Rapport Tfe 7285 Artaud Clement 2014

7/26/2019 Rapport Tfe 7285 Artaud Clement 2014

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Option : Bio Ingnierie et Nanotechnologies

Mtier : Ingnieur Business Development

Tuteur ECL : Virginie Monnier

Tuteur Entreprise : Jean-Sbastien Thomann

cole Centrale de Lyon

TFE 2014

Centre de Recherche Public Gabriel Lippmann

Belvaux, Luxembourg

Rapport Final de Travail de Fin dtudes

Fabrication of hybrid organic-inorganic nanoparticles for

encapsulation and stability studies

ARTAUD Clment


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Fabrication of hybrid organic-inorganic nanoparticles for encapsulation and stability studies

ARTAUD Clment, TFE 2014 Page | 2


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RemerciementsJe remercie chaleureusement mon tuteur Jean-Sbastien Thomann, chef de file au sein dUGN de

la thmatique Nano4Med dans laquelle sinscrit ce projet, pour son management clair et toute

la pdagogie dont il a su faire preuve au long du stage.

Je remercie de mme Galle Corne, tudiante en thse sous la direction de Jean-SbastienThomann, pour tout le temps et laide prcieuse quelle a pu maccorder, sans qui les dbuts du

projet auraient t beaucoup plus fastidieux.

Merci galement au directeur dquipe, Damien Lenoble, pour son coute et sa comprhension.

Un grand merci lensemble de lquipe UGN et leurs doctorants pour leurs conseils et leur

disponibilit tout au long de ce stage. Je les remercie galement pour leur accueil chaleureux mon

gard et les bons moments de dtente partags autour dun caf.

Je remercie enfin ma fiance qui ma suivi et soutenu sans faillir pendant ces 6 mois.


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RsumCe rapport dtaille les avances de 6 mois de travail de recherche sur la synthse et la

fonctionnalisation de nanoparticules doxyde de fer ferromagntique et biocompatibles afin de

vectoriser le traitement spcifique du glioblastome multiforme. Ce travail se prsente sous deux

objectifs : crer un vecteur superparamagntique de plus de 5nm pour le marquage spcifique duglioblastome et sa rvlation sous IRM, et explorer un procd de fabrication de vecteurs poreux et

ferromagntiques de moins de 100nm pour lencapsulation de principes actifs anticancreux.

Des nanoparticules de magntite superparamagntiques hydrophobes de 9nm ont ainsi t

fabriques avec succs en utilisant un procd de coprcipitation bien dtaill dans la littrature.

Ces particules ont t fonctionnalises pour les rendre hydrophiles et biocompatibles en greffant

des PEGs leur surface. Ces PEG ont leur tour t utiliss comme site de liaison pour coupler un

anticorps de marquage du glioblastome, le Cetuximab. Des conclusions ont t tires quant la

qualit de ce couplage et loptimisation quil peut en tre faite pour amliorer le produit.

Les vecteurs msoporeux de maghmite ont t synthtiss suivant un mme protocole, issu de

la synthse de silice msoporeuse dcrite dans la littrature, en tudiant linfluence de la ractivit

du prcurseur, du temps, et des conditions de traitement des particules sur leur structure poreuse.

Les mcanismes ractionnels ont t partiellement tablis, ainsi que le procd permettant

datteindre la structure la plus poreuse.

Les produits de synthse ont tous t analyss en utilisant la microscopie lectronique en

transmission et balayage, la diffraction des rayons X et la diffusion dynamique de la lumire.

Mots cls : Nanomdecine, Glioblastome Multiforme, Anticorps, Cetuximab, Nanoparticule,

Magntite, Maghmite, Oxyde de fer, Superparamagntisme, Ferromagntisme, Msopores, PEG


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AbstractThis report presents the results of a 6 months work of research about the diagnosis and therapy

of multiform gliomas by the mean of functionalized ferromagnetic iron oxide nanoparticles. Two

aspects where analyzed: the proper synthesis of a superparamagnetic nanoparticle for the targeting

and observation of gliomas tumor under MRI, and the study of the fabrication of a porousnanoparticle for use in drug delivery.

The superparamagnetic particles were synthetized with success, and were made of magnetite

with a size of 9nm. Their functionalization went through the addition of PEG on the surface, to

provide biocompatibility. The targeting functions were added by the grafting of a specific antibody

for gliomas, the Cetuximab. Some conclusions and perspectives of optimization are discussed.

The synthesis of mesoporous maghemite nanoparticles was achieved on the basis of the

knowledge about the mesoporous silica synthsis. Time, Reactivity of the precursor and post

treatment were analyzed as the main parameters involved, and the mechanism of reaction was

partially explained. A process to achieve a good porosity was then set.

Particles were analyzed using the classical transmission electron microscopy, scanning electron

microscopy, X-ray diffraction and dynamic light scattering.

Keywords: Nanomedicine, Multiform glioma, Antibody, Cetuximab, Nanoparticle, Magnetite,

Maghemite, Iron oxide, Superparamagnetism, Ferromagnetism, Mesopores, PEG


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GlossaireAPTES : (3-Aminopropyl)triethoxysilane

BET : Thorie Brunauer, Emmett et Teller

CTACl : Cetyltrimethylammonium chlorideDLS : Diffusion lastique de la lumire

DRX : Diffraction des rayons X

IRM : Imagerie par rsonnance magntique

MEB : Microscopie lectronique balayage

MET : Microscopie lectronique en transmission

PEG : Polythylne glycol

TEA : Trithanolamine

TEOS : Orthosilicate de ttrathyle

TOPO : Trioctylphosphine oxide

UGN : Unit du Gnie des Nanomatriaux


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Table des matiresREMERCIEMENTS ....................................................................................................................................... 3

RESUME ..................................................................................................................................................... 4

ABSTRACT .................................................................................................................................................. 5GLOSSAIRE ................................................................................................................................................. 6

TABLE DES MATIERES ................................................................................................................................. 7

TABLE DES ILLUSTRATIONS ......................................................................................................................... 8

INTRODUCTION ........................................................................................................................................ 11

1. UN PROJET DE RECHERCHE ACTIF : LE TRAITEMENT DU GLIOBLASTOME .............................................. 13

1.1.UGNET SES PARTENAIRES .......................................................................................................................... 13

1.2.LA MALADIE ET LES MECANISMES DACTIONS .................................................................................................. 13

1.3.AXES DE DEVELOPPEMENT DU PROJET ........................................................................................................... 14

1.4.CAHIER DES CHARGES DU PROJET .................................................................................................................. 15

2. ETAT DE LART DES DISPOSITIFS NANOPARTICULAIRES DOXYDE DE FER .............................................. 17

2.1.SYNTHESE DE NANOCRISTAUX ...................................................................................................................... 17

2.1.1. Coprcipitation ....................................................................................................................... 17

2.1.2. Synthse haute temprature ............................................................................................... 18

2.1.3. Synthses haut rendement .................................................................................................. 19

2.2.FONCTIONNALISATION DES PARTICULES ......................................................................................................... 20

2.2.1. Traitement de surface ............................................................................................................ 20

2.2.2. Structuration pour lencapsulation de mdicaments ............................................................. 23

2.3.CONCLUSION ........................................................................................................................................... 26

3. PRODUCTION DES AGENTS DE CONTRASTE .......................................................................................... 27

3.1.SYNTHESE PAR COPRECIPITATION.................................................................................................................. 27

3.2.FONCTIONNALISATION PAR LAPTES ............................................................................................................ 283.3.INTRODUCTION DES PEG ............................................................................................................................ 30

3.4.GREFFAGE DU CETUXIMAB .......................................................................................................................... 31

3.5.CONCLUSION ........................................................................................................................................... 32

4. PRODUCTION DE PARTICULES POREUSES DOXYDE DE FER................................................................... 33

4.1.ADAPTATION DES PROCEDES DE SYNTHESE ..................................................................................................... 33

4.2.RESULTATS GENERAUX ............................................................................................................................... 36

4.3.INFLUENCE DE LA REACTIVITE ET DU TEMPS ..................................................................................................... 37

4.4.MECANISME REACTIONNEL REEL PROPOSE ..................................................................................................... 40

4.5.INCORPORATION DE SILICE .......................................................................................................................... 41

4.6.LA CALCINATION POUR ACCROITRE LES PROPRIETES MAGNETIQUES ...................................................................... 43

4.7.CONCLUSION ........................................................................................................................................... 45

CONCLUSION ............................................................................................................................................ 47

BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................................ 48

ANNEXE : MAGNETISME DANS LES OXYDES DE FER .................................................................................. 50


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Table des illustrationsFIGURE 1:EVOLUTION DU NOMBRE DE PUBLICATIONS CONTENANT LE MOT-CLE :"NANOMEDICINE"(DONNEES SCOPUS) ............ 11

FIGURE 2:STRUCTURE DE LA BARRIERE HEMATOENCEPHALIQUE ......................................................................................... 14

FIGURE 3:IMAGE METDE NANOPARTICULES DE MAGNETITE COPRECIPITEES (EXTRAIT DE8).ON REMARQUE LA DISPARITE DE FORME

ET DE TAILLE DES PARTICULES ............................................................................................................................... 18

FIGURE 4:IMAGE METDE PARTICULES ISSUES DE LA DECOMPOSITION THERMIQUE (EXTRAIT DE 11) .......................................... 19

FIGURE 5:POLYETHYLENE GLYCOL ............................................................................................................................... 20

FIGURE 6:MECANISME DE SEQUESTRATION DES NANOPARTICULES.A:SANS PEG,LA PARTICULE EST CAPTEE PAR LES MACROPHAGES

ET ELIMINEE.B:AVEC UNE COUCHE DE PEG LA PARTICULE A MOINS D'AFFINITE AVEC LES OPSONINES,ET EST DONC MOINS

SUSCEPTIBLE D'ETRE ELIMINEE (EXTRAIT DE13

) ........................................................................................................ 21

FIGURE 7:REACTION D'HYDROLYSE ET DE CONDENSATION DU SILANE FONCTIONNEL.RDESIGNE LE GROUPE FONCTIONNEL (EXTRAIT DE11

) ................................................................................................................................................................. 21

FIGURE 8:STRUCTURE D'UN ANTICORPS ET GROUPES FONCTIONNELS ACCESSIBLES,ESSENTIELLEMENT AMINES ET CARBOHYDRATES.FC

DESIGNE LE FRAGMENT CONSTANT,SITE PREFERENTIEL DE MODIFICATION DE LANTICORPS............................................... 22

FIGURE 9:(A)PROCESSUS DE FABRICATION DE LA NANOPARTICULE SUR LE MOULE EN POLYSTYRENE .(B)NANOPARTICULE CREUSE

APRES CALCINATION (EXTRAIT DE14

) ..................................................................................................................... 23FIGURE 10:MECANISME DE RESTRUCTURATION DE LA PARTICULE PAR L'EFFET KIRKENDALL (EXTRAIT DE

15) .............. ............... ... 24

FIGURE 11:IMAGE METDES NANOPARTICULES CREUSEES APRES RECUIT.LA BARRE D'ECHELLE REPRESENTE 10NM..................... 24

FIGURE 12 : MECANISME DE FORMATION D'UNE STRUCTURE MESOPOREUSE DE MAGNETITE SUR LES MICELLES DE POLYMERE

AMPHIPHILE (EXTRAIT DE17

) ................................................................................................................................ 25

FIGURE 13 : IMAGE MET DES NANOPARTICULES MESOPOREUSES. LA STRUCTURE DES JOINTS DE GRAINS EST PARTICULIEREMENT

VISIBLE,SIGNE DUNE IMPORTANTE POROSITE (EXTRAIT DE18

) .................................................................................... 25

FIGURE 14:NANOPARTICULES DE SILICE MESOPOREUSE.LE CONTRASTE DU AUX PORES EST BIEN VISIBLE DANS LES PARTICULES...... 26

FIGURE 15:IMAGE METDES NANOPARTICULES SYNTHETISEES PAR COPRECIPITATION.LE GRAPHE MONTRE LA DISPERSION DE TAILLES

DES PARTICULES,CALCULEE A PARTIR DES IMAGES MET ............................................................................................ 27

FIGURE 16:SPECTRE DRXDES PARTICULES.LES PICS INDEXES CORRESPONDENT A DES PLANS CRISTALLINS DE LA MAGNETITE, SAUF

MENTION SPECIFIQUE POUR LE PIC 104CORRESPONDANT A L'HEMATITE.LE SPECTRE EST LISSE POUR PLUS DE LISIBILITE........ 28

FIGURE 17:L'APTES................................................................................................................................................. 28

FIGURE 18 : SPECTRE DLS DES PARTICULES COUVERTES D'APTES. LE MILIEU EST LEGEREMENT ACIDIFIE, ET DES EPANCHEMENTS

DAGREGATION SONT VISIBLES A 70NM ET 120NM.LE RAYON HYDRODYNAMIQUE MOYEN EST DE 56NM +/-30NM............ 29

FIGURE 19:SPECTRE DLSDES NANOPARTICULES PEGYLEES .............................................................................................. 30

FIGURE 20:LE SULFO-SMCC ..................................................................................................................................... 31

FIGURE 21 : (A) PROFIL D'ELUTION DES ANTICORPS SUVI PAR SPECTROMETRIE DE FLUORESCENCE (RHODAMINE, EXCITATION A

540NM,EMISSION A 590NM).(B)PHOTO DES COLONNES CHARGEES EN RHODAMINE RESIDUELLE................................... 31

FIGURE 22:ETHOXYDE DE FER ..................................................................................................................................... 33

FIGURE 23:FERRATRANE ........................................................................................................................................... 33

FIGURE 24 :DIAGRAMME DE STABILITE DES HYDROXYDES DE FER SELON LE PH.AU PH12, LE FER EST PRESENT SOUS UNE FORME

ANIONIQUE (EXTRAIT DE 23)................................................................................................................................. 33

FIGURE 25 : PARTICULES DANS L'EAU APRES DIALYSE. UNE FLOCULATION TYPIQUE DE L'OXYHYDROXYDE DE FER EST CLAIREMENTOBSERVEE ........................................................................................................................................................ 36

FIGURE 26:IMAGE MEBDE PARTICULES ENGLUEES DANS LE SURFACTANT RESIDUEL.ELLES SONT INUTILISABLES EN L'ETAT............ 36

FIGURE 27 : IMAGES MET DES PRODUITS SYNTHETISEES SELON LES DIFFERENTES METHODES DINJECTION DU PRECURSEUR, DANS

LORDRE CROISSANT DE REACTIVITE.LES IMAGES DU BAS SONT DES MAGNIFICATIONS DES PREMIERES IMAGES. .................... 37

FIGURE 28:IMAGES METDES PRODUITS DE SYNTHESE DE L'INJECTION SOLIDE APRES 2H OU 16H DE REACTION.LES IMAGES DU BAS

CARACTERISENT L'ETAT DES NOYAUX CRISTALLINS ISOLES,PLUS PETITS APRES UN TEMPS DE REACTION PLUS LONG............... .. 39

FIGURE 29:IMAGE METDUNE PARTICULE D'OXYDE DE FER RECOUVERTE DE SILICE ............................................................... 41

FIGURE 30:IMAGE METDE NOYAUX DOXYDE DE FER ENROBES DE SILICE ............................................................................ 42


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FIGURE 31 : IMAGE MET DE L'INTERFACE SILICE-OXYDE DE FER. LES INTERFERENCES DU RESEAU CRISTALLIN SE DISTINGUENT

PARTICULIEREMENT BIEN .................................................................................................................................... 42

FIGURE 32: IMAGE MEBDE PARTICULES CALCINEES A 500C.LES PARTICULES ONT FONDU ET SE SONT COLLEES SOUS L 'EFFET DU

RECUIT ............................................................................................................................................................ 43

FIGURE 33 : SPECTRE DRX DES PARTICULES CALCINEES, METTANT EN EVIDENCE UNE PHASE MAGHEMITE (NOTEE M) ET HEMATITE

(NOTEE H) ....................................................................................................................................................... 44

FIGURE 34:NANOCRISTAUX RESIDUELS APRES CALCINATION DANS L'ETHYLENE GLYCOL A 200C .............................................. 44FIGURE 35:STRUCTURE CRISTALLINE D'UN SPINELLE ........................................................................................................ 50


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IntroductionLe glioblastome multiforme est la forme la plus frquente et agressive de tumeurs malignes du

cerveau chez lhomme. Ces tumeurs sont extrmement invasives et ressurgissent au mieux quelques

mois aprs traitement. Il reprsente ainsi la principale cause de dcs par cancer chez les personnes

de moins de 35 ans. 1

Lapparition dun tel cancer est spontane, et peut tre associe lvolution vers un grade pluslev dune tumeur bnigne du cerveau. La difficult de dtection du glioblastome, par son

caractre multiforme et son origine sporadique, impliquent rapidement la mise en cause du

pronostic vital du patient.

Les tumeurs infiltrent rapidement et facilement les tissus sains, et les traitements classiques que

sont la chirurgie, la radiothrapie et la chimiothrapie ne suffisent pas les liminer. Par ailleurs la

nature mme de lorgane touch, le cerveau, laisse peu de flexibilit aux mdecins : il faut prserver

un maximum de tissus sains et viter les effets secondaires, au risque de ne pas liminer totalement

la tumeur. De ce fait les rsurgences aprs quelques mois sont invitables, et les traitements ne

prolongent la dure de vie dun patient que de 7 mois en moyenne. 2

Les dernires avances en matire de nanotechnologies laissent ainsi entrevoir de nouvelles

perspectives : couples une comprhension toujours plus prcise des mcanismes biologiques, ces

nouvelles technologies font dj lobjet de recherches et ouvrent la voie vers une nouvelle

mdecine, fonde sur le traitement extrmement slectif et efficace des pathologies. Cet essor se

traduit notamment par lintrt croissant que portent les chercheurs aux possibilits mdicales

offertes par les nanotechnologies (voir Figure 1).

Figure 1 : Evolution du nombre de publications contenant le mot-cl : "nanomedicine" (donnes SCOPUS)


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Parmi ces dispositifs le plus simple envisager dans une utilisation mdicale est la nanoparticule.

De taille comparable un virus, elle est facile injecter dans lorganisme et ne ncessite pas

dintervention chirurgicale invasive. Par ailleurs le choix des matriaux et leurs structures

permettent de nombreuses applications. On dnombre ainsi lutilisation en tant quagent de

contraste en imagerie mdicale, la vectorisation de mdicaments vers les tumeurs, ou encore le

traitement par hyperthermie localise. Ces effets recherchs sont grandement favoriss par des

phnomnes passifs daccumulation dans les tumeurs, quil est possible daccentuer en

fonctionnalisant la surface des particules. Elles deviennent alors des vecteurs capables de cibler avec

une grande spcificit un type de cellules tumorales donn, accroissant ainsi lefficacit des

diagnostics et des traitements. 3

Lobjectif du travail expos ici est ainsi de produire une nanoparticule superparamagntique

capable dtre utilise comme agent de contraste rvlateur du glioblastome en IRM. Cette particule

est synthtise et fonctionnalise selon des mthodes connues.

Une seconde dmarche de recherche est mene en parallle afin de dvelopper un procd de

fabrication et de structuration dun tout nouveau type de vecteur poreux et magntique pour

encapsuler des principes actifs et les dlivrer aux cellules tumorales.


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1.Un projet de recherche actif : le traitement duglioblastome

1.1.UGN et ses partenairesLe projet est un projet de recherche men au sein de lquipe UGN (Unit du Gnie des

Nanomatriaux) du Centre de Recherche Public Gabriel Lippmann, au Luxembourg. Cette quipe fait

force dexprience dans la conception de nanomatriaux fonctionnels, et constitue ainsi un

important atout pour le dveloppement de nouveaux processus de fabrications. De plus

lenvironnement restreint du projet est centr sur les thmatiques de la nanomdecine, et apporte

tout le savoir ncessaire pour la bonne comprhension des contraintes et des enjeux de la

production des nanoparticules. Ce projet sinscrit ainsi dans la progression logique de lquipe sur

ces thmatiques.

Le laboratoire met disposition les outils danalyse standards pour un tel projet, savoir un

microscope lectronique transmission (MET), un microscope lectronique balayage (MEB), un

appareil de diffraction des rayons X (DRX), un appareil de mesure de diffusion dynamique de la

lumire (DLS) ainsi que tout le matriel ncessaire la synthse des particules.

1.2.La maladie et les mcanismes dactionsLe glioblastome multiforme est une tumeur particulirement invasive qui a la particularit de

ncroser les tissus infiltrs. Les dommages causs sont irrversibles et se traduisent

symptomatiquement par des pertes de mmoire et de motricit. Malheureusement ces symptmes

apparaissent trs tardivement et il est souvent trop tard pour traiter correctement la tumeur.

En plus dtre situ dans un organe difficilement oprable, le glioblastome bnficie de la

protection de la barrire hmatoencphalique, rendant peu efficaces la plupart des traitements.

Cette barrire constitue lendothlium le plus slectif de lorganisme. Elle est compose dun

empilement de cellules lies de manire compacte. La Figure 2 montre lorganisation cellulaire de la

barrire hmatoencphalique.

Les cellules endothliales constituent la premire ligne de contrle de cette barrire. Les

jonctions serres qui les lient ne permettent le passage que de petits lments de moins de 5nm 4.

Tout autre lment destin traverser lendothlium doit le faire au travers des cellules par des

mcanismes dendocytose et dexocytose biologiquement ou chimiquement promus. Les pricytes

lis lendothlium renforcent ltanchit de la barrire tout en jouant un rle de rgulateur du

flux sanguin par leur contraction. Enfin les astrocytes sont les gardiens du bien tre des neurones, en

assurant leur soutien mcanique et le transfert des nutriments et des influx nergtiques. Leur rle

dans la cicatrisation du cerveau par neurognse en font galement la source des astrocytomes,

tumeurs bnigne du cerveau et potentiellement volutives vers un glioblastome multiforme.


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Figure 2 : Structure de la barrire hmatoencphalique

Le principal levier utilisable par la nanomdecine est la possibilit de crer des objets capables detraverser cette barrire hmatoencphalique. La taille de lobjet est un paramtre important, mais

concevoir des particules de moins 5nm capables de traverser passivement la barrire rendrait

caduque les problmatiques de ciblage actif. En effet si les particules sont capables de traverser la

barrire la plus slective, elles vont pouvoir se disperser dans lensemble de lorganisme et

saccumuler dans des organes quil nest pas utile dobserver.

Des particules plus grosses prsentent donc un plus grand potentiel slectif. Afin de leur faire

traverser la barrire hmatoencphalique, il est ncessaire dutiliser le phnomne dendocytose

dans les cellules endothliales. Il est possible de promouvoir activement ce transfert en greffant la

surface des particules des cibles pour les intgrines (V3) surexprimes sur les parois des no

vaisseaux sanguins tumoraux

5

. Pour des particules bien stabilises par leur traitement de surface,lendocytose peut tre promue jusqu un diamtre de 100nm.

1.3.Axes de dveloppement du projetLe vecteur cr devra prsenter un caractre extrmement slectif pour les cellules tumorales du

glioblastome, tout en ayant la possibilit de traverser la barrire hmatoencphalique. Cela implique

une taille des particules entre 5nm et 100nm. En outre les particules devront tre

superparamagntiques pour pouvoir apparaitre sur les images IRM dans les tumeurs. Lensemble de

ces proprits devront tre prsentes sous la contrainte dune parfaite biocompatibilit et non

toxicit de la particule.La seconde partie du projet sera attache dvelopper le processus de fabrication de

nanoparticules poreuses et superparamagntiques. Il sera ainsi possible de coupler la fonction de

vecteur de mdicaments la facilit dobservation dun agent de contraste magntique sous IRM.

Les particules produites devront tre caractrises afin de comprendre au mieux les mcanismes

ractionnels impliqus, et ainsi contrler les structures synthtises.


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Une contrainte est impose quant au choix des matriaux : les particules seront uniquement

composes doxyde de fer ferromagntique.

Ce type de matriau bon march est le plus biocompatible des matriaux ferromagntiques, et

est galement le plus utilis sous ses diffrentes formes. Sa prsence ltat naturel dans les

minraux et certains organismes (bactries magntotactiques 6 ) et sa facilit de synthse en

laboratoire en font un matriau de choix pour les applications recherches.

Par ailleurs il a t dmontr que la prsence de fer dans une nanoparticule facilite

biodgradation, rduisant ainsi la toxicit et le risque dagglomration des particules 7.

Plus de dtails quant ce choix et les principales proprits cristallines des oxydes de fer sont

disponibles en Annexe page 50.Error! Reference source not found.

1.4.Cahier des charges du projet

FonctionContraintes

Agent de contraste Particules poreuses

Saccumuler spcifiquement

dans les tumeurs 5nm < diamtre NA

Traverser la barrire

hmatoencphalique

diamtre < 100nm

Endocytose promue par les

rcepteurs surexprims

diamtre < 100nm

Prsenter une structure

adapte lutilisation

mdicale

Solide cristallin

superparamagntique

Solide poreux

superparamagntique

Etre biocompatible

Constitue doxyde de fer

Stabilise par un traitement de

surface

Constitue doxyde de fer

Exempte de rsidus organiques

de synthse

Tableau 1 : Cahier des charges du projet


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2.Etat de lart des dispositifs nanoparticulaires doxyde defer

2.1.Synthse de nanocristauxLa synthse de nanocristaux doxyde de fer superparamagntique se fonde sur des procds bien

connus. Selon la mthode employe il est possible de trouver un compromis entre la facilit et la

quantit de particules produites, tout en conservant une qualit adquat. Lintrt majeur tant

toujours dobtenir une dispersion de cristaux de moins de 20nm et le plus monodisperse possible.

2.1.1.Coprcipitation

Cette mthode est la plus simple et rapide mettre en uvre. Elle permet moindre cot avec

de simples ractifs en solution aqueuse de produire une grande quantit de particules

monocristallines de magntite. Seule la monodispersit des produits laisse dsirer, ce qui peut tre

en partie compens par lajout dun ligand comme lacide olique. 8

quation 1 : Raction de coprcipitation

La raction est simple (quation 1) : il sagit dune prcipitation de sels de fer trivalent et divalent

en solution aqueuse basique, en prsence dacide olique. Gnralement la solution est brutalement

basifie par lajout dammoniaque aprs dissolution des prcurseurs. Cette perturbation brutale du

pH, combine la complexation du fer par lacide olique, permet une tape de nuclation

extrmement rapide et contrle. Des noyaux sont produits en grand nombre, puis laisss croitre

en solution.

La rapidit de nuclation garanti la monodispersit des particules, tandis que ltape de

maturation permet une croissance uniforme des cristaux jusqu la taille souhaite. Si cette tapedure trop longtemps, le phnomne de murissement dOstwald soppose la croissance en

dissolvant et agglomrant les particules, donnant un produit plus grossier (voir Figure 3).


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Figure 3 : Image MET de nanoparticules de magntite coprcipites (extrait de8

). On remarque ladisparit de forme et de taille des particules

Le contrle plus prcis de la taille et de la forme des particules peut soprer en formant laide

de surfactants une mulsion deau dans lhuile. Si les prcurseurs ont pralablement t dissouts

dans leau, les gouttelettes de ce mlange serviront de nanoracteurs pour la prcipitation en milieu

restreint des particules. Les particules seront moins nombreuses, mais mieux dfinies. Le choix du

mlange ractionnel dpend alors pleinement du compromis entre quantit et qualit. 9

2.1.2.Synthse haute temprature

Une possibilit pour amliorer la forme et la monodispersit des particules est de travailler plushaute temprature. Il sagit ici non plus de mettre en contact deux sels en solution, mais de

dcomposer thermiquement un prcurseur organomtallique dans un solvant haut point

dbullition. Les prcurseurs couramment utiliss sont lolate de fer, lactylactonate de fer et les

alkoxydes de fer. Le pentacarbonyle de fer peut galement tre utilis, mais les particules

synthtises seront compose dun cur de fer pur entour dune coquille amorphe oxyde 10.

Un de ces prcurseurs est plac dans loctadcne 320C sous reflux pendant 30min pour initier

sa dcomposition. De lacide olique peut ventuellement tre rajout pour contrler la nuclation.

Ensuite la solution est refroidie lentement pour permettre sa maturation. 11


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Figure 4 : Image MET de particules issues de la dcomposition thermique (extrait de 11)

La temprature bien plus leve dun tel processus permet un contrle beaucoup plus fin de laforme et de la taille des particules de magntite (voir Figure 4). Cependant il est parfois compliqu

mettre en uvre, et les prcurseurs sont relativement chers.

2.1.3.Synthses haut rendement

Pour des applications industrielles il est ncessaire dutiliser des procds de synthse en

continu, assurant la meilleure reproductibilit du rsultat. Il sagit soit de pulvriser haute

temprature un spray de nanogouttelettes dun mlange de prcurseurs et solvants, soit de faire

ragir en phase gazeuse les prcurseurs grce une impulsion laser.

Dans les deux cas la raction est trs localise et produit des cristaux de magntite entre 2 et

60nm de diamtre dans un flux continu de prcurseur. La forme et la taille des particules sontdtermines par les conditions de chauffage des prcurseurs, et la taille des gouttelettes par voie

liquide.

De telles installations sont cependant peu videntes faire fonctionner et ne conviennent qu

un usage exclusivement industriel.


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2.2.Fonctionnalisation des particulesLes particules synthtises doivent subir certaines modifications, que ce soit pendant la synthse

ou suite celle-ci, afin dobtenir les proprits physico-chimiques voulues. Cette dmarche de

fonctionnalisation permet notamment dinduire la reconnaissance spcifique des cellules tumorales,

ou la possibilit dencapsuler des principes actifs.

2.2.1.Traitement de surface

La fonctionnalisation post-synthse consiste en une modification de la surface des particules. Elle

sobtient par lajout de ligands organiques qui vont se lier la particule et induire de nouvelles

proprits de surfaces, comme un caractre plus hydrophile.

2.2.1.1. Stabilisation

La stabilit des particules disperses en solution aqueuse est primordiale pour pouvoir les utiliser.

En effet celles-ci ne doivent en aucun cas sagrger dans lorganisme, ni tre squestres par le

systme immunitaire.

Naturellement loxyde de fer est hydrophile, en raison des groupements Fe-OH de surface, mais

cet tat peut varier suivant les ligands prsents sa surface.Les espces organiques composes damines ou de groupes carboxyles sont trs hydrophiles et

possdent diffrentes charges selon le pH de la solution. En liant la surface de la particule une de

ces espces, il est possible dinduire des charges de surface contrles pour des pH spcifiques, et

notamment pour le pH physiologique 7,4. Ces charges vont stabiliser les particules en solution en

crant des rpulsions lectrostatiques. 12

Dautres ligands organiques, les PEG, constituent une coquille

protectrice autour de la particule. Ces molcules sont des

polymres de longueur variable dthylne glycol, au proprits

biocompatibles reconnues

13

. En effet les PEGs sont despolymres peu ractifs mais capables de former une grande

quantit de liaisons hydrogne, en raison de la mobilit de la

chaine carbone et du nombre important doxygnes qui la

composent (Figure 5).

Les PEGs sont ainsi particulirement hydrophiles et forment un gel aqueux autour de la particule,

qui nexhibe ainsi pas plus daffinits pour lorganisme que ne peut en avoir leau.

Cela se traduit par une plus faible toxicit de la particule, et sa stabilit face lopsonisation et la

squestration est ainsi largement amliore (voir Figure 6).

Figure 5 : Polythylne Glycol


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Figure 6 : Mcanisme de squestration des nanoparticules. A : Sans PEG, la particule est capte par les

macrophages et limine. B : Avec une couche de PEG la particule a moins d'affinit avec les opsonines, et

est donc moins susceptible d'tre limine (extrait de13

)

La conformation des PEG la surface de la particule dpend de la densit de greffage par rapport

la longueur du PEG. Si la densit est trop faible ou le PEG trop long, il se repliera dans une forme en

champignon et ne remplira pas correctement son rle. A linverse une densit importante

produira une conformation en brosse , visible sur la Figure 6.

Ces groupements peuvent tre lis la surface des oxydes de fer principalement par silanisation.

La molcule organique dintrt est termine par un silane, qui va shydrolyser et ragir avec les

groupements Fe-OH de surface de la particule, formant ainsi une coquille de silice fonctionnalise

par des groupements organiques (voir Figure 7). Cette raction est le plus souvent ralise dans le

tolune, qui permet de trs bons rendements et un contrle strict de la quantit deau disponible

pour lhydrolyse. Il est ainsi possible de former une monocouche uniforme et fonctionnelle lasurface des particules 11.

Figure 7 : Raction d'hydrolyse et de condensation du silane fonctionnel. R dsigne le groupe fonctionnel

(extrait de11

)

Selon la disponibilit des ractifs, cet change peut tre ralis en deux pates. La premireconsiste recouvrir la particule dAPTES, un silane amin. Puis il est possible dy greffer avec un

excellent rendement une chaine organique dintrt termine par un ester activ. Ce processus

permet de saffranchir de la synthse prliminaire dun silane fonctionnel, puisquil est construit in

situ la surface de la particule.


22/51



2.2.1.2. Couplage spcifique aux cellules tumorales

Au-del dune simple stabilisation, le choix des ligands de surface permet de spcifier la cible de

la particule. Pour ce faire, des anticorps IgG dirigs contre les cellules du glioblastome sont greffs

sa surface. Ils sont classiquement fonctionnaliss par une chaine organique bifonctionnelle 9.

Le choix de ce liant intermdiaire est motiv par la prsence de nombreux groupes fonctionnels

sur lanticorps (Figure 8). Parmi ces sites de liaison comptent les groupements thiols accessibles parrduction des ponts disulfures, les groupements carbohydrates prsents sur le fragment constant, et

les amines primaires exposes sur lensemble de lanticorps, incluant le site actif. Un couplage mal

maitris risquerait alors de modifier la structure de son site actif et lanticorps perdrait son utilit.

Cest pourquoi il est ncessaire de limiter le nombre dinteractions avec lanticorps lors du

couplage. Un moyen efficace dy parvenir est de faire ragir au pralable lanticorps avec une trs

petite quantit du liant intermdiaire. Un nombre contrl de molcules se fixent ainsi sur

lanticorps, maximisant les chances de conserver le site actif intact. Le liant sera ensuite la seule

espce ractive pour le couplage de la particule.

Cette tape se fait en laissant ragir le second groupe fonctionnel du liant avec llment

correspondant sur la particule. Il est possible dutiliser tous les couples de la chimie organique, en

vitant cependant les ractifs qui risqueraient de lier les anticorps entre eux.

Figure 8 : Structure d'un anticorps et groupes fonctionnels accessibles, essentiellement amines et

carbohydrates. Fc dsigne le fragment constant, site prfrentiel de modification de lanticorps


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2.2.2.Structuration pour lencapsulation de mdicaments

Lorsque lapplication ncessite lincorporation dun principe actif dans la particule, il est

ncessaire de travailler la structure du matriau ds la synthse. La formation de pores ou dun

creux au centre de la particule permet entre autre de protger le principe actif lors de son transport,

et de contrler sa cintique de relargage.

Ces mthodes de synthses impliquent une adaptation du procd classique de coprcipitation,ou une nouvelle approche par des prcurseurs organomtalliques condenss par sol-gel.

2.2.2.1. Utilisation dun moule nanostructur

La manire la plus intuitive de structurer un matriau est de le synthtiser la surface dun

moule. La mthode de moulage la cire perdue est applicable ici en utilisant une nanoparticule

organique ayant une affinit pour le prcurseur. Par exemple il est possible de faire prcipiter du

FeCl2 la surface de nanoparticules de polystyrne pralablement couvertes de groupes carboxyles14.

Une fois le moule recouvert, il est limin par une forte calcination des particules 500C. Il ne

reste alors que la couche doxyde de fer cristalline qui forme une coquille creuse.

(A) (B)

Figure 9 : (A) Processus de fabrication de la nanoparticule sur le moule en polystyrne. (B) Nanoparticule

creuse aprs calcination (extrait de14

)

Ce procd cre ainsi des nanoparticules creuses denviron 200nm de diamtre. Des cristaux plus

petits de magntite forment la coquille et permettent dobtenir une porosit inhrente aux

imperfections des joins de grain (Figure 9).

La structure obtenue est parfaite pour le relargage de mdicaments, mais la particule trop grande

pour pouvoir traverser la barrire hmatoencphalique. Ce procd nest donc pas applicable au

traitement du glioblastome.

2.2.2.2. Murissement structurel sous recuit

Un recuit au-del de 500C des particules induit un rarrangement rapide des cristaux qui la

composent. Il est possible de guider ce rarrangement en sappuyant sur leffet Kirkendall,

impliquant dans une particule la diffusion prfrentielle des espces vers la surface externe 15.

Lide est de construire une particule de fer pure de 10nm de diamtre par dcomposition

thermique du pentacarbonyle de fer. Cette particule va ensuite soxyder en surface pour former une

coquille amorphe de Fe3O4.


24/51



Lors du recuit en prsence doxygne, le fer situ au cur de la particule va prfrentiellement

migrer vers lextrieur et ragir avec loxygne dans la couche doxyde qui recristallise, figeant ainsi

linterface cur/coquille. Il en rsulte une croissance de la couche externe de magntite et une

diminution de la densit du cur de fer (voir Figure 10). Un vide est cr au centre de la particule,

jusqu loxydation complte du cur mtallique.

Figure 10 : Mcanisme de restructuration de la particule par l'effet Kirkendall (extrait de 15)

De petites particules creuses de magntite de 15nm de diamtre sont synthtises par ce

procd (voir Figure 11). Nanmoins la trs petite taille des particules ne permet pas une grande

porosit et donc une encapsulation efficace du principe actif 16, elles ne sont donc pas applicables

aux thmatiques de traitement in vivo traites ici.

Figure 11 : Image MET des nanoparticules creuses aprs recuit. La barre d'chelle reprsente 10nm

2.2.2.3. Synthses hydrothermales guides

Il est possible de modifier directement la manire dont le solvant va interagir avec les

prcurseurs pour structurer les particules. Lutilisation de surfactants dans la solution va permettre

de former des micelles qui vont catalyser la prcipitation des prcurseurs. Le choix du surfactant

dpend de laffinit recherche pour le prcurseur.

Les proportions du mlange ainsi que la temprature doivent tre contrles afin de placer le

mlange dans un quilibre micellaire, et prvenir la formation de lamelles condenses de surfactant.

Au cours de la raction les micelles servent de site de nuclation et se couvrent de noyaux

doxyde. Cette modification de leur tat de surface va induire leur coalescence et des agrgats vontse former, crant une msostructure fortement poreuse. Une calcination permet finalement

dliminer les surfactants et de figer la structure (voir Figure 12) 17.


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Figure 12 : Mcanisme de formation d'une structure msoporeuse de magnetite sur les micelles de

polymre amphiphile (extrait de 17)

Figure 13 : Image MET des nanoparticules msoporeuses. La structure des joints de grains est

particulirement visible, signe dune importante porosit (extrait de18

)

Cette synthse produit des particules non pas creuses mais uniquement poreuses, grce au

rseau complexe de jointures ouvertes entre les grains (Figure 13). Cette porosit est importante sur

des grandes particules, mais il est difficile de maitriser le processus pour crer des particules plus

petites ayant la mme structure, ce qui ne rpond pas au cahier des charges impos.


26/51



Il faut cependant noter que les synthses hydrothermales appliques

la fabrication de nanoparticules de silice poreuses permettent

datteindre des tailles entre 30 et 100nm. Le mcanisme est identique,

mais lutilisation dun surfactant ionique, le CTACl, et dun prcurseur

organosilici, le TEOS, permettent un recouvrement homogne des

micelles par de la silice. Lagrgation des micelles ne donne plus alors

une structure en grain, mais un assemblage compact de sphres creuses.

Lquilibre qui sen suit permet louverture des sphres et la formation

dun rseau de canaux entremls. La structure en trous de vers est

de nature amorphe, mais offre la porosit la plus importante parmi

les structures envisageables (Figure 14).

2.3.ConclusionDans le respect du cahier des charges impos, les nanoparticules utilises comme agent de

contraste seront produites suivant le protocole classique et simple de coprcipitation.

Elles seront fonctionnalises en trois tapes :

Un premier recouvrement par une couche homogne dAPTES, en accord avec lalittrature;

Une greffe de PEG par lintermdiaire dun ester activ afin de stabiliser et passiver la

surface de la particule. Le recouvrement de la surface devra tre le plus important

possible pour assurer une conformation en brosse des PEG. La moiti des PEG utiliss

prsenteront un thiol terminal afin de pouvoir y lier un anticorps ;

Le couplage un anticorps, le Cetuximab, trs largement utilis dans le traitement ducancer. Cet anticorps ragira pralablement avec un ligand par lintermdiaire dune

amine et dun ester activ. Le ligand prsentera un groupe maleimide qui sera enfin

coupl aux thiols des particules.

La conception de particules poreuses sera dveloppe partir des avances les plus

prometteuses sur la silice msoporeuse. La dmarche consistera adapter au mieux les protocoles

pour la synthse de loxyde de fer partir dun prcurseur organomtallique, et permettra de

satisfaire au cahier des charges.

Figure 14 : Nanoparticules de silice

msoporeuse. Le contraste d aux pores

est bien visible dans les particules


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3.Production des agents de contraste

3.1.Synthse par coprcipitationLe protocole de synthse des nanocristaux de magntite est exploit tel quil a t dcrit dans la

littrature 8:

4.8g de FeCl3,6H2O et 1.96g de FeCl2,4H2O sont mlangs dans 20ml deau dionise, puis le

mlange est port 80C sous forte agitation et atmosphre protectrice.

10ml dammoniaque sont ensuite rapidement ajouts. La solution devient immdiatement noire

et, aprs 30min 80C, 849l dacide olique sont ajouts. La solution est conserve sous agitation

80C pendant encore 1h30.

Les particules formes (environ 2g) sont disperses dans leau dionise puis prcipites par un

aimant. Cette procdure de lavage est rpte 3 fois au minimum, jusqu la neutralit de la

solution. Aprs un lavage supplmentaire dans lthanol et prcipitation, les particules sont

redisperses dans 20ml dheptane pour former la solution stock (100mg/ml).

La forme et la taille des particules sont analyses grce des images MET. La structure cristalline

est observe par DRX.

Figure 15 : Image MET des nanoparticules synthtises par coprcipitation. Le graphe montre ladispersion de tailles des particules, calcule partir des images MET


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Figure 16 : Spectre DRX des particules. Les pics indexs correspondent des plans cristallins de la

magntite, sauf mention spcifique pour le pic 104 correspondant l'hmatite. Le spectre est liss pour plus

de lisibilit

Les particules sont synthtises en prsence dacide olique, qui recouvre leur surface lissue de

la synthse. Cela confre aux particules un caractre hydrophobe marqu. La dispersion danslheptane permet dviter lagrgation des particules dans la solution stock, et les protge

efficacement des risques doxydation.

Daprs les analyses MET les particules ne sont pas bien sphriques mais sont relativement bien

monodisperses avec une taille de 9nm +/- 6nm (Figure 15). Ces rsultats sont ceux attendus, et se

conforment au cahier des charges.

Elles sont bien composes essentiellement de magntite, comme visible sur le spectre DRX

(Figure 16), avec une part de phase hmatite non ferromagntique. La prsence dhmatite est

impute loxydation partielle des particules lors de leur mise lair pour lanalyse DRX.

3.2.

Fonctionnalisation par lAPTESAfin de rendre les particules hydrophiles, il est ncessaire de

remplacer lacide olique de surface. LAPTES (Figure 17) est utilis car

lamine primaire, de pKa 9, va tre protone et induire des rpulsions

lectrostatiques entre particules ph 7,4. Les amines vont galement

servir de base lincorporation des PEG.Figure 17 : l'APTES


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Lchange de ligand est fait en suivant un protocole dcrit dans la littrature 19et schmatis la

Figure 7 :

100mg de particules magntiques dans lheptane sont disperses dans 50ml de tolune sous

agitation. A cette solution sont ajouts 2.5ml de triethylamine, 500l dAPTES et enfin 50l deau

dionise. Le mlange est agit sous atmosphre protectrice temprature ambiante pendant 24h.

Les particules sont prcipites par lajout de 50ml dheptane et lutilisation dun aimant. Elles

sont ensuite laves par dispersion dans lactone puis prcipitation par laimant. Aprs 3 lavages, les

particules sont disperses dans 20ml dthanol, pour obtenir une solution stock de 5mg/ml.

Suite la coprcipitation, lacide olique est li la surface de la particule par des liaisons ferro-

esters semi-covalentes. LAPTES, introduit en large excs par rapport la quantit de particules,

dplace ces liaisons pour remplacer lacide olique la surface de la particule.

Le stockage des particules dans lthanol a pour but dviter la prsence deau indsirable pour

les prochaines tapes de fonctionnalisation.

Suite la raction les particules se dispersent trs bien dans des milieux neutres ou lgrementacides, et prcipitent dans les solutions au-del de pH 8,5. Sachant le pKa des amines primaires, ce

rsultat est cohrent avec la prsence ou non de charges positives la surface des particules.

Par ailleurs lintroduction de lAPTES ne modifie en rien la monodispersit des particules, comme

il est possible de lobserver sur les spectres DLS (Figure 18). Toutefois une faible agrgation est mise

en vidence par les panchements du spectre 70nm et 120nm, indiquant un recouvrement non

uniforme, voire incomplet, de la surface, ce qui perturbe les rpulsions lectrostatiques.

Nanmoins le rayon hydrodynamique de 56nm, largement suprieur au diamtre rel des

particules, indique leur bonne solvatation suite cette fonctionnalisation.

Figure 18 : Spectre DLS des particules couvertes d'APTES. Le milieu est lgrement acidifi, et des

panchements dagrgation sont visibles 70nm et 120nm. Le rayon hydrodynamique moyen est de 56nm

+/- 30nm


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3.3.Introduction des PEGLes PEGs choisis pour recouvrir la particule ont une longueur de 40 50 monomres, soit un

poids molculaire moyen de 2500 Da. Ce choix a t fait en accord avec la littrature pour viter

lopsonisation des particules. Chacun des PEGs prsente un groupement NHS (ester activ) pour tre

li aux amines de surface. Les groupements terminaux choisis sont un metyl, absolument inerte,

pour le PEG de protection, et un SSPyr, quivalent un thiol, pour le PEG dancrage de lanticorps.

Le couplage est fait en absence deau avec un fort excs de PEG, suivant le protocole ci-dessous :

25mg de particules enrobes dAPTES sont dcantes par un aimant puis redisperses dans 8ml

de DMF sous agitation. 500l de DIEA sont ajouts, et la solution est laisse incuber pendant

10min. Puis 12.5mg de NHS-PEG-Metyl, 12.5mg de NHS-PEG-SSPyr et 5mg de PyBOP dissouts dans

2ml de DMF sont ajouts. La solution est laisse sous agitation pendant toute une nuit.

Les particules sont collectes par un aimant puis laves dans leau dionise. Cette procdure est

rpte 3 fois. Enfin les particules sont disperses dans 5ml deau, pour obtenir une solution stock

de 5mg/ml.

La DIEA est une amine ternaire qui va permettre de dprotoner les amines de surface des

particules. Son caractre encombr prvient son couplage avec les ester activs par attaque

nuclophile. Le PyBOP est un activateur dacide carboxylique, qui va contrer lhydrolyse des esters

activs par leau rsiduelle.

Les particules PEGyles sont stables dans leau pour une gamme de pH allant de 6 10, des

concentrations infrieures 0.2mg/ml, ce qui est sensiblement plus petit que dans la littrature 12.

Des mesures DLS sur ces particules permettent dobserver la modification de leur rayon

hydrodynamique (Figure 19). Celui-ci a en moyenne augment pour atteindre 83nm +/- 76nm. Les

PEG ont donc bien t greffs la surface de la particule et forment une couche hydrate plusimportante.

Nanmoins la forte dispersion observe implique une conformation mixte entre brosse et

champignon, diffrente de la conformation recherche. Le couplage des PEG na donc pas le

rendement espr, et perd ainsi en efficacit. Cela peut tre d leur longueur, qui provoque des

gnes striques lors de la raction de couplage.

Figure 19 : Spectre DLS des nanoparticules PEGyles


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3.4.Greffage du CetuximabLe greffage du Cetuximab sur la particule est ltape la plus dlicate puisque lanticorps est fragile

et peut tre rapidement dnatur.

Il faut dans un premier temps prparer lanticorps en le nettoyant, car il est indispensable de

saffranchir de tout produit secondaire, telle que la glycine qui maintien les anticorps en suspensionet dont la prsence rduirait considrablement le rendement de couplage de lanticorps. En effet la

glycine est un acide amin, et elle pourrait aisment ragir au lieu de lanticorps, et ainsi prendre sa

place sur la particule.

Le nettoyage seffectue en purifiant par dialyse la solution de Cetuximab 5mg/ml dans du

tampon borate pH 8,5 pendant 24h.

Ce pH est choisi car proche du pKa des amines de lanticorps, sur lesquelles le liant va tre fix. En

protonant une partie des amines, les chances que la raction se produise sur une amine du site actif

sont encore rduites.

Dans le mme temps 2.5mg de particules PEGyles sont traites sous agitation pendant 2h avec

5mg de DTT. Cette tape rduit les ponts disulfures pour activer les thiols de surface. Le DTT est

limin par 3 dialyses successives pour une dure totale de 24h dans le PBS 1x.

Les particules sont stockes en solution sous argon pour viter loxydation des thiols par

loxygne dissout.

Le liant utilis est le Sulfo-SMCC (Figure 20). Il est soluble dans leau et

prsente un groupement ester activ et un groupement maleimide,

faisant un parfait lien entre les amines de lanticorps et les thiols des

particules.

Pour faire ragir le liant sur lanticorps, 100l dune solution de Sulfo-SMCC (4.5mg/ml dans lePBS 1x) sont ajouts 10mg de Cetuximab dans du tampon borate. Le mlange est agit pendant

30min, avant dajouter 23l dune solution de rhodamine isothiocyanate (3mg/ml dans le PBS 1x).

Aprs 1h les anticorps sont spars en utilisant une colonne de dessalage PD10.

(A) (B)

Figure 21 : (A) Profil d'lution des anticorps suvi par spectromtrie de fluorescence (Rhodamine,

excitation 540nm, emission 590nm). (B) Photo des colonnes charges en rhodamine rsiduelle

Figure 20 : Le Sulfo-SMCC


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La sparation des anticorps est rapide et efficace, comme le montre la Figure 21. La rhodamine

permet de suivre la progression des anticorps par spectromtrie de fluorescence.

Enfin le couplage des 5mg danticorps fonctionnels est ralis en y ajoutant 2.5mg de particules

actives. La solution est agite pendant 2h, puis un excs de fluoresceine maleimide est ajout pour

inhiber la raction. Cela permettra galement dobserver le nombre de thiols libres inhibs aprs la

raction.

Les particules sont purifies par un lavage dans le PBS 1x, et dcantes par un aimant. Ces tapes

sont rptes 4 fois, avant de disperser les particules dans 5ml de PBS 1x, formant une solution

stock denviron 0.5mg/ml.

Le couplage des anticorps est attest par un suivi de la rhodamine par spectromtrie de

fluorescence sur la solution stock.

Le rsultat nest pas satisfaisant : moins de 1% de rendement de couplage est atteint. Cependant

il savre que les particules sagrgent dans la solution stock, caractristique dune agglomration

protique.

Les anticorps utiliss sont de taille comparable aux noyaux magntiques synthtiss. La fixation

dun anticorps la surface de la particule perturbe grandement sa stabilit et provoque sont

agrgation avec dautres anticorps et particules. Le rendement de raction sen trouve donc

fortement rduit.

Par ailleurs la disponibilit des thiols nest certainement pas optimale puisque la conformation

des PEGs la surface de la particule est influence par la prsence de lanticorps. Les thiols non

accessibles ne peuvent ainsi pas participer la raction de couplage.

Afin de prvenir ces problmes dagrgation, le milieu ractionnel peut tre dilu et le temps de

raction raccourci. Les anticorps auraient ainsi moins de chances de former des agrgats protiques.

De plus le choix de PEGs plus courts favoriserait leur conformation en brosse et les thiols terminaux

seraient mieux exposs pour le couplage.

3.5.ConclusionLes particules superparamagntiques de magntite ont t correctement synthtises et

caractrises par des mthodes bien tablies. Leur fonctionnalisation a t ralise tape par tape

en conservant une cohrence par rapport au cahier des charges retenu. Les particules ont t

rendues hydrophiles et biocompatibles par lajout dune couche de PEG.Nanmoins le couplage final dun anticorps sur ces particules na pas dmontr son efficacit.

Des ajustements du procd peuvent cependant tre appliqus pour amliorer le rendement de la

raction.


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4.Production de particules poreuses doxyde de fer

4.1.Adaptation des procds de synthseAu vu des rsultats obtenus dans la littrature, le processus de dveloppement dune

nanoparticule poreuse doxyde de fer se fonde sur les acquis obtenus dans les travaux concernant la

silice msoporeuse 20. La principale hypothse de travail sera de considrer que le prcurseur de ferragit de manire analogue au prcurseur de silice.

Le prcurseur utilis est donc comparable au TEOS, prcurseur de

la silice. Il sagit de lthoxyde de fer, un prcurseur organomtallique

trivalent (Figure 22) et extrmement ractif avec leau, pour former

loxyhydroxyde de fer Fe(OH)3.

Lobjectif est justement de contrler cette hydrolyse en vue dobtenir idalement une porosit en

trous de vers .

Le milieu ractionnel est un mlange aqueux de CTACl et de TEA, deux surfactants, en prsence

dthanol, le tout port 60C. Les conditions appliques permettent au CTACl de former des

micelles cationiques denviron 3nm de diamtre.

Le TEA joue un rle de base pour la prcipitation des espces, ainsi

quun rle dagent chlateur du fer, en formant un complexe ferratrane

(Figure 23). Ce complexe ralenti fortement la cintique dhydrolyse du

fer, mais ncessite de fortes tempratures pour apparaitre de manire

significative. 21,22

Sous le pH impos par le TEA (environ pH 12), le fer se prsente en solution sous forme Fe(OH)4-,

comme le montre la Figure 24, laspect anionique permettant en thorie une bonne prcipitation

la surface des micelles cationiques 23.

La condensation des micelles permet ensuite dobtenir la structure poreuse recherche. Cettestructure se caractrise par une grande surface spcifique au sein dune matrice de matriau

amorphe. Cela implique des tapes de traitement supplmentaire des particules pour recristalliser le

matriau et obtenir de bonnes proprits magntiques.

Figure 24 : Diagramme de stabilit des hydroxydes de fer selon le pH. Au pH 12, le fer est prsent sous

une forme anionique (extrait de23

)

Figure 22 : Ethoxyde de fer

Figure 23 : Ferratrane


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Trois voies de synthse ont alors t explores, correspondant chacune, daprs la littrature,

un degr de ractivit du prcurseur, afin de comparer les mcanismes rels ceux connus pour la

silice. Linfluence du temps de raction a galement t tudie. Enfin certains chantillons ont t

combins au prcurseur de la silice msoporeuse, afin dvaluer la possibilit de crer des structures

hybrides poreuses.

Les protocoles utiliss sont les suivants :

Une injection solide du prcurseur pur dans la solution de raction, impliquant la plusgrande ractivit :

Une solution de raction est prpare en mlangeant 64ml deau dionise, 10.4ml

dthanol, 10.4ml dune solution aqueuse de CTACl (25% massique) et 8.28ml de TEA. La

solution est agite 10min temprature ambiante en y faisant buller de largon, afin de

dgazer loxygne dissout.

A 20ml de la solution de raction porte 60C sont ajouts 1.242g de Fe(OEt)3.

Aprs dissolution complte du prcurseur, la solution incube sous forte agitation 60C

pendant 2 16h selon lchantillon recherch.

Les particules sont ensuite centrifuges (45000g, 20min) et le surnageant retir pourstopper la raction. Elles sont enfin stockes forte concentration dans lthanol en vue

de leur post-traitement.

Une injection liquide dans lthanol, limitant la ractivit du prcurseur dans les premierstemps de la raction :

Une solution de raction est prpare en mlangeant 64ml deau dionise, 10.4ml

dune solution aqueuse de CTACl (25% massique) et 8.28ml de TEA. La solution est agite

10min temprature ambiante en y faisant buller de largon, afin de dgazer loxygne

dissout.

Une solution de prcurseur est prpare en dissolvant 1.242g de Fe(OEt)3 dans

2.23ml dthanol. La solution est de couleur brune limpide.

A 20ml de la solution de raction porte 60C est ajoute la solution de

prcurseur. La raction se droule sous forte agitation 60C pendant 2h.

A la moiti de la solution ractionnelle sont ensuite ajouts 865l de TEOS, et la

raction se poursuit pendant 1h 60C. Lautre moiti est immdiatement nettoye.

Chaque produit est nettoy par centrifugation (45000g, 20min) et le surnageant

retir pour stopper la raction. Les particules sont enfin stockes forte concentration

dans lthanol en vue de leur post-traitement.

Une injection suite au traitement pralable du prcurseur avec le TEA, pour forcer la

formation du ferratrane, rduisant par l mme la ractivit du prcurseur :Une solution de raction est prpare en mlangeant 64ml deau dionise, 10.4ml

dthanol, 10.4ml dune solution aqueuse de CTACl (25% massique). La solution est agite

10min temprature ambiante en y faisant buller de largon, afin de dgazer loxygne

dissout.

Le prcurseur est prpar en mlangeant 1.242g de Fe(OEt)3 3.56ml de TEA. Ce

mlange est chauff lair 200C pendant 4h pour permettre la complexation du fer

avec le TEA. Le mlange devient solide, de couleur beige.


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A 20ml de la solution de raction ports 60C est ajout le mlange Fer-TEA. Aprs

dissolution complte du prcurseur, la solution incube sous forte agitation 60C

pendant 2h.

A la moiti de la solution ractionnelle sont ensuite ajouts 865l de TEOS, et la

raction se poursuit pendant 1h 60C. Lautre moiti est immdiatement nettoye.

Chaque produit est nettoy par centrifugation (45000g, 20min) et le surnageant

retir pour stopper la raction. Les particules sont enfin stockes forte concentration

dans lthanol en vue de leur post-traitement.

Les particules traversent ensuite diffrents post-traitements en vue dliminer les prcurseurs et

surfactants incrusts dans les pores. Ces procds sont choisis pour tester certaines proprits des

particules sous des conditions prcises :

La stabilit en solution aqueuse est teste en dialysant les particules dans leau pendant 1semaine :

Environ 20mg de particules dans lthanol sont dilues dans 20ml deau dionise,

puis 2g de NaCl sont ajouts. Cette solution est ensuite agite pendant 2h au bain ultrasons. Les particules sagrgent durant cette opration, qui a pour but dintroduire un

contre ion au CTACl cationique incrust.

Le mlange est ensuite plac dans une poche de dialyse (cut-off molculaire de

15000 Da) dans 1L deau dionise pendant 12h. Les particules dialyses sont

redisperses en ltat dans le bain ultrasons, puis replaces en dialyse pendant 12h

dans 1L deau dionise. Ce processus est rpt pendant 1 semaine, soit environ 10 fois,

suite quoi les particules sont centrifuges (45000g, 20min) et stockes dans lthanol.

La cristallinit du matriau est amliore suivant deux processus de calcination :Une calcination dure , pour laquelle les particules disperses dans lthanol sont

sches sous vide 60C avant dtre chauffes lair durant 3h 500C. Cette opration

calcine tous les rsidus organiques de synthse et recristallise le matriau. 24

Les particules sont ensuite stockes dans lthanol.

Une calcination douce pour laquelle les particules disperses dans lthanol sont

dilues dans un solvant haut point dbullition : squalene, TOPO ou Ethylne glycol. 25

Le mlange est ensuite chauff graduellement jusqu 200C pour liminer lthanol.

Le mlange est alors plac sous reflux pendant 2h 200C, et la solution devient

rapidement noire.

Les particules sont ensuite collectes par centrifugation (45000g, 20min) et

redisperses dans lthanol. Ce processus de lavage est rpt 4 fois. Les particules sontfinalement stockes dans lthanol.


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4.2.Rsultats gnrauxLes particules non retraites ne prsentent que de faibles ractions en prsence dun aimant, et il

est impossible de les prcipiter par ce biais. Cela traduit de faibles proprits magntiques, et donc

une faible cristallinit du matriau juste aprs la synthse hydrothermale.

Comme attendu, le matriau est donc vraisemblablement amorphe. Ce rsultat est confirm par

lanalyse DRX qui ne rvle aucune structure cristalline.Dans leau, la stabilit des particules est assez faible, et la solution retourne rapidement un tat

dquilibre entre le matriau condens et sa forme Fe(OH)3. Cet tat est galement caractristique

de la forte proportion de matire amorphe et donc moins stable (Figure 25).

Figure 25 : Particules dans l'eau aprs dialyse. Une floculation typique de l'oxyhydroxyde de fer est

clairement observe

Enfin une observation MEB des particules rvle que le surfactant est solidement li au matriau,

comme sur la Figure 26. Les surfactants tant toxiques in vivo, il est ncessaire de les liminer, ce qui

implique des lavages plus intenses et donc un risque de destruction des particules.

Figure 26 : Image MEB de particules englues dans le surfactant rsiduel. Elles sont inutilisables en l'tat


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4.3.Influence de la ractivit et du tempsLinfluence de la ractivit du prcurseur et du temps de raction sur la structure des particules

est tudie grce aux images MET.

Ferratrane Ethanol Solide

Figure 27 : Images MET des produits synthtises selon les diffrentes mthodes dinjection du

prcurseur, dans lordre croissant de ractivit. Les images du bas sont des magnifications des premires

images.

Selon la Figure 27, le prcurseur inject dans lthanol a donn lieu la formation de

nanoparticules grossires constitues de grains agglomrs. Ces particules font 80nm +/- 20nm.

Les grains sont des nanocristaux enchsss dans une matrice doxyde de fer amorphe, et sont

rpartis alatoirement au sein de la particule. Des veinures plus claires indiquent des ouvertures au

niveau des joints de grains, et donc une lgre porosit.

Ces particules correspondent ce que les synthses hydrothermales peuvent produire, tout en

respectant la taille limite de 100nm ne pas dpasser. 26

Lorsque la ractivit du prcurseur est amoindrie, par la formation du ferratrane, les objets

produits sont des tapis de nanocristaux de 3nm alatoirement disperss. Parmi ces cristaux setrouvent galement des particules plus grosses denviron 170nm +/- 35nm. Ces particules sont

galement composes de gros cristaux agglomrs, mais ne comportent pas de porosit.

Enfin le prcurseur le plus ractif, inject sous forme solide, cre des particules dont la structure

nest pas sans rappeler un cur moins dense entour dune coquille.


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Il apparait ainsi que plus le prcurseur va tre ractif, plus la nuclation et lagrgation des

noyaux sous forme de nanocristaux vont tre rapides, laissant des lacunes et des vides dans la

particule. A linverse un prcurseur moins ractif provoque des nuclations dsordonnes et un

murissement lent des particules, rsultant en une forte polydispersit du milieu, et des cristaux

agglomrs de manire compacte.

Devant ce constat il est lgitime de se demander quelle est lutilit du TEA. En effet, sans un

prtraitement du prcurseur, il ne semble pas influencer sa ractivit, suggrant que le complexe ne

se forme pas en in situau cours de la raction et que le TEA na quun rle uniquement spectateur.

Cette hypothse est confirme par les donnes littraires qui font tat de la formation du complexe

200C 21.

Le TEA joue cependant un rle de base. Or la raction, par ses similitudes avec des procds sol-

gel (hydrolyse puis condensation des prcurseurs), est sensible au pH. Le TEA permet alors de

rguler ce paramtre ractionnel, connu comme tant dterminant dans les synthses

fondamentales de silice msoporeuse. De plus les prcipitations doxyde de fer sont

systmatiquement ralises en milieu basique, ncessaire la bonne condensation des espces.

Une tude complmentaire pourrait tre mene avec lutilisation dautres bases, afin de

dterminer si le TEA est important pour le mcanisme ractionnel en tant que tel pour son caractrechlateur, ou simplement en tant que base.


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2h de raction 16h de raction

Figure 28 : Images MET des produits de synthse de l'injection solide aprs 2h ou 16h de raction. Les

images du bas caractrisent l'tat des noyaux cristallins isols, plus petits aprs un temps de raction plus

long

Ltude temporelle de la raction sur le prcurseur solide permet de mettre en exergue une

augmentation de la porosit de la particule avec le temps.En effet aprs 16h de raction, il apparait clairement sur limage de droite (Figure 28) des

diffrences de contraste plus prononces et rgulires la surface de la particule, et qui ne sont pas

prsentes lors dune synthse courte. Ce sont des pores dans la coquille cristalline.

La formation de tels pores est attribue un murissement dOswald qui sopre sur la couche

externe de la particule au cours de la synthse. Cette hypothse est corrobore par la rduction en

taille des noyaux cristallins prsents dans la solution : ils passent de 20nm 5nm. Ces noyaux, ainsi

que les plus petits grains de la coquille des particules, se sont dissouts en laissant place aux pores

observs.

Laccroissement du temps de raction permet ainsi daugmenter la porosit de la particule, dans

le cas de linjection solide du prcurseur.

Enfin une tude pousse des images et des interfrences visibles permet daffirmer que les grains

cristallins sont des polycristaux dhmatite non magntique, avec une faible portion de maghmite.

Ce constat explique les faibles proprits magntiques observes prcdemment.


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4.4.Mcanisme ractionnel rel proposSuite ces conclusions, il est possible de remettre en doute certains points du mcanisme

ractionnel, notamment lanalogie de ractivit entre les prcurseurs de fer ou de silice.

La prsence pour un prcurseur peu ractif dune multitude de noyaux de la taille dune micelle

de CTACl suggre une raction interne ces micelles, et non en surface. Or si le prcurseur est trop

ractif, il se condense pour former des noyaux agrgs avant mme davoir pu sinfiltrer dans lesmicelles, processus confirm par labsence de petits noyaux et la croissance de gros cristaux suite

linjection solide du prcurseur.

La raction propose consiste en trois points :

Le prcurseur, caractre hydrophobe, voyage vers lintrieur des micelles de CTACl.Selon sa ractivit, la proportion de prcurseur qui y pntre est variable.

Sous linfluence du milieu basique impos par le TEA, le prcurseur se condense et formedes cristaux, dont la forme et la taille dpendent du lieu de raction. Des noyaux sont

forms dans les micelles et des cristaux plus gros sont forms en solution.

Les cristaux sagrgent pour former des structures dautant plus poreuses que les cristauxsont gros.

Le murissement dOswald rarrange la structure et induit une plus importante porosit.


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4.5.Incorporation de siliceLajout dun prcurseur de la silice, le TEOS, au bout dun certain temps de raction permet

dobserver les mcanismes de formation de structures hybrides doxyde de fer et de silice.

Figure 29 : Image MET dune particule d'oxyde de fer recouverte de silice

La Figure 29 met en vidence lajout en surface dune couche de silice au contraste moins

marqu. Des grains de 3nm se sont forms sur le pourtour de la particule, et agrgs pour former

une structure rugueuse et poreuse.

En observant un autre chantillon (Figure 30), les noyaux susceptibles de sagrger sont enrobsdune coquille de silice, prvenant ainsi la formation de particules.

Il apparait clairement que la silice enrobe bien les particules en ltat, et stoppe totalement la

raction, comme le montrent les cristaux figs dans la silice sur le point de sagrger. Sil sagit

dhybrider les deux matriaux, cela doit tre fait en fin de raction, lorsque le produit a atteint la

maturit recherche.

Par ailleurs une analyse plus fine des interfaces entre la silice et loxyde de fer (Figure 31) rvle

que les cristaux enrobs ont subi une lgre diminution de leur paramtre de maille, de lordre de

5%. La coquille de silice semble donc imposer des contraintes mcaniques aux curs magntiques.

Cette hypothse pourra tre taye par de plus amples analyse en DRX des contraintes internes

du matriau.


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Figure 30 : Image MET de noyaux doxyde de fer enrobs de silice

Figure 31 : Image MET de l'interface silice-oxyde de fer. Les interfrences du rseau cristallin se

distinguent particulirement bien


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4.6.La calcination pour accroitre les proprits magntiquesLa calcination permet non seulement dliminer les surfactants organiques rsiduels, mais elle

provoque une rorganisation du matriau vers une meilleure forme cristalline. La calcination permet

donc en thorie de renforcer la structure du matriau.

Cependant une calcination trop violente induit une condensation des particules de maniretotalement dsorganise. Le produit obtenu est un solide informe, assemblage de multiples

particules soudes les unes aux autres, visible sur la Figure 32.

Figure 32 : Image MEB de particules calcines 500C. Les particules ont fondu et se sont colles sous

l'effet du recuit

Afin dviter de brusquer les structures fragiles, un second recuit est envisag, plus doux, dans

une huile moins de 300C. Le surfactant est bien limin, mais les particules clatent en solution et

retournent ltat de nanocristaux disperss (Figure 34).

Aucun des deux protocoles na permis de conserver la structure des particules. Ils induisent

cependant une cristallisation intressante du matriau : la phase amorphe est transforme en

maghmite et hmatite, comme le montre la Figure 33, provoquant un rehaussement significatif des

proprits magntiques.


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Figure 33 : Spectre DRX des particules calcines, mettant en vidence une phase maghmite (note m) et

hmatite (note h)

Figure 34 : Nanocristaux rsiduels aprs calcination dans l'thylne glycol 200C


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4.7.ConclusionPlusieurs pistes ont t explores pour comprendre comment adapter les rsultats prometteurs

obtenus sur la silice aux oxydes de fer. Il a ainsi t possible dtablir que lthoxyde de fer prcipite

prfrentiellement dans les micelles de CTACl, formant ainsi des nanocristaux qui sagglomrent lors

du murissement de la solution.

Si lobjectif de crer une structure en trous de vers nest pas atteint, il est possible desynthtiser des particules poreuses de moins de 100nm par lintroduction du prcurseur sous sa

forme la plus ractive. Le temps de raction devient ensuite le paramtre dterminant pour le

contrle prcis de la structure. Une tude concernant linfluence du pH sur le produit de raction

pourra tre mene afin dvaluer lutilit prcise du TEA.

Des techniques de recuit plus douces restent dvelopper pour permettre daccroitre la portion

de phase cristalline du matriau, et donc atteindre un ferromagntisme suffisant. Une possibilit

serait de recuire les particules enrobes de silice protectrice. En effet la silice rsiste aux

tempratures employes, et permettrait de conserver une certaine structure en vitant lagrgation.

Certaines caractrisations sont encore mener par la suite, notamment en ce qui concerne

lvaluation de la surface spcifique des particules poreuses analyse par BET, ou ltude

approfondie des contraintes dans les systmes hybrides par incorporation de silice.


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ConclusionDiffrentes approches ont t menes bien au cours de ce projet : la synthse dun agent de

contraste en oxyde de fer ferromagntique, fonctionnel et biocompatible, et la synthse dun

vecteur doxyde de fer poreux de moins de 100nm.

La fonctionnalisation de lagent de contraste na pas donn les rsultats escompts, mais il nesagit ici que dajustements des procds quil conviendra de prendre en compte pour la suite du

projet. La particule synthtise nen reste pas moins conforme aux informations trouves dans la

littrature, et remplit parfaitement les attentes du cahier des charges.

Des particules poreuses doxyde de fer de moins de 100nm ont pu tre synthtises, et le

processus de raction tabli. Il reste nanmoins des zones dombres que des analyses

complmentaires pourront quantifier, notamment propos de linfluence du pH et du temps de

raction.

Enfin un des lments cls qui na pas pu tre abord en raison dun manque de temps estlanalyse prcise du caractre superparamagntique des particules. Cette analyse ncessite des

installations ddies, et devra tre la future priorit pour terminer la caractrisation des particules.

Ces rsultats, bien quincomplets pour dboucher sur des applications immdiatement

thrapeutiques, ouvrent la voie vers de nouveaux

Documents

Rapport Tfe 7285 Artaud Clement 2014