BIOCHIMIE, 1977, 59, 5~5-538. Brbves communications

de Microanalyse rapide de dimycocdrosate de phtiocdrol,

mycosides et de glycdrides dans les extraits a l'6ther de p6trole de Mycobacterium kansasii et du BCG, souche Pasteur.

A s h o k K u m a r KOUL (*) e t M i r e i l l e GASTAMBIDE-ODIER~.

Unioersit~ de Reims, Facult~ des Sciences, Laboratoire de Biochimie Microbienne, B.P. 3~7, 51~6~ Reims.

(7-1-1977).

E n r a i s o n d u r61e i m p o r t a n t que j o u e n t le d i m y e o - c6 rosa te de ph t ioe~ro l I11, 2] et les m y c o s i d e s A, B et G [1] d a n s la d i f f e r e n t i a t i o n des m y c o b a c t ~ r i e s , la ra ise a u p o i n t d ' u n e m i e r o m ~ t h o d e r a p i d e d ' iden t i f i - c a t i o n de ces s u b s t a n c e s s e m b l e s ' i m p o s e r . La loca l i - s a t i o n p r o b a b l e d u d i m y c o c ~ r o s a t e de pb t ioc~ro l , des m y e o s i d e s et des g lyc~r ides h l ' e x t ~ r i e u r de la pa ro i m y c o b a e t ~ r i e n n e p r o p r e m e n t d i te e t le r6le b i o l og ique ~ v e n t u e l q u e p o u r r a i e n t j o u e r ces s u b s t a n c e s d a n s t o u t e s les r ~ a e t i o n s q u i se p a s s e n t h la s u r f a c e des m y e o h a e t 6 r i e s ( t r a n s p o r t de m 6 t a b o l i t e s et b i o s y n - t heses , f i x a t i o n de b a e t 6 r i o p h a g e s , r 6 a c t i o n s a n t i g ~ n e s - a n t i e o r p s ) , s o n t des r a i s o n s s u p p l d m e n t a i r e s de che r - che r h les i den t i f i e r r a p i d e m e n t .

A n t 6 r i e u r e m e n t , la e h r o m a t o g r a p h i e en couche m i n - ce a 6t6 u t i l i sSe d a n s le b u t de d i f fd renc ie r les m y c o - bae t6 r i e s s a n s q u e les c o n s t i t u a n t s r e s p o n s a b l e s des t a c h e s a i e n t ~t~ ea rac t~ r i s~s [;3]. La m i c r o m O h o d e d6er i te d a n s le p r d s e n t t r a v a i l p e r m e t l ' a n a l y s e p a r c h r o m a t o g r a p h i c en e o u c h e m i n c e d u d i m y c o e ~ r o s a t e de ph t ioc~ro l , des m y e o s i d e s et des g lyc6r ides . Ces s u b s t a n c e s s o n t ident i f i~es darts les e x t r a i t s de m y c o - b a t t e r i e s h l ' ~ the r de p~trole ou h l ' h e x a n e ca r il es t c o n n u [4] q u ' u n e e x t r a c t i o n de m y c o b a e t 6 r i e s p a r ces s o l v a n t s en l6ve l a t o u c h e super f ie ie l le des bac i l l e s qui e e p e n d a n t r e s t e n t v i v a n t s ap r6s ce t te o p e r a t i o n et peu - v e n t se m u l t i p l i e r d a n s u n m i l i e u de c u l t u r e .

M A T E R I E L ET METHODES.

Souches bact~riennes, cultures et extractions ?t l'~ther de p~trole.

a) U n f lacon de R o u x e o n t e n a n t 200 m l de m i l i e u de S a u t o n a d d i t i o n n ~ de CaC12 0,0005 g / l , ZnSO, 0,0001 g / l et CuSO, 0,0001 g/1 a ~t~ inoeu l6 avee u n e s o uche de Mycobacterium kansasii A 21. Apr~s 25 j o u r s de cul - t u r e h 37% la pe l l i cu le b a e t 6 r i e n n e a ~t6 a p p l i qu6e e o n t r e la pa ro i d u rSe ip ien t de c u l t u r e p a r r o t a t i o n et le m i l i e u de c u l t u r e a 6t6 d~cant~ et s t~r i l i s6 h l ' a u t o e l a v e . Les bae i l l e s o n t ~t~ r ine6s h l ' e a u disf i l l~e. L ' e a u a 6t~ ~ l imin~e p a r f i l t r a t i on ou d ~ c a n t a t i o n et s t~r i l i s6e p u i s les bae i l l e s o n t 6t6 e x t r a i t s h l ' ~ the r de p~t ro le p e n d a n t q u e l q u e s m i n u t e s e n les a g i t a n t h la m a i n .

L ' e x t r a i t a ~t~ d~cant~, concen t r~ s o u s v ide et f i l tr6 s u r m i l l i p o r e de 0,22 ~x. Ces o p 6 r a t i o n s o n t ~t6 ef fec tu6es le p l u s r a p i d e m e n t p o s s i b l e en p r e n a n t les

(*) B o u r s i e r d u Min i s tb re des Af fa i res E t r a n g b r e s , s t age p o s t d o c t o r a l , P a r i s .

A qu i t o u t e e o r r e s p o n d a n e e do i t 6tre adress~e .

p r 6 e a u t i o n s u s u e l l e s r e l a t i v e s h la m a n i p u l a t i o n des bae i l l e s p a t h o g 6 n e s . Le r e n d e m e n t en e x t r a i t d6pend de la p r o p o r t i o n des d i f f6 ren ts p h 6 n o t y p e s de Myco- bacterium &ansasii d a n s la eu l tu re . J u s q u ' h ce j ou r , s eu l le p h 6 n o t y p e s m o o t h a 6t6 o b t e n u h l ' 6 t a t p u r m a i s ee lui -e i se r e t r a n s f o r m e en v a r i a n t r o u g h lo rs de r e p i q u a g e s u l t 6 r i e u r s [5]. P o u r des e u l t u r e s f o r m a n t u n e pe l l i cu le 6pa i s s e en s u r f a c e m a i s c o n t e n a n t n 6 a n - m o i n s u n e ee r t a i ne p r o p o r t i o n de bae i l l e s s m o o t h , le po ids de l ' e x t r a i t r~colt~ es t de 11 -4- 3 m g (2 × d~- v i a t i o n s t a n d a r d , m o y e n n e de 6 f laeons) . Le r e n d e - mer i t e n e x t r a i t es t p a r f o i s p l u s 61ev6 l o r s q u e la cu l - t u r e p o u s s e r e l a t i v e m e n t r a p i d e m e n t et que les ba - c i l les s o n t e s s e n t i e l l e m e n t de la var i6 t6 r o u g h (453 m g p o u r 10 f lacons a u b o u t de 25 j o u r s ) .

b) Une souehe de Mycobacterium kansasii A 4 a ~t6 eu l t iv6e p e n d a n t 18 j o u r s et e x t r a i t e e o m m e s o u s a). Le po ids d ' e x t r a i t r6eolt6 n ' 6 t a i t que de 2 m g p a r fla- con de e u l t u r e .

c) Q u a r a n t e - c i n q f l acons de 200 m l de m i l i e u de Wong-VCeinz i r l modi f l6 [6] on t ~t6 i nocu l6 s avee u n e souche de Mycobacterium kansasii N ° 12479. Apr6s 21 j o u r s de c u l t u r e h 37 ° , le m i l i e u de c u l t u r e a ~t6 61imin6 des f l acons p a r a s p i r a t i o n , s o u s les bae i l l e s qu i f o r m e n t u n voi le h la s u r f a c e du mi l i eu , et s t6 r i - l is6 h l ' au toe l ave . Les bae i l l e s v i v a n t s ou t 6t6 e x t r a i t s p a r l ' h e x a n e p e n d a n t 24 h, s a n s a g i t a t i o n . Apr~s d6- c a n t a t i o n de l ' ex t r a i t , l ' e x t r a c t i o n a ~t6 r6p6t6e u n e d e u x i ~ m e fo i s p e n d a n t 24 h. P o u r cont r61er la v i t a - l i t6 des bae i l l e s ap rb s 24 h de c o n t a c t avee de l ' h e x a n e s t6r i le , ces d e r n i e r s on t 6t6 r e p i q u 6 s s t 6 r i l e m e n t s u r m i l i e u de ~¢¢ong-Weinzir l modif i6 . L ' i n o e u l a t a pous s6 n o r m a l e m e n t : a u b o u t d ' u n m o i s u n voi le a b o n d a n t de Mycobaclerium kansasii eouvre rou te la s u r f a c e d u m i l i e u de c u l t u r e .

d) U n e m a s s e i m p 0 r t a n t e de bae i l l e s BCG, souche Pasteur, de 12 j o u r s , a 6t6 t r a n s p o r t ~ e a u l a b o r a t o i r e , ]e j o u r de la r6col te . Le l e n d e m a i n , les bac i l l e s on t 6t6 lav6s h l ' e a u p e r m u t 6 e , i m m e r g 6 s r a p i d e m e n t d a n s l ' 6 t he r de l~ t ro l e , f i l tr6s, e e n t r i f u g 6 s et f i l t r6s s u r m i l - l ipore de 0,22 Ix.

Analyse des extraits sur chromatoplaque de gel de silice (fig. 1).

Les e h r o m a t o g r a p h i e s s u r couches m i n c e s o u t ~t6 ef fec tu~es s u r gel de si l ice (Merck G, Type 60, s e lon S tah l ) . L ' ~ p a i s s e u r des p l a q u e s 6 ta i t de 0,25 m m .

Les soloanls de migration ~ta ien t les s u i v a n t s : Mise en 6v idence du d i m y c o c 6 r o s a t e de ph t ioe~ro l

[2] et des g l y e ~ r i d e s : E t h e r de p~ t ro l e -~ the r 95:5 ( s o l v a n t a).

536 A. K. Koul and M. Gastambide-Odier.

Mise e n 6v idence des m y c o s i d e s : c h l o r o f o r m e - m 6 - t h a n o l 96,5:3,5 ( s o l v a n t b).

Mise e n 6v idenee de s u b s t a n c e s t r6s po la i r e s : ch lo - r o f o r m e - m 6 t h a n o l 89,5:10,5 ( s o l v a n t c).

Les rdactifs de rdvdlalion 6 t a i e n t les s u i v a n t s : R 6 a c t i f g6n6ra l des h y d r a t e s de c a r b o n e (2,7) : H2SO[ 60 p. c e n t - - o rc ino l 0,2 p. c e n t ( r6act i f 1). R~ac t i f des d 6 s o x y s u c r e s [8] : C h l o r h y d r a t e de c y s t 6 i n e 0,5 p. c e n t d a n s H~SO~ 3 N :

1 vol. Ac6tone : 9 vol . ( r6ac t i f 2 ; h p r 6 p a r e r i m m 6 d i a t e -

m e n t a v a n t l ' e m p l o i ) . R 6 a c t i f des f o n c t i o n s a l d 6 h y d i q u e s et c 6 t o n i q u e s

l i b re s [8] : D i n i t r o p h ~ n y l h y d r a z i n e 500 m g , H~O 400 m l , HCI

cone. 100 m l ( r6ac t i f 3). R 6 a c t i f des c o m p o s 6 s a r o m a t i q u e s (8, N ° 212). 50 m g de f l u o r e s c 6 i n a t e de s o d i u m d a n s 100 m l de

m 6 t h a n o l h 50 p. c e n t ( r6act i f 4).

Constituants principaux isolds des extraits g~ l'dther de p@trole. (Pr@para t ion des 6 c h a n t i l l o n s s t a n d a r d de r6f6rence) .

Dimycoc@rosate de phtiocdrol (DIM) : Cet te s u b - s t a n c e a @t6 isol6e d u BCG. L ' e x t r a i t & l ' 6 t h e r de p6- t ro le (4,4 g) a dr6 f r a c t i o n n ~ se lon la m 6 t h o d e d ' A n d e r - s o n modi f i6e p a r Aebi , A s s e l i n e a u et L e d e r e r [9] : 49 m g d ' i n s o l u b l e d a n s l ' ac6 tone h c h a u d , 1 g d ' i n s o - l u b l e d a n s l ' aed tone & f ro id et 3,4 g de s o l u b l e d a n s l ' acd tone b. f r o i d o n t ~td o b t e n u s .

Le d i m y e o c 6 r o s a t e de ph t ioc6 ro l a 6t6 isol6 des c i t e s A, i n s o l u b l e s d a n s l ' ac6 tone h f ro id , p a r ch ro - m a t o g r a p h i e s s u c c e s s i v e s s u r c o l o n n e s d ' ac ide s i l i - c ique et s u r c o l o n n e s de s i l icagel . J~3 m g s o n t fi lu6s de ces d e r n i 6 r e s p a r u n m61ange d ' 6 t h e r de p6 t ro le et d ' 6 t h e r 9 0 : 1 0 : u n e seu!e t a c h e s u r c h r o m a t o p l a q u e ( S o l v a n t A, r6ae t i f 1, R f 0,46), spec t re i.r. i d e n t i q u e celui qu i a d~jh ~t6 p u b l i 6 [1~], spec t re de R.M.N'. (Br t&er , S p e c t r o s p i n W P 60 MHz, a c c u m u l a t i o n p a r t r a n s f o r m 6 e de F o u r i e r , d e u t ~ r i o c h l o r o f o r m e , t 6 t r a - m 6 t h y l s i l a n e , 5) 0,9 ( m u l t i p l e t , Me), 1,3 (CH~), 3,1 ( b a n d e de r o t a t i o n d u pic 1,3), 3,3 (OMe), 3,4 et 3,6 (pe t i t s pics t r6s p e u i n t e n s e s n o n in t e rp r~ t6s ) 4,6-5,1 ( m u l t i p l e t , 2 p r o t o n s des f o n c t i o n s a lcoo ls s e c o n d a i r e s s u b s t i t u 6 e s ) . Apr6s u n s 6 j o u r de p l u s i e u r s s e m a i n e s e u t u b e de ver re , le R f de la t o t a l i t 6 d u DIM c h a n g e n o t a b l e m e n t (Rf 0,85), ce qu i i n d i q u e r a i t q u e le DIM p e u t ~tre s n b s t i t n 6 p a r des p r o d u i t s r e l a t i v e m e n t po- l a i r c s et i n s t a b l e s . P a r s a p o n i f i c a t i o n d u DIM de R f 0,85 (po ta s se m 6 t h a n o l i q u e 10 p. c e n t - b e n z 6 n e 1:1, 48 hr . , 25 rag) s u i v i e d ' u n e e s td r i f i ca t ion p a r lc d iazo- m 6 t h a n e et d ' u n e c h r o m a t o g r a p h i c s u r c o l o n n e s6che d ' a l u m i n e , o n i so le 8,4 m g d ' e s t e r s m 6 t h y l i q u e s d a n s les ~ l u a t s 6 the r de p~t ro le et 6 t h e r de p d t r o l e - h e n z b n e 1:1 (es te r s m y c o c 6 r o s i q u e s e n C 27, C 30, n n p e u de C 24 ?, t r a c e s de C 32, p e u d ' ac ides i n f 6 r i c u r s p a r m i l e s q u e l s l ' ae ide p a l m i t i q u e es t p r @ o n d 6 r a n t : La n a - t u r e de ces e s t e r s m 6 t h y l i q u e s a 6t6 d ~ t e r m i n ~ e p a r c o m p a r a i s o n avec des 6 c h a n t i l l o n s a u t h e n t i q u e s s u r u u a p p a r e i l de c h r o m a t o g r a p h i c g a z e u s e F. et M. N ° 609 m u n i d ' u n d 6 t e c t e u r h i o n i s a t i o n de f l a m m e , c o l o n n e 3 p. cen t SE 30 s u r A c r o p a k 30 100/120, 2 m X 1/4, 250 o) et 13,3 m g de ph t ioc6ro l , d d h a r r a s s 6 de ses v a r i a n t e s , d a n s l '61uat b e n z 6 n e - 6 t h e r 1:1 (Rf 0,38, R f d u ph t ioc6 ro l a u t h e n t i q u e 0,38, b e n z 6 n e - 6 t h e r 1:1).

Glyc#rides : Les g lyc6r ides (Fig. 1A) o n t ~t6 i so l6s de la s o u c h e de Mycobacterium kansasii N ° 12479. Apr6s 6 1 i m i n a t i o n de t r a c e s de p r o d u i t s i n s o l u b l e s

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 5-6.

d a n s l ' a c O o n e h c h a u d , la f r a c t i o n 5 t h d r o s o l u b l e de l ' e x t r a i t h l ' 6 t he r de pd t ro le a 6t6 c h r o m a t o g r a p h i d e s u r c o l o n n e s de t r i s i l i c a t e de m a g n 6 s i u m - c 6 1 i t e 2:1 ct d ' a l u m i n e (act iv i t6 III) . Le p r o d u i t 61u6 p a r u n ink- l a n g e h p a r t i e s 6gales d ' d the r de p6 t ro le et de b e n z 6 n e a 6t6 pur i f i6 s u r c o l o n n e s de s i l icagel . T ro i s g lyc6r ides (N °s 1, 2, 3) o n t 6t6 sdpar6s p a r des p u r i f i c a t i o n s pre - p a r a t i v e s su r couche m i n c e de s i l icage l Merck, d a n s le benz6ne . Le g lyc6r ide N ° 1 qu i es t le p l u s a b o n d a n t et qu i p r 6 s e n t e u n e seu le t a che s u r c h r o m a t o p l a q u e d a n s le b e n z 6 n e (Rf 0,8) es t en r&alit6 enco re u n m6- l a n g e de g lyc6r ides . Ses p ropr i6 t6s s o n t les su i - v a n t e s : x ehl°r°f°rme 1740 (es ter) , 2800, 1460 (Me et m6-

• " m a x

o 0

DIM

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1 2

G Mycos±de B

0

G

0 I 2

0 Mycoside

A

A B So ivan t a So lvan t b R6ac t i f 1 R6ac t i f s l et 2

Fro. 1. - - Microanalyse d'extrails 5 l'6ther de pdtrole de M y c o b a c t e r i u m k a n s a s i i el du BCG.

C h r o m a t o g r a p h i e s s u r c o u c h e s m i n c e s de s i l icagel . 1 E x t r a i t & l ' 6 t h e r de p6t ro le de BGG (12 j o u r s ) . 2 E x t r a i t h l ' d the r de p6t ro le de Mycobacterium

kansasii, souche 21 de 25 j o u r s . VIl lA dimycocd, r o sa t e de ph t iocdro l

k \ \ \ \ ' t g lyc~r ides k56¢~ s u b s t a n c e s r 6 a g i s s a n t h I 'o rc inol et a u

c h l o r h y d r a t e de cystd, ine I [ s u b s t a n c e s & I'~tat de t r a c e s

t hy l6ne ) , 1380 (Me) cm-1, u n e f a ib l e b a n d e h 3250 cm-1 ( h y d r o x y l e ) i n d i q u e que ce t r ig lyc6r ide p e u t c o n t e n i r u n peu de g lyc6r ide N ° 2 qu i e s t s u b s t i t u 6 p a r de l ' ac ide m y c o l i q u e m a i s qu i n ' a p a s dt6 d tudi6 d ' a v a n - t age en r a i s o n du peu de p r o d u i t d i s p o n i b l e ; R.M.N. (Appare i l V a r i a n 60, 5, d e u t 6 r i o c h l o r o f o r m e , t ~ t r a m 6 -

Extraits ~ I'dther de pdtrole de mycobactdries. 537

t h y l s i l a n e ) : 0,9 ( m u l t i p l e t , Me) 1,25 (CH2), 2,2-2,4 ( C H ~ - - C = O ) , 3,9-4,3 ( p r o t o n s f ixes s u r les c a r b o n e s p r i m a i r e s ) , 5,3-5,4 ( p r o t o n fix~ s u r ]e c a r b o n e c e n t r a l s e c o n d a i r e ) [11]. Apr~s s a p o n i f i c a t i o n d a n s u n m~- l a n g e h p a r t i e s 6gales de p o t a s s e m 6 t h a n o l i q u e h 5 p. cen t et de benz6ne , l ' ~ t h ~ r o s o l u b l e a 6t~ isol6 et m 6 t h y l 6 p a r le d i a z o m 6 t h a n e p u i s d i s t i l l6 s o u s v ide pouss6 , les f r a c t i o n s r6coltfies en d e s s o u s de 200 ° o n t ~t6 a n a l y s 6 e s p a r c h r o m a t o g r a p h i c g a z e u s e avec u n a p p a r e i l B a r b e r - C o l m a n (s6rie 5000), m u n i d ' u n d~tec- t e u r h i o n i s a t i o n de f l a m m e . U n e c o l o n n e de 1,35 m r e m p l i e de DEGS h 20 p. cen t s u r c h r o m o s o r b W 45-60 a 6t6 u t i l i s6e p o u r la f r a c t i o n d i s t i l l a n t a u - d e s s o u s de 200 °. P o u r la f r a c t i o n d i s t i l l a n t a u - d e s s u s de cet te t e m p 6 r a t u r e la c o l o n n e c o n t e n a i t d u s i l i cone SE 30 h 5 p. c e n t s n r c h r o m o s o r b G 60/80 M. Les t e m p e r a t u r e s des c o l o n n e s 6 t a i e n t r e s p e c t i v e m e n t de 190 ° et de 210-250 °. Les t e m p s de r 6 t e n t i o n des e s t e r s m 6 t h y - l i q u e s o n t ~t6 c o m p a r 6 s avec les t e m p s de r 6 t e n t i o n d ' 6 c h a n t i l l o n s a n t h e u t i q u e s . Les e s t e r s m 6 t h y l i q u e s des ac ides s u i v a n t s o n t a i n s i 6t6 ident i f i~s : ac ide pa l - m i t i q u e , s t da r ique , t u h e r c n l o s t 6 a r i q u e e t ae ide en C 24 p r o v e n a n t p r o b a b l e m e n t de l a p y r o l y s e d ' u n e s t e r m y c o l i q u e [12]. Apr6s a c 6 t y l a t i o n de 3 m g de t r i g l y - c6r ide N ° 1 d a n s 0,04 m l de p y r i d i n e ct 0,06 m l d ' a n h y d r i d e ac~t ique , o n r~v61e 3 t a c h c s s u r c h r o m a t o - p l a q u e de s i l icagel . La s p e c t r o m ~ t r i e de m a s s e du d6- r iv6 ac~tyl~ t o t a l e o n f i r m e q u e le t r i g l y c f r i d e N ° 1 es t en rfiali t6 n n mf i lange de t r i g lyc~r ides ( a p p a r e i l MS 50 AEI) : Les f r a g m e n t a t i o n s observf ies s o n t c a r a c t 6 r i s t i - q u e s d ' u n m f l a n g e de t r i g lyc~r ides de po ids m o l 6 c u - l a i r e s 804 e t 806 q u i se f r a g m e n t e n t s e lon le s c h 6 m a c l a s s i q u e s u i v a n t [!15] :

m y c o l i q u e a ~t6 ident i f i6 p a r c h r o m a t o g r a p h i c s u r couche m i n c e (Rf i d e n t i q u e h ce lu i d ' u n m y c o l a t e de m 6 t h y l e a u t h e n t i q u e ) .

Mycosides A : Les e x t r a i t s h l ' 6 the r de p6 t ro le de Mycobacter ium d~ansasii N ° 12479 on t 6t6 c h r o m a t o - g r a p h i 6 s h p l u s i e u r s r e p r i s e s s u r c o l o n n e s s6ches d ' a l u m i n e W o e l m (act iv i t6 III) . Le m y c o s i d e A es t 61u6 p a r u n m ~ l a n g e d ' 6 t h e r et de m d t h a n o l 98.:2 (Rf 0,40 ; m y c o s i d e A Rf 0,40 ; c h l o r o f o r m e - m 6 t h a n o l 97:3, Kiese lge l G se lon S tah l , r~ac t ion 4 pos i t ive ) . Les c o n s t a n t e s p h y s i q u e s de ce m y c o s i d e c o r r e s p o n d e n t cel les qu i on t 6t6 o b t e n u e s a n t 6 r i e u r e m e n t [10,

k N a C I 1618, 1597 14216] : x e y e l ° h e x a r ' e 223, 274, 281 n m ; 'max - m a x

et 1515 ( a r o m a t i q u e s ) , 3220-3320 ( h y d r o x y l e ) , 1730 (es ter ) , 1000, 990, 980, 970, 887 cm-~ ( b a n d e s n o n i den - tifi~es t y p i q u e s du m y c o s i d e A) ; c e p e n d a n t des e s s a i s e n c o u r s m o n t r e n t qu ' i l s ' ag i t enco re d ' u n m ~ l a n g e . Deux a u t r e s m y c o s i d e s A p l u s p o l a i r e s ( r~ac t ion pos i - t ive a u r~ac t i f 4, R f 0,25 et 0,16 p a r r a p p o r t au m y c o - s ide A R f 0,43 • xeyclohexane 223, 274, 281 rim), ~ luab le s

' - m a x p a r l ' ~ t h e r - m ~ t h a u o l 90:10, s o n t p r e s e n t s en pe t i t e quant i tY.

Quel que so i t l eu r fige, u n e e x t r a c t i o n des bac i l l e s , p r o v e n a n t de c u l t u r e s s u r m i l i e u de S a u t o n , p a r l ' h e x a n e a d d i t i o n n ~ de 0,1 p. cen t de c y e l o h e x y l a m i n c ou de 0,1 p. cen t de d ~ c y l a m i n e [2], a ~ g a l e m e n t con- d u i t h l ' i s o l e m e n t de m y c o s i d e A. A u c u n s u b s t i t u a n t n o u v e a u n ' a 6t6 m i s en 6v idence p a r ces e x t r a c t i o n s .

Mycosides B : L ' i s o l e m e n t et l ' a n a l y s e de ces m y c o - s ides f e r o n t l ' o b j e t d ' u n e p u b l i c a t i o n u l t 6 r i eu r e .

0

oH0 clsH31

CH20-~-C-- '17 35

m / e 211 + 74 : m / e 285 + + 128 = m / e 339 + + 16 = m / e 227 +

m / e 267 + 74 = m / e 341 -t- 128 = m / e 395 + 16 = m / e 283

m / e 211 ac ide m y r i s t i q u e

m / e 239 ac ide p a l m i t i q u e

m / e 267 ac ide s t 6 a r i q u e

m / e 239 74 = m / e 313

128 = m / e 367 16 = m / e 255

m / e 804 (PM) - - 227 = role 577 - - 255 : m / e 5~9 - - - 2 8 3 = m / e 521

m / e 806 ( P M ) - - 227 = m / e 579 - - 255 = role 551 - - 283, = role ~123

Le pic m o l ~ c u l a i r e /t m / e 804 et des pics de f r a g - m e n t a t i o n m o i n s i m p o r t a n t s i n d i q u e n t q u e l ' u n des s u b s t i t u a n t s m i n e u r s es t i n s a t u r C Les pics a u - d e l h de m / e 806 i n d i q u e n t q u e l ' ae ide m y c o l i q u e es t a u s s i u n s u b s t i t u a n t de ces g lyc6r ides . E n effet, ap r6s sapon i f i - c a t i o n et e s t~r i f i ca t ion de l ' ~ t h e r o s o l u b l e d u g lyc~r ide N ° 2 p a r le d i a z o m 6 t h a n e , u n e s t e r m 6 t h y l i q u e d ' ac ide

R E S U L T A T S ET CONCLUSIONS.

La m ~ t h o d e d~cr i te d a n s ce t r a v a i l es t s u s c e p t i b l e d ' e t r e app l i qu~e h la d~tec t ion r a p i d e de m y c o s i d e s dar ts des s o u c h e s n o u v e l l e s de m y c o b a c t ~ r i e s , a n a l y - s~es h l a fin de la p~r iode e x p o n e n t i e l l e de c ro i s sance . Le m y c o s i d e A es t d~ tec tab le d a n s u n e x t r a i t de Myco- bacter ium Jcansasii p r o v e n a n t d ' u n e c u l t u r e de 18 j o n r s d a n s u n seu l f lacon de R o u x c o n t e n a n t 200 m l de m i l i e u de c u l t u r e m a t s les a n a l y s e s s o n t p l u s f ac i l e s avec des bac i l l e s p h o t o c h r o m o g 6 n e s de 25 h 28 j o u r s . Le BCG de l ' I n s t i t u t P a s t e u r a pu ~tre a n a l y s $ p l u s r a p i d e m e n t ca r ce t te s o u c h e es t c o n s t a m m e n t r ep iqu~e en v u e de la p r o d u c t i o n de vacc in et de t u b e r c u l i n e et le d~lai d ' a p p a r i t i o n d u vo i le es t p l u s cour t . L ' e x t r a i t r 6 s u l t a n t d ' u n t r a i t e m e n t r a p i d e p a r l ' ~ the r de p~t ro le o u l ' h e x a n e e o n t i e n t e s s e n t i e l l e m e n t du d i m y c o c 4 r o - sa te de ph t ioc~ro l qui , a n t ~ r i e u r e m e n t a v a i t ~t~ m i s cn ~v idence d a n s des s o u c h e s h u m a i n e s et b o v i n e s v i r n l e n t e s m a t s p a s d a n s les s o u c h e s de BCG e x a m i - n6es [11, 10, 14] , (fig. 1A, BCG, R f = 0,48 ; R f d u di- m y c o c 6 r o s a t e de ph t ioc~ro l t 6 m o i n 0,48), des glyc6- r ides (fig. 1A) et de s m y c o s i d e s (fig. 1B, M. kansasii , m y c o s i d e A R f 0,69 ; R f du m y c o s i d e A t ~ m o i n 0,69 ; BCG m y c o s i d e B, R f 0,60).

D ' a u t r e s s u b s t a n c e s n ' o n t p a s 6t~ ident i f i6es , so i t en r a i s o n de l eu r i n s t a b i l i t 6 (fig. 1 B : deux g lyco l ip ides r ~ a g i s s a n t h l ' o r c ino l d i f f6ren t des m y c o s i d e s d~jh d6- c r i t s [1@, 14-20], so i t e n r a i s o n de l e n r p r e s e n c e en t r6s pe t i t e q u a n t i t 6 ( p i g m e n t s . s u b s t a n c e s c a r b o n y l ~ e s d6 t ec t ab l e s p a r la 2 , 4 - d i n i t r o p h 6 n y l h y d r a z i n e l o r s q u e le b e n z ~ n e es t u t i l i s6 c o m m e s o l v a n t de m i g r a t i o n , g l y c 6 r o p h o s p h o l i p i d e s c o m p l e x e s c o n t e n a n t des p ro - d u i t s qu i r 6 a g i s s e n t h l ' o rc ino l ( r6ac t i f 1, s o l v a n t C). Les g lyco l ip ides i n s t a b l e s s ' h y d r o l y s e n t d~jh pa r t i e l l e - m e n t d a n s les t u b e s de c o n s e r v a t i o n ct enco re d a v a n -

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 5-6.

5 3 8 A . K . K o u l a n d M. G a s t a m b i d e - O d i e r .

t age lo rs des e h r o m a t o g r a p h i e s de pu r i f i ca t ion . Des ae ides l i b re s o n t dt6 iden t i f ids p a r s p e c t r o m d t r i e i n f r a - rouge : X NaC1 3000-2500 (d im6re d ' ac ide c a r b o x y l i q u e ) ,

- m a x

1710 ( C = O du d im6re ) , 1470 et 138,0 (md thy le ) , 935 (OH d u d im6re ) , lo rs de la pur i f i ica t ion des s u b s t a n c e s s t a n d a r d s u r ac ide s i l i c ique .

La p rdsenee de d i m y c o c d r o s a t e de ph t ioc6 ro l d a n s la s o u c h e de BCG 6tudide c o n f i r m e les d o n n d e s de G o r e n [2] r e l a t i v e s h la p rdsence de ce co rps d a n s d i v e r s e s s o u c h e s a t t d n u d e s .

L ' e x t r a i t h l ' 6 t h e r de pd t ro le ou h l ' h e x a n e c o n t i e n t e s s e n t i e l l e m e n t les c o n s t i t u a n t s de la c o u c h e l i p i d i q u e s i tude h l ' e x t d r i e u r de la pa ro i p r o p r e m e n t d i te s a n s que t o u t e f o i s u n e t r~s 16g6re c o n t a m i n a t i o n p a r des c o n s t i t u a n t s des z o n e s i n t e r n e s p u i s s e ~tre e x c l u e ; lc p o n v o i r de r e p r o d u c t i o n des bac i l l e s res te i n t ac t , i l y a t r6s p e u de p h o s p h o l i p i d e s et de p i g m e n t s darts ces e x t r a i t s , la m o r p h o l o g i e en b ~ t o n n e t de la m y c o b a c - t6r ie n ' e s t p a s a l tdrde p a r l ' e x t r a c t i o n (essa i s indd i t s ) . A n t d r i e u r e m e n t , S m i t h et coll . o n t dd jh obse rvd qu ' i l y a u n r a p p o r t d t ro i t e n t r e la m o r p h o l o g i e des colo- n i e s de Mgcobacterium kansas i i et la p r6sence de m y c o s i d e A [121]. Les r d s i d u s g l y c o s i d i q u e s spdc i f iques des m y c o s i d e s A, B e t G p o u r r a i e n t donc ~tre les g r o u - p e m e n t s d 6 t e r m i n a n t s d ' h a p t 6 n e s c a r a c t d r i s a n t r e spec - t i v e m e n t les bac i l l e s a t y p i q u e s p h o t o c h r o m o g 6 n e s , les s o u e h e s b o v i n e s de Mgcobacterium tuberculosis et Mycobacter ium ma'rinum.

Remerciements .

N o u s r e m e r c i o n s les P r o f e s s e u r s E. Lede re r et J. A s s e l i n e a u a i n s i q u e M o n s i e u r le D r H. Dav id p o u r les s u g g e s t i o n s a p p o r t d e s a u c o u r s de la r d a l i s a t i o n de ce t r a v a i l .

Les bac i l l e s BCG n o u s o n t 6t6 a i m a b l e m e n t offer ts p a r M a d a m e M. G h e o r g h i u ( I n s t i t u t P a s t e u r ) , les spec- t r e s de r d s o n a n c e m a g n d t i q u e n u c l d a i r e d u t r i g lycd r ide e t d u d i m y c o c d r o s a t e de ph t iocd ro l o n t 6t6 e m ' e g i s t r d s p a r M o n s i e u r H. Ba i l l i a (Service de M o n s i e u r le P ro f . J. Chuche0 C h i m i e Gdndra le , R e i m s ) et le spec t re de m a s s e d n t r ig lycdr ide ac6tyl6 a 6t6 e n r e g i s t r 5 p a r Mon- s i e u r le D r C o s s o n ( I n s t i t u t de C h i m i e des S u b s t a n c e s N a t u r e l l e s , G i f - s u r - Y v e t t e ) . N o u s r e m e r c i o n s v i v e m e n t t o u t e s les p e r s o n n e s qu i o n t a i n s i c o n t r i b u 6 tt l ' o b t e n - t i on des r d s u l t a t s r a p p o r t 6 s d a n s ce t r a v a i l , N o u s r e m e r c i o n s 6 g a l e m e n t le C o m m i s s a r i a t h l ' E n e r g i e Ato- m i q u e , D d p a r t e m e n t de Biologie , Sac lay , p o u r u n e s u b - v e n t i o n a y a n t fac i l i t6 l ' a c h a t de s o l v a n t s deut4r i6s .

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