persistance des cellules T mémoiresspéci fiques de la variole suggérant quel’étape initiale de la première vaccination estdéterminante. C’est dans ce contexte quenos travaux de recherche se placent ettentent de mieux évaluer l’effet de la voied’immuni sation sur l’induction des réponsesimmuni taires.

Le "Modified Vaccinia virus Ankara" (MVA)est une souche atténuée de VV qui a perdu lacapacité à se répliquer in vitro dans deslignées cellulaires humaines et in vivo chez lasouris et le macaque. Compte tenu de saversatilité pour la production de protéineshétérologues, et de son immunogénicité, leMVA est étudié à la fois en tant que candidatvaccin recombinant (2) et en tant queremplaçant de l’actuel vaccin contre la variole(3-5). Quelle que soit sa voie d’administration,le MVA induit de bonnes réponses cellulaireset humorales, et protège d’une épreuvevirale avec le virus virulent de la vaccineplusieurs modèles animaux. Cependant, denombreux essais vaccinaux utilisent etcombinent souvent différentes voiesd’immunisation sans que l’on sache sil’immunogénicité observée est due au vaccinlui-même ou est influencée par la voied’immunisation.

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Figure. Le MVA est localisé dans des cellulesd’origine myéloïde après vaccination par voie intradermique.

(A) Fréquence des sous-populations cellulairesayant pris en charge le MVA dans les ganglions drainant le derme. 4 heures après injectionintradermique de MVA-gfp, les ganglions ontété prélevés, et les cellules GFP+ ont étéidentifiées par cytométrie en flux à l’aide d’unebatterie d’anticorps. Les macrophages(CD11b+F4/80+) représentent 65% des celluleshôtes du MVA. 15% de particules virales sontretrouvées dans des cellules dendritiquesmyéloïdes CD11c+ CD11b+ (mDCs), et 10%dans des neutrophiles (Ly-6G+Ly-6C+).

(B) Analyse par microscopie à fluorescenced’une cellule dendritique révélée à l’aide du Marqueur CD11c (rouge) et du marqueurnucléaire DAPI (bleu). Une particule viralefluorescente (vert, indiquée par une flèche) estprésente dans le cytoplasme de cette cellule(grossissement X100).

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RÉFÉRENCES

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muscle. En effet, après injection par voieintra musculaire les particules viralesfluorescentes persistent quasi-exclusivementautour des fibres musculaires jusqu’à 48 heures après injection. Ces premiersrésultats soulignent la différence debiodistribution in vivo de l’antigène enfonction du site d’injection de celui-ci.

Compte tenu de l’accessibilité différentiellede l’antigène aux ganglions drainants quireprésentent le site majeur d’initiation de laréponse immunitaire, nous avons ensuiteévalué si la distribution de l’antigène étaitassociée à un recrutement différentiel desous-populations cellulaires. Nous avonsmontré que différentes populations cellu -laires telles que les macrophages, les cellulesdendritiques et les neutrophiles prennent encharge le MVA dès 4 heures et sontprésentes dans les ganglions drainants(Figure). Par ailleurs, des vagues derecrutement de macrophages, cellulesdendritiques myélo ïdes et plasma cytoïdessont observées dans le ganglion drainant lapeau, alors que l’injection de MVA par voieintramusculaire induit uniquement lerecrutement de cellules dendritiquesmyéloïdes dans le ganglion drainant lemuscle.

Nous avons évalué la contribution dechacune de ces sous-populations dans laprésentation des antigènes du MVA auxlymphocytes T CD4+ et CD8+. Pour cela, lesmacrophages et cellules dendritiques isoléesdes ganglions drainant de souris ayant reçule MVA ont été testés pour leur capacité àstimuler la production d’IFN-g par deslymphocytes T naïfs. De manière surpre -nante, après immu nisation par voie intra -dermique, à la fois les macrophages et lescellules dendritiques sont capables d’activerles lymphocytes T. En revanche, aprèsimmuni sation par voie intramusculaire, seulesles cellules dendri tiques ont cette capacité.Nous avons de plus observé que cesdifférences dans la nature des cellulesprésentatrices d’antigène, influencent demanière significative l’intensité et la poly -fonctionnalité des lymphocytes T en termesde production des cytokines IFN-g, IL-2 etTNF-a.

En conclusion, l’environnement tissulaire etcellulaire dans lequel est introduit le vaccininfluence de manière importante le transportde l’antigène et le recrutement de poten -tielles cellules présentatrices de l’antigènedans les ganglions drainants. Ces deux

CLONAGEMOLÉCULAIRE ETFONCTIONNELLE DE LA CHEMOKINECCL28 : IMPLICATIONPOSSIBLE DANS LADOMICILIATION DESPLASMOCYTES À IGADANS LA GLANDEMAMMAIRE

Mustapha BerriHenri Salmon

Équipe Lymphocyte et Immunité desMuqueusesINRA, UR1282, IASP Nouzilly, France

mberri@toursl.inra.fr

2

P rix poster SUITE

facteurs modulent à la fois l’amplitude et lanature des lymphocytes T spécifiques del’antigène. Ces travaux permettent demieux comprendre les mécanismes devaccination, et offrent des donnéesfondamentales qui pourraient aider audéveloppement de nouvelles stratégiesvaccinales.

L a première ligne de défense contreles pathogènes est représentée parl’ensemble des muqueuses de

l’organisme, comme le tractus aéro-digestif eturo-génital. La protection, dite mucosale, meten jeu des médiateurs de la réponse immunecellulaire les lymphocytes B et T, et ceux de laréponse immune humorale essentiellementles immunoglobulines de type A (IgA)sécrétées par des pré-plasmocytes à IgA. Lamigration et la domiciliation de ces cellulesdans les différentes muqueuses dépendent à

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dans les sites intestinaux et extra-intestinaux ycompris la glande mammaire (4). Par consé -quent, nous avons entrepris le clonage, lacaractérisation moléculaire et la distributiontissulaire de la chemokine CCL28. L'obtentiond’ADNc de CCL28 porcine, par la techniquede RT-PCR (3’RACE), a montré la présenced’un cadre de lecture de 384-pb qui codepour une protéine de 127 acides aminés dontles 22 premiers, en N terminal, constituent lepeptide signal. La conservation des quatreacides aminés cystéines spécifiques a montrél'identification d'une nouvelle chemokine detype CC chez le porc. L’alignement de laséquence protéique CCL28 avec cellesappartenant à d’autres espèces a montré unegrande homologie de séquence entre CCL28porcine et celles décrites chez l'homme etchez le singe.

Ensuite la protéine recombinante a étéproduite en utilisant un système d’expressionprocaryotique. Un test de migration a montréque cette protéine avait une activitéchémoattractante vis-à-vis des L14, une lignéecellulaire de lymphoblastes B, obtenue aulaboratoire à partir de mini porc histo -compatible SLAd/d. L’analyse par RT-PCR surdifférents organes, a montré que la chemo -kine CCL25 était exprimé uniquement dansl’intestin grêle à savoir l’iléum, le jéjunum, leduodénum y compris les plaques de Peyer.Ainsi CCL25 serait responsable de la migra -tion des IgA-ASCs et permettrait de centrer laréponse immunitaire vers les antigènesprésents dans l’intestin grêle. En revanche,

CCL28 est exprimée, d’une manière consti -tutive, dans plusieurs organes muqueux telsque la glande salivaire, la muqueuse nasale,l’intestin et le colon, suggérant que cettechemokine pourrait participer à la dissé -mination des IgA-ASCs et unifier ainsi laréponse humorale dans tous les tissusmuqueux (5). Par ailleurs, nous avons montré,contrairement à CCL25, que l’expression deCCL28 était induite dans la mamelle en fin degestation et au cours de la lactation. Aucuneexpression n’a été détectée après le sevrage.Ceci suggère que l’expression de cettechemokine pourrait être sous un contrôlehormonal lié à la lactation telle que laprolactine. La localisation tissulaire, parimmunohistochimie, a montré que la chemo -kine CCL28 était exprimée par les acini de laglande mammaire et aussi dans le lumière oùle lait est excrété (Figure). De plus, l’analyse,en Western blot, a montré la présence deCCL28 dans le lait de truie comme celui de lafemme.

la fois des molécules d’adhésions (adressines,intégrines et sélectines) exprimées par lescellules endothéliales des vaisseaux sanguinset des cytokines ayant une activitéchémoattractante (chemokines) présentesdans le tissu épithélial des muqueuses.L’équipe "Lymphocyte et Immunité desMuqueuses" (LIM) de l’INRA de Tourss’intéresse à l’étude et à la caracté risation desmécanismes de domiciliation des lympho -cytes T et B dans les différents compar timentsmuqueux chez le porc, comme modèleanimal. Par ailleurs, notre équipe étudie lesdifférents facteurs cellulaires et humorauxresponsables de la mise en place des liensimmuns entre les différentes muqueuses et laglande mammaire. En effet, à sa naissance, leporcelet ne possède pas de répertoire immuncapable de produire des IgA efficaces dans lamuqueuse digestive. Le nouveau-né a doncimpérativement besoin d’un soutien immuni -taire passif d’origine maternelle pour ne passuccomber aux infections. Chez les nouveaux-nés, cette immunité est apportée passivementpar le lait maternel. En effet, le lait maternelest riche en IgA produit par les IgA-ASCs quisont recrutées pour aller coloniser la glandemammaire à partir de la fin de la gestation etpendant la période de lactation (1,2). Lerecrutement de ces cellules rentre dans lecadre d'un lien immun entéro-mammaire misen place grâce à l’interaction entre lesmolécules d'adhésion et les chimiokines avecleurs récepteurs respectifs exprimés sur cescellules immunitaires (3). Au laboratoire, desétudes menées chez la souris ont montréqu’au cours du développement de la glandemammaire, l’interaction entre la moléculed’adhésion MAdCAM-1 et les plasmocytes àIgA ne pouvait être seule, responsable durecrutement spécifique d’IgA-ASCs venant del’intestin. En effet, l’expres sion de MAdCAM-1augmente pendant la gestation, atteint un picau moment de la parturition et diminuependant la lactation. En revanche, le nombredes IgA-ASCs ne varie pas pendant lagestation mais augmente au cours de lalactation (2). Ces résultats impliquent laparticipation de facteurs chémoattractantsadditionnels dans le recrutement deslymphocytes dans la glande mammaire.

Des données de la littérature ont montré,chez la souris, que la chemokine CCL25/TECK(Thymus-Expressed Chemokine) était impli -quée exclusivement dans le recrutement et lamigration des IgA-ASCs dans les sitesintestinaux alors que CCL28/MEC (Mucosae-Epithelium associated Chemokine) seraitresponsable du trafic des IgA-ASCs, à la fois,

Figure. Analyse en immunohistochimie deCCL28 dans de la parotide (A et B, scale bar,20µm) et dans la glande mammaire (C et D,scale bar, 20µm). La protéine CCL28 estexprimée dans les acinis (A, flèche) alors queCCL28 est observée au niveau des cellulesépithéliales (C, grande flèche) et dans le lumen(petites flèches) où le lait est excrété (C). Aucuneréaction n’a été observée avec le controlisotypique (B et D).

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RÉFÉRENCES

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L’ensemble des résultats acquis au cours decette étude liés à la distribution tissulaire etl’expression de cette protéine dans laglande mammaire suggèrent que lachemokine CCL28 peut jouer un rôleimportant dans le recrutement des IgA-ASCs au niveau de la glande mammairechez la truie et participe à la mise en placede l’immunité lactogène en contrôlant letransfert passif des IgA de la mère aunouveau né. Les IgA-ASCs présents dans laglande mammaire pourraient être induits etprovenir aussi du tractus aérien supérieur, ausurplus du tractus digestif (6). Les résultatsobtenus au cours de notre étude sont enaccord avec les données obtenus chez lasouris. En effet, des traitements in vivo avecun anticorps anti-CCL28 a permis debloquer l’accumulation d’IgA-ASCs dans laglande mammaire de souris, inhibant lasécrétion d’IgA dans le lait et empêchantainsi la présence d’anticorps dans le tractusgastro-intestinal du nouveau-né (7).

Ces résultats ouvrent des perspectives quantà l’utilisation des chemokines commevecteurs vaccinaux et/ou comme immuno-probio tiques. Ces derniers seraient admi-nistrés dans un compartiment inducteur etpourraient conduire à une augmentation dela réponse immune dans un autre compar -timent effecteur tel que la mamelle pour unemeilleure protection des petits parl’intermédiaire des IgA secrétés dans du lait.

L es lymphocytes T (LT) CD8+ sontdes acteurs importants de laréponse immunitaire. Ils jouent un

rôle clé dans le contrôle et l’élimination desvirus et des bactéries intracellulaires, puisdans la prote ction de l’organisme contre lesréinfections. Ils sont activés par la recon -naissance d’un peptide antigénique spé -cifique, présenté au niveau d’une moléculedu complexe majeur d’histocompatibilité(CMH) de classe I à la surface d’une celluleprésentatrice d’antigène (APC). Au cours deleur interaction avec les APC, les LT CD8+reçoivent plusieurs signaux : i) l ’engagementdu récepteur du LT pour l'antigène (signalTCR), ii) des signaux de costimulation via desinteractions moléculaires, comme entre lesmolécules CD80/86 et le récepteur CD28 desLT, iii) des signaux apportés par des cytokinesproinflammatoires (1). L’intégration de cesdifférents signaux détermine la réponse desLT CD8+ naïfs. Si leur somme dépasse le seuild’activation des LT CD8+, ces dernierssubissent une expansion clonale, acquièrentdes fonctions effectrices et des LT CD8+mémoires sont générés. Si la somme dessignaux est inférieure au seuil d’activation desLT, ces derniers subissent une activationabor tive. Ils prolifèrent, mais meurentrapidement.

Les récepteurs de la famille Toll (TLR) sontdes récepteurs transmembranaires conservésdans l’évolution, capables de reconnaître desmotifs moléculaires associés à différentstypes de pathogènes (PAMP) comme l’ARNdouble brin ou les lipopeptides bactériens.Les TLR sont exprimés par de nombreusescellules de la réponse immunitaire innée. A lasurface des APC, leur engagement induit uneaugmen tation de l’expression de cytokinesproinflam matoires, des molécules du CMH etdes molécules costimulatrices comme CD80/CD86. Ainsi, l’engagement des TLR optimisela présentation des antigènes aux LT etpermet l’activation de la réponse immunitaireadaptative (2). Cependant, des travauxrécents ont établi que les ligands des TLRpeuvent aussi moduler directement lesréponses lymphocytaires T (3) .

En particulier, il a été démontré au labo -ratoire que les LT CD8+ murins exprimentTLR2 et que l’engagement de ce récepteur àleur surface a un effet costimulateur in vitro.Cet effet se traduit par une augmentation dela proli fération, de la survie et des fonctionseffectrices des LT CD8+ activés, ainsi que parune diminution de leur dépendance vis-à-vis

L’ENGAGEMENT DETLR2 À LA SURFACEDES LYMPHOCYTEST CD8+ DIMINUELEUR SEUILD’ACTIVATION

Blandine MercierNathalie Bonnefoy-Bérard

Centre d’Etude et de Recherche en Virologieet ImmunologieInserm U851, Lyon

mercier@cervi-lyon.inserm.fr

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de la quantité d’anti gènes présents dans lemilieu.

La quantité de complexes CMH-peptideprésentés à un LT conditionne la force dusignal TCR, mais l’intensité de ce signal estaussi déterminée par l’affinité des complexesCMH-peptide-TCR formés. C’est pourquoinous avons réitéré l’expérience précédenteen présence de peptides agonistes partiels,le NP4Q et le NP3R, qui forment descomplexes CMH-peptide-TCR de plus faibleaffinité que le NP68 (5). Nos résultatsmontrent que la présence de ligand de TLR2permet une activation des LT CD8+ enprésence de l’agoniste de plus faible affinité(NP4Q), alors que seul, ce peptide n’induitaucune acti vation. De plus, en présence del’agoniste d’affinité intermédiaire (NP3R), lesligands de TLR2 permettent une activationdes LT CD8+ équivalente à celle induite parl’agoniste total NP68.

L’ensemble de ces données démontre quel’engagement de TLR2 à la surface des LTCD8+ diminue leur seuil d’activation vis-à-visde la force du signal TCR, en terme deconcen tration antigénique mais égalementd’affinité des complexes CMH-peptide-TCRformés.

Les résultats précédents ayant été obtenus invitro, nous avons voulu confirmer l’effetcostimulateur de l’engagement de TLR2 à lasurface des LT CD8+ in vivo. Pour cela, des LTCD8+ F5 naïfs ont été transférés dans dessouris TLR2-/- qui ont ensuite été immuniséesen présence du peptide agoniste partielNP3R associé ou non au ligand de TLR2. Lesligands des TLR ayant un effet sur de nomb -reuses cellules de la réponse immunitaireinnée, l’utilisation de souris hôtes TLR2-/-permettait de s’affranchir de toute actionindirecte du ligand de TLR2 sur les LT CD8+étudiés. Nos résultats indiquent que

l’immuni sation des souris avec le peptideNP3R seul induit la prolifération d’environ50% des LT CD8+ F5 mais aucune accu -mulation de ces cellules. En présence deligands de TLR2, la prolifération et l’expan -sion des LT CD8+ F5 augmentent signifi -cativement. Ces résultats démontrent in vivol’effet costimulateur de l’engagement deTLR2 à la surface des LT CD8+.

Afin de compléter ces résultats, nous avonsanalysé les mécanismes moléculairesimpliqués dans l’effet direct des ligands deTLR2 sur les LT CD8+. Nous avons démontréque l’engagement de TLR2 à la surface desLT CD8+ induit une augmentation de l’acti -vation de la voie de signalisation de la PI3-kinase/Akt.

Enfin, la quantité et la qualité des cellulesmémoires générées suite à une infectiondépendant de l’intensité de l’activation desLT CD8+ naïfs (6), nous avons étudié sil’engage ment de TLR2 à la surface de LTCD8+ activés de façon sous-optimale pouvaitavoir des conséquences sur la génération deLT CD8+ mémoires. Les modèles d’activationin vitro ne permettant pas d’étudier lesévènements à long terme, des LT CD8+ F5ont été cultivés 3 jours in vitro en présence dupeptide agoniste partiel NP3R, en présenceou non de ligand de TLR2, puis les LT activésont été transférés dans des hôtes sauvages.Le devenir des cellules a été analysé 30 joursaprès l’acti vation. Nous démontrons que laprésence de ligands de TLR2 lors del’activation in vitro permet l’accumulation decinq fois plus de cellules spécifiques del’antigène. Ces cellules présentent unphénotype mémoire avec une forteexpression de CD44 et l’expression deCD122. Enfin, contrairement aux cellulesactivées en présence du peptide NP3R seul,ces cellules sont fonctionnelles puisque 80%d’entre-elles synthétisent de l’IFN-g lors

des signaux de costimulation normalementapportés par les cellules dendritiques (DC)matures (4). Ces résultats nous ont conduits àrechercher si l’engagement de TLR2 à lasurface des LT CD8+ pouvait aussi diminuerleur seuil d’activation vis-à-vis d’autressignaux. L’ensemble de ce travail a étéeffectué dans un contexte d’activation spéci -fique de l’antigène, à l’aide de LT CD8+ issusde souris trans géniques pour le TCR F5. Dans ce modèle, tous les LT CD8 exprimentle TCR F5, spécifique du peptide antigéniqueNP68 issu de la nucléocapside du virus del’Influenza.

Tout d’abord, nous avons étudié si l’enga -gement de TLR2 à la surface des LT CD8+naïfs pouvait diminuer la quantité d’APCnécessaire à leur activation. Pour cela des LTCD8 F5 naïfs, purifiés par cytométrie en flux,ont été mis en culture en présence de quan -tités croissantes de DC matures présentant lepeptide anti génique NP68, en présence ounon du lipopeptide synthétique Pam3CysSK4(Pam), un ligand du complexe TLR1/TLR2.Afin d’éviter toute action des ligands de TLR2sur les DC, ces dernières ont été obtenues àpartir de souris TLR2-/-. Les résultats montrentque la présence de Pam dans le milieu deculture diminue d’un facteur cinq la quantitéd’APC nécessaire à la prolifération des LTCD8 et à leur expression de la chaine alphadu récepteur à l’IL-2 (CD25). L’engagementde TLR2 à la surface des LT CD8 diminuedonc la quantité d’APC requise pour leuractivation.

Une variation de la quantité d’APC présen tesdans le milieu correspond à la fois à unevariation de la quantité de complexes CMH-peptide antigénique présentés aux LT CD8+et à une variation de la quantité de signauxde costimulation apportés. Comme nousavions déjà démontré que l’engagement deTLR2 à la surface des LT CD8+ diminue leurdépen dance vis-à-vis des signaux decostimulation apportés par les DC matures(4), nous avons cherché à déterminer s’ilpouvait aussi diminuer la quan tité decomplexes CMH-peptide antigéniquenécessaire à l’activation des LT CD8+. Pourcela, des LT CD8+ F5 naïfs ont été cultivés enprésence de concentra tions croissantes depeptide NP68, en présence ou non de ligandde TLR2. Nos résultats indiquent que laprésence de ligand de TLR2 diminue d’unfacteur 100 la quantité de peptide nécessaireà une activation optimale des LT. L’engage -ment de TLR2 à la surface des LT CD8+diminue donc leur seuil d’activation vis-à-vis

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RÉFÉRENCES

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d’une restimulation ex vivo en présence dupeptide NP68 et qu’elles sont capables delyser in vivo des cellules cibles présentantl’antigène NP68 à leur surface. Ces résultatsdémontrent que dans un contexte d’acti -vation sous-optimale, l’engagement deTLR2 à la surface des LT CD8+ permet lagéné ration de LT CD8+ mémoiresfonctionnels.

En conclusion, notre étude démontre invitro et in vivo que l’engagement de TLR2 àla surface des LT CD8+ diminue leur seuild’activation vis-à-vis de la force du signalTCR. En particulier, l’engagement de TLR2permet la génération de LT CD8+ mémoiresfonctionnels dans des conditions d’acti -vation sous-optimale. Ces observa tionssoulèvent d’intéressantes perspectivesd’amélioration des protocoles de vacci -nation. En effet, des combinaisons deligands de TLR ciblant à la fois les cellulesde la réponse innée mais aussi les lympho -cytes T pourraient être utilisés commenouveaux adjuvants. Cependant, nosrésultats suggèrent égale ment qu’au coursd’une infection, des ligands de TLR2pourraient diminuer le seuil d’activation deLT CD8+ autoréactifs et favoriser le déve -lop pement de maladies auto-immunes.

P lus de trente ans après leur décou -verte, les anticorps monoclonaux(AcM) sont parmi les produits

pharmaceutiques qui se développent le plusrapidement pour des essais cliniques. Unevingtaine sont maintenant sur le marché etplusieurs centaines sont en cours dedéveloppement et en tests cliniques et/ouprécliniques. Le travail qui a été effectuer cesdernières années dans notre laboratoiremontre qu’une courte immunothérapie anti -virale par un AcM neutralisant (667) peutexercer un effet thérapeutique positif indirecten orientant la réponse immune de sourisinfectées par un rétrovirus létal (FrCasE) versune immunité antivirale protectrice perdurantbien au-delà de la disparition de l’AcM de lacirculation sanguine.

L’objectif principal de notre travail est d’élu -cider le rôle de l’AcM 667 dans le dévelop -pement de la réponse immune endogène etde caractériser son(ses) mécanisme(s) d’action.En effet, la compréhension des mécanismesimmunologiques impliqués suite à l’admi-nistration d’un AcM thérapeutique estindispen sable pour l’élaboration de nouvellesthéra pies dans le futur et pour leur applicationdans d’autres modèles de pathologiesrétrovirales plus complexes.

Le travail au laboratoire sur le modèled'infection périnatale par le rétrovirus FrCasE"fort inoculum" montre qu’avec un traitementde quelques jours rapidement après l'infec tion(< 2 jours), par l'AcM 667 un IgG2a dirigécontre la glycoprotéine d'enveloppe deFrCasE (1), les animaux survivent sur le longterme (> 1.5 an) sans signe pathologique nivirémie détectable. À la différence desanimaux infectés et non traités qui meurent deneurodégénérescence entre 21 et 28 joursaprès l’infection, les souris infectées et traitées(3 doses de 15µg de l’AcM 667 dans un délaisde 5 jours après l’infection) développent uneforte immunité spécifique du virus FrCasE.Cette immunité implique l’interventionconjointe des composantes humorale (2,3), etcellulaire (4) de la réponse immune endo gène,la première étant responsable de la neutra -lisation du virus circulant, de la diminution dela virémie et du freinage de la propagation duvirus, la seconde étant responsable de ladestruction des cellules infectées et dudéveloppement de foyers infectieux et doncde leucémies à l’age adulte.

Une des hypothèses pour expliquer nosobservations serait que l'immunothérapie, endiminuant la charge virale peu de temps après la primoinfection, "donne du temps" ausystème immunitaire pour "optimiser" sa

ANTICORPSMONOCLONAL 667 :PLUS QU'UN EFFETNEUTRALISANT

Roudaina NasserLaurent Gros

Institut de Génétique Moléculaire deMontpellier

roudaina.nasser@igmm.cnrs.frlaurent.gros@igmm.cnrs.fr

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• Le développement de leucémie à partie dutroisième mois avec une mortalité supé -rieure à 90% vers 6 mois.

Ces premiers résultats, montrent que larédu ction de la charge virale semble suffi -sante pour éviter la neurodégéné rescencemais n’est pas suffisante pour permettre àl’organisme de développer une réponseimmune endogène efficace pour la pro-tection sur le long terme des effets leucé -mogènes du virus. Ces résultats, contraire -ment à certaines données de la littérature,tendraient à confirmer une autre hypothèse,comme quoi la partie constante Fc de l’AcMjoue un rôle crucial dans ces effets pro-tecteurs observés (fixation du complément,"ADCC", formation des complexes immunset fixation de FcR).L'objectif global de notre projet est dedresser un tableau aussi complet quepossible des mécanismes cellulaires etmoléculaires mis en jeu dans les infectionspérinatale par FrCasE pour générer et,ensuite, entretenir, une réponse antiviraleendogène protectrice sur le long terme suiteà une courte immuno thérapie passive. L’idéedirectrice est que ces expériences, conduiteschez la souris, permettront d'obtenir desinformations de nature générique etd'orienter la conception de futuresimmunothérapies passives par AcM desinfections par HIV, HBV et HCV.

L es lymphocytes iNKT (pour "invar iantnatural killer T cells") ont été mis encause dans la régulation de plusieurs

mécanismes immunitaires tels que le maintiende la tolérance, les réponses anti-infectieuseset l'immunité anti-tumorale. Ces cellules ontinitialement été identifiées comme des cellulesco-exprimant un TCR semi-invariant (Va14-Ja18 chez la Souris ou son homologue Va24-Ja18 chez l'Homme) et divers marqueursassociés aux cellules NK (tels que NK1.1 chezla Souris ou son homologue humain CD161),capables de produire rapidement des

réponse. Les ani-maux traités seraientdonc durant lapériode néonataledans une phased’infection contrôlée,grâce à l’anticorpsexogène, qui leurpermet au momentdu sevrage lorsquele système immu-nitaire est pleinement mature de développerune réponse immune endogène efficace etdurable. Un tel mécanisme dépend essen -tiellement de la partie variable (fragment(Fab’)2) de l’AcM.

Si la réduction de la charge virale est suffisantepour protéger les animaux sur le long terme,des souriceaux infectés avec un faible inoculumdont le titre est équivalent à celui observé surdes souris infectées avec des forts inoculumviraux et traitées avec l’AcM 667, doiventnormalement survivre et déve lopper uneréponse immune endogène protectricesimilaire. Dans ce contexte, de nouvellesconditions d’inoculation périnatale du virus"infection périnatale à inoculum réduit", ontété mises au point. En effet, l’inoculation de 1particule infectieuse (pi) par souris permetd’obtenir une cinétique d’infection sur les troispremières semaines équi valente à celleobservée sur des souriceaux infectées avec5x104pi et traités par l’AcM 667 (Figure). Dansces conditions, l’évolution temporelle de lavirémie est très fortement réduite encomparaison avec des souriceaux infectés par5x104 pi, et est identique à celle des animauxinfectés et traités par l’AcM 667. Il est donc désormais possible de comparer lecompor tement à l’age adulte de deux groupesd’animaux contenant des charges viralesidentiques et dont la seule différence est laprésence ou non de l’AcM thérapeutique.

Des données préliminaires, résumées sur leschéma ci-dessous, obtenues avec l’infectionpérinatale à inoculum réduit montrent :• Que la grande majorité des souris (85%)survivent à la neurodégénérescence,confirmant que de fortes charges virales trèstôt après la naissance sont nécessaires audéveloppement de la pathologie.

• Le développement d’une réponse immuneendogène qualitativement équivalente(isotype IgG2a prédominant) aux animauxinfectés à forts inoculum et traités par l’AcM 667, mais avec des concentrationsd’immuno globulines beaucoup plus faibleset donc un pouvoir neutralisant diminué.

• Le développement d’une réponse cellu laireplus faible et moins efficace.

RÉFÉRENCES

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LES LYMPHOCYTESINKT HUMAINSCD4+CD161–CCR7+ET CD4+CD161+CCR7–PRÉSENTENTRESPECTIVEMENT DES PHÉNOTYPIQUESET DES FONCTIONS DE TYPE "MÉMOIRECENTRALE" ET "MÉMOIREEFFECTRICE"

Alexis Rossignol1Anne Barra1André Herbelin2Jean-Marc Gombert1

1 UPRES EA3805, Laboratoired'Immunologie-Hématologie, Poitiers

2 CNRS UMR 8147, Hôpital Necker, Paris

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cytokines aussi bien Th1 que Th2 aprèsstimulation. Les connais sances accumuléesdepuis lors sur les lymphocytes iNKT, enparticulier grâce à de meilleurs outilsd'identification, montrent qu'ils constituent enréalité une population phénotypiquement etfonctionnellement hétérogène.

Ainsi, un premier niveau de dichotomieapparaît entre les lymphocytes iNKT CD4+ etCD4–, en particulier chez l'Homme. Lespremiers présentent un profil de sécrétioncytokinique plus plastique, capables desécréter des cytokines aussi bien Th1 que Th2,alors que les lymphocytes iNKT CD4–présentent un fort biais fonctionnel Th1 (1-3).Au contraire de leur contrepartie CD4–, leslymphocytes iNKT CD4+ sont égalementcapables d'induire la production d'immuno -globulines par des lymphocytes B leurprésentant l'antigène (3). Ce glissement d'unprofil Th0 vers un profil Th1 pourrait repré -senter une étape de maturation tardive deslymphocytes iNKT associée à la perte de CD4.Un second niveau de dichotomie sembleexister, tout au moins chez la Souris, entre leslymphocytes iNKT NK1.1+ et NK1.1–. Ainsi,certaines populations de lymphocytes iNKTNK1.1– sont capables de sécréter de l'IL4 (4)ou de l'IL17 (5) alors que leurs contre partiesNK1.1+ en sont incapables.

Ces résultats sont en accord avec l'hypothèseselon laquelle les différents phénotypes dessous-populations iNKT sont préférentiel lementassociés avec des spécialisations fonction -nelles. Cependant, les mécanismes contrôlantl'acquisition d'un phénotype donné par lesdifférentes populations iNKT sont encore malconnus, chez l'Homme tout particulièrement.La compréhension de ces mécanismes estpourtant primordiale pour une utilisationthérapeutique des lympho cytes iNKT, leuraction (bénéfique ou délétère) au cours desituations patho logiques dépendant princi -palement de l'orientation Th1 ou Th2 qu'ilsvont donner à la réponse immunitaire. Desrésultats obtenus précédemment aulaboratoire suggèrent déjà que les interactionsavec les cellules présen tatrices d'antigène(CPA), en particulier lymphocytes B et cellulesdendritiques myéloïdes (DCm), engagées enpériphérie par les lymphocytes iNKT jouent unrôle important dans ces processus dematuration (3).

A la lumière de ces observations, et paranalogie avec la dichotomie NK1.1 chez laSouris, nous avons choisi de comparer chezl'Homme le phénotype et les fonctions deslymphocytes iNKT CD4+ (c'est-à-dire ceuxdont le phénotype semble le plus diversifié) enfonction de l'expression ou non de CD161,ceci dans le but de déterminer si ces deuxpopulations sont fonctionnellement distinctes.

L'analyse par cyto -métrie de flux deslymphocytes iNKT(par un co-mar quageavec un anti corps anti-Va24 et un tétra mèrede CD1d) con firmetout d'abord quel'expres sion de lamolécule CD161, init -ia lement associée aucaractère "NK" deslympho cytes iNKT,n'est en fait pasrépartie de façonhomogène parmi lesdifférentes sous-populations. Si son expressionest très fréquente au sein de la populationCD4–, elle est également exprimée par uneproportion non-négligeable de cellules iNKTCD4+.

Notre postulat de départ était que lapopulation iNKT CD4+, du fait de sa plasticitéimportante en particulier en terme deproductions de cytokines, comprend unepopulation de type mémoire centrale, telleque définie par l'équipe de Lanzavecchia (6),c'est-à-dire capable de migrer vers les organeslymphoïdes secondaires et présen tant descapacités effectrices réduites. Nous avonsdonc étudié, par cytométrie de flux au seindes cellules mononucléées (CMN) du sang,l'expression membranaire de CCR7 et deCD62L (deux récepteurs impliqués dans lamigration vers les organes lymphoïdes

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périphériques), l'expression intracytoplas -mique de la perforine et la production decytokines (après stimulation par du PMA et ducalcium ionophore) par les deux sous-populations iNKT. Les résultats obtenusmontrent que les lymphocytes iNKTCD4+CD161– sont significativement enrichisen cellules exprimant CCR7 et CD62L, maisqu'ils expriment peu la perforine, l'IFNg, l'IL4ou le TNF–a. Au contraire, les lymphocytesiNKT CD4+CD161+ expriment peu CCR7 etCD62L alors qu'ils sont fortement enrichis encellules exprimant la perforine et productricesde cytokines.

Afin d'étudier la réponse des différentespopulations iNKT à la présentation del'antigène, les cellules T CD4+CD161+ etCD4+CD161– sont purifiées par tris magné -tiques multiples puis cultivées 7 jours enprésence de lymphocytes B ou de DCmautologues, chargées ou non par l'a-GalCer,un ligand expérimental des cellules iNKT. Lesrésultats obtenus montrent que les lympho -cytes iNKT CD4+CD161– sont les plussensibles à la présentation de l'antigène pardes CPA puisqu'ils présentent des facteursd'expansion en moyenne 8 fois plus impor tantque leurs homologues CD4+CD161+ enprésence d'a-GalCer.

Afin de disposer d'une quantité plusconséquente de cellules, ces expériences deco-culture ont également servi de point dedépart à l'établissement de lignées primairesde lymphocytes iNKT, maintenues par la suitesur feeders autologues en présence de PHA,d'IL2 et d'IL15. Une stimulation polyclonale deces lignées par de l'anti-CD3 nous a toutd'abord permis de confirmer que leslymphocytes iNKT CD4+CD161– ont unecapacité de prolifération (mesurée par

Figure. Proposition d'une compartimentationfonctionnelle des lymphocytes iNKT chezl'Homme

SFIACTUALITÉS 34

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CARACTÉRISATIONFONCTIONNELLE DE MOLÉCULESHOMOLOGUES À DES FACTEURS DU COMPLÉMENTDANS LE SYSTÈMENERVEUX DE LA SANGSUE

Muriel Tahtouh

CNRS FRE 2933, USTL Lille1,Villeneuve d'Ascq

muriella_mahdoume@hotmail.com

6

P rix poster SUITE

L e système du complément est uncomposant essentiel de l'immunitéinnée qui intervient dans l’élimina -

tion des pathogènes, directement ou parl'intermédiaire de cellules à activité phago -cytaire qui peuvent être recrutées. Dans lessituations inflammatoires, les cascadesd'activation du système du complémentsurviennent selon 3 voies : une voie classiquedépendant de l’interaction Ac-Ag, une voiealterne activée des composants de surface debactéries, de virus, de parasites ou dechampignons et enfin une voie passant pardes lectines, notamment la MBL (MannoseBinding Lectin) et la ficoline qui reconnaissenten particulier certains sucres de pathogènes(1,2).

Chez les vertébrés, le complément a un rôleimportant dans l’initiation et le maintien de laréponse inflammatoire associée à denombreuses pathologies comme cellespouvant toucher le système nerveux. Dans lelupus érythémateux systémique, les facteursdu complément peuvent avoir un effetprotecteur ou délétère (3). Au cours d'uneischémie cérébrale, une surexpression desprotéines du complément, notamment C1q,C3 et C9 est observée (4). Enfin, dans lamaladie d’Alzheimer, il a été constaté uneélévation du taux des ARN messagers desprotéines du complément et une diminutiondu taux de CD59 dans le cerveau despatients, favorisant ainsi la formation ducomplexe d’attaque membranaire (CAM) etaboutissant à une destruction neuronale (2).Le complément endogène pourrait donc êtreimpliqué dans les processus démyélinisantset neurodégénératifs et jouer un rôle dans laphysiopathologie des maladies du systèmenerveux.

Les invertébrés ne possèdent pas d’immunitéacquise et leur système de défense contre lespathogènes reposent donc sur la seuleimmunité innée, ce qui en fait des modèlesintéressants pour identifier des mécanismesanciens de protection conservés au fil del'évolution. La sangsue représente à ce titreun modèle d'étude de lophotrochozoairesintéressant, dans la mesure où ce grouped'invertébrés annélides présente un degré deproximité génomique avec l'homme plusimportant qu'avec les nématodes ou lesecdysozoaires (5). Des analyses biomolé -culaires, protéomiques et immunologiquesréalisées au laboratoire témoignent del'existence de mécanismes d'immunité innéeau niveau périphérique (6-8). Mais jusqu'àmaintenant aucune étude n'avait abordé

incorporation de thymidine tritiée) signifi -cativement supérieure à celle de leurscontreparties CD4+CD161+, suggérant queces dernières ont atteint un stade dedifférenciation terminale et sont moinscapables de répondre à l'engagement deleur TCR.

Enfin, l'analyse de la production d'IL4 etd'IFNg par les différentes lignées primairesmontre que la présentation de l'a-GalCer pardes lymphocytes B ou des DCm induit uneaugmentation significative de la productiond'IL4 et d'IFNg par les lymphocytes iNKTCD4+CD161–, par rapport à leurs homo -logues fraichement extraits du sang. Enrevanche, il n'existe aucune différencesignificative dans la fréquence de cellulesproductrices parmi les lymphocytes iNKTCD4+CD161+ avant ou après stimulation parles CPA, suggérant que cette population estincapable de moduler sa production decytokines après présentation de l'antigène,au contraire des cellules iNKT CD4+CD161–.L'expression de la perforine n'est quant àelle pas modifiée après re-stimulation, dansaucune des populations considérées.

Dans leur globalité, nos résultats montrentque les populations iNKT CD4+CD161+ etCD4+CD161– humaines constituent bien deux populations fonctionnellementdistinctes (Figure). Ainsi, les lymphocytesiNKT CD4+CD161+ présentent descaractéristi ques directement effectricespuisqu'elles expri ment la perforine,produisent de grandes quantités decytokines (aussi bien de type Th1 que Th2) etprésentent une faible capacité à proliférer.Au contraire, les cellules iNKT CD4+CD161–sont enrichies en cellules exprimant CCR7 etCD62L, prod uisent peu de cytokines maissont capables de moduler cette productionaprès stimulation par des CPA. Elles ontégalement une capacité de proliférationaccrue après stimulation polyclonale ouprésentation de l'a-GalCer par des CPA. Paranalogie avec des travaux du groupe deLanzavecchia sur les populations Tconventionnelles (6), les lymphocytes iNKTCD4+CD161+ semblent donc constituer unepopulation de type mémoire effectrice, peuplastique. Au contraire, les cellules iNKTCD4+CD161– présentent des caractéristiquesde type mémoire centrale et constituent unepopulation à la plasticité plus importante,capable de recirculer vers les organeslymphoïdes périphériques, où la rencontreavec de nouvelles CPA leur permettraitd'acquérir des capacités de stimulation de laréponse immunitaire secondaire.

SFIACTUALITÉS 35

l'implication de facteurs du complémentcomme éléments potentiels l'immunité innéeimpliquée dans la protection et la réparationdu système nerveux chez les invertébrés.Notre travail sur la sangsue médicinaleapporte quelques arguments dans ce sens.

En effet, dans notre laboratoire, il a étérécemment observé que, suite à une lésion,la réparation du système nerveux était plusrapide en présence de bactéries. Un étudedes mécanismes moléculaires et cellulairesintervenant dans les différentes phases duprocessus de réparation pouvant aboutir à larégénération de la chaîne nerveuse de lasangsue a donc été initiée. La recherche detelles molécules au sein du système nerveuxde la sangsue médicinale a été renduepossible grâce à la construction d'unebanque normalisée d'EST enrichie entranscrits rares à partir des ARN totaux desystème nerveux issus de sangsues adultes. Apartir de banques EST spécifiques, il a étépossible d'identifier plusieurs moléculesayant des homologies importantes avec desfacteurs immunitaires de vertébrés. Notreattention s'est principalement portée surcertaines molécules pouvant appartenir auxvoies d'activation du complément.

Deux molécules candidates ont été étudiéesjusque maintenant : une molécule de typeC1q-like et une molécule apparentée auMannose Binding Lectin (MBL). Par desapproches de biologie moléculaire, laséquence de chaque moécule homologue aété déterminée. Des expériences d'hybri -dation spécifique avec les sondes de C1q-likeet de MBL-like ont permis de déceler les ARNmessagers correspondants au niveau desganglions de la chaîne nerveuse de sangsueet principalement au niveau des cellulesnerveuses. De manière intéressante, paranalyse en PCR en temps réel, il a pu êtreobservé une modulation des transcritsspécifiques après incubation de la chaînenerveuse avec des bactéries. De plus lescellules microgliales ainsi que les cellulesnerveuses issues de ganglions soumis à unedissociation mécanique peuvent interagirefficacement avec des bactéries, comme celaa pu être observé par analyse en cytométriede flux. Enfin, une approche immuno -chimique avec un anticorps polyclonal dirigécontre du C1q humain a abouti à la mise enévidence de signaux positifs au niveau descellules nerveuses et microgliales.

Des données acquises jusqu'à maintenant, ilsemble donc raisonnable de penser que des

molécules ayant une homologie avec desfacteurs du complément se trouventprésentes au niveau du système nerveux dela sangsue. Récemment il été évoqué que,face à des signaux de danger, des élémentsrégulateurs communs pour la réponse dusystème nerveux et pour le système immu -nitaire pouvaient exister (9). Compte tenude la capacité de cet invertébré à régénérersa chaîne nerveuse après lésion, il est fortpossible que les molécules originalescaractérisées puissent avoir un rôleimportant dans les mécanismes d'immunitéinnée qui interviennent pour protéger etfavoriser la réparation du système nerveuxaltéré.

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B rèves

LES MULTIPLESVISAGES DESCELLULES NK

Christian A.J. VosshenrichSarah Lesjean-PottierJames P. Di Santo

Inserm U668, Institut PasteurParis

vosshenr@pasteur.frdisanto@pasteur.fr

1

L e système immunitaire inné estcomposé de plusieurs lignéescellulaires, constituées de cellules

Natural Killer (NK), de cellules dendritiques(CD), de granulocytes, de macrophages et demastocytes qui se distinguent les unes desautres par leurs phénotypes et leursfonctions. Les cellules NK sont dépourvuesde récepteurs d’antigènes (et sont doncCD3– ) mais elles expriment certains réce -pteurs parfois spécifiques impliqués dans lareconnaissance de leur cibles (comme NK1.1,NKp46, NKG2D, …) (pour revue, réf 1). Lesfonctions principales des cellules NK incluentl’élimination des cellules infectées oucancéreuses et la sécrétion de cytokines (IFN- g, TNF-a) après stimulation (2). Les CD

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SFIACTUALITÉS 36

sont les sentinelles de l’environnement etdeux sous-populations prédominantes de CDpeuvent être distinguées sur la base de leurtaux d’expression de l’intégrine ax (CD11c).Les CD conventionnelles (cCD) exprimenttrès fortement CD11c, alors que les CDplasmacytoides (pCD) l’expriment plusfaiblement. De plus, les pCDs (au stade "derepos") expriment une molécule propreappelée "pCD antigen-1" (PDCA-1). Cesdeux types de CDs ont un rôle central dansl’initiation de la réponse immunitaireadaptive, car elles sont capables de stimulerles cellules T spécifiques d’antigènes (pourrevue, réf. 3). Les résultat d'un nombrecroissant d’études indiquent que lesdifférentes interactions entre les cellules NKet les CD ont lieu pendant la phase précocede la réponse immunitaire (4). Cette"interface NK-CD" a été proposée commemécanisme cellulaire qui contrôle poten -tiellement le déroulement et la qualité de laréponse immune adaptative.

Cependant, la description récente d’unenouvelle cellule ayant simultanément descaractéristiques phénotypiques et fonction -nelles des NK et des CD suggère que danscertaines conditions l’interface NK-CD neserait pas nécessaire (5,6). Ces cellulesappelées "interferon-producing killerdendritic cells" ou "IKDC" exprimeraient à lafois le marqueur caractéristique des cellulesCD (CD11c) et les marqueurs caractéristiquesdes cellules NK (NK1.1, DX5 et des protéinesde la famille Ly49). Les populations d'IKDCdétruiraient globalement des ciblescancéreuses sensibles aux cellules NK,sécréteraient de l’IFN-g (cytokine typique descellules NK) et produiraient de l’IFN-a(cytokine typique des pCD). Les IKDCpourraient "court-circuiter" la dynamique desinteractions entre les CD et les NK et auraientle potentiel de transmettre rapidement auxlymphocytes adaptatifs les signaux de danger(7). De plus, étant donnée leur activité anti-tumorale, on pourrait espérer que les IKDCsoient utilisées comme nouvelle thérapie (8).Cependant, des connaissances complémen -taires sur leurs origines et leurs dépendancesau cours du développement - comme, parexemple, vis-à-vis des facteurs de croissance -paraissaient nécessaires avant d’envisagerdes essais cliniques.

Notre équipe s’intéressant au dévelop -pement du système immunitaire, nous avonsété intrigués par l'observation que les IKDCsemblaient se développer indépendammentde la chaîne gc, une sous unité essentielle des

récepteurs de l’IL-2, l’IL-4, l’IL-7, l’IL- 9, l’IL-5,et l’IL-21. (6). A l’inverse, les cellules NK sontabsentes chez les souris gc-/-, car IL-15 estessentiel à leur développement (9). De plus,les IKDC semblent être une nouvelle lignéede CD, car ces cellules ne se développentpas en absence de la chaîne b du récepteurIL-2 (IL-2R), contrairement aux cCD et pCD,qui sont présentes en nombre normal chezles souris IL-2Rb-/- (5). Ceci pose problème,l’IL-2Rb étant essentielle pour la transductiondu signal d’IL-15, de même que la chaîne gc.Comment le différentiation des IKDCpourraient-elles être indépendantes d'unechaîne d’un récepteur (gc) et en même tempsdépendantes d’une autre chaîne (IL-2Rb)requise pour le même ensemble de cytokines(IL-2 et IL-15) ? Une possibilité seraitl'existence d'un facteur jusqu'ici non décou -vert qui dépendrait d'IL-2Rb et serait enmême temps indépendant de gc.

Nous avons précédemment rapportél'absence totale des cellules NK1.1+ chez lasouris sans chaîne gc (9). Comme il a été

montré que les cellules IKDC exprimaient lamolécule NK1.1, nous nous attendions à nepas trouver d’IKDC chez les souris déficientesen chaînes gc, contrairement à ce qui a étépublié (6). Cependant, serait-il possible queles IKDC perdent l’expression de NK1.1 chezles souris gc-/- ,mais expriment d'autresmarqueurs de NK comme DX5, comme celaété proposé (8) ? Pour étudier cettepossibilité, nous avons analysé en parallèleles différents CD et de NK, présent dans lesorganes lymphoïdes primaires et secon -daires, chez des souris contrôles, gc-/- et IL-2Rb-/-. Toutes les souris analysées parta -geaient le même fond génétique (C57BL/6)et étaient déficientes pour la recombinaseRag2 (afin de simplifier la détection descellules rares). Nous avons porté notreattention sur les cellules CD11cloB220+,correspondant à la descri ption des IKDCdans des articles originaux (5, 6). Deux typescellulaires, clairement distinguables, ont étéainsi identifiés chez la souris normale(Figure) : les uns expriment Ly6C et pDCA-1,ressemblant ainsi à des pCDs classiques,

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SFIACTUALITÉS 37

alors que les secondes expriment NK1.1 etincluent les IKDC présumées. En revanche,les souris gc-/- et IL-2Rb-/- sont dépourvues detoutes cellules NK1.1+, y compris cellesressemblant aux IKDC, alors que ces animauxpossédaient des populations normales decCD et de pCD. Finalement, toutes les sourisanalysées présentaient une importantepopulation de cellules DX5+NK1.1– quin’exprimaient ni le CD11c, ni le B220 et doncne correspondent pas aux IKDC. Cesdonnées ne soutiennent pas l’hypothèsequ’un facteur non encore décrit, indépendantde gc mais dépendant de l’IL-2Rb, soit exigépour la génération des IKDC (10). Par contre,ces résultats suggèrent fortement que lesIKDC, comme les cellules NK, sont dépen -dantes des chaînes IL-2Rb et gc et exprimentles marquers NK1.1 et DX5.

Nous avons constaté que le développementdes cellules IKDC exige l’IL-15 (10). Leslaboratoires de Colonna et de Shortman ontobtenues les mêmes résultats (11,12). Ceux-ciexpliquent la dépendance des cellules IKDCaux chaînes IL-2Rb et gc et suggèrent uneautre similitude avec les cellules NK. Lamolécule NKp46 (encodé par Ncr-1) estconsidérée comme une marqueur spécifiquedes cellules NK (13). En utilisant des sourisportant un gène rapporteur GFP inséré dansle locus Ncr-1 (14), nous avons pu montré quetoutes les cellules IKDC (NK1.1+CD11cloB220+) exprimaient NKp46; or, ces cellulessont absentes chez les souris transgéniquespour Ncr-1 et gc-/- (10).

Les résultats complémentaires des labora -toires de Colonna et de Shortman (11,12) ontmontré dans la population CD11cloB220+,que les pDC, mais pas les cellules NK1.1+,exprimaient uniformément le récepteur de

lectine Siglec-H (11) et le facteur detranscription PU.1 (12). Un autre "signature"des cellules IKDC serait leur capacité àsécréter de l’IFN-a (5). Blasius et al. (11) ontclairement montré que les cellules Siglec-H+

produisent l’IFN-a (et pas de cellules NK1.1+) ;ces résultats sont en accord avec d’autrespublications (15,16), ainsi contestant lacapacité des IKDC à sécréter cette cytokine.Tous ces résultats redé finissent les deuxtypes de cellules présents dans la populationCD11cloB220+ - les pDC et les cellules NK -en termes de phénotype de d'expression demolécules membranaires, de dépendanceenvers des récepteurs de cytokine et defonctions effectrices putatives (figure). Ilsemble que certaines activités initialementattribuées aux cellules IKDC étaient proba -blement causées par les contaminantsrestants après l’isolement des cellules.

Il a été suggéré que l’expression élevée demolécules du CMH de classe II et le B220 soitun moyen d’identifier les IKDC (5,6).L’expression de molécules du CMH de classeII par les IKDC a été d’ailleurs été proposéecomme marqueur de leur potentiel deprésentation antigénique (5). De manièreintéressante, nous avons constaté quel’expression du CMH de classe II ou du B220n’étaient pas corrélées de façon évidente surles cellules NK1.1+. En outre, en ce quiconcerne l’expression du CD11c, ce mar -queur n’était pas exprimé de façon différentepar les cellules NK1.1+ de la rate, lesganglions lymphatiques ou la moelle osseuse(10). La capacité à co-stimuler les cellules Ts'est avérée aussi faible pour les cellulesNK1.1+, qu’elles soient B220+ ou B220–. Lescellules NK exprimant le CMH de classe II etprésentant un peptide ont pu stimuler lescellules T spécifiques, mais ces cellules

étaient à cet égard moinsefficaces que les CD ou lespCD classiques (10,12). Enfin,nos résultats portant sur lescellules NK CMH de classe II+ressemblent à ceux destravaux précédents démon-trant le potentiel des cellulesNK humaines DR+ à stimulerles cellules T (17,18).

Le nombre des cellules NKexpriment CD11cloB220+ estaugmenté dans les tumeursaprès traitement avec uninhibiteur de tyrosine kinaseet l’IL-2 (6). Considérant queces cellules représentent unesous population des cellules

NK activées, nous avons donc testé sil'expression de CD11c et de B220 pouvaitêtre induite sur des cellules NK aprèsactivation. Nous avons trouvé uneaugmentation forte de l’expression deCD11c et B220 sur les cellules NK1.1+ de lamoelle osseuse, de la rate et des ganglionslympha tiques, chez les souris traitées par desligands qui stimulent la réaction immunitaireinnée à travers les récepteurs TLR3 ou TLR9(sensibles aux produits microbiens). Nousavons également trouvé une augmentationdes cellules NK1.1+ CMH II+ dans lesganglions lymphatiques des souris traitées,mais ceci sans relation avec l’expression duB220. En conclusion, l'expression plus élevéede B220 par des cellules NK1.1+ est liée àleur proli fération, in vitro et in vivo (10).

L’ensemble de nos résultats (10) et de ceuxde deux autres groupes (11,12), démontrentsimultanément que les cellules NK1.1+exprimant un phénotype CD11cloB220+ sontétroitement liées aux cellules NK etn'appartiennent pas à la lignée des CD.Tandis que l'expression de CD11c et deB220 par les cellules NK semble marquer unétat d'activation, nous ne savons pas sitoutes les cellules NK adoptent cephénotype après activation. En tant quetelles, les cellules NK exprimant lephénotype de CD11cloB220++ pourraientreprésenter une sous population particulièredes cellules NK, dont l'activité pourraits'avérer utile dans certains conditionscliniques. Ainsi, l’augmentation du nombrede cellules NK activées dans les tumeurspourrait indiquer leur potentiel bénéfiquedans des stratégies thérapeu tiques.

SFIACTUALITÉS 38

B rèves suite

LE CONTRÔLEDU VIH PAR LESLYMPHOCYTES TCD8+ :IDENTIFIER DESCORRÉLATS DEPROTECTION

Jorge AlmeidaVictor Appay

Equipe AvenirInserm 543, Université Pierre et Marie CurieParis

jorgeramosdealmeida@gmail.comappay@chups.jussieu.fr

2

L es lymphocytes T CD8+ cytotoxi quessont connues pour leur rôle centraldans l’immunité anti-virale. Au cours

de l’infection par le VIH, il est possible dedétecter un grand nombre de lymphocytes TCD8+ spécifiques du VIH. Cependant, lafréquence de ces cellules n’a pas de valeurprédictive quant à la rapidité de progressionvers le SIDA, et il n’est pas rare de voir despatients infectés progresser vers la maladiemalgré un nombre conséquent de lympho -cytes T CD8+ circulants spécifiques du VIH.Ceci suggère que la capacité des lymphocytesT CD8+ à contrôler un virus dépend d’aspectsqualitatifs plutôt que d’aspects quantitatifs. Larecherche de caractéristiques qualitativesreliées à une meilleure protection par leslymphocytes T CD8+, en particulier contre leVIH, est devenue un objectif majeur desimmuno logistes. Ceci est essentiel pour notrecompréhension du contrôle du VIH par leslymphocytes T CD8+, mais aussi et surtoutpour le développement de vaccins efficacesbasés sur l’immunité lymphocytaire T.

Les lymphocytes T CD8+ constituent unepopulation très hétérogène, au sein mêmed’un individu : ces cellules diffèrent sur la basede la restriction HLA class I, de l’épitope viralreconnu, ainsi que de la diversité clonal, et leurefficacité anti-virale peut donc variéegrandement. Cette hétérogénéité représenteune difficulté majeure pour l’identificationprécise dans une sous-population de cellulesde caractéristiques associées à une meilleureefficacité. De manière intéressante, l’expres -sion de certaines allèles HLA class I (c.a.d. HLAB57 et HLA B27) chez le patient infecté a étéassociée avec une progression plus lente versla maladie (1). HLA B27 est particulièrementremarquable car la réponse lymphocytaire TCD8+ spécifique du VIH restreinte par cetteallèle cible un épitope en particulier situé dansp24, appelé KK10 (en contraste avec laréponse lymphocytaire T CD8+ restreinte parHLA B57 qui cible plusieurs épitopes) (2). Deplus, l’apparition d’un mutant d’échappementau niveau de l’épitope KK10 corrèle avec ladébut de la progression vers la maladie (3).Ces informations mettent en avant l’impor -tance des lymphocytes T CD8+ restreints partHLA B27 et spécifiques de KK10 dans lecontrôle du virus et suggèrent que cettepopu lation a une capacité protectricesupérieure.

Corrélats de protection

Afin de mieux définir les propriétés deslymphocytes T CD8+ associées avec unmeilleur contrôle du VIH, nous avons doncréalisé une étude comparative des lympho -cytes T CD8+ restreints part HLA B27 et

spécifiques de KK10 par rapport auxlymphocytes T CD8+ spécifiques d’autresépitopes du VIH (et restreints par d’autresallèles HLA) chez des patients infectés par leVIH mais naïfs de traitements (4). Cettestratégie nous permet de restreindre sensi -blement la difficulté reliée a l’hétérogènéitédes lymphocytes T CD8+ spécifiques du VIH,en nous concentrant sur l’analyse d’unepopulation homogène, c.a.d. les lymphocytesT CD8+ B27-KK10. Notre étude a permisd’identifier des paramètres clairs associés auxlymphocytes T CD8 B27-KK10, et donc aumeilleur contrôle du VIH. En particulier, leslymphocytes T CD8+ B27-KK10 présentent uneavidité fonctionnelle élevée, c’est à dire queces cellules ont une forte capacité àreconnaître leur antigène (c.a.d. le KK10). Ceparamètre définit l’intensité d’interaction entrela cellule effectrice et sa cible, de telle sorteque le lymphocyte T CD8+ de forte aviditéreconnaîtra et détruira plus rapidement lacellule infectée (5). De plus, la capacitépolyfonctionnelle des lymphocytes T CD8+B27-KK10 semble en général supérieure àcelle des autres lymphocytes T CD8+spécifiques de VIH. En effet, les lymphocytes TCD8+ B27-KK10 apparaissent capables deproduire simultanément un plus grand de cytokines effectrices (telles que l'IFN-g,l'TNF-a, l'IL-2 et le MIP-1b), ainsi que dedégranuler des cytotoxins, telle que GranzymeB, après leur stimulation à une concentrationd’antigène donnée (6). Ces deux paramètres,à savoir fortes avidité et polyfonctionnalité,identifiés chez les lymphocytes T CD8+ B27-KK10, semblent constituer la base du meilleurcontrôle du VIH. Il est aussi probable que cesdeux paramètres soient liés entre eux, ouplutôt que la polyfonctionalité des cellules soitdépendante de leur avidité. Les cellules deforte avidité, du fait de leur sensibilité pourl’antigène, reçoivent un stimulus plus fort àune concentration d’antigène donnée, ce quipourrait les amener à produire plus decytokines. Les résultats de nos travaux actuelsvont dans cette direction.

Maintenir l’équilibre dynamique

Nous avons aussi démontré que leslymphocytes T CD8+ B27-KK10 présentent un"turnover" clonal important : c’est à dire quele clonotype dominant, définit par un TCRunique au sein d’une population de mêmespécificité, changeait au cours du temps(remplacé par un clonotype précédemmentsous dominant). Ces changements de domi -nance clonale au sein des populationslymphocytaires T CD8+ B27-KK10 peuvent êtrela conséquence du turnover accru de cescellules, du fait de leur sensibilité pourl’antigène, qui atteignent plus rapidement un

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stade de sénescence réplicative, et sont alorsremplacées par des cellules/clonotypes à plusfort potentiel réplicatif. Il est important deconsidérer l’équilibre dynamique qui s’opèreautour de ces paramètres pour instaurer uncontrôle du VIH (Figure). Alors que d’une part,la sensibilité accrue de certains lymphocytes TCD8+ spécifiques du VIH pour l’antigène leurspermettent d’être efficaces (forte avidité etpolyfonctionnalité), d’autre part, elle lespoussent à atteindre plus rapidement desstades d’épuisement clonal et ces cellulesdoivent être continuellement remplacées pourpermettre un contrôle de la réplication viraledans le durée. Le contrôle du VIH dans letemps dépend donc fortement de la capacitédu système immunitaire à renouveler son

"pool" de lymphocytes T CD8+ protectrices.Hors, nous savons que la capacité derenouvellement des lymphocytes T diminue aucours de l’infection VIH, avec la réduction del’activité thymique et du nombre delymphocytes T naïfs (7). En résumé, le contrôleeffectif de la réplication viral semble êtreexercé en particulier par des lymphocytes TCD8+ spécifiques du VIH qui présentent descaractéristiques avantageuses telles que uneforte avidité et polyfonctionnalité. Cependant,si les ressources immunitaires du patientinfecté ne permettent pas le renouvellementde ces cellules dans le temps, ou si le virusparvient à échapper leur contrôle en mutant,la progression vers la maladie peut survenir ;expliquant pourquoi certains patients infectéspeuvent progresser en dépit de la présenced’un grand nombre de lymphocytes T CD8+spécifiques du VIH qui ne sont pas assezeffectives.

Un pas vers une stratégie vaccinale etun immunomonitoring plus adaptés

Les récents résultats de l’essai vaccinal réalisépar Merck (V520), visant à induire uneimmunité lymphocytaire T anti-VIH, n’ontindiqué aucun effet bénéfique de ce vaccinchez les patients vaccinés. Au delà de ladéception engendrée par ces résultats, cetéchec nous fait surtout prendre conscienceque notre connaissance de l’immunité T et deson induction efficace par un vaccin resteencore très limitée. Il semble à présentimpératif de considérer les paramètresassociés à un meilleur contrôle du VIH par les

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Figure. L’équilibre dynamique du contrôle de la réplication du VIH par les lymphocytes TCD8+ de forte avidité fonctionnelle.

lymphocytes T CD8+, tels que ceux identifiésdans notre étude, lors du design de vaccinsanti-VIH basé sur l’immunité T, ainsi que pourl’immunomonitoring de ces vaccins. En effet, ildevient nécessaire de voir si les candidatsvaccinaux actuels sont capables d’induire descellules de forte avidité pour l’antigène - etpas seulement pour l’antigène présent dans levaccin, mais aussi et surtout pour celui présentnormalement chez le patient - et qui montrentdes capacités polyfonctionnelles. Des testsclassiques, comme par exemple les tests deprolifération in vitro ou bien les tests Elispotréalisés avec des concentrations supra-optimales d’antigène, pour vérifier l’immuno -génicité d’un vaccin n’offrent qu’uneconfirmation très limitée ; ils doivent êtrecomplémenter avec des tests permettant uneanalyse plus fine des réponses T générées. Deplus, il est important de vérifier que lastimulation induite par le vaccin ne conduit àl’épuisement clonal des populations de forteavidité. La mise au point de futurs candidatsvaccinaux nécessite aussi de se pencher plusamplement sur la manière d’influencer lespropriétés des cellules induites chez l’homme.Des études pré-cliniques ont montré que laquantité d’antigène (8), le niveau et le type deco-stimulation (9), ainsi que la voie devaccination (10) influençaient fortement lacapacité fonctionnelle des cellules induites,dont leur avidité. Alors que certains pourraientconsidérer les résultats du vaccin Merckcomme sonnant la glas de la stratégievaccinale visant à induire une immunité Tefficace chez l’homme, le développement detels vaccins ne fait finalement que commencer.

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B rèves suite

IDENTIFICATIONDANS LA MOELLEOSSEUSE HUMAINED’UNE POPULATIONDE PROGÉNITEURSLYMPHOÏDESCAPABLES DECIRCULER ET DE COLONISER LE THYMUS

Emmanuelle SixMarina Cavazzana-CalvoIsabelle André-Schmutz

Inserm U768Hôpital Necker, Paris

andre-schmutz@necker.fr

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L es lymphocytes B, T et NK sont, àl’instar de toutes les cellulessanguines, générées tout au long de

la vie d’un individu à partir d’une cellulesouche hématopoïétique (CSH), selon unprocessus de perte progressive de potentialitéde différenciation concomitante à une spécia -lisation et à une maturation fonctionnelle. Laplus grande partie du développement deslymphocytes B et NK se passe dans la moelleosseuse, alors que les lymphocytes Tnécessitent pour leur développement unorgane spécialisé, le thymus.

Chez l’homme, les connaissances concernantles étapes précoces de la genèse deslymphocytes ou lymphopoïèse et la nature du(ou des) progéniteurs capables de sortir de lamoelle osseuse, de coloniser le thymus et d’ygénérer des lymphocytes T, étaient jusqu’il y apeu de temps, encore très limitées,principalement du fait de l’absence de tests invitro de différenciation T humaine efficaces etde la rareté des échantillons disponibles (1,2).Dans le contexte dans lequel nous évoluons àl’Hôpital Necker-Enfants Malades, celui desdéficits immunitaires primaires de l’enfant etde la greffe de cellules souches hémato -poïétiques qui constitue l’une des seulesoptions thérapeutiques valables pour cesenfants, il nous est donc apparu crucial demieux caractériser ces étapes. En effet, dans lecas particulier des greffes où la compatibilitéHLA entre le donneur et le receveur n’est quepartielle, la génération de nouveauxlymphocytes T prend plusieurs mois durantlesquels les patients sont très sensibles auxinfections et réactivations virales, premièrecause de mortalité après ce type de greffe.L’enrichissement de ce type de greffon avecdes progéniteurs lymphoïdes pourrait doncpermettre d’accélérer la reconstitutionimmunitaire et ainsi empêcher la survenue deces infections.

Nous nous sommes appuyés sur différentstravaux pour avancer dans l’identification desprogéniteurs lymphoïdes. Chez la souris, oùles connaissances dans ce domaine sontbeaucoup plus avancées, Weissman et coll ontproposé un modèle d’hématopoïèse selonlequel tous les lymphocytes B, T et NKdérivent d’un progéniteur commun appelé"Common Lymphoid Progenitor", faisantpendant à un "Common Myleoid Progenitor".Une population caractérisée par le phénotypeLin–c-kitloTdT+IL-7Ra+/lo a été ainsi identifiée(3). Toutefois, son rôle dans la génération delymphocytes T n’est pas clair car sa présencedans le sang est contestée. Depuis cetteétude, d’autres groupes ont mis en évidencel’existence de populations progénitricescapables de circuler et donc de coloniser lethymus (4) mais le rôle exact de chacune dansla thymopoïèse post-natale reste à élucider.Ces études ont permis de souligner

l’importance des conditions expérimentalesdans lesquelles la capacité à coloniser lethymus est mesurée et de la nécessité des’approcher au mieux des conditionsphysiologiques en évitant par exempled’irradier les souris receveuses (4).

Chez l’homme, la lymphopoïèse a été bienétudiée au stade fœtal. Les travaux de BrunoCanque et coll. ont ainsi montré que le thymusfœtal était colonisé par des cellulesn’exprimant à leur surface aucun marqueurspécifique de lignée (Lin-) mais co-exprimant àla fois le marqueur précoce CD34, le marqueurCD45RA, exprimé dès que le potentielérythro-mégacaryocytaire est perdu et dontl’intensité d’expression semble corréler avec laspécialisation vers la voie lymphoïde et enfin lemarqueur CD7 retrouvé plus tard à la surfacedes thymocytes (5). In vitro, ces cellulesLin–CD34+CD45RA+CD7+ sont capables decoloniser le thymus fœtal. Elles ont étéretrouvées à la fois dans la moelle osseusefœtale et dans le sang de cordon maisdiminuent après la naissance pour n’être plusque rarement détectée après l’âge de un an.Cette observation laissait donc ouverte laquestion des progéniteurs lymphoïdesgénérés après ce stade. Anne Galy et coll.avaient dès 1995 observé dans la moelleosseuse post-natale la présence de cellulesLin–CD34+CD45RA+CD10+ capables degénérer in vitro des cellules dendritiques etdes lymphocytes B et NK à un niveau clonal et,dans un modèle complexe de greffe defragments de thymus humains à des sourisimmunodéficientes NOD/SCID, des lympho -cytes T (6). Ce travail remarquable avait étécontesté ensuite par différentes études quisuggéraient que ces progéniteurs Lin–CD34+CD45RA+CD10+, présentant des locus IgHtotalement réarrangés et exprimant desfacteurs de transcription spécifiques de la voiede différenciation lymphoïde B comme Pax 5,étaient en fait des précurseurs lymphoïdes B(7,8).

Entre temps, la découverte de l’importance dela voie de signalisation de Notch dans ladifférenciation lymphocytaire T a permis demettre au point un nouveau test de différen-ciation T applicable aux progéniteurs humainsbasés sur une coculture avec une lignéemurine de cellules stromales de moelleosseuse exprimant par le biais d’unetransduction rétrovirale le ligand de NotchDelta1 (9-11). Toutefois, ce test restait trop peusensible pour détecter un potentiel T faible etdonc pour étudier des échantillons humainsadultes chez lesquels la capacité deprolifération in vitro est toujours très limitée, etsurtout pour quantifier par le biaisd’expérience de dilutions limites la fréquencede progéniteurs T au sein d’une population,ce qui constitue une donnée essentielle pouridentifier au plus près le progéniteurlymphoïde T. Nous avons donc dans un

premier temps optimisé ce test dedifférenciation par coculture pour le rendreplus sensible et pouvoir l’appliquer demanière quantitative et qualitative à deséchantillons humains à la fois pédiatriques etadultes. L’utilisation d’un milieu particulier,l’emploi de trois cytokines intervenant ensynergie dans le processus de différenciationT, l’Interleukine-7, le Stem Cell Factor et leligand de Flt3 à des concentrations précises,se sont révélés essentiels dans cetteoptimisation. Grâce à ce nouveau protocole,nous avons ainsi pu mettre en évidence demanière reproductible le potentiel T depopulations de progéniteurs adultes et plusimportant, nous avons pu le quantifier (12).

En parallèle, nous avons analysé une série deprélèvements de sang de cordon et de moelleosseuse provenant de donneurs d’âgecompris entre quelques mois et 60 ans. Le butde cette étude était de quantifier parcytométrie de flux les progéniteurs Lin–CD34+CD45RA+CD7+ (que l’on appelera pour plusde simplicité "CD7+") et Lin-CD34+CD45RA+

CD10+ ("CD10+"). Cette étude nous a permisde confirmer la disparition des progéniteursCD7+ très rapidement après la naissance et dedémontrer la persistance des progéniteursCD10+ jusqu’à 60 ans avec une fréquence ausein de la population Lin-CD34+ qui diminued’un facteur 3 après l’âge de 10 ans.

Nous avons comparé le potentiel dedifférenciation de la population CD10+ à celuide la population plus immature CD10– à l’aidede tests in vitro de différenciation érythro-myéloïde, et lymphoïdes B, NK et du test dedifférenciation T optimisé. Il s’est avéré que,comme l’avaient montré Anne Galy et coll. en1995, l’acquisition du marqueur CD10 corrélaitavec un enrichissement très important enpotentiel lymphoïde B, T et NK, et avec uneperte drastique du potentiel érythroïde etmyéloïde.

Au cours de la caractérisation phénotypiquedes progéniteurs de la moelle osseuse, nousavions observé qu’une grande majorité descellules CD10+ exprimaient le marqueur CD24(appelé aussi Heat Stable Antigen). Lescellules triées CD10+CD24– et CD10+CD24+ sesont révélées très différentes lors des tests invitro puisque seules les cellules CD10+CD24–possédaient le potentiel lymphoïde élargi B,NK et T, alors que les cellules CD10+CD24+n’étaient capables de générer que deslymphocytes B. De plus, l’analyse de l’état deréarrangement du locus IgH des deuxpopulations a révélé que celui-ci était completdans la population CD10+CD24+. Cettepopulation étant majoritaire au sein de lapopulation CD10+ globale, ses caractéris -tiques propres expliquent les résultats obtenuspar les différents groupes contestant le statutde progéniteur lym phoïde au sens large de lapopulation CD10+.

Nos études suggèrent ainsi fortement que la population CD10+ CD24– de la moelleosseuse pédia trique et adulte pourrait repré -senter la population de progé niteurs lym -phoïdes la plus pré coce. Nous avons donccherché à déter miner si cette popu lationpouvait circuler dans le sang périphérique etcoloniser le thymus. Une population ayant unphénotype semblable a été effectivementretrouvée dans le sang de tous les donneurspédiatriques et adultes analysés, avec unefréquence variant entre 1/20 000 et 1/120 000parmi les cellules mononucléées du sang.Cette population, triée et cultivée in vitro,présente le même potentiel de différenciationque son équi valent dans la moelle osseuse,suggérant un lien de filiation directe entre lesdeux populations.

Par ailleurs, nous avons retrouvé unepopulation Lin-CD34+CD10+CD24– dans tousles thymus post-nataux étudiés. Elle fait partiede la fraction de thymocytes les plusimmatures qui n’expriment pas le marqueurCD1a. In vitro, les cellules thymiquesLin–CD34+CD10+CD24– génèrent des lympho -cytes T et NK, mais aussi des lymphocytes Bbien qu’avec une efficacité moindre que leuréquivalent médullaire. Le contact desthymocytes avec les ligands thymiques deNotch, qui induisent leur engagement dans lavoie de différenciation T, explique sans doutece résultat. Nos observations sont clairementen faveur d’une migration de la populationCD10+CD24– de la moelle vers le thymus, lesimpliquant directement dans la thymopoïèsepost-natale (Figure).

Pour compléter cette étude, nous avonsanalysé le profil d’expression génique desdifférentes populations de progéniteurslymphoïdes présents dans la moelle osseuseet le thymus. Du fait de leur très faible quantitéaprès tri (quelques centaines au mieux), nousavons développé une technique d’analyse RT-PCR multiplex en collaboration avec Sophie

Ezine et Bénédita Rocha (Inserm U591, Paris).Nos analyses des populations CD10–,CD10+CD24– et CD10+CD24+ de la moelleosseuse ont ainsi montré que l’acquisition dumarqueur CD10 corrèle avec l’extinction degènes liés à la lignée myéloïde (GCSFR,GATA1) et l’activation de gènes lymphoïdescomme RAG, TdT et IL-7Ra. En totaleadéquation avec son potentiel mesuré in vitro,B, NK et T, la population CD10+CD24– co-exprime un gène d’engagement dans lalignée B, PAX5 et un gène plus spécifique dela lignée T, CD3e. La population CD10+CD24+engagée dans la voie B montre la persistancede l’expression des gènes lymphoïdes RAG,TdT et Pax5, mais n’exprime plus ni CD3e, niILR7a, alors que la population CD10+CD24-thymique montre un profil d’expressionsimilaire à la population médullaire, avec uneaugmentation d’expression de gènes"lymphocytaire T" comme CD3e concomi -tante à une diminution d’expression des gènes"B" VpreB, Pax5 et EBF.

La caractérisation des progéniteurslymphoïdes humains ouvre de nouvellesperspectives tant au niveau fondamental queclinique. Connaître les conditions degénération de ces progéniteurs (cytokines,facteurs de transcription, capacité à proliférer)pourrait ainsi permettre de mettre au point de

Figure. Modèle de lymphopoïèse humaine post-natale.Les Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH)donnent naissance dans la moelle osseuse à unProgéniteur Myéloïde Commun (CMP) et unProgéniteur Lymphoïde Commun (CLP). Le CLP,caractérisé par le phénotype Lin–CD34+CD10+CD24–, génère d’une part les précurseursdes lymphocytes NK et d’autre part lesprécurseurs B Lin–CD34+CD10+ CD24+. Ils sontégalement retrouvés dans le sang circulant etdans le thymus où ils pourraient donnernaissance aux lymphocytes T matures.

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UTILISATION DU POTENTIELIMMUNOSUPPRESSEURDES LYMPHOCYTES TCD4+CD25+FOXP3+DANS LA PRÉVENTIONDES MÉCANISMES DEREJET AIGUS ETCHRONIQUES APRÈSALLOGREFFE DETISSUS ET D’ORGANES

Olivier JoffreThibault SantolariaJoost van Meerwijk

Inserm U563Centre de Physiopathologie ToulousePurpan

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L a transplantation est une stratégiethérapeutique attractive qui souffrecependant de nomb reuses limita tions.

Dans la société, le don d’organe a toujours suscitéun sentiment ambivalent, mêlé du désir de voirrepoussées les limites de la vie et d’une profondeaversion à l’égard de la manipulation de la mort.Cette dernière perception a longtemps prédo -miné, ouvrant la voie à une pénurie majeure audébut des années 90. Pour inverser cettetendance, des campagnes de sensibilisation ontété mises en place, un cadre légal favorable auprélè vement a été instauré et les méthodes deprélèvement ont été améliorées par lacommunauté scientifique et médicale. Lacompréhension de l’état de mort encépha lique etdes étapes d’ischémie/ reperfusion, etl’identification des consé quences de ces

phénomènes sur la fonction nalité des organes, aaussi permis d’améliorer sensiblement la surviedes greffons en permettant notammentd’optimiser les liquides de conservation.Cependant, malgré tous ces efforts, unelimitation majeure subsiste. Elle est liée àl’activation du système immunitaire de l’hôte quireconnaît comme du non-soi le tissu greffé (1).

La réponse immune allogénique est orchestréepar les lymphocytes T CD4+ allospécifiques dureceveur. Deux voies sont susceptibles d’aboutirà l’activation de ces cellules (1). Dans la semainesuivant la greffe, les cellules dendritiques (DC)tissulaires contenues dans l’organe transplantémigrent dans les ganglions lymphatiquesdrainant. Elles vont alors stimuler les cellules Tallospécifiques par une voie d’allorecon -naissance, qualifiée de directe, qui impliquel’interaction entre le récepteur à l’antigèneprésent à la surface des lymphocytes et lesmolécules de CMH allogéniques intactesexprimées par les DC du donneur. Cette voie estprincipalement responsable du déclenchementdes épisodes de rejet aigu. Les DC du receveursont aussi capables de présenter desalloantigenes aux cellules T. Cette voie, qualifiéed’indirecte, implique la présentation de peptidesallogéniques par les molécules du CMH declasse II endogènes présentes à la surface desDC du receveur. Les peptides présentés dériventde l’action protéolytique de différentes enzymeslysosomales à l’égard des molécules du CMHallogéniques ou des antigènes mineursd’histocompatibilité. Ceci permet notamment lagénération de réponses T auxiliaires et laproduction d’anticorps qui pourront aboutir aurejet chronique de l’organe.

Pour contrôler les mécanismes de rejet, un largepanel de drogues immunosuppressives a étédéveloppé (2). Leur utilisation a permis deconsidérablement augmenter la survie desgreffons à court terme puisque de nos jours 90%des transplants sont encore fonctionnels un anpost-greffe (Source US Transplant et EFG).Cependant, ces traitements présentent denombreux inconvénients. Dû au rôle majeur deslymphocytes T dans l’alloréponse, la plupart desdrogues visent à inhiber leur activation àdifférents niveaux. L’un des problèmes majeursrepose sur le fait que les cibles des agentspharmacologiques ont une expression tissulairenon-restreinte au compartiment lymphoïde sibien que des effets secondaires sévèresapparaissent. De plus, les drogues immuno -suppressives n’inhibent pas seulement la fractionallospécifique du système immunitaire mais ledépriment dans sa globalité. Aussi, les personnestransplantées souffrent-elles d’infectionsopportunistes et l’incidence des cancers est-elleélevée chez ces patients. Enfin, si les traitementssont efficaces pour inhiber les épisodes de rejetaigus, ils n’ont que peu d’incidence sur la surviedes organes à long terme. Après la premièreannée, 3 à 5 % des patients perdent en effet leur

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nouvelles stratégies thérapeutiques dans lecontexte de la greffe de CSH évoquée plushaut ou dans le cas particulier des déficitsimmunitaires héréditaires ou acquis. Lacompréhension des mécanismes demigration de ces progéniteurs vers le thymuspar l’étude des chémokines et facteursd’adhésion impliqués pourrait conduire àune inter vention directe pouvant accélérerou augmenter ce processus.

Enfin la connaissance détaillée de la nichelymphoïde pourrait favoriser la mise au pointde nouveaux conditionnements cibléscapables de la vider, ce qui permettraitd’éviter l’usage de la chimiothérapie ou de laradiothérapie dans les protocoles deconditionnement précédent une greffe deCSH et par conséquent de prévenir latoxicité qui lui est associée.

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transplant chaque année. Ce constat est lié audéveloppement inexorable d’une forme de rejet,qualifiée de chronique, qui ne conduit pasdirectement à la destruction de l’organe mais àl’obstruction progressive de la lumière desvaisseaux sanguins, aboutissant ainsi gradu -ellement à la fibrose totale du greffon.Actuellement, cette artério sclérose de transplan -tation constitue l’obstacle majeur à la survie àlong terme d’organes vascularisés (1).

Depuis que la transplantation d’organe a étéenvisagée comme solution thérapeutique et quel’alloréponse déclenchée par le systèmeimmunitaire de l’hôte a été identifiée commeprincipal obstacle à sa réussite, de nomb reusesgénérations de drogues immuno suppressivesont donc été développées avec le soucipermanent d’un ciblage toujours plus précis descellules responsables de la pathologie et d’uneréduction des effets iatrogènes. Si les efforts derecherche consentis ont permis des avancéesconsidérables dans la survie des greffons et laqualité de vie des patients, les limitationsmajeures qui persistent ont conduit lacommunauté scientifique à mettre au point denouvelles approches. Elles reposent sur lamanipulation de l’organe ex vivo, le transfert degènes, ou l’utilisation de DC tolérogènes ou decellules régulatrices.

Le projet que nous avons initié en 2001 visait àutiliser le potentiel immunosuppresseur deslymphocytes T CD4+CD25highFoxp3+ afind’induire un état de tolérance aux alloantigèneschez le receveur (3-6). L’idée était donc d’essayerde manipuler ce mécanisme périphériqued’induction de la tolérance au soi afin decontrôler, de façon durable et spécifique, lecompartiment T allospécifique.

La population suppressive CD4+CD25high Foxp3+a un rôle non-redondant dans le contrôle ducompartiment T autospécifique (3). Ces cellulesreprésentent 5 à 10% du compartiment T CD4périphérique et sont naturellement produites dansle thymus même si leur génération par conversionde cellules T CD4 "conventionnelles" sous l’effetdu TGF-b a été rapportée. En plus de leur rôledans le contrôle du répertoire auto-immun, lescellules T régulatrices sont impliquées dans lamodulation des réponses immunes anti-infectieuses, le contrôle des pathologies immuno-inflammatoires et l’induction de tolérance foeto-maternelle. De façon délétère, elles inhibent aussiles réponses anti-tumorales. Sur le planfonctionnel, leur spécificité et mode d’action sontlargement controversés même si in vivo l’IL-10 etle TGF-b jouent un rôle majeur. Une étude récentea aussi suggéré qu’elles pourraient inhiber lesréponses T en induisant l’apoptose des cellulesconventionnelles par privation de cytokines.

Le potentiel immunosuppresseur des cellules TCD4+CD25+Foxp3+ a conduit de nomb reuseséquipes à développer des systèmes expé -

rimentaux visant à évaluer leur utilisationpotentielle en immunothérapie, notamment dansle cadre de la transplantation. Lorsque nousavons initié nos travaux, en 2001, diffé rentsgroupes avaient suggéré l’importance descellules T régulatrices dans la modulation desréponses allogéniques. Ils avaient notammentétabli que la déplétion avant greffe de la fractionCD25 permet d’exacerber les réponses immunesallogéniques de l’hôte, mais aussi du greffondans des modèles de "maladie du greffon contrel’hôte". Ces résultats nous ont amené à penserque l’utili sation de la fraction allospécifiquecontenue dans le compartiment régulateurpourrait permettre d’induire un état de toléranceaux allogreffes. Pour tester cette hypothèse, etdonc inverser l’équilibre naturellement établientre les compartiments effecteurs etrégulateurs, différentes stratégies s’offraient ànous. Afin de faire émerger sélectivement lapopulation suppressive allogénique, certainsgroupes avaient développé des protocolesreposant sur l’injection d’anticorps non-déplétants ou de DC tolérogènes. Nous avonsopté pour une autre approche qui consistait àisoler des cellules T CD4+CD25high naïves, à leséduquer ex vivo en présence d’alloantigènesavant de les réinjecter en quantités suffisantespour contenir le compartiment effecteuralloréactif (4-6).

Induction de tolérance aux allogreffesde moelle osseuse

Nous avons tout d’abord développé un modèlemurin d’allogreffe de moelle osseuse. Lesanimaux receveurs étaient conditionnés parirradiation létale afin d’éliminer leur compar -timent hématopoïétique. Après reconstitution deleur système immunitaire par injection desplénocytes totaux ou de lymphocytes T purifiés,

RÉFÉRENCES

1. Lechler RI et al 2005. Organ transplantation -how much of the promise has been realized?Nature Medicine. 11:605-613.

2. Kahan BD 2003. Individuality: the barrier tooptimal immunosuppression. Nature ReviewImmunology. 3:831-838.

3. Shevach EM et al 2006. The lifestyle of naturallyoccurring CD4+CD25+Foxp3+ regulatory Tcells. Immunol Rev. 212:60-73.

4. Joffre O et al 2004. Induction of antigen-specific tolerance to bone marrow allograftswith CD4+CD25+ T lymphocytes. Blood. 103:4218-4221.

5. Joffre O & van Meerwijk JPM 2006.CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes in bonemarrow transplantation. Seminars Immunol.2006. 18:128-135.

6. Joffre O et al 2008. Prevention of acute andchronic allograft rejection withCD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes.Nature Med 14: 88-92.

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ils étaient alors greffés par un mélange de moelleosseuse syngenique et semi-allogénique enprésence de lymphocytes T régulateurs purifiés àpartir d’animaux non manipulés. Cliniquementnon-relevant, ce système présentait conceptu -ellement de nombreux avantages par rapportaux approches utilisées jusqu’alors. L’injection demoelle osseuse syngénique permettait notam -ment d’induire la survie de l’animal en cas derejet du greffon mais aussi et surtout d’obtenir unmodèle quantitatif nous permettant de mettre enévidence des rejets ou protections partielles. Lefait de travailler avec des hôtes irradiés de façonlétale nous a donné la possibilité de finementcontrôler les ratios entre cellules T convention -nelles et régulatrices et de pouvoir moduler lapopulation responsable du rejet du greffon.

Dans ce système, nous avons pu montrer quecontrairement aux cellules T CD4+CD25+ naïves,les cellules T régulatrices préstimulées ex vivo enprésence d’alloantigènes sont capables decontrôler efficacement le rejet de la moellegreffée (4,5). La protection est durable, permet lareconstitution de l’ensemble des lignageshématopoïétiques, est dépendante du TGF-bmais pas de l’IL-10, et peut être obtenue à faibleratio Treg : Tconv. La manipulation du compar -timent effecteur nous a permis de montrer queles cellules T régulatrices sont capables d’inhiberindifféremment le rejet induit par deslymphocytes T CD4+ ou CD8+. Enfin, la co-injection avec la moelle syngenique et la moelleallogenique cible, d’une deuxième moelleosseuse allogénique n’exprimant pas lesantigènes ayant servi à l’étape de stimulation exvivo, nous a permis de montrer que l’actionsuppressive des cellules T régulatrices peut êtrespécifique. Dans ce système, les cellules grefféesexprimant les alloantigènes utilisés pour stimulerles cellules T CD4+CD25+ sont efficacementprotégées alors que le greffon allogénique non-relevant est rejeté. Ces données ont été par lasuite confirmées dans des systèmes relativementproches par de nombreuses équipes.

Contrôle des rejets aigus et chroniqueaux allogreffes d’organes et de tissus

La suite du projet a tout d’abord consisté àdévelopper notre modèle vers une approcheconceptuellement extrapolable à la cliniquehumaine. Ainsi, nous avons montré qu’aprèsculture en présence d’alloantigènes, les cellules Trégulatrices contrôlent de façon durable etspécifique le rejet d’une greffe de moelleosseuse totalement allogénique chez desanimaux conditionnés uniquement par irradiationsous-létale. Cette approche s’est cependantavérée inefficace pour contrôler le rejet dirigécontre une greffe solide (cœur ou peau).

Cet échec nous a amené à émettre l’hypo thèsequ’une stratégie combinée, basée sur l’injectionde cellules T régulatrices et l’induction d’un

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COMPTE RENDU

UN PARTENARIATRÉUSSI ENTRE LA SFI ET IMMUNID

La SFI a organisé le lundi 26 novembre 2007 son24ème Atelier Technologique àl'Ecole Normale Supérieure deLyon qui traitait de L'APPROCHE GLOBALE DESRÉPERTOIRES IMMUNITAIRES : DE LA RECHERCHE AUDIAGNOSTIC EX-VIVO. Pour la première fois, une Société de Biotechnologie a pleinement participé à l’organisation de l’atelier aux côtés de la SFI.

Sylvia Cohen-Kaminsky

Retours sur la conférence...

“L'objectif était de faire le point sur lestechniques globales de l'analyse desrépertoires immunitaires (RI) en tant qu'outilsde recherche, et de discuter de leur perti -nence pour certaines applications au servicedes malades" rappelle Sylvia Cohen-Kaminskymembre du CA de la SFI. Les interventions desconférenciers ont permis de comprendre lesdiverses approches dispo nibles pour l'analyseglobale des RI au plan technique et pratique,et d'identifier leurs domaines d'application en recherche, ainsi que sur le plan médical."L'idée originale de suivre le RI en immuno -monitoring devrait permettre d'aider lesmédecins à piloter et personnaliser lestraitements et les scientifiques à mieuxcomprendre les méca nismes d’action de cestraitements" poursuit Nicolas Pasqual, respon -sable d’ImmunID, Biotech européenneinnovante en "immuno monitoring". Cettejournée a contribué à faire un état des lieuxgrâce à l’expertise des scientifiques référentsdans ce domaine.

Retour sur les points fortsdes interventions…

En guise d’introduction Sylvia Cohen-Kaminsky à travers son expérience dans laMyasthénie autoimmune a résumé les besoinsdu point de vue de l’utilisateur, ainsi que lesquestions posées face à une problématiqued’analyse du répertoire T dans une situationphysiopathologique donnée: a) Quels sont lestissus, cellules pertinentes pour cette analyse,est-ce que ces échantillons sont accessibles ?b) Est-ce que la chronicité des maladiesreprésente un obstacle ou un atout pourrendre ces analyses informatives ? c) Quelsdomaines d’application pour quelle techno -logie ? d) Comment combiner les techno -logies pour répondre à une questionscientifique ou physiopathologique ?

Dans les faits le chercheur est souventconfronté à la problématique de l’acces sibilitédes échantillons pertinents pour la pathologieétudiée. Il est important de sélectionner lespatients inclus dans les études de RI au moinsselon deux critères : un délai court entre lespremiers signes de la maladie et l’analyse pouréviter la complexité due au "spreading"d’épitope, et selon le traitement, afind’identifier des modifications de répertoireindicatrices de la pathologie. Les effets destraitements sur le remodelage du RI est unequestion à aborder dans un second temps. Leséchantillons étudiés sont rarement les plus

chimérisme hématopoïétique, serait plusefficace. Nous espérions que les celluleshématopoïétiques allogéniques participeraientà l’induction de tolérance centrale et périphé -rique, ainsi qu’à la survie des cellules Trégulatrices responsables de leur protection etde celle de la greffe solide. Confirmant cettedernière hypothèse, nous avons montré que lasurvie des cellules T CD4+CD25+Foxp3+transférées est aug mentée lorsque les receveurssont co-injectés avec des cellules exprimant lesalloantigènes ayant servi à l’étape de culture exvivo (par comparaison avec des animaux injectésavec les cellules régulatrices prestimulées et dela moelle osseuse syngénique).

Nous avons utilisé ce système pour essayerd’induire un état de tolérance à des allogreffesde peau et de cœur. Nous avons observé que laco-injection de cellules régulatrices et de moelleosseuse allogénique permettait d’induire lasurvie à long terme de ces deux types degreffes. Cependant, l’analyse histologiqueréalisée sur les organes prélevés 100 jours aprèstransplantation a révélé que les mécanismes derejet n’étaient pas totalement contrôlés en dépitdu chimérisme hémato poïétique induit. Un rejetchronique carac térisé notamment par del’artériosclérose et une destruction tissulaireassociée à une infiltration de lymphocytes,macrophages et d’éosino philes se dévelop paitinexorable ment.

Les lymphocytes T allospécifiques peuventreconnaître directement les molécules du CMHallogénique à la surface des DC du donneur(voie directe), ou reconnaître des peptidesallogéniques associés au CMH du soi à lasurface des cellules présentatrices de l’hôte(voie indirecte). Dans notre système, les cellulesT régulatrices n’étant activées ex vivo que par lavoie directe, nous avons émis l’hypothèse quel’absence d’induction de tolérance soit liée aufait que la population suppressive injectée soitincapable d’inhiber les cellules effectricesallospécifiques activées indirectement. Cepostulat était rationnel car cette voie aprincipalement été associée au rejet chronique.Nous avons donc modifié notre système deculture de façon à enrichir la populationrégulatrice injectée en cellules reconnaissant lesalloantigènes par les deux voies de recon -naissance. Nous avons ainsi pu montrer que lacoinjection de ces cellules et de la moelleosseuse allogénique permettait d’inhibertotalement et à long terme la réponse allogé -nique, le greffon demeurant exempt de toutetrace d’agression (6).

Ces deux travaux témoignent de l’immensepotentiel des lymphocytes T régulateursCD4+CD25highFoxp3+ et suggèrent que cescellules pourraient, dans un avenir proche, êtreutilisées en clinique humaine dans desprotocoles visant à induire un état de tolérancedurable et spécifique à des allogreffes.

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COMPTE RENDU

informatifs. Les lymphocytes du sang péri -phérique trop souvent utilisés ne reflètent pasla région cible de la pathologie. Lamicrodissection laser est une approchepuissante qui permet de disposer de coupesdes tissus cibles, contenant des infiltratsinflammatoires lymphocytaires diffus, ouencore des formations plus organisées commeles follicules lymphoïdes tertiaires avec centresgerminatifs, pour réaliser les analyses derépertoire. En contrepartie, cette approchenécessite des méthodes très sensibles. Il estenvisageable que cette approche, couplée àdes outils d’immunomonitoring robustespuisse révéler des relations précises entresignatures immunitaires et physiopathologiedes maladies impliquant le système immuni -taire, avec à la clef des outils pour le diagno -stic, le pronostique et le suivi clinique del’efficacité des traitements.

Une conférence introductive par PhilippeKourilsky a fait le point sur l'historique desméthodes d’étude du RI. En tant que véritablepionnier de l’analyse globale des RI, il anotamment présenté l’Immunoscope®,développé dès 1992, en appuyant l’idée de lapotentialité de son utilité en clinique humaineSon point de vue est que "La Science est bellequand elle utile", et que "L’immuno logie n’apas rendu ce qu’on attendait d’elle vis-à-visde la clinique" et que "oui les RI sontcomplexes, mais qu’il faut appréhender cettecomplexité de façon progressive en sedonnant des instruments et des outilsconceptuels".

L’analyse du RI est une approche incontour -nable de l’immunomonitoring, mais il restebeaucoup à faire pour fournir un outilréellement adapté aux besoins des cliniciens,en particulier coupler l’analyse du RI avecd’autres approches "d’immunomonitoring" etstandardiser les procédures. D’après PhillipeKourilsky, un des principaux avantages del’Immunoscope, dont le principe est d’analyserla longueur de CDR3 au niveau des ARNm, estl’ajustement du niveau d’analyse avec desamorces nucléo tidiques de plus en plusspécifiques. L’Immunoscope permet enthéorie de suivre les chaînes a, b, g, d et IgH.Le suivi de clonotypes dits "publics" estparticulièrement utile. Le fait qu’un même picde taille puisse abriter des séquenceslégèrement différentes, mais de mêmespécificité, peut contribuer à réduire lacomplexité. Des traitements informatiquespoussés accroissent la vitesse et la puissanced’analyse. Il est hors de doute que l’approchea été, et reste fort utile dans de nombreusessituations. Il faut reconnaître néanmoinsqu’elle reste relativement chronophage etonéreuse. Plus on désire être précis, plus la

méthode est lourde à mettre en œuvre. Aussi,il convient de réaliser un ajustement de latechnologie et du niveau de complexité. Deplus, l’Immunoscope souffre de limitationsintrinsèques et aurait deux "pêchés origi nels" :le premier est de ne pas donner accèssimultanément aux deux chaînes (lourde etlégère, b et a, d et g) produites par la mêmecellule ; le second est que la détection d’uneclonalité n’indique en rien la fonctionnalité(anergie ou non, production d’interleukines,etc) des cellules exprimant un TCR donné.Enfin, il faut noter que cette approche utilisedes ADNc qui reflètent un état d’activationtranscriptionnel, ce qui induit inévitablementun biais lorsqu’on on utilise les donnéesexpérimentales de l’Immuno scope pourdénombrer de façon relative des populationscellulaires.

Après avoir brossé un panorama desévolutions de l’outil Immunoscope, et soulignéson importance, notamment dans le suivi desimmunodéficiences en collaboration avec le Pr Alain Fisher, il conclut qu’il faut être àl’écoute des cliniciens et qu’il faut progresseravec des ajustements en perma nence entre lacomplexité des RI, les développementstechnologiques, et le dialogue avec lescliniciens. Finalement, il souligne l’intérêtd’avoir organisé cet atelier de façon conjointeentre une société de biotechnologie et leschercheurs et cliniciens appartenant à la SFI."Pour le bien des malades, la porte estouverte à de nouvelles approches complé -mentaires…". Le ton était donné, avecjustesse, précision et grande sagesse…

La conférence s'est poursuivie à un rythmesoutenu, par les interventions successives deplusieurs experts internationaux.

Guy Gorochov, nous a présenté des interro -gations et résultats concernant l’étude descellules T régulatrices par l’approcheImmunoscope. Une des problématiques, estcomment comparer deux RI : La stratégieoriginale utilisée a consisté à établir un profilde référence à partir de plusieurs sujets sains.Ensuite les RI ont été soustraits à ce RI moyenafin d’obtenir un seul indicateur qui représentela perturbation du RI. Cette méthode anotamment permis de mettre en évidence lastabilisation des répertoires lymphocytaireschez les patients HIV+ recevant un traitementantiviral efficace. De plus, au niveau techno -logique les études de diversité menées parPCR sur des popu lations complexes présen -tent d’importantes limitations : il est en effetdifficile de définir précisément certaines sous-populations, et il existe des limitationsméthodologiques liées à la qualité et à lareprésentativité des échantillons d’une part, et

à la non- linéarité des réactions de PCR,d’autre part.

Selon Guy Gorochov, nous ne sommes pasencore à l’ère de l’application médicale enroutine de l’analyse des RI. Pour l’heure sonlaboratoire d’immunomonitoring travaille surdes études longitudinales à l’échelonunicellulaire, par RT-PCR multiplex enparticulier pour l’analyse des Tregs. Dans cecas la diversité étudiée n’est pas une diversitéglobale. L’analyse repose sur la co-détectionde Foxp3, des cytokines IL-10 et TGF-b et desséquences CDR3. Il est ainsi possible decorréler la diversité à un type de populationcellulaire. Les analyses basées sur cesdistinctions phénotypiques indiquent que lesrépertoires des cellules T conven tionnelles etde Treg sont en grande partie distincts.

Marie Paule Lefranc nous a présenté labase de données de référence mondialeIMGT qui couvre l’ensemble des gènes du RIsur plusieurs espèces (B, T, MHC, la séquenceet la structure). "Tous les travaux de R&D enimmunogénétique ont besoin d’un très fortniveau de structuration au niveau de lanomenclature des gènes des TCR et Ig. IMGTest un outil de choix pour les experts dudomaine". Marie Paule, nous a fait un rappelsur l’outil Junction (V-D-J) Analysis : cette basede donnée permet, en rentrant une séquenceV-D-J réarrangée, de déterminer le nom desgènes V, D et J, ainsi que les bases qui ont étéajoutées ou délaitées. Cet outil donneégalement des résultats au niveau proté -omique. Un autre outil très utile, est IMGT-V-Quest qui compare jusqu’à 50 séquencesréarrangées par analyse. Ceci fait gagner untemps considérable aux cher cheurs. Une desproblématiques en devenir pour l’étude desRI est la structure 3D des TCRs. IMGT faitfigure de pionnier avec notamment ladescription de la structure en "Collier deperle". A la question "Donnez vous des courspour initier les chercheurs non experts àl’étude de l’immunogénétique", le Pr Lefrancnous indique que IMGT n’a pas la possibilitéde le faire de manière récurrente, mais quecela est possible sur demande. Merci MariePaule…

Patrick Miqueu a présenté les dévelop -pements de la compagnie TcLand. Ledéveloppement de méthodes statistiquesdédiées à l’analyse des TcLandscapes baséssur l’utilisation du principe de l’Immunoscopea confirmé l’intérêt de l’étude du RI dansdifférentes pathologies chroniques. La sociététravaille essentiellement sur les gènes V etapporte une dimension quantitative àl’Immunoscope en quantifiant les transcrits.

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de l’efficacité d’un traitement. Visible ment cesnouveaux tests font gagner du temps auxbiologistes en identifiant directement le nomdes réarrangements V-J (sans besoin deséquencer) et en mesurant en parallèle leniveau d’immunodéficience du patient. Des études cliniques sont en cours pourcompléter ces données". ImmunID espèreque d’ici quelques années, la techno logieImmunTraCkeR® permettra de répondre enquelques minutes seulement à la demandedes cliniciens ayant besoin d’outils d’immuno -monitoring pertinents et simples d’utilisation,pour adapter au mieux le traitement despatients en proposant le médicamentadéquat, à la bonne dose et au bon moment.Des contrats avec l’Industrie pharmaceutiqueindiquent le potentiel et la facilité de mise enœuvre de cette techno logie. Une affaire àsuivre…

Niek de Vries a décrit une nouvelle appro-che prometteuse, la technologie I-array®(Immune Array), pour l’étude de la diversitéde jonction par Puce à ADN. La technologies’appuie sur le fait que lors de la recom bi-naison VDJ, seulement quelques bases sontenlevées ou rajoutées au niveau des gènes V-D-J (en moyenne de 1 à 6). Les oligo -nucléotides sur la puce ont une taille de 6 pbavec toutes les combinaisons possibles. Deplus sur les réarrangements sont hybridés des"annealers" qui permettent de connaître lenombre de bases supprimées dans le gène Vou J. Cette approche à un seuil de déte ctiontrés fin et serait 2 logs plus sensible queImmunoscope à titre comparatif pourdétecter l’infection à CMV. L’objectif de cettepuce n’est pas de permettre l’identification dela séquence mais de chercher des marqueursavec une sensi bilité supérieure à toutes lesautres techno logies. Cette technique pourraits’avérer parti culièrement efficace dans larecherche de maladies résiduelles. Même sicette approche est peut être encore onéreuse,son seuil de détection est prometteur. Lesdévelop pements prévus devraient permettrede l’optimiser et de consolider les résultatsdéjà obtenus. Une autre affaire à suivre…

Adrien Six a présenté le logiciel ISEApeaks®automatisant l’analyse de l’Immunoscope. Celogiciel permet également de créer une basede données qui permet l’analyse de la diversitéet de la perturbation d’un RI. "Pour réaliser uneétude des RI pertinente, il faut standardiser lesapproches pour établir des bases de donnéesavec des informations comparables entre elleset si cela est possible, essayer de combinerl’étude du RI à d’autres approches d’immuno -monitoring (ex : immunité innée)". Adrien Sixnous a présenté un travail sur les CDR3 deslymphocytes T lors de l’infection par

plasmodium (CM+) chez la souris. Dans cetteétude, les échantillons étaient des rates desouris naïves et des rates infectées parplasmodium. La perturbation d’un RI estcalculée à partir d’un profil de référence. Deuxindex ont été utilisés pour estimer la pertur -bation des RI : "Gorochov" un index indice deperturbation globale ; et "Oligo score" unindex indicateur d’une oligoclonalité récur -rente. Une analyse stati stique et de clusteringest ensuite effectuée, avec une représentationen colonne des Vb, et en ligne des échantillons.La méthode de clustering non-supervisé (k-means clustering) permet de classer les pro -fils sans à priori. Cette méthode visualise lesrésultats de façon intéressante: dans l’exemplemontré, tous les CM+ sont regrou pés. Dans unsecond temps, une étude en cinétique a étémenée. L’analyse a permis de mettre enévidence une augmentation de la pertur bationau jour 5. Ces résultats démon trent qu’uneétude biosta tistique adéquate est primordialepour mettre en évidence les biomarqueurs del’infection.

Gilles Marodon a présenté ses tous derniersrésultats montrant que l’étude du répertoireimmunitaire permet de s’assurer de la qualitéde la génération d'un système immunitairehumain chez les souris immuno-déficientesaprès injection de cellules souches CD34+ desang de cordon. Les données montrent queles animaux présentent une diversitécombinatoire proche de celle de l’homme,que ce soit pour les chaînes a et b du TCR oupour les chaînes lourdes des Ig. L'étude duphénotype des différentes populationscomposant le système immunitaire a montréqu'une forte proportion de cellules naïves étaitretrouvée. Des études préliminaires montrentque le répertoire immunitaire diversifiécorrobore une activité fonctionnelle descellules humaines générées chez la sourisaprès immunisation avec un candidat vaccin.Même si la méthode expérimentale est encorelourde, le taux de succès de reconstitutionainsi que l'homogénéité du répertoireimmunitaire est encourageant pour que cetype de modèle puisse être un jour utilisé enpré-clinique. Au final, le fait de combiner lemodèle de souris humanisées avec unimmunomonitoring précis des répertoiresimmunitaires avec le test ImmunTraCkeR,semble prometteur, tant au niveau infectieuxqu’au niveau cancéreux.

Rafick Sékaly, a présenté des donnéesoriginales sur l’homéostasie de la réponseimmunitaire au VIH pendant une HAART : duthymus à la périphérie. En préambule il adéclaré qu’il est particulièrement importantlors d’une étude "d’immunomonitoring" desRI de lier diversité et fonctionnalité. Les

Les problèmes rencontrés pour les échan -tillons avec très peu de transcripts peuventêtre résolus en travaillant en triplicat. Cecipermet d’avoir un indicateur de confiance desprofils. Une différence est calculée par rapportà une distribution normale de type gaus -sienne. Ainsi le TClandScape est unereprésentation qui combine l’Immunoscope,une approche quantitative et donne un indicede confiance. Dans cette représentation, lacouleur et l’amplitude des pics donne desinformations complémentaires. Deux typesd’analyse de données ont été présentés : uneétude longitudinale et une étude destratification. L’étude longitudinale portait surdes patients atteints de sclérose en plaque.Une analyse non supervisée a été conduitepermettant d’extraire des informations desprofils, et de réduire les données. Des calculsde distance entre les différents profils ont étéréalisés et corrélés avec les quantités detranscrits. La généralisation de la notion dedistance à n individus a permis de comparertous les individus entre eux à chaque familleVb. L’analyse a permis d’identifier un point derupture au niveau des profils et d’établir descorrélats entre répertoire T et état deslésions. L’étude de stratification concernaitune cohorte de patients subissant une greffede rein. La méthode Multi Dimensional Scalinga été utilisée afin d’étudier les données. Cetteétude a visiblement permis de différencier lespatients tolérants des patients présentant unrejet, suggérant que le répertoire pourrait êtreun marqueur du devenir à long terme dugreffon.

Nicolas Pasqual à présenté les résultats etles innovations de la société ImmunID, notam -ment le test ImmunTraCkeR® basé sur de laPCR multi-N-plex au niveau de l’ADNg, ainsique la méthode d’analyse NDL® développéesur les chaînes du TCR a, b, g, d et la chaînelourde des Ig chez l’homme et la souris.L’ImmunTraCkeR® mesure la diversitécombinatoire V-J et permet plusieurs niveauxd’analyse en évitant les biais de transcription(car directement sur l’ADNg, un réarran -gement au niveau ADN = une cellule) : 1/évaluer le risque infectieux du patient, 2/ touten suivant de manière résolutive d’éventuelsclones de lymphocytes T ou B pouvantreprésenter la signature d’une pathologie.Grâce à une étude longitudinale chez unpatient, il est possible de vérifier que cedernier conserve bien un RI diversifié ethomogène (moins de risque infectieux) tout ensuivant l’efficacité du traitement d’immuno -thérapie sur les clones liés à la pathologie.

"Nos récents résultats de suivi des lympho -proliférations et des immunodéfi ciences sontencourageants pour le diagnostic et l’évalu ation

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www.sfi-immunologie.com.fr

travaux qu’il a menés reposent sur l’étude dela polyfonctionnalité des cellules T. Lesfonctions des cellules qui sont étudiées sont lasécrétion d’IFN-g, d’interleukines et de PD1. Il montre que la charge virale est corrélée àl’expression de PD1. Une forte expression dePD1 témoigne d’une charge virale élevée. Lescellules T CD8+ au cours de l’infection au VIH,ne sont plus capables de générer des cellulesmémoire et perdent à la fois de la diversité auniveau du répertoire T, et de la diversitéfonctionnelle, qui ne se limite pas seulement àla production d’IFN-g. Il utilise la technologiedes tétramères pour isoler les cellules CD8+spécifiques du VIH, et les étudier dans letemps au cours de l’infection, en analysant leurfonctionnalité, les voies de signalisationimpliquées dans la mémoire, la présence demolécules anti-apoptotiques, et leur diversitédirectement par séquençage. Cette étudepermet de montrer que la chute de ladiversité est souvent due à la perte demultifonctionnalité et que la thérapie HAARTrestaure la réponse immunitaire, la fonction -nalité des cellules CD8+ et semble conduire àl’émergence de nouveaux clones T. D’oùl’utilité de combiner les approches "d’immu -nomonitoring"…

Table Ronde… et Epilogue : l’atelier s’estpoursuivi par une table ronde, au cours delaquelle des perspectives ont été évoquéesautour de l’analyse globale des RI immuni -taires. Il a été souligné les progrès destechniques de séquençage (technologieSolexa) permettant de séquencer descentaines de milliers de clones en un tempsrecord. Mais le criblage à haut débit et leséquençage ne donnent pas la structure ni lafonction. Il faut arriver à jumeler fonction etoligoclonalité, encore que les réponses contrebeaucoup de pathogènes soient polyclonales.La génération de ces données d’analyseglobales des RI immunitaires pose leproblème des bases de données spécifiques,et soulève la question de la résolution de lastructure cristallographique à grande échelle.Aucune technique à l’heure actuelle nepermet de définir l’identité des chaînes TCR aaet bb sur les mêmes cellules, aucune techniquen’est développée à l’échelon unicellulaire.Pour finir, l’idée a été soulevée par NicolasPasqual de créer un site web avec un systèmed’aiguillage pour aider l’utilisateur à faire deschoix sur les approches technologiques lesplus adaptées à son étude et à construire unprogramme de recherche autour de l’analysedes RI. En effet pour chaque situation physio -pathologique, une combinaison d’approchescomplé mentaires pourrait répondre de façonprécise aux questions posées.

En conclusion, la présentation des dévelop -pements autour de l’Immunoscope et destechnologies ImmunTraCkeR et I-Array ontprouvé que le champ technologique del’analyse globale des RI poursuit sondéveloppement. L’avenir nous dira si l’analyseglobale des RI sera un jour à la portée du litdu malade…

Lien vers le programme de la conférence :

Le Programme du 24ème atelier technolo giqueà l'ENS Lyon sur L'APPROCHE GLOBALE DESRÉPERTOIRES IMMUNI TAIRES (RI): DE LARECHERCHE AU DIAGNOSTIC EX-VIVO.

Session I - Complexité des approchesglobales des RI immunitaires

Pr Philippe Kourilsky, Institut Pasteur, Paris.Les répertoires immunitaires : indispensables,ou trop complexes pour être utiles ?

Pr Guy Gorochov, Université Pierre et MarieCurie Inserm U543, Paris.Approches globales pour l'analyse de ladiversité Immunitaire. Quelles indicationsmédicales ?

Session II - De l’immunogénétiquefondamentale à la "météo immunitaire"

Pr Marie-Paule Lefranc, IMGT, Montpellier"IMGT-ONTOLOGY et analyse des réper -toires immunitaires"

Dr Patrick Miqueu, TC-Land, NantesApproche bioinformatique et biostatistiquedes données d’analyse du répertoire.

Dr Nicolas Pasqual, ImmunID Technologies,Grenoble. ImmunTraCkeR, mesure exhaustive de ladiversité combinatoire des lymphocytes T&Bau niveau génomique

Dr Niek de Vries, Academic Medical Center,AmsterdamMonitoring the T-Cell Receptor Repertoire atSingle-Clone Resolution

Session III - Applications de l’analyse duRI en infectiologie

Dr Adrien Six, CNRS UMR7087, UPMC, Paris 6Analyse globale de la diversité du répertoireCDR3 des lymphocytes T lors de l'infectionpar Plasmodium

Dr Gilles Marodon, UMR7087, Hôpital PitiéSalpêtrière, ParisModèles de souris humanisées pour la vacci -nation : un nouvel outil d’étude des maladiesinfectieuses, suivi par l’analyse du répertoireimmunitaire

Dr Rafick Pierre Sekaly, Université deMontréal, CanadaHoméostasie de la réponse immunitaire auVIH : du thymus à la périphérie

Table ronde

Pierre Rafick Sékaly, Guy Gorochov, NicolasPasqual et Sylvia Cohen-KaminskyVers une analyse du répertoire immunitaireau service des patients ?

Le texte intégral du 24e Atelier techno -logique se trouve sur les site web de la SFIwww.sfi-immunologie.com.fr et d'ImmunIDwww.immunid.com

18ème COURS D'IMMUNOLOGIE DE LA SFICarry-le-Rouet, du mercredi 12 au samedi 15 mars 2008Comité d’organisation : Michel Fougereau, José Boucraut (ASSIM), Paul Guglielmi etPhilippe Naquet

11ème COLLOQUE CYTOKINES DU CROISICPresqu'île du Croisic, du lundi 5 au mercredi 7 Mai 2008Comité d’organisation : Vincent Praloran, Jean-Claude Lecron, Hans Yssel, Michel Dy,Hugues Gascan, Aimé Vazquez et Yannick Jacques

7ème JOURNEE SCIENTIFIQUE DU CRI/SFI

Club Rhumatisme et InflammationClub Auto-immunité et ImmunopathologieThème " Lymphocytes T régulateurs et maladies auto-immunes"Institut Pasteur - CIS - Paris, le jeudi 29 Mai 2008 de 9h30 h à 17h00Comité scientifique : J.M. Berthelot, Sophie Caillat-Zucman, Xavier Mariette, Joël Pestel, Benoît Salomon et Jean Sibilia

CONGRÈS ANNUEL DE LA SFI

UNESCO - Paris du mardi 25 au jeudi 27 novembre 2008"From Immunodeficiency to hypersentivity"

Comité d’organisation : Armand Bensussan, Brigitte Autran Comité scientifique : Alain Fischer, Antoine Magnan, Bernard Malissen, DominiqueKaiserlian, Eric Oksenhendler et François Romagné

La réunion sera suivie le vendredi 28 novembre de 9h à 16h par un Atelier Technologique : "Imagerie vitale" et, en sessions parallèles, par une journée du Club Vaccinologie de la SFI

4ème COURS MÉDITERRANEEN SUPÉRIEUR D'IMMUNOLOGIE

Institut Pasteur de Tunis, octobre 2008

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Pour toute information sur ces évènements, visitez le site web de la SFI :http://www.sfi-immunologie.com.fr/

LA VIE DE LA SFI EN 2008

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