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Méthodes de Diagnostic microbiologique

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Page 1: Méthodes de Diagnostic microbiologique

Méthodes de Diagnostic microbiologique

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A- Méthodes diagnostiques basées sur la croissance bactérienne

• Les méthodes diagnostiques établies sur lescaractéristiques culturales sont trèsimportantes pour l'identification de la plupartdes micro-organismes pathogènes.

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I- Isolement des agents pathogène à partir des

échantillons cliniques:• En cas de suspicion d'infection chez un patient, des

échantillons biologiques sont prélevés et adressés aulaboratoire de microbiologie pour analysesmicrobiologique et/ou immunologique, et/oumoléculaire .

• Les échantillons peuvent être de toutes sortes : sang,urine, fèces, crachat, liquide céphalo-rachidien ou pusprélevé à partir d'une plaie. Un écouvillon stérile peutservir pour prélèver le site infecté.

• Cet écouvillon est ensuite déchargé à la surface d'unegélose et/ou dans un milieu de culture liquide ; cemilieu est ensuite incubé.

• Des biopsies tissulaires peuvent être égalementprélevées et mises en culture de la même manière.

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• Une fois le micro-organisme isolé et identifié, leclinicien doit s'assurer de sa réelle mise en causedans la maladie infectieuse diagnostiquée.

• C'est pour cela que les conditions de réalisationdes prélèvements sont primordiales. Les risquesde contamination doivent être évités par laréalisation de l'asepsie.

• De plus, les conditions de prélèvements doiventpermettre d'optimiser l'inoculum prélevé.

• Enfin, certaines précautions sont indispensablespar rapport aux exigences culturales des micro-organismes, comme le maintien de l'anaérobiosepour les bactéries anaérobies strictes. Une foisprélevés les échantillons doivent être mis enculture le plus rapidement possible.

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Les milieux de culture

• La culture constitue une part importante de lamicrobiologie médicale, grâce au choix des milieux deculture et des conditions d'incubation appliquées pourl'isolement des micro-organismes à partir deséchantillons biologiques.

• La plupart des micro-organismes importants en cliniquepeuvent être cultivés, donc isolés et identifiés, et celagrâce à la grande variété des milieux de culture existants.

• La plupart des échantillons cliniques sont d'abordcultivés sur des milieux non sélectifs, comme les gélosesau sang qui permettent la croissance de la plupart desorganismes aérobies et anaérobies facultatifs.

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• L'utilisation des milieux d'enrichissement, quicontiennent des facteurs permettant la croissance desmicro- organismes exigeants, est souvent nécessaire ;c'est par exemple le cas pour l'isolement de Neisseriagonorrhoeae, agent responsable de l'urétritegonococcique ou de Salmonella spp agent dessalmonelloses.

• Certains milieux sont dits sélectifs car ils permettent,grâce à l'addition de composés dans le milieu, defavoriser la croissance de certains micro-organismes,tout en inhibant la croissance d'autres micro-organismes.

• Enfin, les milieux différentiels sont des milieuxspécialisés qui permettent l'identification des micro-organismes à partir des caractéristiques culturalesrévélées sur ces milieux.

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Le sang

• La bactériémie correspond à la présence de bactériesdans le sang .

• Ce phénomène est rare chez l'individu sain, arriventoccasionnellement et de manière transitoire enréponse à des actes invasifs, lors de soins dentaires oulors de traumatismes.

• La présence prolongée de bactéries dans le sang estgénéralement indicatrice d'infection systémique.

• Les bactéries les plus fréquemment retrouvées dans lesang sont les entérobactéries, notamment Escherichiacoli ou Klebsiella pneumoniae, les cocci Gram positifcomme Staphylococcus aureus et Streptococcuspyogenes, et le bacille Gram négatif Pseudomonasaeruginosa.

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• La septicémie ou sepsis est une infection générale grave del'organisme qui résulte de l'association d'une bactériémieet d'un syndrome de réponse inflammatoire systémique.

• Les signes cliniques sont souvent une hyperthermieaccompagnée de frissons et d'accélération du rythmerespiratoire. Les formes les plus graves sont le sepsis sévère(sepsis avec dysfonctionnement aigu d'un ou plusieursorganes vitaux comme les reins, le cœur ou les poumons)et le choc septique, caractérisé par une hypotensionartérielle majeure.

• Les hémocultures sont le seul moyen d'isoler et d'identifierl'agent causal ; le diagnostic et le traitement dépendentalors de la bonne réalisation des cultures du sang.

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• La procédure standard de culture du sang,appelée hémoculture consiste à préleveraseptiquement 20 mL de sang veineux et à lesinjecter dans deux flacons, dits d'hémoculture,qui contiennent à la fois des anticoagulants et dumilieu de culture conventionnel.

• Un des flacons est incubé en aérobiose, l'autre enanaérobiose. L'incubation se fait à 35 °C et lalecture des flacons se fait plusieurs fois par heurependant au moins cinq jours, ceci le plus souventgrâce à des systèmes automatisés.

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• La majorité des micro-organismes ayant une réellesignification clinique sont détectés dans les deuxpremiers jours, alors que d'autres, plus exigeants, lesont entre le troisième et le cinquième jourd'incubation.

• Certains systèmes d'hémoculture emploient desagents chimiques lysant les globules rouges et lesglobules blancs de manière à libérer les pathogènesintracellulaires.

• Des indicateurs de croissance détectent lesmicroorganismes présents dans les flaconsd'hémoculture, puis l'observation microscopique etla réalisation de subcultures les identifient.

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• Les automates d'hémoculture détectent la croissance microbienne parl'augmentation de la production de dioxyde de carbone ou parturbidimétrie, une lecture étant réalisée toutes les dix minutes.

• Sur l'ensemble des prélèvements de sang, un taux de contamination,incompressible, est attendu ; celui-ci est de l'ordre de 2 à 3 %.

• Les contaminants les plus courants appartiennent à la flore cutanéenormale, comme Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes oules bactéries corynéformes.

• Cependant, ces contaminants sont aussi occasionnellement responsablesd'infections touchant le système cardiaque (endocardite bactériennesubaiguë) ou peuvent coloniser des dispositifs intravasculaires tels que lesvalves cardiaques artificielles.

• C'est pourquoi, la validation clinico-microbiologique est indispensablepour une bonne interprétation des résultats d'hémoculture.

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Les urines

• Les infections du tractus urinaire sont très fréquentes,notamment chez les femmes. Sachant que les agentsimpliqués dans ce type d'infection proviennent le plussouvent de la flore digestive normale (Escherichia colipar exemple), l'analyse cyto-bactériologique des urinesrequiert de grandes précautions.

• Dans la plupart des cas, l'infection des voies urinairesse fait par voie ascendante après colonisationprogressive de l'urètre jusqu'à l'infection de la vessie.

• Les infections urinaires sont aussi la première caused'infections nosocomiales.

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• Une infection urinaire significative implique engénéral au moins 105 bactéries par millilitre d'urinesrecueillies au milieu du jet après lavage soigneux dela sphère génitale externe.

• En l'absence d'infection, une contamination duprélèvement apporte moins de 103 bactéries parmillilitre.

• Les agents pathogènes urinaires les plus courantssont des entérobactéries, avec notamment E. coli,qui compte pour plus de 90 % des cas. Les autresbactéries habituellement retrouvées sont Klebsiella,Enterobacter, Proteus, Pseudomonas, Staphylococcussaprophyticus et Enterococcus faecalis.

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• Neisseria gonorrhoeae, agent de l'urétritegonococcique, ne se développe pas dans l'urine enelle-même, mais sur l'épithélium urétral et estdiagnostiqué par d'autres méthodes.

• Un examen microscopique direct des urines permet dedépister la présence anormale de bactéries, c'est-à-direune bactériurie. Cependant, cette bactériurie estplus communément dépistée au moyen debandelettes urinaires qui testent certains paramètrestémoins de la croissance bactérienne et de l'infection.

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• Ainsi, la détection des entérobactéries peut être objectivéepar la mise en évidence de nitrites (activité nitrateréductase propre aux entérobactéries) dans l'urine, cetteréaction n'étant positive qu'au-delà d'un certain seuil (>105 par millilitre), ce qui permet ainsi l'utilisation de ce testcomme un moyen simple de dépistage des infectionsurinaires.

• Sur les bandelettes urinaires, d'autres tests sont associés :détection de l'activité estérase (des leucocytes), et del'activité peroxydase (présente chez une grande variété debactéries ).

• Une mise en culture de l'urine doit suivre une bandeletteurinaire positive. En cas de bactériurie, une coloration deGram peut être réalisée directement à partir deséchantillons urinaires, de manière à identifier lescaractéristiques morphologiques des pathogènes.

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• Sont retrouvés entre autres des bacilles Gram négatif(enterobactéries), des cocci Gram négatif (Neisseria) ou descocci Gram positif (Staphylococcus, Enterococcus).

• La coloration de Gram ou d'autres méthodes de colorationsont souvent utiles pour la détection des bactériesdirectement dans les échantillons biologiques.

• Pour la culture des échantillons urinaires, on utilise deuxtypes de milieux :

• l) géloses au sang non sélectives et

• 2)milieux sélectifs pour les enterobactéries, comme le milieuMac Conkey ou le milieu à l'éosine et au bleu deméthylène(milieu EMB) .

• Ces derniers milieux permettent la différenciation initialeentre les souches d'entérobactéries fermentant le lactose etcelles ne le fermentant pas, tout en inhibant la croissance desbactéries Gram positif telles que Staphylococcus spp.(contaminant cutané classique).

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• Avec l'expérience, une identification présomptive de labactérie, fondée sur la couleur et la morphologie descolonies obtenues sur les milieux , est possible.

• Une telle identification doit être étayée par des testscomplémentaires, et le diagnostic microbiologique doit êtrela conjonction cohérente de tous les tests réalisés.

• La culture d'urine peut être quantitative par comptage descolonies retrouvées sur les milieux ensemencés aprèsinoculation d'un volume urinaire calibré, généralement à1uL.

• Finalement, si aucune culture bactérienne n'est obtenuemalgré des signes urinaires fonctionnels persistants, il fautenvisager la recherche de bactéries de croissance difficilecomme Neisseria gonorrhoeae, de bactéries intracellulairescomme Chlamydia trachomatis, de bactéries de croissancelente comme Mycobacterium tuberculosis, ou enfin debactéries anaérobies

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Les fèces

• Un recueil et une conservation appropriés des fèces sontimportants pour l'isolement des pathogènes intestinaux.

• Durant la conservation, l'acidité fécale augmente si bien quele délai entre le recueil de l'échantillon et la mise en route del'analyse bactériologique doit être le plus court possible.

• Ceci est particulièrement important pour l'isolement deShigella et Salmonella, deux genres sensibles aux pH acides.

• Les selles fraîchement émises sont placées dans un pot(contenant éventuellement un tampon phosphate destiné àcontrecarrer l'acidification) adapté au transport jusqu'aulaboratoire.

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• Les selles hémorragiques ou glaireuses (pus) etles selles de patients suspects sont ensemencéessur différents milieux sélectifs adaptés àl'isolement de bactéries spécifiques

• De nombreux laboratoires utilisent égalementdes milieux différentiels et spécifiques, avec desconditions d'incubation adaptées à l'identificationd'Escherichia coli 0157:H7 et de Campylobacter,deux bactéries pathogènes intestinales majeurestransmises généralement par les aliments et l'eaucontaminés.

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Les plaies et abcès

• Les infections survenant sur des plaies traumatiques à la suitede morsures humaines ou animales, de brûlures, de coupuresou de la pénétration de corps étrangers, doivent êtredocumentées par des échantillonnages soigneusementréalisés ;

• l'interprétation des résultats obtenus exige des précautions.

• En effet, la flore locale colonise souvent les plaies et les abcès,et les écouvillonnages de telles lésions sont fréquemmentsouillés.

• Pour les abcès et autres types de lésions purulentes, lameilleure méthode de prélèvement est l'aspiration à l'aided'une seringue et d'une aiguille stérile après désinfectionpréalable de la peau.

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• Les lésions purulentes profondes sont prélevées chirurgicalementpar la réalisation de biopsie(s).

• Une grande variété de pathogènes est associée à ce type de lésionspurulentes, parmi lesquels figurent de nombreuses bactériesanaérobies.

• Les conditions de prélèvements, de transport et de culture enaérobiose et en anaérobiose sont donc primordiales pour unebonne évaluation microbiologique de ce type d'infection.

• Les pathogènes que révèlent fréquemment les prélèvements de pussont des entérobactéries, Staphylococcus aureus, Pseudomonasaeruginosa, et des bactéries anaérobies comme Bacteroides etClostridium.

• Les milieux habituellement utilisés sont les géloses au sang, lesmilieux spécifiques des entérobactéries et des milieux au sangadditionnés de composés spécifiques et d'agents réducteursnécessaires à l'isolement des bactéries anaérobies strictes.

• Une coloration de Gram permet d'observer de tels échantillonsdirectement au microscope.

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Prélèvements génitaux et diagnostic microbiologique des infections à Neisseria gonorrhoeae

• Chez les hommes, l'écoulement urétral purulent est le symptômeclassique de l'infection sexuellement transmissible (IST) appeléeurétrite gonococcique ou gonorrhée .

• En l'absence d'écoulement urétral, un prélèvement est réalisé àl'aide d'un écouvillon stérile fin inséré dans la partie antérieure del'urètre et ensemencé le plus rapidement possible sur un milieuadapté à la culture de Neisseria gonorrhoeae.

• De manière alternative, un recueil des premières urines du matinest possible pour la recherche de ce pathogène.

• Chez les femmes, devant la suspicion d'IST, il est nécessaire deréaliser à la fois un prélèvement du col utérin et de l'urètre.

• La mise en œuvre des procédures adaptées est décisive pour lediagnostic microbiologique d'infection à N. gonorrhoeae (ougonocoque) colonise les muqueuses uretrales, du col utérin, del'anus, de la gorge et des conjonctives.

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• Cette bactérie est sensible à la dessiccation et se transmetainsi presque exclusivement par contact direct entrepersonnes.

• Les mesures de santé publique pour contrôler les cas degonococcie passent par l'identification des porteursasymptomatiques, ce qui nécessite le recours à des analysesmicrobiologiques.

• N. gonorrhoeae se présente comme un diplocoque Gramnégatif, parfois pléiomorphe. Aucun autre micro-organismesimilaire morphologiquement ne se retrouve dans la flore dutractus urogénital.

• Ainsi, l'examen direct d'un frottis vaginal ou cervical montrantaprès coloration de Gram des diplocoques Gram négatif est enfaveur d'une urétrite gonococcique.

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• Dans un tel cas, l'examen microscopique des sécrétionspurulentes montre fréquemment des diplocoques Gramnégatif phagocyté par les neutrophiles . Certains laboratoiresanalysent les échantillons génito-urinaires pour la recherchede N. gonorrhoeae (et de Chlamydia trachomatis) en utilisantdes sondes nucléiques ou l'amplification par PCR.

• Les milieux non sélectifs d'enrichissement de N. gonorrhoeaecontiennent du sang cuit et sont appelés géloses « chocolat »en raison de leur couleur marron foncé.

• Ce milieu est rendu sélectif par addition de la vancomycine,de la nystatine, du triméthoprime et de la colistine ; cesquatre antibiotiques inhibent la croissance des bactéries de laflore normale, mais pas celle de N. gonorrhoeae.

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• Les milieux inoculés sont incubés à 37 °C enatmosphère aérobie humide contenant entre 3 et 7 %de CO2 nécessaire à la croissance du gonocoque.

• Les boîtes sont examinées après 24 à48 heures deculture et testées pour la recherche de l'oxydase, cartoutes les espèces de Neisseria sont oxydase positif.

• L'identification définitive nécessite la déterminationd'un panel complémentaire de tests phénotypiques(utilisation des sucres) et/ou des tests immunologiquesou moléculaires.

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Les cultures des bactéries anaérobies• Les bactéries anaérobies strictes sont des causes fréquentes

d'infection. L'isolement et l'identification des pathogènesanaérobies nécessitent des méthodes de culture etd'isolement spécifiques.

• En général, les milieux pour les anaérobies ne diffèrent pas deceux utilisés pour les bactéries aérobies, excepté :

• l) qu'ils sont habituellement plus riches en constituantsorganiques,

• 2) qu'ils contiennent des agents réducteurs (cystéine outhioglycolate le plus souvent) et

• 3) qu'ils possèdent des indicateurs redox.

• Les procédures de maniement et de traitement deséchantillons sont élaborées de manière à exclure toutecontamination par l'oxygène, celui-ci étant toxique pour lesbactéries anaérobies strictes.

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• Dans l'organisme, il existe différentes niches naturellementanoxiques (par exemple, certaines portions de la cavitébuccale ou le tractus intestinal bas), dont les constituantshabituels de la flore locale sont en partie des bactériesanaérobies strictes.

• Par ailleurs, d'autres sites anatomiques peuvent deveniranoxiques, à la suite de destruction tissulaire (par plaie outraumatisme) qui conduit à la réduction de l'apport sanguinet donc au manque en oxygène. Ce phénomène favorisealors l'installation de bactéries anaérobies strictes.

• De manière générale, les bactéries anaérobies strictes,appartenant aux flores normales, sont des pathogènesopportunistes.

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• Il existe cependant deux exceptions majeures :Clostridium tetani (responsable dutétanos) etClostridium perfringens (responsable de la gangrènegazeuse et d'intoxication alimentaire), toutes deuxcapables de former des endospores, formes derésistance bactérienne retrouvées dans les sols.

• Les méthodes de culture en anaérobiose cumulent leproblème habituel de la contamination desprélèvements et celui du maintien d'une atmosphèrestrictement anoxique.

• Les échantillons cliniques prélevés par aspiration à laseringue ou par biopsie doivent être immédiatementplacés dans un tube dépourvu d'oxygène(possibilitéd'utiliser une solution contenant un agent réducteurcomme le thioglycolate et un indicateur rédox commela résazurine, laquelle se colore en rosé en présenced'oxygène).

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• La seringue peut servir de système de transport àcondition d'enlever l'aiguille et de bien boucher laseringue.

• Pour l'incubation en anaérobiose, les boîtes de Pétrisont placées dans une jarre, où l 'anoxie est obtenuepar remplacement de l'air par un mélange N2-CO2dépourvu d'oxygène, ou par ajout de composésconsommant l‘O2 présent dans la jarre.

• Par exemple, il y a production de H2 qui, en présenced'un catalyseur comme le palladium, se combine à l' 02libre pour former de l'H2O.

• D'autres alternatives existent, comme l'utilisation demilieux de culture qui contiennent des agentsréducteurs ou l'utilisation de « boîtes à gants »anaérobies remplies d'un gaz dépourvu d'O2 comme leN2 ou l'H2 .

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Méthodes d’identification basées sur les caractéristiques de croissance

• Si les primocultures, c'est-à-dire les culturesissues de l'ensemencement des prélèvementsbiologiques, montrent une croissance debactéries, le travail du microbiologiste médicalest alors de les identifier.

• Les méthodes d'identification utilisées sontcelles basées sur les caractéristiques decroissance.

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• Après primoculture, les bactéries à identifiersont habituellement repiquées en subculturesur des milieux permettant la mise enévidence de différents tests biochimiques.

• La plupart des tests biochimiques sontactuellement réalisés à l'aide de kitsminiaturisés appelés galeries d'identificationbiochimique.

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• Les systèmes d'identification rapide des entérobactériessont souvent utilisés car ces bactéries sont fréquemmentimpliquées dans les infections urinaires et digestives. Desgaleries d'identification rapide sont également disponiblespour d'autres groupes ou espèces bactériennes.

• Par exemple, des galeries d'identification ont étédéveloppées pour Staphylococcus aureus, Streptococcuspyogenes, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilusinfluenzae et Mycobacterium tuberculosis.

• Des galeries d'identification des levures Candida albicanset Cryptococcus neoformans existent également .

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La résistance aux antimicrobiens

• L'isolement des micro-organismes pathogènes permet de confirmerle diagnostic clinique et d'adapter le traitement antimicrobien.

• La question de la détermination de la résistance aux antimicrobiensest un problème aigu de santé publique.

• La détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI)se fait par la méthode de diffusion en milieu gélose(antibiogramme).

• Les procédures pour la détermination de la sensibilité des bactériesaux antibiotiques sont régies par des documents émanant desdivers comités nationaux reconnus par l'OMS :

• pour les États-Unis, le National Commutée for Clinical LaboratoryStandards (NCCLS) ;

• pour la France, le Comité de l'antibiogramme de la Société françaisede microbiologie (CA-SFM).

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B- Méthodes immunologiques de diagnostic clinique• Les techniques d'immunoanalyse sont largement utilisées

pour la recherche spécifique de micro-organismespathogènes ou de constituants caractéristiques de cespathogènes.

• Ces tests sont utilisés pour confirmer l'existence d'uneinfection lorsque l'agent responsable ne peut être identifiéen culture ou n'est pas cultivable.

• Quand les méthodes de culture ne sont pas disponibles enroutine ou sont difficiles à mettre en œuvre, notammentpour de nombreuses infections virales, dont l'infection parle virus de l'immunodéficience humaine (VIH),

• les techniques d'immunoanalyse constituent un moyenefficace et relativement simple pour l'identificationspécifique de pathogènes.

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• Des anticorps spécifiques de pathogènes sontutilisés in vitro pour le diagnostic de maladiesinfectieuses.

• L'identification de l'agent responsable se fait,dans certains cas, par la recherche de la réponseimmune humorale ou cellulaire développée parl'organisme du patient en réaction à l'infection ;dans d'autres cas par l'utilisation de testsdiagnostiques à base d'anticorps spécifiques del'agent infectieux.

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Titres anticorps, tests cutanés et diagnostic des maladies infectieuses

• La mesure du titre (quantité) des anticorps spécifiques del'agent infectieux suspecté permet le diagnostic d'unemaladie. le titre des anticorps spécifiques du pathogènedoit être élevé. Ce titre peut être mesuré par destechniques de précipitation, d'agglutination ou par d’autresméthodes immunologiques.

• La procédure classique consiste à préparer des dilutions ensérie du sérum du patient, le« titre anticorps » correspondà la dilution la plus forte à laquelle la réaction antigène-anticorps est détectable.

• Une seule mesure du titre des anticorps ne peut êtreutilisée pour affirmer une infection active.

Page 41: Méthodes de Diagnostic microbiologique

• Ainsi, pour confirmer le diagnostic d'uneinfection aiguë, il est essentiel de montrer uneaugmentation du titre des anticorps sériquesentre la phase aiguë et la phase de convalescencede la maladie.

• Cette augmentation du titre des anticorps est lameilleure preuve que la maladie est liée à l'agentinfectieux suspecté.

• Dans certains cas cependant, la seule présenced'anticorps spécifiques peut suffire au diagnosticde l'infection.

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• Toutefois, les infections ne sont pas toutes à l'origined'une immunité systémique.

• Si un pathogène reste très localisé dans l'organismehôte, l'induction d'une réponse immune peut êtrefaible, sans augmentation du titre des anticorps,alors que le pathogène prolifère abondamment ausite de l'infection. L'infection par Neisseriagonorrhoeae, bactérie responsable de l'urétritegonococcique, n'entraîne pas de réponse immunesystémique ou protectrice, la réinfection d'unindividu guéri est donc possible.

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• Les tests cutanés permettent aussi de détecterl'exposition à un pathogène.

• Le test cutané à la tuberculine consiste en l'injection intra-dermique d'un dérivé purifié protéique de Mycobacteriumtuberculosis. Une réaction inflammatoire positive semanifeste par un érythème et une induration atteignant leurdéveloppement maximal quarante huit heures aprèsl'injection ; elle révèle une infection active ou une expositionpréalable à Mycobacterium tuberculosis. Ce test identifie lesphénomènes d'hypersensibilité retardée.

• Les tests cutanés sont utilisés en routine pour le diagnostic dela tuberculose, de la lèpre, d'un certain nombre de maladiesfongiques et d'autres infections dans lesquelles la réponseanticorps est faible ou inexistante.

Page 44: Méthodes de Diagnostic microbiologique

• Réactions antigène-anticorps in vitro : sérologie• La sérologie est l'étude des reactions antigène-anticorps .• Les réactions sérologiques sont à la base de tous les tests

immunodiagnostiques.• Les principes de la réaction antigène-anticorps résident

dans l'interaction spécifique de déterminants antigéniquesavec la région variable de la molécule anticorps.

• Divers tests sérologiques sont utilisés pour l'identificationd'antigènes, ils dépendent des propriétés de l'antigène etdes conditions choisies pour la réaction.

Page 45: Méthodes de Diagnostic microbiologique

Anticorps polyclonaux et monoclonaux

On peut identifier 2 types d’anticorps: des anticorps polyclonaux et un anticorpsmonoclonal.

Anticorps polyclonaux:

- un mélange complexe d'immunoglobulines isolées du sérum sanguin. Cesanticorps reconnaissent une série d'épitopes différents.

- Ils possèdent une large gamme de sélectivités et affinités. Ceci peut donnerlieu à des réactions croisées ou à des interférences dans un essaiimmunologique.

Anticorps monoclonal:

- anticorps spécifique sécrété par les hybridomes produits grâce auxméthodes de la technologie des hybridomes (impliquant des culturescellulaires)

- Il se lie à un épitope particulier .

- Les anticorps monoclonaux sont plus spécifiques et possèdent des

propriétés plus reproductibles. Ils sont les anticorps de choix pour les essaisanalytiques.

Page 46: Méthodes de Diagnostic microbiologique

• La neutralisation• La neutralisation est l'interaction in vivo ou in vitro d'un anticorps

avec un antigène, conduisant à la réduction ou à l'inhibition del'activité biologique de l'antigène.

• Un anticorps spécifique est capable de neutraliser une toxinemicrobienne en bloquant la partie active de la toxine [cas desexotoxines bactériennes].

• Un antisérum neutralisant une toxine est une antitoxine. Elles sontutilisées dans le traitement du botulisme, du tétanos et de ladiphtérie, toutes ces maladies étant liées à la productiond'exotoxines bactériennes.

• Certains virus peuvent aussi être neutralisés par des anticorpsspécifiques. Les anticorps spécifiques de l'hémagglutinine et de laneuraminidase des virus de la grippe empêchent l'adsorption desvirus sur les récepteurs des cellules hôtes.

Page 47: Méthodes de Diagnostic microbiologique

• La précipitation• La précipitation est la formation d'un complexe

insoluble résultant de l'interaction d'un anticorpssoluble avec un antigène soluble.

• Les réactions de précipitation sont facilementanalysables in vitro ; ce sont des tests sérologiquespermettant la quantification de concentrations enanticorps.

• Les proportions des deux substances réactives doiventêtre optimales, un excès d'anticorps ou d'antigèneconduisant à la formation de petits complexes immunssolubles.

Page 48: Méthodes de Diagnostic microbiologique

• Réactions avec précipitation:• Les réactions avec précipitation

sont basées sur un principe semblable aux réactions par agglutination; la différence étant que l’antigène est une espèce moléculaire soluble au lieu d’une particule (bactérie ou cellules).

• À un certain rapport Ac/Ag, le complexe anticorps et antigènes devient insoluble et précipite.

• Quantité de précipité formé en fonction de la quantité d’antigène ajoutée pour une concentration totale d’anticorps fixe

Page 49: Méthodes de Diagnostic microbiologique

• Les réactions de précipitation en gels d'agarose ou tests d'immunodiffusion (ou « immunodiffusion double » ou «réaction d'Ouchterlony ») étudient la spécificité desréactions antigène-anticorps

• Les solutions d'antigène et d'anticorps sont déposées dansdes puits percés dans le gel et diffusent, des lignes deprécipitation apparaissant. Les interactions moléculaires dedeux antigènes différents avec un antisérum peuvent êtreévaluées par l'observation des lignes formées.

• Si les deux antigènes sont identiques, il se forme une seuleligne de précipité (ligne d'identité). Si les puits adjacentscontiennent un antigène commun et l'un des puits un secondantigène, une ligne d'identité partielle apparaît.

• L'immunodiffusion est un outil de recherche en biochimiepour évaluer les relations entre des protéines issues desources différentes.

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Page 51: Méthodes de Diagnostic microbiologique

• Agglutination

• L'agglutination est une réaction entre unantigène et un anticorps spécifique qui formeun agglutinat visible. Simples d’utilisation, trèsspécifiques, peu coûteux, rapides etrelativement sensibles, ces tests sontlargement utilisés en laboratoire de diagnosticclinique et biologique

Page 52: Méthodes de Diagnostic microbiologique

• l'agglutination directe

• L’agglutination directe est le résultat del'interaction d'un anticorps soluble avec unantigène de surface cellulaire ou une autreparticule insoluble. On utilise ces réactionspour la classification des antigènes de surfacedes bactéries et des globules rouges(érythrocytes).

Page 53: Méthodes de Diagnostic microbiologique

• L'agglutination passive• L'agglutination passive est l'agglutination

d'antigènes ou d’anticorps solubles, adsorbés oucouplés chimiquement soit à des cellules, soit àdes billes de latex ou à des particules de charbon.La cellule ou la particule se définit dans ce cascomme un porteur inerte.

• Les réactions d'agglutination passive ont unesensibilité pouvant être jusqu'à cinq foissupérieure à celle des tests d'agglutinationdirecte.

Page 54: Méthodes de Diagnostic microbiologique

• L'identification de souches cliniques de Staphylococcus aureuspar agglutination avec une spécificité proche de 100 % en estun exemple; le test est réalisé en seulement trente secondes.

• D'autres tests d'agglutination de billes de latex permettentl'identification de différents streptocoques B-hémolytiques dugroupe A de Lancefield (Streptococcus pyogenes), B, C, D, F etG Neisseria gonorrhoeae et Neisseria menigitidis,Haemophilus influenza, Escherichiacoli 0157:117, des virusresponsables de gastroentérites (rotavirus, adénovirus) et leschampignons Cryptococcus neoformans et Candida albicans.

• La sensibilité et la spécificité des tests d'agglutination passivesont souvent élevées. Aucun équipement coûteux ni decompétence particulière ne sont nécessaires pour leur miseen œuvre, ce qui en fait des tests adaptés aux programmes dedépistage à grande échelle, utilisés largement en diagnosticclinique et en recherche.

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Anticorps fluorescents

• Des marqueurs fluorescents peuvent modifier les anticorpschimiquement pour la détection d'antigènes à la surfacecellulaire.

• Les techniques de fluorescence• Des marqueurs fluorescents peuvent être liés de façon

covalente à des anticorps : la rhodamine B, qui fluoresce enrouge, l'isothiocyanate de fluorescéine, qui fluoresce enjaune-vert.

• Ce marquage ne modifie pas la spécificité de l'anticorps,mais permet la lecture avec un microscope à fluorescence.Les anticorps fluorescents liés à une cellule émetttent unefluorescence lorsqu'ils sont excités par une lumière delongueur d'onde définie. La lumière fluorescente émise estle plus souvent rouge-orange ou jaune –vert en fonction dumarqueur utilisé

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• Ces anticorps fluorescents permettent l'identificationde micro-organismes directement dans lesprélèvements pathologiques (in situ), sans passer pardes techniques d'isolement et de culture. On parle demarquage fluorescent direct ou indirect.

• Dans la technique directe, l'anticorps, dirigé contrel'antigène de surface, est lié de façon covalente aumarqueur fluorescent.

• Dans la technique indirecte, la présence d'un anticorpsnon fluorescent à la surface cellulaire est détectée parun anticorps fluorescent dirigé contre l'anticorps nonfluorescent.

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Marquage direct Marquage indirect

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• Les applications

• le diagnostic de légionellose est mis en œuvre parmarquage du tissu pulmonaire avec des anticorps fluorescentsspécifiques des antigènes de paroi de Legionellapneumophila.

• un antigène de capsule de Bacillus anthracis confirme lediagnostic d'anthrax.

• L’infection par Bordetella pertussis, agent de la coqueluche.

• Les tests de fluorescence directe sont aussi utilisés dans lediagnostic d'infections virales identifiés au sein deprélèvements avec des anticorps spécifiques parimmunofluorescence directe.

• L'utilisation des techniques à base d'anticorps fluorescentsn'est cependant pas dénuée de pièges, comme desmarquages non spécifiques lors de réactions croisées entreantigènes de surface de diverses espèces bactériennes,

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Tests immunoenzymatique (ELISA) et dosages radio-immunologiques (RIA)

• Les tests immunologiques utilisés en diagnosticdoivent avoir une forte sensibilité et donc lacapacité de détecter de très faibles quantités decomplexes antigène-anticorps. Par leur fortesensibilité, les tests ELISA (enzyme-linkedimmunosorbent assay) et RIA(radioimmunoassay) sont largement utilisés.

• Dans ces tests, des enzymes et des radio-isotopesmarquent respectivement les anticorps. Lafixation covalente de ces molécules sur lesanticorps diminue la quantité de complexesantigène-anticorps requise pour être détectés.

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Les tests ELISA

• La liaison covalente enzyme-anticorps utilisée dansles tests ELISA n'altère ni l'activité catalytique del'enzyme ni la spécificité de l'anticorps.Généralement ces enzymes sont la peroxydase, laphosphatase alcaline et la B-galactosidase.

• Chacune catalyse des réactions produisant dessubstances colorées qui sont détectées à des tauxtrès faibles par un spectrophotomètre. Ces testsimmunologiques sont fortement spécifiques etsurtout sensibles.

• La méthode ELISA directe détecte des antigènes, etla méthode ELISA indirecte détecte des anticorps.

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• Des procédés ELISA rapides utilisent des réactifs adsorbés surun support matériel comme des bandelettes de papier, desmembranes plastiques ou de nitrocellulose, ou des bâtonnetsen plastique (dipstick).

• Une réaction colorée apparaît sur ces supports en un tempstrès court.

• Ces tests rapides servent au diagnostic d'urgence de maladiesinfectieuses comme l'infection par le VIH ou l'anginestreptococcique.

• Ces tests ont l'intérêt de ne pas nécessiter de compétencestechniques pour être mis en œuvre.

• Les résultats sont alors obtenus in situ, limitant les délais deprise en charge du patient. L'inconvénient de ces tests est leurmoindre spécificité par rapport aux tests plus élabores. Aussices tests doivent-ils le plus souvent être confirmés par unetechnique standard.

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Test Eliza direct

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• Les tests ELISA VIH• Des outils de criblage sensibles, spécifiques, rapides et peu

coûteux sont requis pour tester des sérums d'individusexposés au VIH ou pour s'assurer de l'absence de risque detransmission du VIH lors d'une transfusion sanguine ou deproduits sanguins.

• Ces tests sont des ELISA indirects recherchant des anticorpsanti-VIH dans le sérum.

• Une réaction positive indique que les anticorps présentsdans le sérum du patient reconnaissent les antigènes VIH.Des sérums contrôles (VIH positif et négatif) sont inclus enparallèle du sérum du patient pour établir la spécificité.

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Test Eliza indirect: recherche d’anticorps anti-VIH

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• Le test ELISA VIH est une technique rapide, trèssensible, spécifique pour la recherche d'une expositionau VIH.

• Les tests ELISA conviennent au dépistage en série etsont facilement automatisables. Dans certainesconditions, ce test peut néanmoins donner desrésultats faussement positifs qu'une techniquedifférente doit confirmer, le plus souvent unetechnique de Western blot (ou immunoblot). Unetechnique Western blot VIH positive associée à unELISA VIH positif est la preuve d'une infection par leVIH.

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• Les autres tests ELISA d'importance clinique

• Des centaines de tests ELISA sont utilisés en clinique.

• Des ELISA directs détectent des toxines bactériennes (toxine cholérique,d'Escherichia coli entéropathogènes et de Staphylococcus aureus), desvirus (rotavirus, virus des hépatites, de la rubéole, de la rougeole, desoreillons et les parainfluenza).

• Des tests ELISA indirects détectent des anticorps sériques antibactériens :Salmonella, Yersinia, Brucella, rickettsies, Vibrio cholerae, Mycobacteriumtuberculosis, Mycobacterium leprae , Legionella pneumophila, Borreliaburgdorferi et Treponema pallidum .

• Et aussi pour la détection de levures (Candida) et de divers parasitesagents

• les tests ELISA sont largement utilisésen raison de la rapidité de leur miseen œuvre, de leur faible coût, d'absence de déchets radioactifs et de leurlongue durée de conservation.

• La forte sensibilité de ces tests en fait un important outil immuno-diagnostique.

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• les analyses radio-immunologiques (RIA)• La technique de RIA utilise des isotopes radioactifs comme conjugués

d'anticorps ou d'antigènes, et non des enzymes comme pour les testsELISA.

• L'isotope iode 125 (125 I) est souvent utilisé, le marquage se faisant eneffet sans modification de la spécificité des anticorps ou des antigènes.

• Les tests RIA mesurent des quantités très faibles de protéines sériquestelles que l'hormone de croissance,

• Le RIA est aussi sensible que l'ELISA et une mise en œuvre rapide.• L'équipement pour la détection de la radioactivité est néanmoins

spécialisé et cher. Des quantités importantes de déchets radioactifs sontengendrées, et la décroissance de la radioactivité (demi-vie) des radio-isotopes restreint les dates limites d'utilisation des trousses de réactifs.

• Ainsi les tests RIA sont utilisés seulement quand les tests ELISA ne sont passuffisamment adaptés ou sensibles. Le RIA est préféré à l'ELISA pour laquantification de protéines sériques, certains composants du séruminhibant certains substrats enzymatiques des ELISA ou des interactionsantigène-anticorps.

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• Procédés d'immunoblot• Les techniques d'immunoblot utilisent des anticorps pour

l'identification discriminante de protéines spécifiques decertains pathogènes, même dans des mélangescomplexes comme le sang ou les lysats cellulaires.

• Trois techniques sont utilisées :• l) séparation des protéines sur gel de polyacrylamide ;• 2) transfert des protéines du gel sur une membrane de

nitrocellulose ou de nylon ;• 3) identification des protéines par des anticorps

spécifiques.• L'association des deux dernières étapes correspond à la

technique de western blot (protéines), distincte de celledu Southern blot (ADN) ou du northern blot (ARN).

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• Lors de la première étape de l'immunoblot, unmélange de protéines est soumis à uneélectrophorèse sur gel de polyacrylamide. Lesprotéines sont alors séparées en bandesdistinctes, chacune représentant une seuleprotéine d'un poids moléculaire donné .

• Les protéines sont transférées sur unemembrane. Les anticorps dirigés contre certainscomposants du pathogène sont alors ajoutés. Laradioactivité est détectée après exposition de lamembrane à un film d'autoradiographie.

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Western blot ou Immunoblot

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• L'identification d'une protéine d'un pathogènedonné est alors possible en comparant laposition des bandes colorées respectives del'échantillon et du contrôle.

• Les techniques d'immunoblot détectent soitdes antigènes (mise en évidence directe dupathogène)

• ou des anticorps (mise en évidence indirected'une exposition au pathogène).

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C- Méthodes de diagnostic moléculaires

• Des techniques moléculaires extrêmementsensibles, sont disponibles et largementutilisées pour la détection de pathogènes.

• Elles ne dépendent pas de la détection de laréponse immune dirigée contre le pathogène,ni de l'isolement ou de la croissance dupathogène,

• méthodes souvent difficiles à réaliser.

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• Les techniques moléculaires utilisent les caractèresgénotypiques plutôt que phénotypiques pourl'identification de pathogènes. L'intérêt desméthodes de diagnostic génétique ou de détectiondes acides nucléiques réside en différents points :

• 1)les acides nucléiques peuvent être aisément isolésde tissus infectieux ;

• 2) il est possible de les visualiser et de les quantifier ;

• 3) la séquence nucléotidique du génome d'unpathogène est unique, ainsi son analyse conduit aveccertitude à son identification;

• 4) les séquences peuvent être amplifiées pouraugmenter la quantité de matériel disponible pourl'analyse.

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• Les diagnostics utilisant des sondes nucléiques

• Un des plus puissants outils analytiques disponibles pour lesmicrobiologistes médicaux est l'hybridation d'acidesnucléiques.

• Au lieu de détecter un organisme complet ou ses produits,l'hybridation détecte la présence de séquences ADNspécifiques d'un organisme donné.

• Les sondes d'acides nucléiques correspondent généralementà de l'ADN simple brin complémentaire d'une séquenceunique d'un gène d‘interêt.

• Si un micro-organisme présent dans un échantillon cliniquecontient des séquences ADN ou ARN complémentaires de lasonde, la séquence de la sonde peut s'hybrider formant ainsiune molécule double brin, (après préparation appropriée del'échantillon pour l'obtention de l'ADN simple brin du micro-organisme )

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• La sonde est marquée par une molécule traçante(isotope radioactif, enzyme ou composé fluorescentpermettant la détection de son hybridation à une cibledonnée.

• Les sondes d'acides nucléiques présentent différentsavantages par rapport aux immunoanalyses.

• Les acides nucléiques sont plus stables que les protéinesà de fortes températures et à des pH élevés, et sont plusrésistants aux solvants organiques et autres produitschimiques.

• Par cette relative stabilité chimique, les techniquesutilisant des sondes nucléotidiques peuvent identifier desorganismes qui ne sont plus vivants.

• Certaines sondes nucléiques sont plus spécifiques que lesanticorps et détectent des différences d'un seulnucléotide entre deux séquences d'ADN.

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• Les sondes utilisées en laboratoire de diagnostic clinique

• Dans la plupart des cas, les cultures sur boîtes de Pétri ou lesfragments de tissus infectés sont traités avec des produitsalcalins puissants, pour lyser les cellules et dénaturerpartiellement l'ADN afin d'obtenir des molécules simple brin.Le mélange est apposé sur une matrice (bâtonnet filtre) oulaissé en solution, puis marqué par une sonde.

• L'hybridation est menée à une température permettant laformation d'un complexe stable entre les séquenceshomologues de l'ADN cible et de l'ADN de la sonde.

• Un lavage élimine les sondes non hybridées, l'hybridationétant quantifiée grâce à la molécule marquée liée à la sonde(mesure de radioactivité, d'activité enzymatique ou defluorescence, selon le marqueur).

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• Des sondes nucléotidiques sont commercialiséespour l'identification de micro-organismespathogènes majeurs comme Neisseriagonorrhoeae, Chlamydia trachomatis etMycobacterium tuberculosis.

• En plus de leur utilisation en diagnostic clinique,les sondes moléculaires ont des applications dansle domaine de l'industrie alimentaire ainsi quedans les organismes de contrôle de la nourriture :recherche de pathogènes tels que Salmonella ouStaphylococcus

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Les diagnostics moléculaires utilisant la PCR (polymerase chain reaction)

• Des oligonucléotides spécifiques et de très courte séquence(généralement de quinze à vingt-quatre nucléotides) serventd'amorces pour l'amplification par PCR de l'ADN depathogènes donnés. La PCR amplifie l'ADN environ un milliardde fois. En théorie, elle permet la visualisation d'une seulemolécule d'ADN issue d'une seule cellule bactérienne.

• Par exemple, les amorces dont les séquences sont spécifiquesd'un gène d'un micro-organisme donné peuvent servir àtester l'ADN issu de tissus potentiellement infectés, même sice micro-organisme ne peut être ni visualisé ni cultivé.

• Ces méthodes ont un intérêt majeur pour l'identificationd'infections virales et intracellulaires.

• Actuellement, de nombreux tests sont des PCR en temps réel.Cette technique nécessite l'utilisation d'amorces marquéespar des fluorochromes.

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• Les automates de PCR en temps réel ont des systèmesoptiques de précision qui suivent, à chaque cycle,l'incorporation d'amorces ou de sondes marquées dansles produits de PCR. Une courbe d'amplificationpermet de visualiser en temps réel cette incorporation,ce qui permet de s'affranchir des étapes de détectioncomme l'électrophorèse.

• La technique de RT-PCR (Reverse-Transcriptase PCR)permet par exemple de suivre l'évolution de l'infectionpar le VIH. Cette méthode inclut une étape préalablede production d'ADNc directement à partir de l'extraitd'ARN de l'échantillon à analyser.

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• Diagnostic virologique

• l'identification et le diagnostic des infections viralesest différent de celle des infections bactériennes.

• Les virus sont tous des parasites intracellulairesobligatoires, ne peuvent pas être directement cultivéssur des milieux artificiels, mais doivent croître dans descellules de mammifères.

• La microscopie permet l'observation directe des virusou de leur effet cytopathique ; divers tests in vitro,directs ou indirects, sont disponibles pourl'identification des virus pathogènes.

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• La croissance des virus in vitro• la culture des virus à partir de prélèvements cliniques est

plus difficile, plus longue et plus spécialisée que la culturede la plupart des bactéries pathogènes.

• Les cultures cellulaires utilisés pour la croissance des virussont des lignées cellulaires humaines à durée de vie longue(cellules immortalisées), croissant rapidement et se divisantindéfiniment dans les milieux de culture cellulaire.

• Les virus peuvent aussi se répliquer sur des cellules de reinde singe Rhésus. Ce sont des cellules primaires qui meurentaprès un nombre limité de divisions cellulaires et nepeuvent être maintenues indéfiniment en laboratoire. Ellessupportent la croissance de nombreux virus pathogènes etreprésentent un intérêt majeur pour l'isolement initial devirus inconnus (15 à 30 % d'infections respiratoires aiguësn'ont pas d'étiologie connue).

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• La microscopie électronique

• Le diagnostic virologique peut aussi être fait par microscopie électronique. Les virus présentent des caractéristiques morphologiques différentes visualisées en microscopie électronique à partir d'échantillons cliniques .

• Des méthodes de centrifugation et filtration doivent préalablement concentrer et séparer les particules virales des tissus humains.

• Bien que moins fiable que les méthodes immunologiques ou de sondage nucléique, l'observation de particules virales d'une morphologie spécifique dans un tissu humain donné est prédictive d'une infection.

• Des anticorps spécifiques de virus peuvent être utilisés pour augmenter la sensibilité et la spécificité de la technique : des anticorps agglutinants permettent l'agrégation des particules virales, qui sont alors plus facilement différenciées des débris cellulaires.

• Des anticorps conjugués à des métaux lourds favorisent aussi la visualisation des virus en microscopie électronique.

• L'utilisation de la microscopie électronique est néanmoins limitée par le coût et la complexité du microscope.

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• Les autres tests de diagnostic virologique

• Dans la plupart des cas, le diagnosticvirologique repose sur des testsd'immunoanalyse ou des techniquesd'hybridation d'acides nucléiques. Des testsELISA directs détectent des particules virales,des anticorps immunofluorescents spécifiquesd'antigènes viraux détectent des cellulesinfectées.

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