Plantes médicinales et phytothérapie1986, Tome XX, n° 2, p. 155-167

MÉTHODE D'ÉTUDE DES PROPRIÉTÉS ANTISEPTIQUESDES HUILES ESSENTIELLES PAR CONTACT DIRECT

EN MILIEU GÉLOSÉ

1par B. BENJILALI(1), A. TANTAOUI-ELARAKI(2,3),

M. ISMAÏLI-ALAOUI(1)et A. AVADI

(1) Département de Chimie et Biochimie Alimentaire. lA V Hassan II.B.P. 6202 Rabat-Instituts (Maroc).

(2) Département de Microbiologie Alimentaire et de Biotechnologie lA V Hassan II.B,P, 6202 Rabat-Instituts (Maroc).

(3) Centre National de Coordination et de Planification de la Recherche Scientifiqueet Technique, B.P. 1346 Rabat R,P. (Maroc).

RÉSUMÉ

La méthode de Beylier-Maurel pour l'étude du pouvoir antiseptique des huiles essentielles(HE) a été modifiée, et appliquée aux essences du thym (Thymus capitatus), du romarin(Rosmarinus officinalis), de l'Eucalyptus (Eucalyptus globulus) et de l'armoise blanche(Artemisia herba alba).

L'HE de thym s'est révélée la plus active sur les 37 souches de moisissures étudiées, suiviede l'armoise, celles du romarin et de l'eucalyptus étant les moins efficaces,

L'HE de thym a été éprouvée également sur 17 souches de levures et 73 isolats de bacté-ries. La sensibilité de ces deux types de microorganismes s'est montrée très inférieure à celledes moisissures,

SUMMARY

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J

The Beylier-Maurel's method for studying antimicrobial effects of essential ails has beenmodified and used to study oils from thyme (Thymus capitatus), rosemary (Rosmarinusofficinalis), eucalyptus (Eucalyptus globulus) and mugwort (Artemisia herba alba), Thymeessential oil was the most effective against 37 mold strains successively followed by mug-wort, rosemary and eucalyptus oils. The Tyme essential oil has been also tested against17'yeasts and 73 bacterial strains. Its antimicrobial effect was shown to be higher on moldsthan on yeasts and bacteria,

1. - INTRODUCTION

De nombreux travaux rapportent les propriétés antimicrobiennes deshuiles essentielles (HE) des plantes aromatiques, L'activité antiseptiquedes HE de thym, en particulier, est bien établie [9, 16], mais de nombreu-

- 155 -

--- ----

ses autres HE produisent des effets antibactériens [4, 7, 10, 11, 13] et/ouantifongiques [6, 12, 14]. Des applications pratiques de ces activités anti-septiques ont été proposées dans de nombreux domaines tels que la théra-peutique humaine [9, 15] et animale [10]. D'autre part, l'effet inhibiteurde certaines HE sur le développement des bactéries d'origine alimentaire[5] laisse entrevoir des perspectives d'applications dans ce domaine égale-ment.

Nous avons, pour notre part [3] cité un certain nombre d'utilisationstraditionnelles des plantes aromatiques au Maroc notamment pour la pré-servation des denrées alimentaires.

Dans le cadre d'un programme d'investigations visant, d'une part, laconnaissance des plantes aromatiques et médicinales du Maroc, et d'autrepart, la recherche de procédés modernes de conservation des aliments,inspirés des techniques traditionnelles, il était nécessaire de disposer detechniques simples, rapides, reproductibles, et économiques pour l'étudedes propriétés antiseptiques des HE. Une de ces techniques, dite demicro-atmosphère, mise au point par Kellner et Kober, rapportée parAllegrini et Siméon de Bouchberg [1] et modifiée par nous, a déjà étédécrite [3]. Dans ce travail, nous présentons une seconde: la techniqued'étude en milieu gélosé de Beylier-Maurel, rapportée par Allegrini etSiméon de Bouchberg [1] à laquelle nous avons également apporté desmodifications.

. Cette technique permet la détermination de la concentration minimaleinhibitrice (CMI) dans des conditions expérimentales précises. Elle per-met, par ailleurs, contrairement à la technique de micro-atmosphère, detester, par contact direct avec le microorganisme, l'HE dans sa globalitéet non pas uniquement les constituants de la phase vapeur.

II. - MATÉRIEL ET MÉTHODES.

2.1. Les huiles essentielles.

Ce travail porte sur les six HE déjà testées par la méthode demicroatmosphère dans notre travail précédent [3] où nous avions pré-cisé les raisons de leur choix, les méthodes de leur extraction et de leuranalyse. Le tableau I rappelle la nature et la composition des HE utili-sées.

2.2. Les souches de microorganismes.

Les 37 souches de moisissures précédemment testées par la techniquede micro-atmosphère [3] ont été reprises dans cette étude. Il s'agit,comme nous l'avions fait remarquer, de représentants d'espèces souventincriminées dans la pollution des denrées alimentaires.

- 156.-

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...

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TABLEAU 1

Composition des huiles essentiellesétudiées: les teneurs, expriméesen %, sont déterminéespar c.P.G. ;en admettant que tous les coefficients de réponsesont égaux :

d'après BEN JILALl et al. [3].

VI-..1

a-pinène camphène {3-pinène p-cymène r-terpi - cinéolea-thujone {3-thujone camphre carvacrolnène 1, 8

Armoise 1 1 2 - - - 1,5 65 8 8 -

(Artemisia herba alba)

Armoise II 3 3 - - - 4,5 traces 83 6 -(A. herba alba)

Armoise III 2 7 - - - 5,5 35 8 38 -

(A. herba alba)

Thym traces 1,5 traces 15 1 - - - - 78(Thymus capitatus)

Eucalyptus - 29 - - - 69 - - - -(Eucalyptus globulus)

Romarin 15 4 6 - - 52 - - 12 -

(Rosmarinus officina/is)

Les 17 souches de levures, représentant 6 espèces, et les 73 isolats debactéries appartenant à 17 espèces, proviennent d'échantillons de« smen » marocain *. Le smen est un corps gras alimentaire préparé àpartir de beurre fermier par lavage, salage et stockage à l'abri de l'air et àtempérature ambiante pendant 4 à 6 mois au moins. Toutes les souchesde bactéries s'étaient montrées lipolytiques. Elles sont soumises, danscette étude, ainsi que les levures, à la seule action de l'HE de thym. Cetteplante ou ses extraits étant incorporés au beurre dans certainespréparations de smen, il nous a semblé intéressant, en effet, deconfronter ces souches à l'action de cette HE.

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2.3. Technique d'étude.4

L'HE est dispersée, à des concentrations variables, dans le milieu deculture gélosé avant solidification, grâce à un tensioactif, le Tween 80. Lemilieu, solidifié en boîte de Pétri, est ensemencé en surface, puis on suit,dans le temps, le développement des cultures en fonction de laconcentration en HE.

- Préparation des boîtes de Pétri (RP) avec différentes concentrationsen HE.

Une solution de Tween 80 à 10 070dans l'eau est stérilisée à 120°Cpendant 15 min. A cette solution, on ajoute, aseptiquement, une quantitéd'HE telle que le rapport HE/Tween soit de 80/20 (v/v). On agite auvortex pendant 2 à 3 min pour disperser l'HE dans la solution; onobtient ainsi la solution mère « S ».

Dans des tubes à essais contenant chacun 18 ml de milieu géloséstérilisé, on ajoute, aseptiquement, 2 ml de la solution «S» ou dediverses dilutions de cette solution de façon à obtenir les concentrations(v/v) en HE, dans le milieu, de 1/100, 1/250, 1/500, 1/1 000 et 1/10 000.Les milieux utilisés sont le Czapeck-Dox Agar (pH 7,2) pour lesmoisissures, le Sabouraud gélosé (pH 5,6) pour les levures, et la gélosenutritive ordinaire pour les bactéries.

On agite ensuite au mixeur à vortex, on coule dans les BP et on laisserefroidir.

H--

"- Ensemencement.

L'ensemencement se fait par touches à la surface de la BP contenantles concentrations en HE allant de 0 à 1/100.

Pour éviter l'envahissement des boîtes par les bactéries mobiles, ondoit, après solidification du milieu, finir le séchage de la surface de

* Les auteurs en profitent pour remercier le Pr. EL MARRAKCHI(Département del'HIDAOA, Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II) pour avoir fourni ces souches.

- 158 -

gélose par un séjour de 15 min dans une étuve à 37°C. Dans cesconditions, on peut ensemencer dans la même boîte jusqu'à 34 souchesde bactéries.

Pour les levures, chaque BP peut servir à l'étude d'une trentaine desouches et pour les moisissures, une vingtaine d'isolats peuvent êtreétudiés.

Le repérage des différentes souches peut être facilement réalisé ensuivant un ordre précis d'ensemencement qu'on peut indiquer aumarqueur sur le fond de la BP.

- Incubation.

Nous préférons incuber les boîtes sur les paillasses à températureambiante (22-25 °C), afin d'éviter que l'évaporation des HE dans l'étuvecharge l'atmosphère de cette dernière en vapeur d'HE, ce qui risqueraitde fausser les résultats.

- Lecture et expression des résultats.

Pour chaque souche, on note:

. La durée d'inhibition totale: lorsque l'inhibition totale a étéobtenue, nous avons essayé de suivre son maintien pendant 12 joursd'incubation.

. La concentration minimale inhibitrice (CM!) : plus petite dose pourlaquelle aucun développement n'est visible. La CM! est notée 5 joursaprès la pousse du témoin pour les moisissures et 48 h pour les bactérieset levures.

Pour pouvoir comparer les essences entre elles quant à leur efficacité,et les micro-organismes quant à leur sensibilité à une même essence, nousavons adopté le système de notation indiqué au tableau II.

TABLEAU Il

Système de notation de l'efficacité antiseptique des Huiles Essentielles(ou de la sensibilité des microorganismes à leur action)en fonction de la Concentration Minimale Inhibitrice.

- 159 -

Concentration Minimale Inhibitrice Note d'efficacité de l'HE(C.M.I.) (= note de sensibilité du microorganisme)

C.M.I. 10-4 510-4 < C.M.I. 10-3 410-3 < C.M.I. 2.10-3 3

2.10-3 < C.M.I. 4.10-3 24.10-3 < C.M.I. 10-2 1

10-2 < C.M.I. 0

,

.il

"

FIG. 1. - Effet antibactérien de l'HE de thym testé par la méthode de contact direct enmilieu gélosé contre 70 souches isolées du smen.III 000, 1/500, 1/250 et 1/100 représentent les concentrations de l'HE dans le milieu deculture (VIV).

"

"

FIG. 2. - L'effet antimicrobien de l'HE de thym testé par la méthode de contact direct enmilieu gélosé contre 17 souches de levures isolées du smen. 1/1 000, 1/500, 1/250 et1/100 représentent les concentrations de l'HE dans le milieu de culture (VIV).

- 160 -

III. - RÉSULTATS ET DISCUSSIONS.

Les HE sont douées de propriétés antimicrobiennes certaines. Laméthode ci-dessus décrite est parfaitement adaptée à leur étude. Lesfigures 1 et 2 représentent le type de résultats obtenus. Ces derniers,consignés sur les tableaux III, IV, V et VI, appellent les observationssuivantes:

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~

3.1. Efficacité antifongique comparée des essences étudiées.

Le tableau III permet de conclure que, quelle que soit l'espèce demoisissure testée, l'HE de thym est toujours de loin la plus efficace.Viennent ensuite les HE d'armoise blanche puis celle de romarin etcelle d'eucalyptus. Ce classement est identique à celui que nous avionsdéjà établi par la méthode de microatmosphère [3]. Il concorde, parailleurs, avec l'échelle établie pour l'efficacité des constituants desessences: phénols> cétones> oxydes [9, Il]. En effet, l'essence dethym testée est très phénolée (environ 80 0,10de carvacrol), celles del'armoise comportent entre 84 et 94 % de cétones (a-thujone, iJ-thujoneet camphre), les deux autres étant des essences à oxydes: cinéole 1,8notamment.

Les 3 chémotypes d'armoise ont pratiquement la même activité. Lanature différentedu composémajoritaire [3]ne semblepas avoir d'effet apparent.

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3.2. Sensibilité comparée des microorganismes étudiés.

Le tableau III montre que, au sein des moisissures étudiées, lasensibilité moyenne aux 6 HE testées est approximativement la même etse situe autour de 2. Cependant, certaines espèces semblent se distinguerpar une sensibilité relativement plus élevée; c'est le cas d'Aspergillusrepens, Penicillium purpurogenum et Byssochlamys nivea, avec desdegrés de sensibilité moyens respectivement de 3,3 ; 3,7 et 3,3. D'autres,au contraire, présentent une certaine résistance; tel est le cas, enparticulier, d'Alternaria tenuissima (degré de sensibilité moyen: 1,5). Cesobservations rejoignent celles de notre travail précédent [3] où, enparticulier, A. repens et Byssochlamys nivea s'étaient montrésrelativement plus sensibles, et A. tenuissima plus résistant, que lamoyenne des moisissures. Cependant, pour beaucoup de micromycètes,nous ne retrouvons pas exactement le même degré de sensibilité relative,ce qui s'explique aisément par la composition différente des phasesliquides, étudiées dans ce travail, et des phases vapeur correspondantesmises en œuvre dans la méthode de microatmosphère utiliséeprécédemment [3].

"

- 161 -

TABLEAUIII

Degrés de sensibilité des moisissures aux huiles essentiellesou degrés d'efficacité antifongique des huiles essentielles

(d'après le système de notation du tableau Il).

Légendea : non producteur d'aflatoxine.b : producteur d'aflatoxine.c : non producteur d'ochratoxine.

d : producteur d'ochratoxine.e : résistant à 10 ppm de thiabendazole.f : sensible à 5 ppm de thiabendazole.

- 162 -

y

J:

~

~

ArmoisesThym Romarin Eucalyptus Moyenne

Moisissures 1 II III

Aspergillus niger 4 2 3 2 1 0 2A. flavus n.t. (a) 4 2 2 2 1 0 1,8A. flavus t. (b) 4 2 2 2 1 0 1,8A. ochraceus n.t. (c) 4 2 2 2 1 0 1,8A. ochraceus t. (d) 4 2 2 2 1 0 1,8A. repens 5 4 4 3 2 2 3,3A. versicolor 4 2 2 2 2 1 2,16A. fumigatus 4 1 1 2 1 1 1,66Moyenne du genre

4,1 2,1 2,25 2,1Aspergillus 1,25 0,5 2Penicillium italicum R. (e) 4 2 2 3 1 0 2P. italicum S. (t) 4 3 3 4 2 1 2,8P. digitatum 4 1 2 2 1 1 1,8P' caseicolum 4 2 3 3 1 1 2,33P. cyclopium 4 1 1 2 1 1 1,66P. frequentans 5 2 2 2 1 1 2,16P. clavigerum 4 3 3 2 2 1 2,5P. notatum 4 2 2 2 1 0 1,8P. nigricans 4 1 2 2 1 1 1,8P. brevicompactum 4 1 3 2 1 1 1,8P. purpurogenum 5 3 4 4 3 3 3,66P. implicatum 4 1 2 2 1 1 1,8Penicillium sp. '4 2 2 2 1 1 2Moyenne du genre

Penicillium 4,15 2 2,15 2,4 1,6 1 2,1Paecilomyces varioti 4 1 2 2 1 3 2,2Doratomyces sp. 4 2 2 2 2 1 2,2Cladosporium sp. 5 2 2 2 1 1 2,2Gliocladium roseum 4 1 1 2 1 1 1,6Ulocladium atrum 4 2 3 2 1 1 2,2Byssochlamys nivea 5 4 4 2 2 3 3,3Stachybrotys sp. 5 1 2 3 2 3 2,7Alternaria tenuissima 4 1 1 2 0 1 1,5Geotrichum candidum 4 1 2 2 1 3 2,2Neocosmospora sp. 4 1 2 1 1 1 1,6Eidamella spinosa 5 2 3 3 2 1 2,6Syncephalastrum 5 2 2 2 1 1 2,2

racemosumAbsidia corymbifera 4 2 2 2 1 1 2Mucor racemosus 4 1 2 2 1 1 1,8M. spinosus 4 3 4 3 1 1 2,6M. hiemalis 4 3 4 4 1 1 2,8

Moyenne générale 4,2 1,9 2,3 2,3 1,2 1,1

TABLEAUIV

Degré d'efficacité de l'huile essentielle de thym (Thymus capitatus)contre des levures isolées du smen

(d'après le système de notation du tableau II).

Légende:N - Nombre de souches présentant le degré de sensibilité correspondant.S = Score global obtenu par les' souches de même degré de sensibilité: obtenu en

multipliant le degré de sensibilité par N.S (total)

a = Degré moyen de sensibilité:N (total)

La comparaison des résultats relatifs à l'action de l'HE de thym sur lesmoisissures d'une part (Tableau III) et de ceux obtenus avec la même HEsur les levures (Tableau IV) et les bactéries (Tableau V) d'autre part,montre clairement la plus grande sensibilité des micromycètes par rapportaux autres groupes de microorganismes étudiés. En effet, le degré desensibilité moyen est de 4,2 pour les moisissures, et de 2 pour lesbactéries et les levures. La résistance relative des bactéries lipolytiquesisolées du smen, en particulier, est à mettre en relief. En effet, il a étémontré que le principal phénomène qui préside à l'élaboration du smenest une lipolyse d'origine microbienne [8]. Nos observationspréliminaires, récemment confirmées par celles de BANQOUR [2],

- 163 -

DegréDegré de2 1 0 Total moyen desensibilité 5 4 3

sensibilitéenregistré (a)

N 0 1 2 1 4 0 8Kluyveromy- 2ces lactis S 0 4 6 2 4 0 16

N 0 1 0 0 0 0 1Kluyveromy- 4ces sp. S 0 4 0 0 0 0 4

N 0 1 0 0 0 0 1Saccharomy- 4ces cerevisiae S 0 4 0 0 0 0 4

N 0 0 0 0 1 0 1Saccharomy- 1ces sp. S 0 0 0 0 1 0 l

N 0 0 0 1 2 0 3Torulopsis 1,33sphaerica S 0 0 0 2 2 0 4

N 0 0 0 1 2 0 3Debaryomyces 1,33hansenii S 0 0 0 2 2 0 4

TABLEAUV

Degré d'efficacité de l'huile essentielle de thym (Thymus capitatus)contre des bactéries lipolytiques isolées du smen(d'après le système de notation du tableau Il).

- 164 -

DegréDegré de2 1 0 Total moyen desensibilité 5 4 3

sensibilitéenregistré (a)

N 0 1 0 8 9 3 21Bacillus1,38cereus S 0 4 0 16 9 0 29

N 0 0 1 4 0 0 5B. firmus 2,2

S 0 0 3 8 0 0 Il

N 0 0 2 1 1 0 4B. licheni-2,25formis S 0 0 6 2 1 0 9

N 0 0 0 1 2 1 4B. megate- 1rium S 0 0 0 2 2 0 4

N 0 0 2 0 0 1 3B. coagulans 2

S 0 0 6 0 0 0 6

N 0 0 2 1 0 0 3B. alvei 2,66

S 0 0 6 2 0 0 8

N 0 0 2 0 0 0 2B. pumilus 3

S 0 0 6 0 0 0 6

N 0 0 0 0 1 0 1B. brevis 1

S 0 0 0 0 1 0 1

N 0 0 1 0 0 0 1B. subtilis 3

S 0 0 3 0 0 0 3

N 0 2 2 1 1 0 6Staphylococ- 2,83cus cohnii S 0 8 6 2 1 0 17

N 0 0 1 1 0 0 2Staphylococcus 2,5hemolyticus S 0 0 3 2 0 0 5

N 0 0 2 5 0 0 7Aeromonas2,28hydrophila S 0 0 6 10 0 0 16

suite Tableau V

~

t

Légende:N - Nombre de souches présentant le degré de sensibilité correspondant.S = Score global obtenu par les souches de même degré de sensibilité: obtenu en

multipliant le degré de sensibilité par N.S (total)

a = Degré moyen de sensibilité:N (total)

TABLEAUVI

Durée d'inhibition totale, en jours, de 37 souches de moisissures,par 6 huiles essentielles incorporées dans le milieu de culture gélosé

à différentes concentrations (seules les extrêmes sont reportées).

~

If

indiqueraient que l'évolution normale du smen ne serait pas affectée parl'adjonction de thym ou d'extraits de thym. Une ébauche d'explicationde l'usage du thym dans ces préparations traditionnelles de smen seraitdonc, en plus de l'aromatisation, une préservation du produit contre ladétérioration par les microorganismes indésirables, notamment lesmoisissures, sans nuire à son évolution normale.

- 165 -

0 4N 0 0 3 1 0Aeromonas

2,75sp. S 0 0 9 2 0 0 li

N 0 0 2 2 0 0 4Pseudomonas

2,5sp. S 0 0 6 4 0 0 10

N 0 0 2 0 1 0 3Moraxella

2,33sp. S 0 0 6 0 1 0 7

N 0 0 1 1 0 0 2Acinetobacter 2,5sp. S 0 0 3 2 0 0 5

N 0 0 0 0 0 1 1Vibrio sp. 0

S 0 0 0 0 0 0 0

HElThym

Armoise Armoise Armoise Romarin Euca-1 II III lyptus---

10-4 0 à 8 0 0 0 0 010-3 8 à > 12 0 0 0 0 0

2.10-3 > 12 0 à 8 0 à 9 0 à 7 Oà5 Oà64.10-3

> 12 0 à 12 1 0 à 12 5 à 12 0 à 7 0 à 810-2 > 12 6 à > 12 10 à > 12 10 à > 12 5 à > 12 0 à > 12

3.3. Maintien de l'inhibition dans le temps.

La durée d'inhibition totale dépend de la nature de l'HE, de sacomposition, et de la souche considérée. Pour de nombreux micro-organismes, il existe' des concentrations pour lesquelles l'effet inhibiteurest temporaire: l'inhibition est totale pendant 3, 6, 7... jours, puis ledéveloppement reprend très lentement. A des concentrations plus élevées,l'inhibition est maintenue pendant au moins 12 jours (fin del'observation).

Les résultats (Tableau VI) confirment encore la supériorité de l'HE dethym. En effet, pour la totalité des micro-organismes, l'inhibition estmaintenue pendant plus de 12 jours avec la concentration de 10-3. L'HEd'eucalyptus se montre toujours la moins efficace, certaines souches étantencore capables de démarrer leur croissance, en même temps que letemoin, avec la concentration relativement élevée de 10-2. Enfin, les HEd'armoise et de romarin occupent une position intermédiaire.

~

t'

IV. - CONCLUSION.

La méthode que nous présentons permet d'obtenir des résultatsreproductibles. En effet, testée sur les mêmes micro-organismes et lesmêmes HE par deux opérateurs d'une part, et deux fois par le mêmeopérateur à une année d'intervalle d'autre part, elle a donné des résultatssimilaires.

Comparée à la technique de microatmosphère [3], elle aboutit auxmêmes observations générales, telles que l'efficacité relative des 3 typesd'essences (thym, armoise, et romarin-eucalyptus) vis-à-vis d'un micro-organisme. En revanche, des différences peuvent être notées au niveau dela sensibilité individuelle des souches vis-à-vis d'une HE donnée. Cesdifférences peuvent s'expliquer, au moins en partie, par la différence decomposition entre la phase liquide de l'HE, utilisée dans la méthode decontact direct, et la phase vapeur, mise en œuvre dans la technique demicroatmosphère [3].

t

s

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