THESE PRESENTEE

POUR L'OBTENTION

DU

DIPLOME DE DOCTEUR DE 3e CYCLE

A

L'UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE

- PARIS 6-

SPËCIALlTË : PHYTOPATHOLOGIE

PAR

Annie VERNENGHI

SUJET DE LA THESE :Réactions de défense du Lycopersicul11 escu/entu111Mill. à des infections cryptogamiques : mise en évidence

de phytoalexines et de leurs propriétés inhibitrices.

SOUTENUE LE 28 FEVRIER 1985 DEVANT LA COMMISSION COMPOSEE DE:

MM. G. BOMPEIXC. BOISSONJ. EINHORNI. SMITHA. RAVISE

PRESIDENTRAPPORTEUR

AVANT-PROPOS

En France, depuis 15 ans, sont réalisées des recherches

de physiopathologie sur les mécanismes de défense de la tomate

contre des parasites fongiques. Cette étude représente l'un des

maillons des investigations et elle a profité tant du matériel

végétal sélectionné par H. Laterrot que des travaux de

P. Davet, M.C. Durand, F. Fettouche, C. Neema, I. Smith et coll.et B. Trique.

Nos travaux ont également bénéficié d'une collaboration

interdisciplinaire avec des chimistes, notamment ceux du Labora­

toire des Médiateurs Chimiques dirigé par M. Descoins que jeremercie de sa sollicitude et M. E1nhorn, Kunesch et

Malosse qui ont non seulement déterminé des structures de substan­

ces toxiques mais également procédé à des synthèses d'analogues

structuraux.

M. le professeur Bompeix, inspirateur de nombreux tra­vaux dans ce domaine, me fait l'honneur de présider ce jury ce

dont je lui suis profondément reconnaissante.

Spécialiste des maladies tropicales en particulier des

verticillioses, M. le professeur Boisson a bien voulu être le rap­porteur de cette étude et je le remercie très sincèrement de ses

fructueuses réflexions.

Le Dr Smith, directeur général adjoint de l'O.E.P.P.,

malgré ses obligations, a accepté de me faire bénéficier de son

expérience personnelle sur les recherches des phytoalexines de latomate et je suis touchée par sa sollicitude.

L'indulgence de M. Einhorn pour mes interprétationsparfois fantaisistes de ses découvertes me confond et me rassure.

Enfin, j'ai bénéficié de l'accueil amical et des con­

seils permanents de M. Ravisé, inspecteur général de recherche à

l'O.R.S.T.O.M. qui m'a guidée avec beaucoup d'attention.

Cependant, ces résultats n'auraient pas été acquis sans

le dévouement de M. Pelletier qui a cultivé en serres des milliers

de plants de tomate et celui de Mme Van de Wandel qui a assuré une

partie des tâches techniques. Je dois à MM. Taquet et Akhtar Jamal

Khan une ambiance amicale de travail soutenue par de nombreuses

discussions.

- l -

SOM MAI R E

INTRODUCTION

1. Importance alimentaire et évolution de la culture

p. 1

de la tomate p. 1

2. Historique de l'évolution des recherches sur les

mécanismes de résistance •.•....••......••..•••.• p. 2

3. Les objectifs de recherche ••.•••••..•..••••..•.. p. 6

MATERIEL ET TECHNIQUES ••..••••••••...•.•...•.•••••••••.. p. 7

1. Matériel vêgêtal p. 7

1 • 1. La plante hOte p. 7

1.2. Les agents pathogènes .•.•••.•.....•....•.•• p. 7

1.2.1. Phytophthopa papasitiaa dast .••••.•. p. 8

1.2.2. VeptiaiZZium aZbo-atpum Reinke et

Berth p. 9

1.3. Le champignon destiné aux tests de toxicité p. 9

2. Infections expérimentales ..•..•.•......••...••.. p. 10

2.1. Stade végétatif des plants •..••••••..•••..• p. 10

2.2. Inoculation du P. papasitiaa

2.3. Inoculation du V. aZbo-atpum

2.4. Application d'inhibiteurs en serre .

p.

p.

p.

10

10

10

2.4.1. Application d'acide a amino-oxy-

acétique (A. 0 . A. ) .........••.•...•.. p. 10

2.4.2. Application d'inhibiteurs de Smith-

Klein and French (S.K.F.) .••••.••..• p. Il

2.5. Déroulement de l'incubation en serre •.•...• p. Il

2.6. Techniques d'inoculation sur feuilles

in vitro p. 12

- II -

3. Extraction des substances fongistatiques •••••..• p. 13

3.1. Extraction chloroformique .•••••••.••••••••• p. 13

3.2. Extraction méthanolique ••••••••••••••••.••• p. 13

3.3. Hydrolyse alcaline des tissus ••••••••.•••.• p. 13

3 ~ 4. Tests biologiques •••••••.•••••••••••••••••• p. 16

3.5. Les étapes de séparation - Schéma récapitu-

lat!f p. 16

3.5.1. Les extraits chloroformiques •••••••• p. 16

3.5.2. Les phases aqueuses, les extraits

méthanoliques et MeOH 50% ••.•••••••• p. 16

4. Techniques de purification .••••••••••.•••••••••• p. 17

4.1. Chromatographie sur colonnes ••.•••••••••••• p. 18

4.1.1. Résines échangeuses d'ions •••••••••• p. 18

4.1.2. Polyvinylpyrrolidone •••••••••••••••• p. 18

4.1.3. Gel LH 20

4.1.4. Silicagel Fluka 60 c.e

p. 19

p. 19

4.2. Chromatographie sur plaques •••••••••••••••• p. 20

4.2.1. Les systèmes d'élution •••••••••••••• p. 21

4.2.2. Les conditions de migration et

l'obtention des fractions ••••••••••• p. 21

4.3. Entraînement à la vapeur d'eau ••••••••••••• p. 23

4.4. Distillation sous vide •.••••••••••••.••.••. p. 23

4.5. Chromatographie liquide à haute performance

(C.L.H.P.) ••••..•••.••••.••••••••.••••••••• p. 24

4.5.1. C.L.H.P. analytique ••••••••••••••••• p. 24

4.5.2. C.L.H.P. préparative •••••.•••••••••• p. 26

- III -

5. Formation de dérivés

5.1. La méthylation

5.2. L'acétylation

p.

p.

p.

26

27

27

5.3. Exploitation chromatographique des dérivés. p. 28

5.3.1. Chromatographie sur plaques p. 28

5.3.2. C.L.H.P. analytique et préparative p. 28

5.3.3. Chromatographie en phase gazeuse

couplée à la spectrométrie de masse. p. 28

6. Dosage des phénols totaux

6.1. Techniques de dosage

p.

p.

29

29

6.2. Etude comparative des réactions de l'hôte .. p. 29

6.3. Etude de l'action de médiateurs

7. Etudes spectrométriques

7.1. Spectrométrie dans l'ultra-violet

p.

p.

p.

30

30

30

7.2. Spectrométrie de masse •...•••.•.•.•.•••.... p. 30

i7.3. Spectrométrie par résonance magnétique

nucléaire (R.M.N.) p. 31

8. Tests de toxicitê p. 31

8.1. Tests biologiques en C.C.M•••••....••.••... p. 31

8.2. Tests en milieu liquide en lames à

concavité p. 32

RESULTATS p. 33

1ère partie: Les facteurs de résistance ••••••••••• p. 33

1. Les sesquiterpènes p. 33

1.1. Techniques chromatographiques d'isolement •• p. 33

- IV -

1.1.1. Séparation sur colonne échangeuse

d r ions et C. L. H. P • ••••••••••••••.••• p. 33

1.1.2. Séparations chromatographiques sur

plaques et en C. L •H•P • •••••••••••••• p. 35

1.1.2.1. Chromatographie sur plaques p. 35

1.1.2.2. C.L.H.P. p. 36

1.1.3. Série LH 20 - Sesquiterpènes de phase

polaire p. 37

1.2. Préparation de dérivés

1.3. Essais de purification par entra1nement a la

p. 39

vapeur d' eau CI • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • p. 41

2. Les esters méthyliques d'acides gras insaturés et

leurs dérivés oxygénés ••.•••••••.•••••••••••.••• p. 43

2.1. Localisation et mode d'extraction •••••.•.•• p. 44

2.2. Techniques de purification ••.••••..•••.•••• p. 44

2.2.1. A partir de la phase chloroformique. p. 44

2.2.2. A partir de la phase méthanolique ••• p. 50

2.3. Contrôle de localisation ••••••••••••••••••• p. 51

2.4. Vérification de la nature des substances ••• p. 52

2.5. Caractères chromatographiques p. 53

2.5.1. En C.C.M. p. 53

2.5.2. En C.L.H.P p. 55

2.6. Etudes structurales - Vérifications chimi-

ques ...........•........•........•......... p. 58

3. Les composés phénoliques .•.••••.•..•••••••..•••• p. 64

3.1. Localisation et modes d'extraction p. 64

3.2. Repérage des zones toxiques ..••••..•••.•••• p. 64

- v -

3.3. Appréciation des rendements relatifs des

techniques à partir d'un extrait de tissus

de racines p. 66

3.3.1. Entrainement à la vapeur d'eau .•.••• p. 66

3.3.2. Traitement par le bicarbonate de

sodi'UIl\ •..•.••••••••••••••••••••••••• p. 66

3.3.3. Traitement par résines échangeuses

d'ions p. 67

3.3.4. Lyophilisation...................... p. 69

3.4. Présentation des séquences d'extraction •••• p. 70

3.4.1. Elimination des substances apolaires p. 70

3.4.2. Rétention des phénols libres •..••••• p. 70

3.4.3. Traitement par le polyclar

3.4.4. Purification sur gel LH 20

p. 70

p. 71

3.4.5. préparation de dérivés .•••••••••••.. p. 72

3.5. Les composés phénoliques

3.5.1. Modes d'obtention

simples . p. 72

p. 72

3.5.2. Les principales substances •••••..•.• p. 74

3.5.3. Les caractères chromatographiques •.• p. 74

3 • 5 • 3 • 1. En C. C . M. ..•............... p. 74

3.5.3.2. En C.L.H.P p. 77

3.5.3.3. En C.G.

4. La tomatine et la tomatidine

- S. M. • •••••••••••• p. 79

p. 83

4.1. Techniques d'obtention ••••••••..•••••.••••• p. 83

4 • 2. La tomatine- ;... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p • 83

4.3. ra tomatidine p. 86

- VI -

4.4. Interférences entre substances toxiques •••• p. 87

4.4.1. Fraction F

4.4.2. Cristaux D

..........................•••••••• ., ••••••••••••••• 1&.

p. 87

p. 89

5. La substance H

5.1. Techniques

•• ., ••••• O •• D.CI.ClIlCl ••• CI •••••••••••

d'isolement .

p. 90

p. 90

5.2. Caractères chromatographiques •••••••••••••• p. 91

5.3. Etudes structurales •••••••••••.•••••••••••• p. 91

2ème partie: Etude des réactions à l'infection

expér im.entale . " Cl • • • • • • • • • • • • • • • • • •• p. 93

1. Evolution des concentrations en phénols totaux p. 93

1.1. Variabilité de l'accumulation des phénols

totaux après l'infection •••••••••••••••••• p. 93

1.2. Influence des génomes confrontés

2. Etude chromatographique par C.L.H.P. en phase

aqueuse

p. 94

p. 97

2.1. Comparaison des extraits du cultivar Piéra-

line : témoin/inoculé par P. parasitiaa p. 97

2.2. Comparaison des extraits du cultivar Pié-

ralbo : témoin/inoculé par P. parasitiaa p. 99

2.3. Comparaison des extraits du cultivar Piéra-

line : témoin/inoculé par V. albo atrum p.101

2.4. Comparaison des extraits du cultivar Pié-

ralbo : témoin/inoculé par V. albo atrum p.103

2.5. Comparaison des réactions des deux culti- 103

vars à l'infection ••.•...•••••••••.•••••.• p.103

2.5.1. Infection par le P. parasitiaa ••••• p.

- VII -

2.5.2. Infection par le V. aZbo atpum p. 105

2.5.3. Différences de réactions selon le

parasite inoculé .•..•...•.•........ p. 105

3. Etude chromatographique par C.L.H.P. en solvants

organiques p. 107

3.1. Comparaison des extraits du cultivar Piéra-

line : témoin/inoculé par P. papasitiaa p. 107

3.2. Comparaison des extraits du cultivar Pié-

ralbo : témoin/inoculé par P. papasitiaa p. 107

3.3. Comparaison des extraits du cultivar Piéra-

line : témoin/inoculé par V. aZbo atpum p. 109

3.4. Comparaison des extraits de cultivar Pié-

ralbo : témoin/inoculé par V. aZbo atpum p. 109

3.5. Comparaison des réactions des deux cultivars

à l'infection P.109

3.5.1. Infection par le P. papasitiaa ..... P.I09

3.5.2. Infection par le V. aZbo atpum ..... p. III

3.5.3. Différences de réaction selon le

3ème partie

parasite inoculé

Etude de la modulation des réactions

de défense

p. III

p. 112

1. Evolution des concentrations en phénols totaux

1.1. Action de l'AOA sur des plants cultivés en

serre

p. 112

p. 112

1. 2. Essai de stimulation de synthèse de composés

phénoliques sur des feuilles en survie p. 114

1.2.1. Cas de feuilles du cultivar Piéraline p.lls

1.2.2. Cas de feuilles du cultivar Piéralbo p.116

- IIX -

2. Etude chromatographique par C.L.H.P. en phase

aqueuse CI • • • • • • • p. Il 7

2.1. Cultivar Piéraline : comparaison de l'action

AOA/TEPA CI Q CI CI •••• CI •••••••••••••• e - • • • • • • • • • p. 117

2.2. Cultivar Piéralbo : comparaison de l'action

TEPA/éliciteurs • • • • •. • • • • • . ••• • • • • • • ••• ••• p. 121

.3. Etude chromatographique par C.L.H.P. en solvants

organiques p. 123

4. Bilan des réactions de défense et de leur modu-

lation . . . . .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 123

4ème partie : Etude in vitpo de la toxicité des

phytoalexines •••••••.•.•.••••••.•••• p. 125

1. Les dérivés d'esters méthyliques d'acides gras.. P.125

1.1. Gamme de concentration p. 125

1.2. Inf luence du pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 127

1.3. Etude de la toxicité en fonction du temps p.127

1.4. Influence de la durée de contact sur la

survie .... Cl Cl •••••••••••••• III ••••••• III • • • • • •• p. 129

2. Les composés phénoliques et les alcaloides p.129

2.1. Influence du pH

2.2. Etude de la toxicité en fonction du temps

p. 130

p. 130

3. La substance H ................................. p. 133

3.1. Gamme de concentration

3.2. Etude de la toxicité en fonction du temps

p. 133

P·133

- IX -

4. Recherche de synergie entre inhibiteurs .••....• p.135

4.1. Entre dérivés oxygénés d'acides polyéniques

4.1.1. et des composés phénoliques

4.1.2. et la tomatine ou la tomatidine

4.1.3. et phénols et alcaloide

p. 135

p. 135

p. 135

p. 137

4.2. Entre substance H et les autres inhibiteurs p.137

5. Les symptômes d'inhibitions..................... p.139

DISCUSSION

1. La diversité des substances inhibitrices

p. 141

p. 142

1.1. La tomatine et la tomatidine

1.2. Les sesquiterpènes

1.3. Les composés phénoliques

.............. p. 142

p. 143

p. 144

1.4. Les esters méthyliques d'acides gras insa-

turés et leurs dérivés oxygénés ••••••••.•. p.146

1.5. La substance H

2. Toxicité in vitro

............................ p. 147

p. 148

3. La modulation de la réaction de défense

3.1. Modulation selon les génomes confrontés

3.2. Modulation physiologique

3.2.1. Rôle des inhibiteurs

3.2.2. Stimulation de la résistance

3.2.2.1. par le TEPA

p. 149

p. 149

p.150

p.150

p.151

p.151

3.2.2.2. par des éliciteurs fongiques p.151

3.3. Comparaison avec d'autres procédés de sti-

mulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 152

- x -

CONCLUS IONS GENERALES • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • p. 153

RESUME • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • p. 156

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • p. 158

ABREVIATIONS

- Ae

- Clf

- CyHx

- EtOH

- Hx

- Me et MeOH

- To

Acétate d'éthyle

Chloroforme

Cyclohexane

: Ethanol

Hexane

: Méthanol

Toluène

INTRODUCTION

- 1 -

INTRODUCTION

1. Importance alimentaire et évolution de la culture de la tomate

La culture de la tomate - Lyaopersiaumesau~entum Mill.­est actuellement répandue dans toutes les régions tempérées et

celles a climat chaud. Elle représente un appoint nutritif impor­

tant en Afrique, au Moyen-Orient, en Asie, en Amérique Centrale et

du Sud non seulement comme aliment frais mais aussi comme source

de vitamines et de sels minéraux. Le berceau d'origine de la tomate

est la cordillière des Andes dans des régions correspondant aujour­d'hui au Chili, à la Colombie, à l'Equateur et au Pérou. Cette

plante introduite vers 1550 en Italie (Pier Andrea Matteoli 1554

cité par Rick, 1978) fut connue dans tout le bassin méditerranéendès la fin du 16ème siècle. Son introduction sur le continent afri­

cain fut beaucoup plus tardive. Elle débuta vraisemblablement à la

fin du 18ème siècle à l'ile de Gorée au Sénégal (Ki-Zerbo 1972,

Condé 1984) et gagna le Cap Vert lorsque furent recherchées des

activités de substitution à la traite. Progressivement, la culture

de la tomate se propageait le long des cOtes du golfe de Guinée vers

l'Afrique Australe avant de pénétrer dans les régions subsahéliennes

oft les traditions alimentaires reposaient sur la consommation quasi

exclusive de céréales locales.

L'extension de cette culture est très différente selon

le degré d'évolution agricole: France 10.000 ha environ, Etats-Unis

200.000 ha, Liban (d'oft proviennent les parasites étudiés) 6.500 ha,

les superficies cultivées en Afrique, mal appréhendées, correspon­

dent à des jardins familiaux hormis quelques pJ.antations indus­trielles surtout au Sénégal et en COte d'Ivoire. Il en va de même

pour la consommation : quelques fruits par individu en zone sahé­

lienne lors de la saison des pluies, 25,5 kg en moyenne par indi­

vidu et par an aux Etats-Unis.

Les rendements moyens rendent compte de la pression para­

sitaire : de l'ordre de 60 T/ha aux Etats-Unis en culture exten­

sive, de 100 T/ha en France - principalement en maraîchage -

12,5 T/ha au Liban - exclusivement en maraîchage. Dans ce cas,

comme en Afrique ou en Asie, les pertes considérables résultent

- 2 -

d'attaques de parasites de racines - nématodes, agent du Corky

root (CoZZetotriahum aoaaodes et Pyrenoahaeta Zyaopersiai) et flore

fongique du sol Jde maladies vasculaires - verticilliose et fusa­

riose -)d'attaques du collet - Phytophthora sp. - et de nombreuses

infections foliaires d'origine cryptogamique ou virale. Les sour­

ces de résistance aux principaux parasites ont été trouvées parmi

les populations spontanées de Lyaopersiaum sp. de la cordillière

des Andes. Citons, entre autres, le Lyaopersiaum pimpineZZifoZium

Mill.pour la résistance au Fusarium oxysporum f. lyaopersiai Brushi

et au Phytophthora infestans de By, le Lyaopersiaum hirsutum var­

gZabratum Mill. pour les résistances aux CZadosporium fuZvum Cke'Jau

Beptoria Zyaopersiai Speg. et au Pyrenoahaeta Zyaopersiai Gerlach

(Pécaud et Laterrot, 1966). Cette énumération met en évidence que

des mécanismes communs de résistance à plusieurs maladies sont sus­

ceptibles d'exister chez ces Lyaopersiaum sp .• Des travaux l'ont

confirmé notamment pour deux maladies vasculaires, le flétrissement

bactérien et la fusariose (Kaan et Laterrot, 1977) et pour des in­

fections à Phytophthora sp. (Ravisé et Tanguy, 1971).

2. Historique de l'évolution des recherches sur les mécanismes de

résistance

L'importance économique de la culture et l'incidence des

pertes provoquées par le parasitisme fongique, bactérien et viral

sont prohablement les causes, au cours des quinze dernières années,

des nombreuses études physiologiques des mécanismes de défense de

la tomate. Contrairement à d'autres Solanacées - pomme de terre,

piment - ou à d'autres familles botaniques - Légumineuses, Malva­

cées - il n'a pas été possible jusqu'à maintenant de déceler, chez

la tomate, de substances inhibitrices majoritaires en dehors des

composés phénoliques et en de bien moindres concentrations d'un

alcaloïde, de sesquiterpènes et de substances polyacétyléniques. La

tomate n'est pas la seule plante dont les réactions au parasitisme

sont complexes. Stoessl (1982) indique que même chez la pomme de

terre au moins six voies métaboliques sont stimulées lors de la

réaction de défense par hypersensibilité au Phytophthora infestans.

- .2 bis -

LEGENDES DES PLANCHES l ET II

PLANCHE l

Photo N° l - Symptômes de pourriture du collet provoquée

par une infection expérimentale de P. parasitica

sur un plant de cultivar Kahalé âgé de 3 semaines.

Photo N° 2 - Symptômes analogues sur un plant de cultivar

Baïnou infecté naturellemt au stade montaison;

Liban,Jyié,septembre 1973.

PLANCHE II

photo N° 3 - Aperçu de la répartition de la mortalité

provoquée par le-E. parasitica au cours du

premier mois de végétation en parcelle expéri­

-mentale pour le cultivar Fiersol ( VFN ) possé-

-dant une certaine tolérance au champ pour le

~. parasitica. Liban,Arnchit,novernbre 1974.

Photo N° 4 - Symptômes de flétrissement irréversible,au

lever du jour,d'un plant de cultivar Kahalé au

stade floraison.Liban,Jounieh,septembre 1974 •

pl.1

pl.2

- 3 -

Chez l'aubergine, Ward et al. (1975) indiquent la multiplicité des

substances élaborées, notamment des sesquiterpênes, et les grandes

difficultés éprouvées pour les séparer. De même, Deverall (1977) a

extrait des substances fluorescentes fortement toxiques pour le

CZadosporium cucumerinum des tissus infectés de concombre, celles­

ci sont extrêmement labiles et se dégradent au fur et à mesure des

étapes de purification quelles que soient les techniques mises en

oeuvre.Très schématiquement et sans procéder à une énumération

exhaustive des études, nous allons tenter de pr4ciser les voies de

recherche concernant les mécanismes de défense chez la tomate. La

plante élabore vraisemblablement une série de barriêres biochimi­

ques, certaines des substances existant à de moindres concentrations

avant l'infection, d'autres étant synthétisées après l'intrusion

parasitaire. Le métabolisme des composés phénoliques est profondé­

ment perturbé. Cela aboutit à l'accumulation de nombreux produits

phénoliques libres, estérifiés ou conjugués et aussi à des polymé­

risations donnant de la lignine de néoformation (Glazener 1982)

comme chez le tabac (Massala et al. 1980), la pomme de terre

(Friend et al. 1973) ou le radis (Ohguchi et Asada, 1975). Cette

réaction est décelée dans les cas de résistance d'infections raci­

naires - Corky root (Davet et Ravisé, 1976), nématodes (Brueske et

Dropkin, 1973) - de maladies vasculaires - fusariose (Matta et al.,

1967), verticilliose (El Khatib et al., 1974 ; Pollock et Drysdale,

1976) - de collet - Phytophthora sp. (Ravisé et Tanguy, 1971) - ou

de fruits - Botrytis cinerea (Glazener, 1982) et mildiou (Trique,

1977) -

Matta et al. (1969) établissent que les accumulations de

composés phénoliques sont plus importantes chez les variétés résis­

tantes inoculées avec une souche non parasite de F. ozysporum qu'avec

une souche de F. ozysporum f. Zycopersici. Danko et Corden (1981)

établissent sans ambiguité, avec d'autres cultivars, que la résis­

tance à la fusariose est concomitante à l'accumulation de plu­

sieurs substances phénoliques. Pollock et Drysdale (1976) observent

une importante stimulation des activités d'enzymes impliquées dans

la biosynthèse de phényl propanoides chez des cultivars sensible et

résistant à la verticilliose ; le cultivar résistant accumule moins

de phénols que le sensible, sans doute à cause du blocage rapide de

- 4 -

l'infection. Cette hypothèse est corroborée par les travaux de

De Wit et Spikman (1982) sur l'élicitation de la résistance dans

les feuilles de cultivars sensibles et résistants à la clados­

poriose.

De même, les réactions en culture axénique de jeunes

plants à des infections par des Phytophtho~a sp. correspondent à

l'accumulation de composés phénoliques qui inhibent in vit~o la

croissance des agents pathogènes et l'activité de leurs enzymespectinolytiques (Ravisé et Tanguy 1971, Ravisé et Trique 1972a,

1972b, Trique 1981). Trique (1975, 1977) a démontré la précocité

de la réaction, dosable six heures après l'infection, et son expres­

sion à toutes les étapes du cycle végétatif.

La stimulation de synthèse de sesquiterpènes est décrite

dans plusieurs études de réaction à la verticilliose (Tjamos et

Smith 1974 et 1975, Elgersma 1978) et la fusariose (Mc Cance et

Drysdale 1975, Hutson et Smith 1980) ou à la cladosporiose des

fruits (De Wit et Flach 1979). Dans ces interactions, seule la

rishitine est identifiée à des concentrations relativement faibles

et le plus souvent associée à d'autres facteurs de résistance:

tomatine pour la fusariose, composés polyacétyléniques dans le cas

de la cladosporiose. Comme le souligne Stoessl et al. (1976), la

synthèse de rishitine semble dans toutes les interactions analysées

de moindre importance que celle de composés phénoliques ou d'alca­loides ; ils présument également, d'après leurs travaux et ceux de

Tjamos et Smith, la contribution d'autres sesquiterpènes provenant

de la même séquence de biosynthèse. Dans ces conditions, les recher­ches n'ont pas pu être étayées par des études fines de toxicité in

vit~o, en particulier de possible synergie avec d'autres produits

du métabolisme de la plante.

La structure des phytoalexines de nature polyacétyléni­

que décelées dans la résistance à la cladosporiose par De Wit et

Flach a été établie par De Wit et Kodde (1981) et leur contribution

confirmée par Elgersma et OVereem (1981). Il s'agit essentiellement

de falcarinol et de falcarindiol ; leurs concentrations sont rela­

tivement faibles dans les tissus mais leur toxicité est élevée.

- 5 -

Enfin, la contribution à la résistance de l'alcaloide ­

la tomatine - et de son aglycone - la tomatidine - est contrever­

sée. Gottlieb (1943) a établi que les broyats de tissus de tomate

sont toxiques pour le F. OZY8po~um. Fontaine et al. (1948) ont

démontré que la tomatine est le principal inhibiteur présent dans

les tissus sains dont les teneurs s'accroissent après l'infection.

Pourtant selon Kern (1952), l'alcaloide est surtout localisé dans

les feuilles. Il contribue à la résistance au Septoria tyaope~8iai

(Arneson et Durbin 1967, 1968) ainsi qu'à celle aux attaques de

P8eudomonas sotanaaearum (Mohanakumaran et al. 1969). Dans les

tissus infectés par le F. OZY8po~um f. tyaope~siai, une importante

stimulation de synthèse intervient et s'observe dès le premier

jour. Elle est plus marquée chez les cultivars résistants

(Langcake et al. 1972, Drysdale et Langcake 1973, Hammerschlag

et al. 1975)· sans qu'il soit possible d'affirmer la prééminence

de sa contribution à la résistance à la fusariose.

Une réponse partielle à l'interrogation sur la contribu­

tion des différentes substances toxiques mentionnées ci-dessus est

sans doute fournie par les expériences de stimulation des réactions

de défense de la tomate. L'apport de catechol induit, en moins de

24 heures, la résistance à la fusariose chez des cultivars sensi­

bles (Retig et Chet 1974) celle-ci étant associée à un important

accroissement des concentrations en phénols totaux dans les tissus.

De même, l'arrosage avec de l'acide quinique non toxique pour le

F. OZY8po~um f. tyaoper8iai (Carrasco et al. 1977, 1978) de plants

de tomate se traduit par une augmentation des teneurs en esters

phénoliques de l'acide quinique dans les racines puis dans les

tiges, en relation avec l'apparition de la résistance au parasite.

La stimulation de la résistance de feuilles de tomate au

Phytophtho~a aap8~a~ par l'éthyl phosphite d'aluminium est asso­

ciée, dans le cas des nécroses bloquantes, à une nette élévation

des teneurs en phénols totaux dans les tissus (Vo Thi Hai et al.

1979, Bompeix et al. 1980, Guest et Bompeix 1983). Cependant,

d'autres modifications du métabolisme de l'hôte semblent interve­

nir sous l'effet du T.E.P.A. lors de l'apparition des nécroses

- 6 -

bloquantes en particulier des sécrétions lipidiques accrues, ces

produits diffusant des vacuoles vers les espaces intercellulaires.

3. Nos objectifs de recherche

Dans le cadre de notre étude des réactions de défense de

la tomate à des infections cryptogamiques, plusieurs points sont

abordés :

- Nous avons tout d'abord tenté d'isoler, de purifier et

d'identifier certaines phytoa1exines et de déterminer la contribu­

tion à la résistance des substances appartenant à différents grou­

pes chimiques : phénols, sesquiterpènes, a1ca1o1des, composés po1y­

acétyléniques et substances lipidiques observées lors des expé­

riences de stimulation par le T.E.P.A ••

- Dans une seconde étape nous étudions l'évolution des

teneurs en phytoa1exines dans les tissus selon les génomes confron­

tés - Piéra1ine et Piéra1bo pour la plante hôte, P. parasitiaa etv. albo_atrum pour les agents pathogènes.

- Une troisième partie permet de déterminer l'effet de

certains médiateurs - inhibiteurs ou stimulateurs - de la réaction

de défense sur l'accumulation de phytoa1exines.

- Enfin, la dernière partie de ce travail analyse in vitro

la toxicité des facteurs de résistance pour le P. parasitiaa. La

cinétique et les modalités de l'inhibition sont établies pour chaquecatégorie d'inhibiteurs. La synergie d'action est recherchée entre

plusieurs groupes de substances chimiques naturelles ou de synthèse

biologiquement actives.

MATERIEL ET TECHNIQUES

- 7 -

MATERIEL ET TECHNIQUES

Les tentatives d'élucidation des structures des facteurs

de résistance et les études de leurs propriétés inhibitrices in

vitro ont impliqué la mise en oeuvre de nombreuses techniques. Par

ailleurs, l'instabilité chimique des produits étudiés de même que

les quantités utilisées dans les études de toxicité ont nécessité

un effort considérable de cultures en serre du matériel végétal.

Ainsi, l'exploitation de dix séries d'infections expér~entales,

échelonnées entre novembre 1982 et octobre 1984, correspond à plus

de 50 kg de tissus frais qui ont été extraits par les méthodes dé­

crites ci-dessous.

1. Le matériel végétal

1.1. La plante hôte

La tomate - Lyaope~siaum esauZentum Mill.- est une Sola­

nacée appartenant au genre lycopersicum. Les deux cultivars utilisés

pour cette étude sont des obtentions de Laterrot généticien à

l'INRA: Le cultivar Piéraline qui possède les gènes de résistance

Ph + S au mildiou et Ve à la verticilliose et le cultivar Piéralbo

isogénique de Piéraline par l'allèle Ve. Ils sont cultivés en serre.

Les graines des deux cultivars sont mises à germer en terrines pen­

dant 6 à 10 jours. Les plants sont ensuite repiqués en pots. Le sol

utilisé pourla culture correspond à un mélange de terre franche, de

terreau et de tourbe dans la proportion 2-2-1 ~ il est renouvelé

après trois séries d'infection expérimentale. Après transplantation,

en hiver et au printemps, les jeunes plants reçoivent une applica­

tion de solution nutritive minérale. Ils sont soumis à une tempéra­

ture de 22 à 30°C en été, de 18 à 24°C pendant les périodes froides

et à un éclairage d'appoint.

1.2. Les agents pathogènes

Afin de comparer les réactions physiologiques des culti­

vars aux infections expérimentales, deux parasites de la tomate

sont utilisés dans nos essais.

- 8 -

1.2.1. Phytophthora parasitica Dast.

c'est un champignon polyphage appartenant à la classe des

phycomycètes, le genre Phytophtho~a représentant l'un des princi­

paux parasites de l'ordre des péronosporales. Son thalle est cons­

titué de filaments mycéliens coenocytiques à parois cellulosiques

réfringeantes. La reproduction asexuée s'effectue par des sporo­

cystes qui libèrent des oospores biflagellées ou germent directe­

ment en formant des hyphes mycéliens. Ils correspondent à la forme

prédominante de la dissémination du parasite. Des chlamydospores

assurent la conservation dans le sol et dans les débris végétaux

(Riou et Ravisé 1970) dans lesquels le champignon peut survivre

sous forme s~prophytique. La reproduction sexuée permet vraisembla­

blement des remaniements génétiques (Ravisé 1966, Boccas 1978).

Chez la tomate, ce parasite provoque en région chaude une

pourriture molle du collet et des fruits (Ravisé et Boccas 1969,

Ravisé 1970).

L'isolat de P. pa~a8itiaa utilisé dans nos essais fut

isolé au Liban sur plants de tomate (Ravisé, 1975) : la souche est

conservée en tubes, avec des repiquages tous les trois mois. L'ino­

culum est préparé en boîtes de Pétri puis en milieu liquide dont la

composition est pour un litre d'eau distillée (Ravisé 1972) :

- 10 g de broyat de pois

- 15 g de glucose

- 20 ppm de polymyxine

0,2 g de MgS040,5 g de K2S040,2 mg de CaC120,2 g de K2HP040,8 g de KH2P04

- 15 g de gelose

1 mg de thiamine

0,5 mg de FeS040,5 mg de ZnS040,02 mg de CUS040,02 mg de MnC1 20,02 mg TiS040,02 mg de M070 2 (NH4 )6

Une infection expérimentale nécessite la préparation de

6 1 d'inoculum. A cette fin, le champignon est mis en culture en

erlenmeyer de 250 ml contenant environ 100 ml de milieu liquide.

- 9 -

La stérilisation à 110°C pendant 10 min. préserve· l'intégralité de

la structure de la thiamine. L'incubation des cultures a lieu en

étuve à 28°C et à l'obscurité.

1.2.2. Verticillium albo-atrum Reinke et Berth.

Cet agent pathogène appartient à la classe des adélomy­

cètes. Dans la famille des verticilliées caractérisée par des coni­

diophores en verticilles typiques se distinguent 3 genres dont le

genre VertiaiLLium est le plus important. Le thalle septé et fuligi­

neux porte des conidies solitaires formées à l'extrémité de conidio­

phores faiblement différenciés, légèrement constrictés à l'apex. La

conservation s'effectue grâce à des chlamydospores et à des sclérotes

(Boisson et Lahlou 1983 inter al.), on ne connait pas de reproduction

sexuée mais plusieurs études tendent à indiquer que la parasexualité

constitue, dans le genre VertiaiLLium, un facteur de variabilité

(Esser et Kuenen 1967, Typas et Heale 1976). Ce micromycète peut

vivre sous forme saprophytique. Chez la tomate, le V. aLbo-atrum

provoque fréquemment des occlusions d'une partie des stèles vascu­

laires et le jaunissement puis la fanaison des feuilles alimentées

par ces vaisseaux. Des coupes longitudinales des tiges permettent la

détection de la maladie reconnaissable au brunissement des vaisseaux.

La souche utilisée pour ce travail fut isolée au Liban de

plants de tomate (Davet Ravisé 1974). Elle est conservée en tubes

ou en boites de Pétri sur une décoction de malt, de pomme de terre

et de carotte gélosée à 20% 0 (Boisson et Lahlou 1981). Les repi­

quages sont effectués tous les quatre mois afin de limiter la variai

bilité. Le milieu de l'inoculum est identique mais exempt de gélose.

Les conditions de stérilisation des milieux et d'incuba­

tion des cultures sont les mêmes que celles observées pour le

P. parasitiaa.

1.3. Le champignon employé pour les tests de toxicité

Afin de repérer les substances toxiques sur les plaques

chromatographiques nous utilisons une souche de CLadosporium aLados­

porioides (Pers.) Lk. provenant du laboratoire de pathologie végé-

- 10 -

tale de l'Université Paris VI. Le champignon est cultivé en tubessur une décoction glucosée et gélosée de pommes de terre, les spo­res étant prélevées après 10 à 20 jours d'incubation.

2. Infections expérimentales

2.1. Stade végétatif des plants

Les inoculations sont réalisées sur des plants âgés de 4à 7 semaines, selon la vitesse de croissance, correspondant au

stade d'émission des ébauches florales. Les plants subissent unescarification au collet avant l'inoculation de P. parasitica ou de

v. aZbo-atrum à l'aide d'un scalpel sur 2 cm de haut.

2.2. Inoculation du P. parasitica

Les thalles du champignon sont dilacérés dans leur milieude culture à l'aide d'un broyeur Turmix. La dose d'inoculum, 15 mlde broyat, appliquée au collet de chaque plante correspond à envi­ron 10 mg de mycélium sec.

2.3. Inoculation du V. aZbo-atrum

Les cultures sont dispersées en quelques dizaines desecondes à l'aide du broyeur Turmix.

Une vérification au microscope permet d'apprécier la con­

centration de conidies dans la suspension qui varie entre 106 et5.106 par ml. Celle-ci est appliquée à raison de 10 ml au collet dechaque plant.

2.4. Application d'inhibiteurs en serre

Ces expériences n'ont été réalisées que sur le cultivarPiéraline.

2.4.1. Application d'acide a amino-oxy-acétique (A.C.A.)

L'A.C.A. est un inhibiteur compétitif de la phényl ammo­niac-lyase (PAL), enzyme du cycle des phénylpropanoides.

- Il -

Le traitement des plants débute une semaine avant l'ino­

culation du P. parasitica par trois applications d'AOA dont ladernière intervient la veille de l'infection. Puis quatre applica­

tions sont espacées entre le jour d'inoculation et la récolte.Chaque plant reçoit à chaque application 1 mg d'AOA déposé au pied

de la tige.

2.4.2. Application d'inhibiteurs Smith Klein et French

(S.K.F.)

Ces inhibiteurs bloquent en partie les biosynthèses déri­vant du malonyl Co A et du mévalonyl Co A (Reid 1968, Douglas et

Paleq 1974).

Nous avons utilisé deux produits :

- SK et F nO 3301 A : 2,2-diphényl 1-(6 diméthylamino éthoxy oxy)

pentane hydrochloride,

- SK et F nO 525 A : diéthylamino éthyl diphényl propyl acétatehydrochloride.

Le traitement débute une semaine avant l'infection expé­rimentale par pulvérisation sur le feuillage à la concentration de

-410 M dans une solution tampon phosphate à pH 7,2. Pendant la durée

de l'essai les solutions sont pulvérisées deux fois par semaine.

2.5~ Déroulement de l'incubation en serre

La température et le degré d'hygrométrie de la serresont contrôlés. Une pulvérisation d'eau 2 à 3 fois par jour per­

met d'éviter le dessèchement de l'atmosphère et de la ~erre despots.

Dans ces conditions, certains plants de Piéralbo inoculéspar le P. parasitica présentent des symptômes typiques.

- 12 ~

Entre le 3ème et le 4ème jour après l'infection apparais­

sent des nécroses brun clair à rougeatre sur le collet et la partiesupérieure du pivot. Puis progressivement le cortex devient vitreux,des lésions vert-sombre d'aspect vitreux progressent lentement. Lesass'ises parenchymateuses s'affaissent partiellement, les plantsatteints se plient et fanent. Aucun symptOme de jaunissement ou defanaison n'est provoqué par le V. atbo-atrum sur les deux cultivars.

Après 7 à 10 jours d'incubation - selon la saison - lesplants sont arrachés, les tiges sont sectionnées à environ 10 cmau dessus du collet. Les tiges et les racines sont lavées, séparées"pesées,pÙ!sconservées ~-18°C dans un congélateur.

2.6. Techniques d'inoculation sur feuilles in vitro

Les expériences sont réalisées avec des feuilles adultesprélevées des troisième et quatrième verticilles de plants âgés de5 à 7 semaines. Après désinfection superficielle, les feuilles sontblessées à la base du l~e par un emporte pièce de 6 mm de diamè­tre. Les implants calibrés de P. paraaitiaa sont prélevés sur descultures en bottes de Pétri âgées d'un mois à l'aide d'un emportepièce de 10 mm de diamètre et déposés sur la blessure.

La solution sur laquelle les feuilles sont maintenues ensurvie, est une solution de tampon phosphate de S8rensen, 1/15M,additionnée de polymyxine à 20 ppM.

Les médiateurs sont ajoutés en milieu tampon aux concen­trations suivantes :

- Tris-O-éthyl phosphDnate d'aluminium' (TEPA) 200 ~g/ml

- Acide arachidonique : 40 ~g/ml

- Glucosamine : 35 ~g/ml.

L'incubation se déroule en éclairement continu de l'ordrede 150 lux/m2 et à la lumière du jour pendant 8 heures, à une tem­pérature de 25°C, pendant 60 heures pour les feuilles de Piéralineet 110 heures pour les feuilles de Piéralbo.

- 13 -

3. Extraction des substances fongistatiques (fig. 1 et 2)

Les tissus congelés de tiges ou de racines sont dilacé­

rés à l'aide d'un broyeur Turrnix dans des solvants préalablement

réfrigérés.

3.1. Extraction chloroforrnique

Le broyage des tissus dans du chloroforme est utilisé pour ex­traire les substances apolaires et moyennement polaires -lipides, sesqui

terpènes, dérivés d'acides gras insaturés, etc •.• La diffusion est

réalisée à l'obscurité et à température ambiante pendant 24 heures.

L'eau de constitution des tissus est séparée par parti-tion de la phase chloroformique. Celle-ci est ensuite évaporée à sec et

reprise dans un mélange Hx : MeOH 87% (3 : 1) afin d'améliorer la

séparation des lipides (Galanos et Kapoulos 1962).

3.2. Extraction méthanolique

Deux voies sont suivies. D'une part les tissus préalable­

ment extraits au chloroforme sont repris pour une diffusion de 48

heures dans le méthanol dans les mêmes conditions que ci-dessus.D'autre part des tissus sont broyés directement dans du méthanol

50%, la diffusion des substances se réalise dans les mêmes condi­

tions.

Ce procédé permet l'extraction des composés phénoliqueslibres, des alcaloldes (tomatine et son aglycone) ainsi que des

substances en cours de caractérisation. Les lipides sont partielle­

ment éliminés par partition dans l'hexane ; les acides gras libresdemeurent en grande partie dans la phase méthanolique.

3.3. Hydrolyse alcaline des tissus

Dans certaines séries, après extraction méthanolique,

les tissus sont hydrolysés par une solution de potasse à 0,5N ou

à 2N dans le méthanol (Tanguy 1972, Kato et al. 1983). Au bout de

- 14 -

C.L.H.P. C.L.B.P. C.L.B.P.

~l.~Si+r~/ Si

C.L.B.P. Col. Si

~colonne polyclar

• 2e

extraction (48h)

méthanol

1

r ~méthylation gel LB 20

1 out plaques Si

Plaque~ /

n C.L.B.P. Col. Si C 18

des tissus Ji extractiondes lipides

~ ~Bexane phase méthanol

l -----eauCh~)f~_"' _

plaques plaquesSi + N03Ag Si

l l

partition

le extraction (24h)

chloroforme

lr

entraInementvapeur

sesquiterpènes

dérivés oxygénés

d'acides gras insaturés

phénols

tomatine

fractions F et B

Fig. l - Schéma d'extractions successives des tissus des

plants du cu~tivar Piéraline inoculés par le

P. parasitica par le chloroforme puis le méthanol

étapes de purification à l'aide du polyclar des subs­

tances toxiques polaires et apolaires.

- 15 -

substances retenuesneutre

phase acide

(pH 3)~

gel LB 20

hydrOlySr-a-l-c-a-l-i-n-e------=::ex::~::racï"'thanOliqu~th' • i

des tissus lu.ction C03 11N· /:~s~:~ssnes

lyophilisationd'un aliquot

test toxicitéC.C.M.

1

Plaques Si

1C.L.H.P.

1"'"

substancesapolaires

lcf. fig. 1

\fractions polaires

/ \méthylation Col. Polyclar

Col. Si Col. Si C 18

l lplaques Si plaques Si

"" /n C.L.H.P. Col. Si C 18

Fig. 2 - Schéma d'extraction méthanolique de tissus de plants

des cultivars Piéraline et Piéralbo inoculés par le

P. parasitiaa ou le V. albo-atrum soit à partir de

résines échangeuses d'ions soit de bicarbonate de

sodium.

- 16 -

24 heures, la phase neutre est extraite à l'acétate d~éthyle, laliqueur alcaline acidifiée à pH 3 puis les substances phénoliques

extraites au dichlorométhane.

3.4. Tests biologiques

Les fractions ci-dessus sont soit concentrées sous vide

à 40°C à l'aide d'un évaporateur Büchi, soit lyophilisées. Ces

échantillons sont alors chromatographiés sur plaque de silice dans

différents systèmes éluants afin de repérer les substances toxiques

à l'aide du test au C. aZadosporioides.

3.5. Les étapes de séparation. Schéma récapitulatif

Les extraits bruts, débarrassés d'une partie des substan­

ces lipidiques et des pigments lors de la partition dans le mélange

Hx-Me 87% (3 : 1) ou Hx : Me 50%, subissent plusieurs séries de

fractionnŒments.

3.5.1. Les extraits chloroformiques

Après partition dans le mélange Hx-Me 87% (3 : 1), ces

extraits sont chromatographiés sur colonnes atmosphériques de si­

lice, sur plaques préparatives de silice H et enfin en C.L.H.P. sur

colonnes desilice avec différents éluants.

3.5.2. Les phases aqueuses, les extraits méthanoliques

et MeOH 50%

Ils contiennent de nombreux produits oxydables - lipidi­

ques ou phénoliques - et des subs·tances polaires, certaines d'en­

tre elles étant dégradées ou polymérisées.

Afin d'en séparer les constituants par affinités nous

avons utilisé plusieurs séquences :

- 17 -

~ Résines échangeuses d'ions - MR7, XAD 2 -, polyvinylpy~rolidone

(polyclar), plaques préparatives ou colonnes atmosphériques de

silice, gel LB 20 et CLHP sur colonne de silice greffée en C 18.1

~ Certains extraits bruts sont traités au bicarbonate de sodium à

5%. Aprês extraction de la phase neutre par du chloroforme ou du

dichlorométhane, l'extrait est acidifié à pH 3 à l'aide d'acide

chlorhydrique, les phénols et les substances acides ainsi libé­rés sont extraits par du dichlorométhane.

Les séquences de purification sont ensuite identiques à

celles établies ci-dessus.

Les processus dé dégradation s'avérèrent plus importantslors de l'emploi des résines échangeuses d'ions que par la voie des

séparations à l'aide du bicarbonate de sodium. Cependant, les rési­

nes échangeuses d'ions retiennent davantage d'impuretés notamment

des acides libres, des substances basiques (cette fraction n'a pasété explo~tée quoique contenant des produits fongistatiques) et

même des pigments.

L'emploi des colonnes de polyclar et de LH 20 a permis

une relative séparation des substances polaires bien que des che­vauchements interviennent dans l'élution des fractions.

A tous les stades importants de purification nous avons

procédé à des tests d'activité biologique par chromatographie surcouche mince à l'aide du c. cZadosporioides.

4. Techniques de purification

Elles reposent pour l'essentiel sur différents procédés

chromatographiques. Cependant, les séparations des composés toxi­

ques s'avérant particuliêrement difficiles nous avons tenté d'amé­

liorer les purifications, notamment celles des dérivés des acides

gras en C 18, des sesquiterpênes et des composés phénoliques.

- 18 -

4.1. Chromatographie sur colonnes

D'une façon générale, les résines, les gels ou la silice

sont employés dans des colonnes de taille comprise entre 1 et 6 cm

de diamètre et 15 à 120 cm de hauteur de telle sorte que le rapport

pondéral entre échantillon et support soit compris entre 1/500 et

1/1000. Après équilibrage du support avec l'éluant initial, l'échan­

tillon, préalablement incorporé à quelques grammes de support et

séché sous vide en dessiccateur, est transféré sur le haut de la co­

lonne. La vitesse d'élution est comprise entre 0,5 et 2 ml/mn selon

la taille de la colonne.

4.1.1. Résines échangeuses d'ions

Nous avons utilisé 2 types de support, les résines Dowex

MR7 (Fluka) et amberlite XAD2 (Touzart et Matignon) possédant

d'importantes capacités d'échange H+ et OH-. Les résines sont mises

à équilibrer dans le premier éluant, le plus souvent de l'hexane,

celui-ci devant entraîner les substances neutres non fixées. Puis,

les composés acides ou phénoliques sont élués par du MeOH 80% ou

50% soit avec P04H2K de 0,1 à 0,5M soit en gradient de molarité

d'acide chlorhydrique.

4.1.2. Polyvinylpyrrolidone - polyclar réticulé ­

(Touzart et Matignon)

Ce support, accepteur d'hydrogène, fixe jusqu'à 30 à 40%

de son poids sec en phénols et en tannins. Le pH optimum de fixa­

tion des substances est voisin de 3,5. Un rendement maximum est

obtenu après un gonflement du polyclar pendant 24 heures. De nom­breuses références d'emploi du polyclar et d'élution en milieu

aqueux ou organique ont guidé notre expérimentation (inter al.

Quarmby 1968, Alibert 1973).

Les composés phénoliques non ionisés s'adsorbent bien

aux pH acides sur ce support, dans nos conditions expérimentales

la tomatine est également retenue. Une première élution à l'acétate

- 19 -

d'éthyle permet d'entrainer les substances peu retenues. Les pro­

duits polaires sont séparés par un gradient d'élution allant du

méthanol pur au MeOH 50% puis par du MeOH 50% additionné de P04HK2de O,IM à 0,5M. Toutes les substances actives sont récupérées à par­

tir de pH 8. Malgré d'importants chevauchements des produits, prin­

cipalement de composés phénoliques, entre les fractions MeOH,

MeOH 90%, MeOH 80% ou MeOH 50% nous obtenons un premier tri des

produits inhibiteurs. En particulier, les fractions basiques sont

enrichies en produits très polaires tels que la substance H.

4.1.3. Gel LH 20

Ce gel est l'équivalent, adapté aux solvants organiques,

des gels de chromatographie d'exclusion de la série sephadex uti­

lisés en phase aqueuse. Le gel LH 20, composé d'un dextran réticulé,

permet la rétention par adsorption dans le réseau de pores de subs­

tances, principalement phénoliques, dont le poids moléculaire est

inférieur à 3.000 daltons.

Les phénomènes de co-entrainement par des lipides (cf.

infra) ne nous ont pas permis de purifier de façon significative

les fractions provenant d'une première séparation sur polyclar.

Une partie des substances lipidiques, possédant vraisemblablement

des poids moléculaires élevés estéluée par le chloroforme. Toutes

nos tentatives d'élution sélective par l'isopropanol puis par le

méthanol ont échoué. Nous avons grossièrement séparé les composés

phénoliques et une partie de la substance H dans des fractions col­

lectées dans le méthanol.

4.1.4. Silicagel Fluka 60

La granulométrie de la silice employée varie de 20 à

60 ~.

Des séparations d'extraits bruts sur colonnes de silice

6 cm x 120 cm ont été tentées avec des séquences d'élution Hx-Ae

(2 : l et l 1), Ae pur, Ae-Me (5 : 1 à 1 : 1) et MeOH pur. Ces

séparations s'avèrent très lentes et de nombreuses dégradations

interviennent au cours de l'élution.

- 20 -

Fréquemment, des purifications complémentaires ont été

réalisées entre deux séries de chromatographie par C.L.H.P. pourtenter soit d'éliminer des impuretés (lipides, traces de polyclar ••• )

soit de séparer plusieurs produits élués dans une fraction corres­

pondant à un pic ultra-violet ou réfractométrique. MM. Einhorn et

Kunesch ont, par ce procédé, purifié sur des microcolonnes de si­

lice, les dérivés naturels d'acides gras en C 18 ainsi que les

monoépoxydes, le diépoxyde et l'alcool diénique de synthèse obtenus

à partir des acides linoléique et linolénique. Le plus souvent, les

séquences d'élution correspondent à la succession suivante : Hx,

CH2C12 , CH2C12-Ae (1 : 1), Ae et MeOH.

4.2. Chromatographie sur plaques

Nous avons comparé l'efficacité des séparations obtenues

par chromatographie de partage sur plaques et par chromatographie

d'adsorption sur gels de silice. La seconde technique nous a paru

moins polluante et plus performante malgré des résultats imparfaits.

Les systèmes chromatographiques utilisés correspondent aux techni­

ques mises au point pour séparer les substances naturelles

( Stahl 1969), James et Morris 1964) et à des systêmes adaptésà plusieurs plantes dont des solanacées (inter al. Hillis et

Ishikura 1968, Tanguy 1970, Ravisé et al. 1970 à 1981, Stoessl

et al. 1973 et 1975, Tjamos et Smith 1974 et 1975, Bompeix et al.

1980) •

Les chromatographies analytiques et les tests d'activité

biologique sont effectués en chromatographie sur couche mince

(C.C.M.) de silice de 0,2 ~m avec support plastifié (Schleicher et

Schüll LF 254), les chromatographies préparatives sont réalisées

sur plaques de verre avec de la silice GF - fluorescente à 254 nm ­

ou de la silice H en couche de 5 mm. Afin de modifier la migration

des substances à double liaison et de mieux les isoler la silice H

est parfois additionnée de 10% de AgN03 .

- 21 -

4.2.1. Les systêmes d'élution

Les principaux systêmes chromatographiques ont été adap­

tés aux groupes de substances biologiquement actives que nous ten­

tons de séparer.

Les sesquiterpênes et les dérivés d'acides insaturés

sont élués par les mélanges

Hx-Ae (2 1) CH2CI2- EtOH-H2O (85 12 . 2).cy Hx-Ae (l 1) Isobutylméthylcétone

Hx-Ae (l 1) Di-iso-propyléther

Hx-Ae-Me (50 . 50 . 5) Acétonitrile. .

Ces éluants ont également servi à mettre en évidence le phénomêne

de co-entra1nement de composés phénoliques par des lipides.

Les composés phénoliques sont séparés par :

Hx-Ae-Me

Clf-Me

Clf-Me

Clf-Me

{50 80

(95 5)

(8S 15)

(l:l)

12)

ges :

La tomatine et la substance H sont éluées par les mélan-

Clf-Me (85 : 15)

Clf-Me (l : 1)

Les élutions de plaques de silice H à 10% de AgN03 sont assurées

par un mélange To-Ae (2 : 1).

4.2.2. Les conditions de migration et l'obtention des frac­

tions

En chromatographie d'adsorption sur silice les

Rf = (distance parcourue par la sUbstance) diffèrent selon lesdistance du front au point de dépôt

structures et les substituants tant dans les solvants organiques

- 22 -

que dans les solvants aqueux. En particulier, les fonctions alcools

et les hydroxyles phénoliques abaissent le Rf. Par contre la méthy­lation l'augmente. Il en est de même pour une acétylation naturelle

ou ménagée. Nous avons essayé d'utiliser ces propriétés pour sépa­

rer entre eux les dérivés d'acides gras insaturés et les composésphénoliques. Cependant, quel que soit l'éluant utilisé nous n'avons

pas pu séparer de façon pratique les acides linoléique etlinoléni­

que de leurs esters méthyliques, des monoépoxydes ou des alcoolsdiéniques correspondants.

Pour les produits aromatiques tels que les phénols des

séries cinnamique et benzoïque et leurs dérivés nous avons obtenu

des séparations partielles avec d'importants chevauchements même

après deux chromatographies successives avec des systèmes de capa~

cité d'élution différente. Cette difficulté est accrue par le phé­

nomène de co-entraînement des produits phénoliques par des lipides.

La première étape d'identification des substances enC.C.M. est basée sur la comparaison du Rf de migration dans plu­

sieurs éluants avec celui des produits de synthèse. Puis cette

identification est affinée par la spectrométrie en ultra-violet etdans la plupart des cas par la spectrométrie de masse. Nous n'avons

pas tenté l'identification des dérivés des acides phénoliques ­

esters et glucosides - identifiés précédemment (Ravisé et Tanguy

1971, Ravisé et Trique 1972, EL Khatib et al. 1974) faute de subs­

tances de référence.

En chromatographie préparative, les produits correspon­dant à des zones de Rf sont repérés soit par leur fluorescence na­

turelle sous lumière ultra-violette à 254 ou 366 nm soit par l'in­

termédiaire du marqueur de fluorescence incorporé à la silice GF

qui présente cependant l'inconvénient de polluer de façon durable

les extraits. Pour la plupart des dérivés des acides gras insatu­

rés, les positions relatives des produits recherchés sont déter­

minées sur une partie d'une plaque préparative traitée au SbC13 à

saturation dans le chloroforme et révélée à 125°C.

- 23 -

Les différentes bandes de silice sont grattées à l'aide

d'une spatule et reprises dans un mélange Ae-Me (IO : 1) où se

dissolvent les produits recherchés. Leur extraction est réalisée

par filtration sous vide sur filtres Whatman P.T.F.E. à pores de

0,2 ~m. Les fractions sont ensuite séchées sous vide avec un éva­

porateur Büchi.

Au cours des chromatographies préparatives interviennent

d'importantes dégradations aussi bien des substances apolaires que

des produits phénoliques. Quelle que soit la fraction chromatogra­

phiée, à chaque séparation, nous observons au résiduel d'importan­

tes accumulations de substances altérées : dérivés complexes des

acides gras insaturés (Shimura et al. 1981, Kanazawa et al. 1983),

produits d'oxydation ou de polymérisation des composés phénoliques.

Parmi ces derniers, les acides phénoliques di-hydroxylés ainsi que

l'acide férulique et leurs dérivés s'avèrent particulièrement ins­

tables ce qui entra1ne des pertes très importantes. L'instabilité

de ces produits mentionnée dans la littérature (Friend 1981, Lewis

et Oxman 1984) a considérablement gêné nos travaux.

4.3. Entra1nement à la'vapeur d'eau

Une séparation originale de substances apolaires, notam­

ment de sesquiterpènes, a été utilisée par Moede (1983) à partir

d'extraitsbrutsde tissus de pomme de terre. Par barbottage de va­

peur d'eau dans une solution aqueuse, les substances les plus vola­

tiles sont entra1nées. La technique est transposée à des extraits

chloroformiques de tissus de tomate. L'objectif est l'élimination

des pigments et des acides gras qui gênent la purification des ses­

quiterpènes et des dérivés oxygénés d'acides polyéniques.

4.4. Distillation sous vide

Cette technique est mise en oeuvre par M. Kunesch au

laboratoire des médiateurs chimiques. Une distillation fractionnée

sous vide poussé permet la séparation de dérivés d'acides gras in­

saturés à partir d'échantillons partiellement purifiés sur plaques

- 24 -

de silice. Toutefois, des dénaturations interviennent, des concen­

trations de phtalates distillés aux températures utilisées limitent

l'emploi de la technique.

4.5. Chromatographie liquide à haute performance (C.L.Il.P.)

4.5.1. C.L.H.P. analytique

Cette technique permet une comparaison très fine des dif­

férents extraits entre eux. Elle permet également d'établir une

première corrélation entre des pics ultra-violets ou réfractomé­

triques et les résultats des tests biologiques réalisés sur plaques

chromatographiques. Des tests.chimiques caractérisent aussi les

substances et per.mettent de mieux les localiser sur plaques. Ils

sont de plusieurs sortes :

* Une pulvérisation de trichlorure d'antimoine à saturation dans le

chloroforme sur le chromatogramme porté ensuite à 110°C pendant

10 mn révèle les terpènes et les phénols.

* Les composés polyacétyléniques sont décelés par pulvérisationd'une solution de KMn04 à 1% dans 2% de Na 2C03 •

* La p. nitroaniline diazotée est un révélateur spécifique des phé­

nols. Elle est composée d'un mélange de trois produits

• 5 ml d'une solution de 4-nitroaniline à 0,5% dans une solution

d'acide chlorhydrique 2N

• 0,5 ml de nitrate de sodium à 5%

• 15 ml d'une solution aqueuse d'acétate de sodium à 20%.

Différentes colonnes sont employées au cours des C.L.H.P.

analytiques :

- 25 -

- colonne de silice, diamètre 3/8', longueur 30 cm, granulomêtrie

5 ~, dêbit de 1,5 à 2 ml/mn

- colonne de silice, diamètre 1/4', longueur 15 cm, granulomêtrie

5 ~, dêbit de 1 ml/Mn ..

Les solvants utilisês pour ces deux colonnes sont

Hx-Ae-Me (100 : 30 : 3)

Hx-Ae-Me (50 50 5)

Hx-Ae-Me (50 80 12)

Ae-Me (5 : 1)

MeOH pur

- colonne de silice greffêe en C 18, diamètre 3/8', longueur 30 cm,

granulomêtrie 7 ~, dêbit 2 ml/Mn

ou 2%)

L'êlution est ~ssurêe par des solutions acêtiques (5% 0

MeOH ou d'acêtonitrile.

- colonne de silice à 10% de AgN03 , diamètre 1/2', longueur 30 cm,

granulomêtrie 7 ~, dêbit 2 ml/mn

(1 4) •

Les solvants sont des mêlanges de To-Ae (2 1) et

Les analyses peuvent être rêalisêes en êlution isocratique

avec un seul solvant ou en gradient à l'aide de deux solvants.

Dans ce dernier cas, un ordinateur Apple II, reliê aux pompes, per­

met de rêgler le pourcentage des diffêrents êluants ainsi que le dê­

bit.

Les analyseurs consistent en un dêtecteur à ultra-violet

Shimadzu SPD-2A et en un rêfractomètre Knauer. Les deux appareils

sont employês lors d'une analyse isocratique, seul le détecteur à

ultra-violet fonctionne dans le cas d'une êlution graduelle.

- 26 -

4.5.2. C.L.H.P. préparative

Après avoir caractérisé et localisé sur plaques chromato­

graphiques les substances toxiques et avoir déterminé, grâce à laC.L.H.P. analytique, les méilleures méthodes d1élution pour. les pu­

rifier, nous travaillons à l'échelle préparative afin d'accumuler

des quantités importantes de produits toxiques. Deux sortes de co­

lonnes de silice sont employées

- colonne de 3/8 1, longueur 30 cm, granulométrie 5 ~, débit 1,5 ou

2 ml/mn

- colonne de 1/2 1 de diamètre, longueur 50 cm, granulométrie 7 ~,

débit 2,5 à 3 ml/mn.

Colonne de silice greffée en C 18

- colonne de 3/8' de diamètre, longueur 30 cm, granulométrie 7 ~,

débit 2 ml/mn

- colonne magnum 0.0.5., diamètre 1/2', longueur 50 cm, granulomé­trie 7 ~, débit de 2,5 à 3 ml/mn.

Colonne de silice à 10% de AgN03

- colonne de 1/2' de diamètre, longueur 30 cm, granulométrie 7 ~,

débit de 2 ml/mn.

Pour toutes les colonnes, les solvants utilisés sont les

mêmes qu'en C.L.H.P. analytique. Les deux détecteurs sont employés

au cours des purifications.

5. Formation de dérivés

Afin de pallier les difficultés de séparation résultant

des chevauchements de substances, plusieurs tentatives de dériva­

tion ont été effectuées.

- 27 -

S.l. La méthylation

Le principe est de remplacer par un radical méthoxy-OCH3­

un sommet hydroxylé ou l'hydroxyle d'une fonction carboxylique. Le

produit méthylé migre plus haut et, dans ces conditions, peut éven­

tuellement se séparer d'autres substances. Le procédé est utilisé

pour tenter d'affiner la séparation d'une part des sesquiterpènes

d'avec des acides gras insaturés ou leurs dérivés, d'autre part des

composés phénoliques entre eux ou d'avec des sesquiterpènes.

Au laboratoire, la méthylation est réalisée à l'aide du

trifluorure de bore dans le méthanol à 60°C pendant 1 heure. Après

refroidissement des échantillons, ceux-ci sont dilués à 10 volumes

d'eau distillée puis les substances méthylées sont extraites par

le dichlorométhane.

M. Kunesch a procédé à des méthylations par le diazomé­

thane. Cette méthode a l'avantage d'éviter la présence d'impuretés,

seuls se formant des polymères du diazométhane insolubles dans le

dichlorométhane.

S.2. L'acétylation

L'acétylation, réalisée à 30°C pendant 12 heures en pré­

sence de pyridine redistillée et d'anhydride acétique, permet de rem­

placer par un radical acétate - CH3COOo- une fonction hydroxyle

(alcoolique ou phénolique) .

L'ester ainsi obtenu migre beaucoup plus que la substance d'ori­

gine, il est aussi plus volatil. Nous avons tenté de séparer par

ce procédé des sesquiterpènes de dérivés d'acides gras et de com­

posés phénoliques.

- 28 -

5.3. Exploitation chromatographique des dérivés

5.3.1. Chromatographies sur plaques

La méthylation par le diazométhane est utilisée surtout

pour des fractions partiellement purifiées correspondant à des lots

de plusieurs kg de tissus. Après méthylation, les substances sont

séparées sur plaques préparatives de silice H dans les systèmes

Hx-Ae-Me (50 : 50 : 5) et (50 : 80 : 12).

Les tentatives de séparation sur plaques de silice des

substances acétylées n'ont pas donné de résultats satisfaisants.

5.3.2. C.L.HeP. analytique et préparative

La méthylation d'extraits chloroformiques de tissus est

utilisée pour la séparation des produits d'oxydation des esters

méthyliques des acides linoléique et linolénique sur colonne de

3/8' x 30 cm de silice 5 ~ à 10% de AgN03 . L'élution est assurée

par un mélange de To-Ae (2 1) et (1 : 1).

D'autre part, afin de limiter la dégradation des subs­

tances phénoliques, des fractions provenant de colonnes de polyclar

ont été méthylées avant d'être séparées sur colonne de silice gref­

fée en C 18 - granulométrie 7 ~ - O.D.S. magnum 1/2' x 50 cm à

l'aide de gradients de MeOH ou d'acétonitrile dans une solutionaqueuse à 5% 0 •

5.3.3. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spec­

trométrie de masse (CG-SM)

Les substances acétylées ou méthylées plus volatiles sont

éluées à de plus basses températures en CG.

La préparation de ces dérivés a permis de caractériserplusieurs produits d'oxydation d'acides gras insaturés ainsi que

les principaux composés phénoliques par chr0matographie en phase

gazeuse couplée à la spectrométrie de masse au Laboratoire desMédiateurs Chimiques.

- 29 -

6. Dosage des phénols totaux

6.1. Technique de dosage

La méthode de dosage employée, test de Folin, est basée

sur la grande oxydabilité des substances phénoliques en milieu al­

calin. Le réactif utilisé (Folin etCiocalteu, 1927) est réduit lors

de cette oxydation et la coloration bleue produite est proportion­

nelle aux taux de composés phénoliques.

Un volume d'extrait correspondant à une quantité connue

de tissus frais est additionné de 0,25 ml de réactif de Folin­

Ciocalteu et de 1 ml d'une solution aqueuse de Na2C03 à 20%. Le

volume total est ajusté à 5 ml par de l'eau distillée. La prise

d'échantillon ne doit pas contenir plus de 0,2 ml de MeOH.

Après une heure d'agitation, les lectures de densités

optiques sont faites par rapport à un blanc ne contenant que de

l'eau distillée et les réactifs sur un spectrophotomètre Beckman

à 725 nm.

L'estimation quantitative des phénols totaux est réalisée-4grâce à une gamme étalon d'acide chlorogénique 10 M préparée dans

les mêmes conditions que le dosage proprement dit. Les teneurs des

différents extraits sont exprimées en~g d'équivalent d'acide chlo­

rogénique par gramme de tissus frais.

6.2. Etude comparative des réactions de l'hôte

Ces dosages sont réalisés sur extraits de tissus de

Piéraline et de Piéralbo sains ou inoculés par P. parasitica ou

v. aZbo-atrum. Une comparaison du potentiel des réactions de dé­

fense des deux cultivars vis-à-vis de leurs agents pathogènes peut

ainsi être établie.

- 30 -

6.3. Etude de l'action de médiateurs

Les dosages de Folin sont également réalisés sur des ex~

traits de tissus de Piéraline ou de Piéralbo traitées par diffé­rents médiateurs des réactions de défense, inhibiteurs - A.O.A. ouS.R.F. - ou stimulateurs - TEPA, acide arachidonique et glucosamine.Ceci permet une évaluation quantitative de la modulation des réac­tions de défense chez l'hOte.

7. Etudes spectrométrigues

La progression des purifications des substances inhibi­trices est évaluée par spectrométrie dans l'ultra-violet. Les ten­tatives de détermination des structures des produits manifestantune activité biologique sont réalisées par des laboratoires spécia­lisés : spectrométrie de masse (SM) au Laboratoire des MédiateursChimiques sous la direction de M. Einhorn, spectrométrie de réso­

nance magnétique nucléaire (RMN) à l'Institut de Chimie des Subs­tances Naturelles du CNRS •.

7.1. Spectrométrie dans l'ultra-vio~et

Les spectres sont établis avec un spectrophotomètreBeckman 24 entre 380 nm et 200 nm dans le méthanol redistillé.L'évolution des pics caractéristiques permet d'apprécier d'une partles progrès de purification, d'autre part les pertes intervenuesau cours des séparations chromatographiques. L'ensemble des spec­tres établis sont comparés à ceux de produits de référence dispo­nibles.

7.2. Spectrométrie de masse

Cette technique n'est pas mise en oeuvre à notre niveau.Les substances à étudier sont ionisées par un faisceau d'électronspuis fragmentées. L'analyse des ions s'effectue à l'aide d'un fil­tre quadripolaire. L'appareil utilisé au Laboratoire des MédiateursChimiques est un système CG-SM Nermag RIO-laC piloté par ordinateur.

- 31 -

Les spectres de masse sont effectués en ~pact électronique, éner­gie des électrons = 70 eV, et en ionisation chimique, énergie desélectrons = 90 eV. La température de la sour~e est de 110°C.

Un couplage de CG-SM est réalisé avec un chromatographe

en phase gazeuse Perkin Elmer 3920 â détecteur par ionisation deflamme équipé d'une colonne capillaire chargée de CP Sil 50 p. Lechromatogramme Girdel utilisé est équipé d'une colonne capillairechargée soit de phase apolaire (CP Sil 5), 25 ou 50 m, soit polaire(CP Wax) 25 ou 50 m. La température d'élution est programmée de 160°C

â 240°C avec une progression de 10°C par minute,'

7.3. Spectrométrie par résonance magnétique nucléaire

La spectrométrie parrésonance magnétique nucléaire (RMN)

du proton est basée sur l'interaction des noyaux de molécules avecun champ magnétique de grande intensité.

Les noyaux donnant une résonance se comportent comme descharges orientées émettant leur propre champ magnétique interfé­rant avec celui de l'appareil. Le spectromètre de l'Institut de

Chimie des Substances Naturelles est un appareil Bruker de 400 MHz.

Les interprétations des spectres de CG-SM et de RMN sontr~alisées par MM. Einhorn et Kunesch, ch~istes du laboratoire desmédiateurs chimiques.

8. Les tests de toxicité

8.1. Tests biologiques en C.C.M.

A chaque étape de purification des extraits nous nousassurons de la présence et de la non dégradation des substancestoxiques grâce â un test biologique. La technique consiste à pulvé­riser, sur la plaque chromatographique, une suspension de spores dec. aZadosporioides et un milieu nutritif P.D.A •• La plaque est en­suite mise en incubation en étuve à 28°C en milieu atmosphériquesaturé d'humidité. Après deux ou trois jours, le mycélium noir du

champignon s'est développé sur toute la plaque, des plages blanches,

révèlent la présence des zones fongitoxiques.

- 32 -

8.2. Tests en milieu liquide en lames à concavité

Ces tests sont réalisés avec le P. parasitiaa. Les subs­

tances toxiques purifiées sont dissoutes dans du méthanol puis in­corporées à concentration connue au" milieu minéral de culture. La

teneur finale en alcool est toujours de 2%. Une concentration équi­

valente de méthanol est incorporée aux solutions témoins.

La toxicité des produits testés est déterminée en lames

à concavité pour une gamme de concentration comprise entre 50 et

250 ~g/ml. Les implants de P. parasitiaa sont soit des hyphes végé­tatifs soit des fragments de thalles gélosés contenant sporocystes

et chlamydospores. La toxicité des substances purifiées est égale­

ment étudiée en synergie avec celle de huit phénols et de deux al­

caloides déjà connus pour leur fongitoxicité.

Les lames sont lutées à la lanoline afin d'éviter toute

évaporation du milieu de culture. Elles sont mises à incuber en

étude à 28°C et à l'obscurité. Les observations s'échelonnent sur

une durée de 3h30 à 72 h.

RESULTATS

- 33 -

RESULTATS

1ère PARTIE

1. Les sesquiterpènes

LES FACTEURS DE RESISTANCE

Nous avons éprouvé d'importantes difficultés à séparer

les sesquiterpènes présumés contribuer à la toxicité des extraits

de tissus des cultivars Piéraline et Piéralbo pour le P. parasitiaa

et le V. albo atrum. Nous indiquons cinq des méthodes suivies pour

les purifier.

1.1. Techniques chromatographiques d'isolement

1.1.1. Séparation sur colonne échangeuse d'ions et C.L.H.P.

La fraction initiale correspond aux substances apolaires

obtenues lors de la partition d'un extrait brut entre l'hexane et

le méthanol 87% (3 : 1). Cet échantillon est ensuite déposé sur une

colonne de résine échangeuse d'ions MR7 - 90 cm x 4 cm - Les sesqui­

terpènes se retrouvent dans la fraction contenant les substances

apolaires non fixées sur la résine, pesant 84 mg. A ce stade, est

vérifiée la persistance de la toxicité et celle de la réaction colo­

rée au trichlorure d'antimoine caractéristique des sesquiterpènes

recherchés.

La fraction est purifiée par C.L.H.P. avec la double dé­

tection ultra-violette et réfractométrique sur colonne de silice

irrégulière de 7 ~ - 1/2' x 50 cm - puis sur colonne de silice 5 ~­

3/8' x 30 cm -. Dans chaque cas l'élution est d'abord réalisée par

un mélange Hx-Ae-Me (100 : 30 : 3) puis (50 : 50 : 5). L'échantil­

lon est scindé en deux fractions en fonction de l'accumulation de

substances toxiques: l'une principalement vers Rf 0,35 pesant 3 mg,

l'autre vers Rf 0,43 pesant 6 mg en CCM avec l'éluant Hx-Ae-Me

(5 a : 50 : 5).

Les études de structure sont effectuées par chromatographie

gazeuse couplée à la spectrométrie de masse. Elles sont réalisées en

impact électronique et en ionisation chimique par l'ammoniac. D'au­

tre part, des spectres sont établis par introduction directe des

rIERltA·;:"S [DAAflLE: A' AfltllE 1.

l tOOy'a h,

- 34 -

[100. 10J 31-JFttl-t;)J;; \- Jk:l-:~ l

, 1{,:-.)If. 'al

2

rit .........; .....; [r...,",,:f"1LE HI ••Iollt. "

11''--'''U '.,~...,. _.-

ri il

"'1 ~"1 r 1

i,l/. 1:':'1'11'; ,!: 1 1 1. ''····'f····.

€,(I

IlE:PM~r.'SlDAA

f"1LC A' 'TllIlATCO?

,1

[100. 101 :U-JkI'l-U':U-JHtl-e3 12

43

791 9 143

Fig. , Elution en C.G. - S • r'I • du sesquiterpène...J

de~

232 et de (Sc. 442) ~1"~ = son spectre massespectre de masse du sesquite!"1]ène de ..+ = 222 (Sc. 996) •1'~

262

280

300

300 320 340 , 360 380 400

- 35 -

échantillons dans la source du spectromètre de masse.

Par ce procédé, sont reconnus trois sesquiterpènes. L'und'eux est mal caractérisé. Les deux autres (fig. 3) correspondent

+à des masses de M = 222 - m/z 204 (M-18), 189, 173, 161, 143, 131,+119, 107, 105, 95, 93, 91 - (SC.781) et de M = 232 - m/z 204 (M-28)

189, 176, 161, 143, 131, 119, 105, 95, 93, 91 - (SC.442).

Le sesquiterpène de masse 222 est caractérisé par la

perte d'un hydroxyle (M-1B) puis d'un carbonyle (M-1B-29). Il s'agit

probablement d'un alcool sesquiterpénique.

1.1.2. Séparations, chromatographiques sur plaques et en1

C.L.B.P.

1.1.2.1. Chromatographie sur plaques

Des essais comparatifs de purification de la fraction con­tenant les sesquiterpènes sont réalisés sur p~aques de silice GFavec différents éluants. Ceux-ci ont été choisis parmi les référen­ces indiquant les possibilités de séparations sélectives de lipidesou de substances polaires. Le mélange CH2Cl2 - Et OB - 5 20 (85 : 122) sépare relativement bien les sesquiterpènes des produits polaires,

en particulier des acides gras libres, mais présente deux inconvé­nients. L'élution est irrégulière en chromatographie préparative à

cause de la non miscibilité des solvants. Les sesquiterpènes restentmélangés avec des lipides notamment les esters méthyliques d'acidesgras en C 16 et C 18.

L'isobutylméthylcétone entralne une partie des substancesapolaires, la fraction contenant les phénols et les sesquiterpènesreste au résiduel.

Le di-iso-propyléther fournit des séparations irréguliè­res dépendant des changements de température.

- 36 -

L'acétonitrile s'avère le plus performant, une bande si­

tuée entre les Rf 0,10 et 0,25 contient les sesquiterpènes. Cet

éluant est retenu pour les séparations chromatographiques sur pla-

·ques préparatives de silice H. Elles concernent une fraction apo­

laire de 700 mg provenant d'une extraction de tissus par le chloro­

forme et d'une partition dans l'hexane et le méthanol 87%. Les pro­

duits situés dans la zone de Rf compris entre 0,10 et 0,25 sont en­

suite chromatographiés deux fois sur plaques de silice H avec pour

éluant le mélange Hx-Ae-Me (50 : 50 : 5). Deux bandes correspondant

respectivement aux Rf 0,60 - 0,40 et 0,40 - 0,20 sont retenues.

Elles contiennent des substances toxiques présumées correspondre à

des sesquiterpènes.

1.1.2.2. C.L.H.P.

Des essais comparatifs de séparation sont réalisés sur

colonne de silice 5 ~ - 3/8 1 X 30 cm - et sur colonne de silice 7 ~

greffée en C 18 - 3/8 1 x 30 cm -. Dans le premier cas les éluants

sont les mélanges Hx-Ae-Me (100 : 30 : 3) puis (50 : 50 : 5), dans

le second de l'acétonitrile à 40%, 55%, 70% et du MeOH 90%. La

chromatographie sur colonne de silice élimine bien les substances

polaires en particulier les phénols mais sépare mal les lipides ­

esters méthyliques diacides gras en C 18 etc ••• - des sesquiterpènes.

Au contraire, sur colonne de silice greffée en C 18, les lipides sont

mieux séparés des sesquiterpènes qui sont élués dans les fractions

contenant des phénols ; les pertes de substances sont importantes.

L'alternance des deux systèmes chromatographiques a ~té essayée.

Cependant le rendement - poids de substances collectées par rapport

aux poids injectés - était si faible que ce procédé de purification

nia pas été retenu.

Après trois purifications successives sur colonne de

silice 5 ~ - 3/8 1 X 30 cm - deux fractions toxiques pesant 10 mg

et 8,5 mg aux Rf compris entre 0,45 et 0,35 dans le solvant Hx-Ae-Me

(50 : 50 : 5) ont été soumises à l'analyse structurale. Le chromato-

graphe en phase gazeuse équipé d'une colonne capillaire apolaire avec

une programmation de chauffage de 160°C à 225°C est couplé au spec­

tromètre de masse. Les spectres sont établis en impact électronique

- 37 -

et en ionisation chimique avec l'ammoniac. La fraction la moins

polaire contient trois substances aliphatiques de masses M+ = 138,

152 et 170 ainsi que des dérivés d'oxygénation d'acide diénique+reconnus ultérieurement (M = 310) et un sesquiterpène. Celui-ci

de masse M+ = 222 - m/z 204, 189, 175, 161, 143, 131, 119, 107,

105, 95, 93, 19 - (SC.1013) ne possède pas le même pic de base que

le précédent sesquiterpène de même masse moléculaire, il s'agit

probablement d'isomères. Dans la deuxième fraction, trois produits

représentent environ 80% de l'échantillon. Ce sont également des

substances aliphatiques possédant des fonctions alcool secondaire.+Le sesquiterpène contenu dans cette fraction a pour masse M = 222.

D'après sa fragmentation, il est un isomère des deux précédents mais

sa rétention en CG est différente. Il est élué à une température

comprise entre 200 et 220°C tandis que les produits majoritaires sont

élués entre 220 et 225°C, c'est pourquoi il fut envisagé de le puri­

fier par chromatographie en phase gazeuse préparative sur une colonne

de silicone de 1 mm de diamètre intérieur. Des incidents techniques

n'ont pas permis de réaliser ce projet.

1.1.3. Série LH 20. Sesquiterpènes de phase polaire

Une fraction polaire é1uée par le méthanol d'une colonne

de gel LH 20 s'est avérée contenir deux sesquiterpènes. Ceux-ci ont

été séparés au cours de trois chromatographies sur colonne de silice

greffée en C 18 - 3/8' x 30 cm - avec un gradient d'acétonitrile de

5% à 80% soit dans un tampon P04H2K O,OlM à pH 2 soit dans une solu­

tion acétique à 5%0. Les deux échantillons polaires ont été étu­

diés en CG-SM. La séparation est effectuée sur colonne capillaire de

silicone chauffée de 150°C à 250°C.

La fraction contenant le premier sesquiterpène est toxi­

que au Rf 0,75 - 0,80 sur plaque de silice éluée par le solvant

Hx-Ae-Me (50 : 80 : 12). L'analyse structurale permet de déceler

quatre groupes de substances élué5 à partir de 200°C, vraisembla­

blement des hydrocarbures saturés. Le sesquiterpène (fig. 4) est+élué avant 200°C, son poids moléculaire est M = 222 - m/z 208, 204,

189,177, 161,143, 131,119,105,95, 93, 91 - (SC.871). D'après

r~SIDHR

nu: .o' TDtMTE:Ol

- 38 -

C1QD, 10]

POL.2 CPSIL5 l~O~C SCANSOO 10MOIC.MIN240WC

l'

1?42

0:5-JUL.-i30:5-JUL.-i3

TIC-o

2:521

tart~·SID"RnLt Al TOIto:oTtQl

d' -. oA .....:. •...:.~:.:.,'-"'1. .."Q. ...

~

1000 l~OO

Cl00, 10::1

3000

O~-JUL.-i3

OS-JUL.-S3

SCAN-e?l-e=s

2

?991

143161

... 4

Fig. 4 - Elution en CG-SM et spectre du sesquiterpêne de+

M = 222 obtenu dans une phase polaire.

- 39 -

sa polarité, ce sesquiterpènes est différent des précédents bien quela fragmentation indique la présence d'une fonction alcool et pro~

bablement d'une cétone.

La toxicité de la seconde fraction polaire est décelée auRf 0,65 dans les mêmes conditions d'élution. Ce sesquiterpène a une

+masse M = 220 - m/z 205, 189, 169, 159, 143, 131, 121, 105, 91 -(SC.1287). Parmi les hypothèses nous envisageons la présence d'unefonction cétone. Ce produit pourrait correspondre! une forme réduite

+de la solavetivone qui a pour masse M = 218. Dans cette même frac-tion la CG-SM détecte un stéroïde en C 21 pouvant représenter 20% de

l'échantillon.

+Un autre sesquiterpène de masse M = 222 fait parti4 dela fraction toxique H (cf. infpa) obtenue dans des conditions pro­ches de celles décrites ci-dessus. La fragmentation de ces deux ses­

quiterpènes polaires est quasi identique.

1.2. Préparation de dérivés

Les difficultés de purification nous ont incitée! prépa­rer des dérivés par acétylation et par méthylation.

L'acétylation des fractions apolaires contenant principa­lement des substances lipidiques, des sesquiterpènes et quelquesproduits phénoliques provoque des modifications de migration nonsélectives.

Par contre, la méthylation est plus performante. Au labo­ratoire, elle est réalisée sur de petits échantillons à l'aide de

BF3 dans le méthanol. M. Kunesch, au laboratoire des médiateurschimiques, a effectué des méthylations au diazométhane d'une partsur un échantillon de 60 mg déj! purifié par C.L.H.P., d'autre part

sur une fraction de 600 mg provenant d'une partition dans l'hexaneet le méthanol 87%. Pour cette dernière, les étapes de séparation

sur plaques de silice H et en C.L.H.P. sur colonne de silice sontanalogues à celles décrites ci-dessus. Les acides gras et les phé­nols méthylés ont leursRf accrus dans les éluants Hx-Ae-Me

- 40 -

ne-o

Fl9_ 5 - EluCiaa ea CG-SM de. deux aesquiCerpane. de K+ • 236(Sa.S7. ec 9U) et: spect:re du .esqult:erptne _jari­taire (~a.874)

100 2GO :00 4ClO soà lIOG ?OO 800 sao &000 uao &200

UOO. &02 23-JUl1-83 •tCRfUlCotSlDM n-JUlI-83rU.1: AI .,..mERer.l

&oo:r- ~a ·&21~.1SC~-r.a

91 l 3l 9 ~

41

240 260 320

- 41 -

(100 : 30 : 3) et (50 : 50 : 5) tandis que ceux des sesquiterpènes

ne sont pas modifiés. Par ce procédé, après quatre séries de chro­

matographie en C.L.H.P. sur colonne de silice 7 ~ - 1/2' x 50 cm ­

puis sur colonne de silice 5 ~ - 3/8' x 30 cm - nous avons fourni

quatre échantillons pesant respectivement 6 mg, 3 mg, 2 mg et 2 mg

pour l'étude structurale. Les sesquiterpènes sont concentrés dans

les échantillons 2 à 4 mieux purifiés. L'un des sesquiterpènes a+pour masse M = 222 - m/z 208, 204 (M.l8) , 190, 161, 143, 131,

120, 105, 95, 93, 91 -. Il correspond au produit représentésur la fig. 5. Nous notons une ressemblance avec le produit de la

fig. 3. Deux autres sesquiterpènes ont la même masse M = 236. Ils

sont élués avec des temps de rétention différents en CG sur colonne

capillaire apolaire. Leurs fragmentations, malgré des analogies,

diffèrent au niveau des fragments 189, 135, 133, 131, 94 (fig. 5).

Ce sont probablement des isomères. Ils possèdent la même masse molé­

culaire que la lubimine (st~essl et al. 1976). Le pic à 204 (M-32)

correspond à la perte d'une molécule de méthanol. La perte d'un

fragment 29 peut être l'indice de la présence d'une fonction cétone.

1.3. Essais de purification par entraînement à la vapeur d'eau

L'étude de Moede (1983) sur extrait de pomme de terre

indique que la vapeur d'eau entraîne des sesquiterpènes d'un échan­

tillon aqueux. Nous avons essayé de transposer la méthode à la

tomate.

L'essai initial est réalisé avec un échantillon peu puri­

fié pesant 60 mg. La vapeur d'eau entraîne effectivement le sesqui­terpène de masse M+ = 222. Nous avons tenté de purifier des frac­

tions de C.L.H.P. pesant Il mg puis cinq fractions provenant dechromatographies préparatives pesant au total 356 mg. Les contrôles

de toxicité indiquent que celle-ci est conservée au Rf initial aprèsl'entraînement à la vapeur. Cependant, l'analyse en C.L.H.P. sur

colonne de silide 5 ~ - 3/8' x 30 cm - révèle que des substances

lipidiques sont toujours associées aux sesquiterpènes. Il a étéétabli ultérieurement qu'il s'agit des dérivés d'acides gras en

C 18. Des essais de séparation sur plaques de silice imprégnées de

10% de AgN03 suivis de C.L.H.P. sur colonne de silice 7 ~ à 10% de

AgN03 - 1/2' x 30 cm - avec pour éluants des mélanges To-Ae (2 : 1)

et (1 4) s'avèrent insuffisants.

42 -

11ER"~G/S 1OHR,.. IL.( .:lI TOMai

[100. 10l 22-üEI:-8~

::':::-DCC-S:·2

100~D 1 410806322 li

TI CaO

953

2200200:10ISOO:I1400

T~~--...

773

NEPMAG/SIOARF'ILE AI TOMO 1

ClOO. 10l 22-0EC-13322-DEC-133

6

100~- 2097100a RT -1014".21"5

SCAH"617-393

79

54

41

67

9

91

147

190

1::10

17S

160

161

140

121 133

120

203

J219

'I-r1rlf4l-l'+lt.....,-IIJj.4'+-fflLjLjl.r.......,..a,JIfJJ.I.rTT'1~.....,rrr'tTl.......-rj 1 1 1 j i 1 1 1· i ' 1 Iii l , , , i"200 220 2-10100el)6040

Fig. 6 - Elution en C.G. - S.M. et spectre de masse

du sesquiterpène de M+ = 246 ( Sc. 617 )

246

300 320 3401

360

- 43 -

Par cette voie, nous obten~ns principalement un sesqui-+terpène de masse M = 246 - m/z 218 (M-28), 203,200,190,161, 147,

133, 121, 105, 95, 93, 91 - (SC.617). La figure 6 représente l'élu­

tion de la fraction et le spectre du produit.

D'après la fragmentation il pourrait s'agir d'un céto­alcool. Nous ne connaissons pas de produit directement comparable

(Stoessl, 1983).

Ainsi, nous avons séparé par les différents procédés neuf

sesquiterpènes correspondant à des poids moléculaires de 220, 222,

232, 236 et 246. Dans le groupe de M+ = 222 existent au moins deux

séries d'isomères. Toutes ces fractions s'avèrent toxiques pour le

P. parasitiaa in vitro. Nous n'avons pas pu comparer ces sesquiter­

pènes avec des échantillons de solavetivone, de lubimine et d'oxy­

lubimine gracieusement fournis à M. Einhorn par le professeur AkioMurai de l'université d'Hokkaido, ceux-ci s'étant dégradés pendant

le transport.

2. Esters méthyliques d'acides gras insaturés et leurs dérivésoxygénés

Des fractions toxiques s'avèrent contenir presque exclu­

sivement des substances Jipidiques. Elles sont retrouvées réguliè­

rement dans toutes les séries d'infections expérimentales. L~ plu­

part des tentatives de purification par chromatographie sur plaques

de silice préparatives ou par C.L.H.P. aboutissent à la dégradationde la quasi totalité des produits manifestant in vitro des proprié­tés biologiques. Il s'est avéré, à la suite d'analyses par spectro­

métrie de masse, que les substances inhibitrices appartiennent à

différentes séries d'acides gras insaturés. D'après les études de

M. Einhorn en chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectro­métrie de masse, il s'agit d'esters méthyliques d'acides gras en C 9-­

nonanoates de méthyle - en C 16 et principalement en C 18 - linoléate

et linolénate de méthyle - ayant subi une oxydation. La première hy­pothèse envisagée, d'après l'étude des fragmentations en SM, fut

l'existence d~ monoépoxydes de ces trois groupes. La deuxième hypo-

- 44 -

thèse, après la réalisation de spectres de RMN sur des produits

purifiés par CG préparative, fut l'existence d'alcools diéniques

conjugués dans le cas des esters méthyliques d'acides insaturés

en C 18.

2.1. Localisation et mode d'extraction

Ces substances sont trouvées dans toutes les parties de

la plante atteintes par le parasite : base de la tige, collet et

racines. Elles s'y trouvent sous forme d'esters méthyliques libres,

probablement dans le cytoplasme ou dans les vacuoles. En effet, ces

produits diffusent rapidement hors des tissus lors de l'extraction

chloroformique. Néanmoins, une seconde extraction de ces tissus par

le méthanol permet d'en recueillir des quantités non négligeables.

Il est à noter que l'extraction chloroformique est écour­

tée afin de limiter les dégradations des substances migrant dans la

phase aqueuse (eau de constitution des tissus) ; ceci pourrait ex­

pliquer une extraction partielle. Les substances recueillies dans

la phase méthanolique correspondent à une diffusion plus lente.

Elles possèdent peut-être des liaisons plus stables avec le contenu

cellulaire que les substances diffusant dans la phase chloroformi­

que; l'existence de ces liaisons reste à prouver. Selon une autre

hypothèse, le broyage au mixer dilacérant mal les tissus, il est

possible que les substances extraites par le méthanol proviennent

d'assises cellulaires situées au centre des fragments tissulaires,

la phase chloroformique n'extrayant que le contenu des cellules

endommagées ou se trouvant à la périphérie des fragments.

2.2. Techniques de purification

2.2.1. A partir de la phase chloroformique

Quatre séries d'extrait chloroformique de tissus réalisées

entre 1982 et 1984 et correspondant à 40 kg de tissus frais sont

chromatographiées sur plaques préparatives de silice H dans le sol­

vant Hx-Ae-Me (50 : 50 : 5). La conservation de ces fractions à

-iOoC dans l'hexane pendant plusieurs semaines provoque la condensa-

- 45 -

tion de lipides, en particulier d'esters méthyliques et de leurs

produits d'oxydation, ainsi que de sesquiterpènes et de quelques

substances polaires sous forme de glomérules insolubles dans l'he­

xane. Leur chromatographie par deux séries de plaques préparatives

de silice H avec pour éluant le mélange Hx-Ae-Me (50 : 50 : 5) per­

met de recueillir trois fractions toxiques d'un poids total de

980 mg. Elles contiennent des sesquiterpènes, des esters méthyli­

ques et les produits d'oxydation correspondant à des acides gras en

C 9 ou C 10 - en particulier de nonaène 5 oate de méthyle - en C 16 ­

de l'acidepalmitoléique- et principalement en C 18 - des acides

linoléique et linolénique. Il existe probablement des dérivés ana­

logues d'acides en C 20 et en C 21 (SC.559 de bld et SC 802 de b l ).

La diversité des substances contenues dans ces fractions

explique la difficulté éprouvée pour localiser avec précision les

zones de toxicité sur les chromatogrammes puisqu'elles migrent tou­

tes de façon semblable.

La purification se poursuit en C.L.H.P. sur colonne de

silice à 10% de AgN03 - 30 cm x 1/2' -. Après plusieurs essais pré­

liminaires, nous retenons un mélange en proportions croissantes de

toluène et d'acétate d'éthyle pour l'élution. Celle-ci se déroule

en deux étapes :

* To-Ae (2 : 1) : ce système élue les substances insaturées possé­

dant plusieurs doubles liaisons. Il entraîne notamment des esters

méthyliques d'acides gras en C 18 différant par le degré d'insa­

turation. C'est pourquoi ces fractions contiennent plusieurs subs­

tances fortement toxiques.

* To-Ae (1 : 4) : l'élution des substances plus polaires, même

dans ce système, comporte d'importants chevauchements. Nous avons

décelé des dérivés d'acides gras en C 21 mono-insaturés. Plusieurs

frac'tions sont toxiques pour le C. aZadosporioides sur plaques

chromatographiques et le P. parasitiaa in vitro.

- 46 -

0/1 _•••••• -.

... ,­-_ ..-.,- -

1

. '3". .

11

.... 1'---.,.".!---, 1

: 1.,.. i

.. ,. !!

'" , "• _ .. 1_.

'" 1

Chromatographie en C.L.H.P. sur colonne de silicegreffée en C 18 - 3/8' x 30 cm - des esters méthy­liques d'acides gras en C 18 et de leurs dérivésoxygénés. Les fractions toxiques sont éluées dansla zone 3•

Eluant : acétonitr1le A 25\ (zone 1), 45\ (zone 2)et 80\ (zone 3). débit 2 ml/mn, défilement 5 mm/mn,détection UV A 280 nm, S ~ 0,16. Détection réfrac­tomêtrique en zone 1 (---).

--_. , . _.... , ...---

Fig. 7

........ -- ...--..... ::::-:·.:~·t·;::.:::: .1. :1: ..

C";'.....

."::1...

.....

- 47 -

Bien qu'imparfait, ce procédé chromatographique sur

colonne de silice imprégnée de AgN03 permet d'éliminer des quanti­

tés importantes de substances lipidiques dépourvues de toxicité et

éluées dans les premières fractions ainsi que des substances polai­

res parmi lesquelles ~es acides gras saturés fortement retenus sur

la colonne.

D'autres purifications en C.L.H.P. sont réalisées sur

colonnes de silice greffées en C 18 - 3/8' x 30 cm et 1/2' x 50 cm -.

Après plusieurs essais, l'élution est effectuée en trois étapes par

de l'acétonitrile à 25%, 45% et 80% dans une solution acétique à

5% 0 • Les substances polaires sont éliminé~s dans les fractions

les plus aqueuses. La quasi totalité des produits est éluée dans

l'acétonitrile 80% ; cette fraction contient toutes les substances

toxiques. Dans ces conditions expérimentales, il existe un impor­

tant chevauchement entre les produits d'oxydation des acides gras

insaturés et les esters méthyliques correspondants. De sur9roit les

pertes, à chaque étape chromatographique, dépassent 60% du poids

initial. Par contre, les substances polaires sont bien éliminées

dans les premières fractions éluées. La figure 7 indique ces moda­

lités d'élution.

Les tests de toxicité réalisés en CCM avec pour éluant le

mélange Hx-Ae-Me (50 : 50 : 5) révèlent des plages d'inhibition

correspondant à des Rf compris entre 0,90 et 0,75 (cf. p. 53).

Les esters méthyliques correspondant aux deux acides gras insaturés

sont regroupés en un spot unique de toxicité au Rf 0,90.

Dans une étape ultérieure, la purification des substan­

ces est affinée en C.L.H.P. sur une colonne de silice 5 ~ - 3/8' x

30 cm -. Les éluants utilisés sont des mélanges Hx-Ae-Me à diffé­

rentes proportions (100 : 30 : 3, 50 : 50 : 5, 50 : 80 : 12) puis

Ae-Me (100 : 20) (fig. 8).

Cette méthode permet une bonne séparation des produits

toxiques par rapport aux lipides recueillis en début d'élution et

aux substances polaires telles que les phénols ou la tomatidine

éluées par des solvants à plus forte proportion d'alcool. Cependant,

...,~.~,

zoN

.1)

:>ZQ...

48

que (---J.Les esters m6thyliques sont d6tectés dans le pic r6­fractom6trique de la zone 2, les produits oxyg6néssurtout dans la zone 4 (UV et réfractomètre).

- - 1

-,:.. ..- !

.. .-j

- 49 -

la séparation entre esters méthyliques en C 18 et leurs produits

d'oxydation s'avêre difficile: les chevauchements d'une fraction

sur l'autre sont três importants. Des chromatographies successives

permettent un enrichissement partiel mais l'interpénétration des

fractions reste supérieure à 10%. De plus, de nombreuses pertes

par oxydation interviennent.

Les substances recherchées étant apolaires et présumées

de poids moléculaires peu élevés, nous avons tenté de les séparer

par entraînement à la vapeur d'eau. Les phases chloroformiques

correspondant à l'extraction d'environ 15 kg de tissus (tiges et

racines confondues) ont été nécessaires à cette étude. Les entraî­

nements sont réalisés par barbottage de la vapeur d'eau dans un

échantillon aqueux.

Aprês une chromatographie en CCM avec l'éluant Hx-Ae-Me

(50 : 50 : 5) un test biologique met en évidence la présence de

substances toxiques aux Rf 0,90 ; 0,80 ; 0,75 : 0,60 et 0,55 à

0,40. A l'évidence, la vapeur d'eau entraîne des dérivés d'acides

gras et des sesquiterpênes.

A partir des entraînements à la vapeur, trois voies dif­

férentes de purification ont été suivies :

~ 1êre voie : Chromatographie préparative sur plaques de silice H

à 10% de AgN03 dans l'éluant To-Ae (2 : 1), puis C.L.H.P. sur

colonne de silice - 3/8' x 30 cm - à 10% de AgN03 : l'élution est

réalisée par un mélange de To-Ae (2 : 1). Enfin, la fraction

toxique est lavée à l'hexane sur une petite colonne atmosphéri­

que de silice - 15 x 2 cm -

~ 2ème voie : Elle consiste en une succession de trois séparations

par C.L.H.P. sur colonne de silice - 3/8' x 30 cm - dans l'éluant

Hx-Ae (5 : 1).

~ 3ème voie : Une séparation en C.L.H.P. sur colonne de silice

- 3/8' x 30 cm - dans l'éluant Hx-Ae (5 : 1) afin d'établir la

proportion de pertes provoquées par les chromatographies succes­

sives.

- 50 -

Quelle que soit la méthode utilisée, ~ chaque étape de

purification, un test de toxicité des échantillons permet de véri­

fier la présence et la non dégradation de la substance toxique re­

cherchée. Par contre, le test ne permet pas d'évaluer les pertes

en cours de manipulation dûes aux techniques ou consécutives auxdégradations, en particulier aux oxydations.

2.2.2. A partir de la phase méthanolique

Appliquant la méthode mise au point par Galanos et al.

(1962), nous avons réalisé une partition de la phase méthanolique

dans un mélange Hx-Me 87% (3 : 1).

La phase hexane entraîne les lipides neutres et toutes

les substances apolaires tandis que la phase MeOH 87% retient les

produits polaires.

La phase hexane est chromatographiée sur colonne atmos­

phérique - 25 x 2 cm - de résine Dowex MR7 échangeuse d'ions forte­

ment acide - fortement basique. Cette résine permet l'élimination

des acides libres et celle des bases (parmi celles-ci des substan­

ces semblant proches des phénolamides). Une première élut ion de

100 ml d'hexane collectée en quatre fractions permet d'entraîner

les substances les plus apolaires. Les autres produits, contenus

dans l'échantillon, sont élués par de l'acétate d'éthyle puis par

de l'acétate d'éthyle ajusté à pH 3 à l'aide d'acide acétique.

Enfin, la résine est éluée avec une solution de méthanol additionné

de P04HK2 à pH 9.

Par ce procédé, les substances toxiques correspondant aux

produits d'oxydation d'esters méthyliques d'acides gras sont con­centrées dans la fraction éluée par l'hexane. En particulier, nous

ne retrouvons pas de substances toxiques dans les fractions dépla­

çant les acides faibles fixés sur la résine. Ceci tend à indiquer

que les produits d'oxydation des acides gras ne se trouvent pas sous

forme d'acides carboxyliques dans les tissus.

- 51 -

2.3. Contrôle de localisation

Les travaux de Kato et al. -(1983) sur la résistance du

riz à la pyriculariose nous ont incitée à vérifier si nos méthodes

d'extraction entraInaient bien tous les produits d'oxydation d'aci­

des gras insaturés. Après extraction par le chloroforme et le mé­

thanol, 4,7 kg de tissus (racines et tiges confondues) sont hydro­

lysés par une solution méthanolique de potasse à 2N pendant 48 heures.

Une première extraction au chloroforme permet de récupérer

la phase neutre, l'acidification à pH 3 de la solution potassique

libère la phase acide.

Ces deux fractions sont chromatographiées sur plaques pré­

paratives de silice H à 10% de AgN03 puis en C.L.H.P. sur colonne desilice à 10% de AgN03 - 1/2' x 30 cm -. On obtient ainsi un échan­

tillon de 5,5 mg.

L'analyse en CG-SM de la fraction toxique ainsi purifiée

révèle que les produits d'oxydation d'acides gras insaturés ne se

trouvent qu'à l'état de traces (Scan 1055). La toxicité de l'extrait

pourrait être attribuée à d'autres substances (sesquiterpènes) et au

linoléate de méthyle (Scan 805) •

La bande résiduelle des plaques prépar~tives est repriseet méthylée au diazométhane. Après deux chromatographies successives

sur plaques de silice H avec pour éluant le mélange Hx-Ae-Me

(50 : 50 : 5) la fraction toxique est analysée.

Comme pour l'échantillon précédent, la CG-SM ne révèle

que des traces d'acides gras. La présence de nombreux phénols librestant benzoïques que cinnamiques est mise en évidence : elle peut ex­pliquer la toxicité de la fraction.

L'hydrolyse prolongée des tissus par la potasse 2N extrait

seulement des traces de produits d'oxydation d'acides gras. Ces subs­

tances ne semblent donc pas estérifiées aux parois comme dans le casdu riz.

- 52 -

2.4. Vérification de la nature des substances

Nous nous sommes assurée que les esters méthyliquesd'acides gras révélés par CG-SM dans nos échantillons étaient d'ori­

gine naturelle et non synthétisés au cours des étapes de purifica­

tion par contact avec le méthanol.

.Les tissus sont broyés dans le chloroforme, le diffusat

obtenu est chromatographié sur plaques préparatives de silice H

dans l'éluant Hx-Ae (1 : ~) puis en C.L.H.P. sur colonne de silice

à 10% de AgN03 - 1/2' x 30 cm -. L'élution est assurée par un mé­lange To-Ae (2 : 1). Aucun alcool n'est utilisé au cours des mani­

pulations.

L'étude en CG-SM des fractions purifiées révèle l'exis­

tence de dérivés d'oxydation d'esters méthyliques d'acides gras enC 18 : ceux-ci sont donc bien à l'état naturel dans la plante.

Une expérience réalisée avant de connattre la nature des

substances ci-dessus démontre la toxicité des esters méthyliquesen C 18 (principalement de linolénate de méthyle) et de leurs déri­vés oxygénés. Sur une fraction de C.L.H.P. de 7 mg en fin de puri­fication est réalisée une hydrogénation catalytique en présence de

platine. Le but de l'expérience était de séparer les sesquiterpènesde substances lipidiques. Les tests de toxicité pour le C. cZados­

porioides rêalisés après l'hydrogénation révèle des zones d'inhibi­tion aux Rf 0,90 à 0,85 et 0,76 à 0,65 dans l'éluant Hx-Ae-Me(50 : 50 : 5). Ces Rf sont compatibles avec ceux des produits deréduction des esters méthyliques des acides mentionnés ci-dessus.

Le spectre de RMN réalisé sur cette fraction toxiqueaprès hydrogénation indique la présence exclusive de graisses. A

l'époque, il avait été noté l'absence de tout indice complémentairede présence de substances toxiques pouvant être relié à des pro­duits connus (Sept. 83).

- 53 -

2.5. Caractères chromatographiques

2.5.1. En C.C.M.

Au Rf oü est décelée la toxicité sur plaque de silice

- 0,80 avec pour éluant le mélange Hx-Ae-Me (50 : 50 : 5) - nous

localisons le ou les monoépoxydes de linolénate de méthyle, de

linoléate de méthyle et les alcools diéniques (mélange d'isomères)

correspondant. Il n'existe pas de différences de migrations entre

les alcools diéniques et les époxydes d'acides gras en C 18.

Les substances toxiques virent au bistre foncé après révé­

lation au chlorure d'antimoine à saturation dans le chloroforme et

chauffage à 120°C. Après pulvérisation d'une solution de Mn04K on

obtient, à froid, une coloration jaune intense qui vire au brun

quelques heures plus tard.

La caractérisation des produits naturels biologiquement

actifs est donc facilitée par les comparaisons de leur migration

avec celle des produits de synthèse - monoépoxydes de linoléate et

linolénate de méthyle, diépoxyde de linoléate de méthyle et alcool

diénique dérivé du linoléate de méthyle -. Ces produits de synthèse

ont été purifiés par des chromatographies sur colonne de silice puis

par distillation sous vide avant de procéder aux tests de toxicité.

En chromatographie sur plaques de silice éluées par le mélange

Hx-Ae-Me (50 : 50 : 5) des plages d'inhibition pour le C. cLados­

popioides sont observées :

- au Rf 0,90 pour l'alcool diénique

- au Rf 0,85 pour les monoépoxydes des deux esters méthyliquesd'acides gras insaturés

- au Rf 0,75 pour le diépoxyde de linolénate de méthyle.

Les substances de synthèse présentent les mêmes réactions

colorées avec le trichlorure d'antimoine à saturation dans le chlo­

roforme et avec le permanganate de potassium que les échantillons

- 54 -

Comparaison des caractères chromatographiques en C.C.M.

des alcools polyacétyléniques (selon De Wit et Kodde

198~) et d'esters méthyliques d'acides gras en C 18 ou

de leurs dérivés oxygénés de tissus du cultivar Piéra­

line inoculé par le P. pa~asitica.

A B C D .

0,92 0,92brun· brun

0,86 0,86jaune jaune

0,80 0,80brun brun

0,76 0,76bistre bistre

0,72jaune

0,68 traces 0,68 0,68brun brun brun

0,63jaune

0,55 0,55bistre bistre

Eluant : cyclohexane - acétate d'éthyle (1 : 1)

Révélation : MN0 4K à 1% dans solution C03Na2 à 2%

A phytoalexines polyacétyléniques

B : extraction à la vapeur d'eau d'une fraction chloroformique de

Piéraline

C fractions CLHP sur col. Si C 18 - 1/4' x 25 cm - d'extrait

chloroformique éluées par l'acétonitrile à 25% et à 45%

D fraction CLHP éluée par l'acétonitrile à 80%.

- 55 -

purifiés, migrant aux Rf correspondants, provenant des tissus de

tomate. Malgré toutes les purifications, les études en CG-SM indi­

quent la présence de plusieurs composés dans les fractions toxi­

ques.

Nous avons comparé les caractères chromatographiques de

ces substances à ceux obtenus par De Wit et Kodde (1981) pour les

alcools polyacétyléniques - falcarinol et falcarindiol - dans les

systèmes d'élution CyHx-Ae (1 : 1) et Clf-Me (95 : 5). Les études

de migration sont réalisées d'une part sur une partie aliquote de

substances entrainées par la v~peur d'eau et d'autre part sur un

second aliquot de celles-ci chromatographiées en C.L.H.P. sur co­

lonne de silice greffée en C 18 - 3/8' x 30 cm - avec de l'acéto­

nitrile à 25%, 45% et 80%.

Dans le système Clf-Me (95 : 5) falcarinol et falcarin­

diol migrent respectivement au Rf 0,43 et 0,48. A ces niveaux nous

n'observons aucune substance appartenant aux déri~és des acides

gras insaturés. Ceux-ci, dans les mêmes conditions, migrent à des

Rf compris entre 0,77 et 0,86. De même dans le système CyHx-Ae

(1 : 1) les substances polyacétyléniques migrent au Rf 0,63 et 0,72

tandis que les dérivés d'acides gras insaturés sont localisés entre

les Rf 0,75 et 0,90 (tab. 1).

2.5.2. En C.L.H.P.

A la fin de l'année 1982, un essai de purification d'une

fraction toxique par chromatographie alternée sur colonne de silice

et sur colonne de silice greffée en C 18 nous donnait une première

indication sur la répartition des produits toxiques sans en connai­

tre la nature.

Ainsi, sur colonne de silice 5 ~ - 3/8' x 30 cm - éluée

avec le mélange Hx-Ae-Me (50 : 50 : 5) à 2 ml/mn, nous observons un

pic réfractométrique à 7 mn suivi, entre 8 et 10 mn, par un fort

pic en ultra-violet. Le premier pic correspond principalement aux

esters méthyliques des acides linoléique et linolénique tandis que

- 56 -

le pic en ultra-violet colncide avec l'élution de leurs produits

d'oxydation.

Sur colonne de silice greffée en C 18 - 3/8' x 30 cm ­

les produits toxiques sont élués en acétonitrile 80% dans une solu­tion acétique à 5% 0 comme nous l'indiquons ci-dessus~

Une injection de la fraction toxique éluée en acétoni­

trile 80% sur la colonne de silice 5 ~ - 3/8' x 30 cm - permet deretrouver le pic réfractométrique à 7 mn ainsi que le pic ultra­

violet entre 8 et 10 mn.

Lorsque la nature des substances fut connue, l'injection

de produits de synthèse sur les différentes colonnes utilisées en

C.L.H.P. permet de préciser leurs caractéristiques chromatographi­

ques (fig. 8)

* sur colonne de silice 5 ~ - 3/8' x 30 cm - l'éluant utilisé est

le mélange Hx-Ae-Me (50 50: 5)

- linolénate de méthyle4 et 8 mn

pic étendu, dans l'ultra-violet entre

- monoépoxydes delinolénate de méthyle

entre 4 et 8 mn

pic dans l'ultra-violet

diépoxyde de linolénate de méthyle : deux pics en ultra-violet

correspondant à deux isomères entre 8 et 10 mn.

Ces substances sont retrouvées dans plusieurs séries

d'extraits bruts de Piéraline et de Piéralbo.

Un groupe de pics dans l'ultra-violet, sans doute unmélange de ces produits, appara1t entre 4 et 10 mn après le début

de l'élution. Ces pics sont plus intenses dans les extraits inocu­lés par un parasite que dans les extraits témoins.

- 57 -

Fig. 9 - Représentation schématique des structures présumées

de dérivés oxygénés d'acides gras en C 18.

A = monoépoxyde 9,10 de linolénate de méthyle.

B = alcool diénique dérivé du linoléate de méthyle.

A

OH

B

- 58 -

~ sur colonne de silice greffée en C 18 - 3/8' x 30 cm - tous lesproduits de synthèse sont élués par le méthanol à 80% dans une

solution acétique à 5% 0 •

2.6. Etudes structurales, vérifications chimiques

Les recherches réalisées au laboratoire des médiateurs

chimiques sur ces substances représentent un important travail qui

se poursuit actuellement.

M. Einhorn assume toute l'analyse des substances natu­

relles en CG-SM et la synthèse des mono- et diépoxydes d'acidesgras polyéniques, M. Kunesch synthétise un alcool diénique dérivé

de l'acide linoléique (fig. 9).

Les produits extraits de la tomate correspondent à deuxsubstances, maintenant présumées être des alcools diéniques. Leurtemps de rétention en CG sur colonne de CP Sil 5, 25 m est supérieurà ceux du linol€ate et du linolénate de méthyle. Ce temps de réten­tion est voisin de celui du monoépoxyde 9-10 du linoléate de méthyle.cepe~dant, sur colonne _polaire (CP Wax, 25 m) le produit naturel aun temps de rétention plus long que le produit de synthèse (mono­époxyde 9-10 de linoléate de méthyle), ceci conduit à deux hypothèses

- le produit n~turel correspond à un époxyde monoéthylénique conjugué,- ou bien il serait un alcool diénique.

La figure 10 indique l'élution en CG avant purificationde la fraction puis après purification sur une colonne de siliceatmosphérique ainsi que le spectre de masse établi après élutionsur la colonne polaire, l'analyse étant réalisée à 220°C: M+ = 310,m/z 298 (M-l8), 185, 155, 153, 97,95, 83, 81,79,71,69, 67, 55.

Des spectres sont réalisés en ionisation chimique soitpar l'ammoniac soit par le monoxyde d'azote.

En I.C./NH3 se distinguent les ions M + 18 = 328,+M = 310, M + 1 = 311, m/z 293 (Pic de base = M + 1 - 18).

100%- 1 4108083226

59 -

9153

Fig. 10 - Elution en CG-SM de deux isomères de dérivés oxygé­nés d'acides gras en C 18.

f i ê ê Sc.1280A g ract on pr par e par C.L.H.P. 'Sc.1347)

B =après purification sur microcolonne de siliceISc.716 et 791)

C = fragmentation caractéristique de ces substan­ces de M+ g 310 ISc.716).

A

20Q 4(P) 600

I~. 5004503041 8

800 1000 1200 1400 1600 ISOO 2200

124

B

1~7

100

- \ 100%- 21 "3&480:5

400 700 800

SCHlI·;-16-70~

c41

43 &7

:1' ,,~I ..U~lc":.i."."l"",,,,~L~,,:~L40 60 80 100 120 140 160 180

-

2 221 2 :5 279

200 220 240 2iO 2eo

NERt!>.G·'S IDAP.f" [LE FI: nmo:>

- 60 -

(11)0, 10l l: '-(Il:I"'-:J~

J~-IWI'-:::~

-l-'OO'~:~4f;=1

j

TOM. 61 HVDRO.:;e:tIE CPSIL 16');,:,:;C'500 220'" 10.-:/1111 2~1I

TTIC=O

::1:1.

ilII153 ,.

••1: •

ERMAI~"'S l r'ARILE ft: 101103

EU) 1

[1 (ICI.

1

1

RT =21:2::.6

7437

69

40 60

a:3

ao 100 120 140

1El?'

1::'1 1 . 1

° o"lo .. o/, .. I''''OI°ir''160 180 201)

~'43

'., r," '-"'-"-MTI ,1..--::;;0 ='.0

t!g~_!! - Elution et spectre en CG-SM de l'ester méthylique de

l'acide hydroxy 9 octadécanolque <SC.I283) provenant

de l'hydrogénation catalytique des isornêres de l'alcooldiénique <SC.716 et 791 de la fig. 10).

260 :zeo :soo1 i i i i '. il. il' i i 'J' i i "r'rrlT

·~·~O

- 61 -

En I.C.INO se distinguent les ions (M+NO)+ =340, M+ = 310,m/z 308 (M,.2), 292 (M..l8), 185, .155.

La formation de l'ion (M-2)+ p~ut être liée à la présence à!unalcool dont la réactivité avec NO est connue pour donner des pro-duits d'oxydation: l'ion 308 est donc interprétable dans le sens

d'une fonction alcool.

Ce phénamêne, selon M. Einhorn, n'est pas connu pour des

époxydes en I.C. sous NO.

Dans les mêmes conditions, l'ion 185 peut correspondre à

un époxyde. Il est également compatible avec la présence d'un alcoolsecondaire dans l'hypothêse d'une oxydation préliminaire de cette

fonction sous NO. Dans les deux cas, cet ion 185 peut indiquer larupture d'une fonction oxygénée en position 9 (alcool) ou 9-10 (épo­

xyde). (Einhorn communication personnelle) •

L'hydrogénation catalytique des substances naturelles a étéréalisée soit avec l'oxyde de platine dans le méthanol soit avec ducharbon palladié dans le méthanol. Dans les deux cas, elle aboutit~ l'ester méthylique de l'acide hydroxy 9 octadécanoique (fig. 11). La

réaction, même conduite dans un temps três court, ne permet pas de faireapparaltre d'époxyde saturé. Aprês toutes les hydrogénations, les deux

+isomères donnent le même produit de. M =~14 - m/z 187, 158, 155, 87, 83,14, 69, 67, 55 (Scan 1283). Les ions 187 et 158 sont caractéristi­ques de la fragmentation en ~ et ~, de l'hydroxyle avec réarrangement

d'un hydrogêne. L'ion 155 est issu de 187-32 soit perte d'une molé­cule de méthanol i les ions 74 et 87 indiquent la présence d'unester méthylique. La masse du produit hydrogéné est confirmée parSM en I.C. sous NB3 i les deux modes d'hydrogénation aboutissent·au même résultat. Toute tentative pour isoler un éventuel précur-seur de structure époxydée s'est révélée négative malgré les dif­férentes modifications concernant la nature, la quantité de cata­lyseur et le temps de réaction. Ces résultats sont en faveur del'hypothêse d'un alcool diénique.

flCRI1AG'SlDAR'ILE AI PAUlICUD

62

t 100, IDl 1(J-tcUl"o-o:..>('';'-f.dJC-$3

S lA. ~ CPSIL~8 .~WC 'SCMf1 625> lSOk--)240.': <IORC'IUII

1001<- ~&70S~"

Fig. 12

Comparaison d'une fraction contenant un dérivé oxy­géné d'acide gras en C 18 majoritaire (Sc.1364 del'élution en CG-SM) préparée par C.L.H.P. et d'unaleool diénique de synthèse.A et B 1 élution et spectre en CG-SM de la frac­

tion C.L.H.P.C 1 spectre de l'alcool diénique de synthèse.

TIC·O

200~IDAR'ILE AI PAUlIERID

9

A

eoo 1000UOD, IDl

B

T"-

1200 1"""IO-U>::-El1D9-MlJi.l-83

440

249

IU:Rl1AG'SIDAR'ILE AI ALaatll.ID

41

93

300

c

304Q 360uoo, ID]

_ 420

29-I<OU-l'429-<fIIU-84

5C1Vl-~2-313

5541 57

2!l2

- 63 -

La deutériation en présence d'oxyde de platine dans le métha­

nol (0.0) pour localiser la position des doubles liaisons, n'a pas

encore permis de repérages certains.

Actuellement, même sans connaitre exactement la position

des doubles liaisons, les résultats de l'hydrogénation catalytique,

selon M: Einhorn, tendent à indiquer qu'il s'agit d'un alcool dié­

nique.

Enfin, le traitement par le chlorure d'acétyle destiné

initialement à dériver une éventuelle fonction alcool conduit, dans

un bref délai, directement à un triène dans le cas des produits

naturels. Au contraire, avec lesmonoépoxydes dulinoléate de méthyle

la réaction aboutit à la formation de chloroacétates.

Par ailleurs, la synthèse par M. Kunesch d'alcools diéni­

ques dérivés du linoléate de méthyle purifiés par chromatographie

sur colonne puis pour une partie par distillation sous vide a per­

mis de vérifier l'apparente validité de cette hypothèse. En effet,

cette synthèse a abouti à l'obtention de nombreux isomères. Par

transposition allylique se forment des alcools en C 9 avec deux

doubles liaisons conjuguées i ces produits sont fluorescents sous

lumière ultra-violette à 254 nm et à 366 nm. La figure 9 représente

les deux structures initialement envisagées de monoépoxyde et d'al­

cool diénique d'esters méthyliques d'acides gras en C 18. La figure

12 indique la similitude entre un spectre de masse d'un des pro­

duits naturels et celui d'un alcool diénique, fluorescent, de syn­

thèse. En 1983, la fraction quasi pure n'avait pas été complètement

identifiée.

- 64 -

3. Les composés phénoliques

3.1. Localisation - Mode d'extraction

Les substances phénol~ques se trouvent dans toutes les

parties de la plante : tiges, collets et racines. Elles sont prin­

cipalement extraites par le méthanol, d'autres proviennent de la

phase aqueuse de l'extraction chloroformique. Les phénols libres

sont séparés des substances neutres par traitement des extraits

bruts soit avec le bicarbonate de sodium à 5% soit par passage sur

résine échangeuse d'ions XAD 2 ou MR7. L'hydrolyse des tissus par

une solution de potasse méthanolique libère les substances phéno­

liques estérifiées aux parois et les aglycones des différents gly­

cosides et esters. Les substances phénoliques étant beaucoup plus

polaires que les acides gras méthylés, leurs dérivés oxygénés etles sesquiterpènes, leur séparation est obtenue par chromatographie

sur plaque de silice avec des éluants tels que les mélanges Hx-Ae-Me(50 : 80 : 12) ou Clf-Me (85 : 15) et (1 : 1).

En C.L.H.P. sur colonne de silice, leur élution s'avère

difficile même avec des éluanta très polaires - Hx-Ae-Me (50 : 80

12), Ae-Me (5 : 1) et méthanol pur - c'est pourquoi nous avons cher­

ché à les séparer et à les identifier principalement en C.L.H.P. sur

colonne de silice greffée en C 18 avec des éluants aqueux et acidi­

fiés dont les principaux correspondent à des gradients d'acétonitrile

ou de méthanol.

3.2. Repérage des zones toxiques

De novembre 1982 à mai 1984, cinq séries d'infections ex­

périmentales nous ont permis d'obtenir avec une bonne reproducti­

bilité les mêmes substances toxiques. Cependant leurs teneurs dans

les tissus varient selon les conditions climatiques des saisons,

en particulier la température et d'éclairement. Ainsi, en été, la

température des serres varie de 25 à 35°C, la luminosité est forte,la croissance et la vigueur des plants est maximale. En hiver, par

contre, la température étant plus basse (de 18 à 22°C) et l'éclai­

rage réduit, la vigueur des plants est médiocre. Cela se traduit

Tableau 2

- 65 -

par une réduction notable du poids de racines et de tiges formées

et également par des teneurs en substances toxiques moins impor­

tantes qu'en été. Nous tentons de combler cet handicap par un con­

tact plante-parasite plus long en hiver qu'en été: 12 jours au

lieu de 8.

Dans les tissus des plants du cultivar Piéraline résis­

tants à l'infection par le P. parasitiaa s'accumulent des substan­

ces polaires toxiques pour l'agent pathogène et pour le C. aZados­

porioides. Nous indiquons ci-dessous leurs caractéristiques chroma­

tographiques en C.C.M. (tableau 2).

Caractères chromatographiques en C.C.M. (RF) dans dif­

férents éluants de substances polaires toxiques extrai­

tes des tissus de plants du cultivar Piéraline inoculés

par le P. parasitiaa

z abréviations : Hx = hexane

Ae = acétate d'éthyle

Me = méthanol

z composés identifiés

0): vanill ine 0: diméthoxybenzaldéhyde

ffi' acide férulique 0: acide p. coumarique

5 : acide dihydroxybenzoique @: acide caféique

(2): acide trihydroxybenzolque 0): acide chlorogénique

Hx-Ae-Me Hx-Ae-Me Clf-Me50 : 50 : 5 50 : 80 : 12 85 : 15

0,75 CD 0,90 0,90 - 0,85 (Det@

0,70 0,85 @ 0,75

0,50 0· 0,80 0) 0,70

0,45 0 0,70 0,65 CD0,30 (2 produits) 0,62 0 0,55

0,25 ® 0,55 0,45

0,20 ® 0,45 0 0,35 00,35 0,30 Œ)0,25 (j) 0,25

0,18 @ 0,20 CD0,05

- 66 -

3.3. Appréciation des rendements relatifs des techniques à par­

tir d'un extrait de tissus de racines

2,3 kg de tissus de racines et de collets sont broyés

dans le méthanol 50%. Après unè diffusion de 60 heures à tempéra­

ture ambiante et à l'obscurité, le diffusat est recueilli et séparé

en quatre lots.

3.3.1. Entraînement à la vapeur d'eau

Une partie aliquote correspondant à 800 g de tissus frais

est évaporée, reprise par de l'eau puis fait l'objet d'un entraîne­

ment à la vapeur d'eau suivi d'un contrOle en CG sur colonne capil­

laire. Ce dernier révèle la présence de 12 produits majoritaires.

Un test de toxicité sur plaque chromatographique après élution par

le mélange Hx-Ae-Me (50 : 50 : 5) indique un spot principal de toxi­

cité au Rf 0,75 - 0,80 (zone des dérivés oxygénés d'esters d'acides

gras) et un spot diffus au Rf 0,48 correspondant vraisemblablement

à un sesquiterpène. Le trichlorure d'antimoine révèle, quant à lui,

deux zones de produits virant au rouge (sans doute de la vanilline)

et une zone diffuse virant au bistre aux Rf 0,48 à 0,55 correspon­

dant aux traces de quelques phénols entraînés par la vapeur d'eau.

3.3.2. Traitement par le bicarbonate de sodium

Une partie aliquote correspondant à 500 g de tissus frais

est débarrassée du méthanol par évaporation. La phase aqueuse res­

tante est additionnée de bicarbonate de sodium à 5% pour fixer les

phénols libres. Les substances neutres sont alors extraites par le

butanol. La solution bicarbonatée est ensuite acidifiée à pH 3 afin

d'en extraire les phénols libres par le dichlorométhane. Après un

contrOle de toxicité sur plaque pour le C. aZadosporioides~ les

deux fractions sont chromatographiées séparément sur plaques prépa­

ratives de silice H afin de séparer les composantes de la toxicité.

Après deux chromatographies successives, les produits inhibiteurs

sont recherchés dans les différentes fractions avec quatre systè­

mes éluants. Le tableau 3 indique la répartition des zones toxiques

pour le C. aZadosporioides.

- 67 -

3.3.3. Traitement par résines échangeuses d'ions

Le traitement est effectué sur une partie aliquote de

l'extrait correspondant à 500 g de tissus frais. Des brunissements

intervenant lors de l'extraction des substances apolaires par par­

tition de l'extrait brut aqueux ou méthanolique dans l'hexane ou le

butanol, laissent présumer d'importantes oxydations. Pour remédier

à ces dégradations l'échantillon est chromatographié sur une colonne

de résine amberlite XAD 2 fortement acide et fortement basique. Les

produits apolaires sont d'abord éliminés puis les substances fixées

sur la résine sont éluées à pH 3. Les composés phénoliques sont ex­

traits de la fraction acide par le dichlorométhane et le butanol.

Au cours de la dernière étape, interviennent très rapide­

ment des noircissements, indices d'oxydation. Nous avons comparé

sur plaquœchromatographiques la répartition de la toxicité pour

le c. aladosporioides suivant le degré d'oxydation de deux extraits

élués en phase acide.

Les essais ont été reproduits à partir de 9,2 kg de tis­

sus frais scindés en deux lots, l'un traité par le bicarbonate de

sodium, l'autre par la résine XAD2 . De la fraction bicarbonatée sont

obtenus 1,2 g de phénols libres, de celle de la résine XAD2 665 mg.

Aux pertes quantitatives plus importantes sur résine s'ajoute la

dispar~tion de plusieurs substances toxiques (tab. 3).

Ce tableau fournit une première indication sur la répar­

tition de la toxicité dans la phase neutre comprenant en particu­

lier des phénols liés et dans les phases acides contenant les phé­

nols libres.

- 68 -

Répartition des substances inhibitrices dans les deux

séries d'extraits provenant de la phase neutre, de la

phase bicarbonatée après acidification et de la phase

acide de XA0 2 •

Hx-Ae-Me Hx-Ae-Me Clf-Me Clf-Me

50 : 50 : 5 50 : 80 : 12 85 : 15 1 : 1

0,90 0,90 O'80} fractionPhase neutre O,SO 0;S5 0,80 0,70 B

de C03BNa 0,75 0,76 (tomatidine) 0,65

(phénols liés, 0,75 0,65 0,53 0,50 fraction

alcaloïdes, 0,50 0,60 F

stérols ••• ) 0,37 0,32

0,15

0,70 O,SO 0,90

0,66 0,65 0,67

Phase acide 0,50 0,60 0,62

de C03BNa 0,45 0,20 0,40

(phénols résiduel 0,15 0,35

libres) résiduel 0,30

0,17

résiduel

oxydé : 0,90

0,71 0,63

0,57 0,57

0,39 0,46

0,21 non oxydé :

Phase acide 0,93

de résiduel 0,33

XAD20,81

0,19

0,77

0,59 résiduel

0,52

- 69 -

3.3.4. Lyophilisation

La lyophilisation d'une partie aliquote de l'extrait mé­

thanol 50% correspondant à 500 g de tissus frais a pour but d'appré­

hender la répartition des substances toxiques dans l'échantillon

brut en fin d'extraction. Les analyses chromatographiques de répar­

tition de la toxicité sont, avec le C. aZadosporioides sur plaques

de silice, réalisées par les mêmes éluants que ci-dessus. Le ta­

bleau 4 indique la répartition des substances toxiques dans les qua­

tre systèmes utilisés

Recherche des substances toxiques dans un extrait de

tissus de tomate Piéraline inoculée par le P. parasitiaa

après lyophilisation à l'aide de quatre éluants de pola­

rité croissante.

Hx-Ae-Me

50 : 50 : 5

0,85 - 0,70

0,66 - 0,40

0,37 - 0,17

Résiduel

Hx-Ae-Me

50 : 80 : 12

0,96

0,86

0,78

0,71 - 0,64

0,60 - 0,50

0,45

0,23

0,18 - Résiduel

Clf-Me

85 : 15

0,80

0,65

0,60

0,53

0,40

0,35 - 0,30

0,10 - Résiduel

Clf-Me

1 : 1

0,90 - 0,80

(tomatidine)

0,54 - 0,42

0,37 (tomatine)

résiduel

La comparaison des résultats obtenus en fonction du

traitement permet une première évaluation des pertes consécutives

aux séparations de phase et aux chromatographies. L'entrainement

par la vapeur d'eau semble efficace pour extraire des substances

neutres (sesquiterpènes, dérivés d'esters méthyliques d'acide

gras •.. ) avec un faible entrainement des substances phénoliques

telles que la vanilline. Ce procédé ne peut pas être appliqué à la

purification des substances polaires. La séparation de phase et

deux chromatog~aphies successives provoquent peu de pertes appa-

- 70 -

rentes dans la phase neutre (cf. ci-dessus) par contre nous consta­tons des disparitions de toxicité correspondant principalement aux

composés phénoliques dihydroxy 3,4 benzoïque, trihydroxy 3,4,5 ben­

zoïque et à l'acide caféique. Parmi les composés phénoliques récu­

pérés en quantité importante nous avons la vanilline, l'acide p. cou-

marique, l'acide férulique et l'acide chlorogénique. Nous consta-

tons également que ~es substances extraites dans la phase neutre sont

mieux conservées au cours des manipulations que les produits phéno­

liques oxydables. Parmi les substances neutres nous avons identifié,outre des phénols, la tomatidine à Rf 0,76 dans l'éluant Hx-Ae-Me

(50 : 80 : 12) et à Rf 0,84 dans l'éluant Clf-Me (85 : 15).

3.4. Présentation des séquences d'extraction

Les résultats obtenus lors des essais préliminaires nous

ont incitée à choisir des procédés d'extraction qui nous parais­

saient le moins dégrader les substances toxiques recherchées.

3.4.1. Elimination des substances apolaires

Cette technique a été décrite dans les chapitres concer­

nant les dérivés d'acides gras insaturés et les sesquiterpènes, elleconsiste en une partition entre la phase polaire (phase aqueuse ou

phase méthanol 50%) et de l'hexane ou du n-butanol.

3.4.2. Rétention des phénols libres

La fraction polaire est additionnée de bicarbonate desodium à 5% de façon à fixer les phénols libres. La phase neutre

est extraite par le n-butanol. puis la solution bicarbonatée estacidifiée à pH 3, les phénols sont extraits successivement par le

dichlorométhane et le n-butanol.

3.4.3. Traitement par le polyclar

La phase neutre est mélangée à une quantité aliquote de

polyclar, l'ensemble est séché sous vide. L'échantillon à fraction-

- 71 -

ner est monté sur une colonne de 60 cm x 3 cm ou de 90 cm x 5 cm,

selon son importance, garnie de polyclar équilibré dans l'acétate

d'éthyle.

Les substances non adsorbées sont éluées par l'acétate

d'éthyle. Les produits adsorbés sont détachés progressivement par

du méthanol, du méthanol 80%, du méthanol 50% et enfin par du mé­

thanol 50% additionné de ~04HNa2 à O,lM.

Un important chevauchement des substances est observé

dans ces fractions.

Les séries de chromatographies sur polyclar ont permis

d'obtenir à partir de 9 kg de tissus, deux fractions toxiques,

l'une de 900 mg correspondant à l'élution par le gradient de mé­

thanol à méthanol 50%. l'autre de 140 mq par l'élution avec le

méthanol 50% additionné de P04HNa2 O,lM à pH Il. Cette fraction

contient surtout deux produits : la tomatidine et une substance

de structure mal élucidée, la fraction H.

3.4.4. Purification sur gel LH 20

Nous av~ns essayé d'affiner les séparations par des chro­

matographies complémentaires sur des colonnes de 30 cm x 2,5 cm et

de 30 cm x 3 cm chargées respectivement par 30 g et 100 g de gel

LH 20. Les échantillons à fractionner sont apportés dans un rapport

pondéral de 1/500 à 1/1000 par rapport au gel. Les séquences d'élu­

tion sont : chloroforme ou dichlorométhane, isopropanol et méthanol.

L'isopropanol ne permet pas d'élution sélective. Le chlo­

roforme entraîne des lipides et des substances peu polaires conte­

nus dans l'échantillon. Les lipides se comportant probablement comme

co-solvant, certains produits polaires sont entraînés dans les frac­

tions chloroformiques. Ils peuvent en être récupérés soit par une

seconde chromatographie sur gel LH 20 soit en chromatographie pré­

parative sur plaques de silice H. L'élution au méthanol entraîne

d'une façon peu sélective les produits polaires. Cependant, ceux-ci

- 72 -

étant en grande partie débarrassés des impuretés lipidiques, devien­

nent plus accessibles en C.L.H.P.

3.4.5. Préparation de dérivés

Nous avons procédé à la méthylation par le BF3 afin de

mieux séparer ,les composés phénoliques entre eux mais aussi des

acides gras migrant à des Rf parfois proches. Des extraits de tis­

sus, à l'échelle préparative, sont méthylés par M. Kunesch à l'aide

de diazométhane au laboratoire des médiateurs chimiques. Par ce pro­

cédé, une partie des produits phénoliques est stabilisée avant chro­

matographie en C.L.H.P •• Par contre, des essais d'acétylation ne

permettent pas une séparation satisfaisante des composés phénoliques

des autres produits en chromatographie préparative sur plaques.

3.5. Les composés phénoliques simples

3.5.1. Mode d'obtention

Nous avons indiqué ci-dessus que lors des tentatives de

séparation sur résine amberlite XA02 interviennent des pertes im­

portantes notamment d'acides caféique, dihydroxy 3,4 benzoïque et

trihydroxy 3,4,5 benzoïque. Pour y remédier, nous avons incorporé

dans l'éluant un anti-oxydant, l'acide ascorbique. Celui-ci pré­

sente le grave inconvénient de ne pas se séparer complètement des

substances phénoliques même après plusieurs chromatographies en

C.L.H.P. sur colonne de silice greffée en C 18 éluée avec un solvant

aqueux et acidifié.

Les acides cinnamiques et leurs dérivés prédominent dans

les extraits de tissus provenant de tous les organes après infec­tion par le P. pa~asitiaa. En outre, sont décelés des acides et des

aldéhydes benzoïques. Ces composés phénoliques existent sous forme

libre dans les extraits étudiés. Il se peut qu'une partie d'entreeux provienne d'hydrolyses d'esters, ou moins vraisemblablement de

glycosides, survenues au cours des manipulations (extractions de

longue durée, chromatographies sur plaques). L'hydrolyse alcalinedes tissus libère des quantités importantes d'acides cinnamiques etdans une moindre mesure d'acides et d'aldéhydes benzoïques.

- 73 -

Fig. 13 - Représentation schématique des principaux consti­

tuants phénoliques décelés dans les extraits de

tissus du cultivar Piéraline inoculé par le P. para­

sitiaa.

Rl

A

R3

R2

Rl

B

R3

R2

A - SERIE CrNNAMIQUE

RI = COOH, R2 = H.. R3 = OH ., acide p - coumarique.RI = COOH, R2 = R3 = OH : acide caféique

RI = COOH, R2 = OCH3, R3 =OH · acide férulique·RI = COO-quinique, R2 = R =OH . acide chIorogénique3 .

B - SERIE BENZOIQUE

RI = COOH, R2 = R3 =CH, R4 = H . acide dihydro~I 3,4benzoique.RI = COOH, R2 = R3 = R4 = OH · acide trihydroxy 3~'4 JS,benzoïque·RI = CHO, R2 = OCH3, R3 = OH, R4 = H : vanilline

RI = CHO, R2 =R3 = OCH3, R4 = H . diméthoxy 3, 4 benzaldéhyde.

- 74 -

Nous avons seulement déterminé les concentrations en phé­nols totaux (cf. infra), sans établir la contribution de chacun deces composés. En effet, celle-ci avait été mise en évidence par destravaux antérieurs (Ravisé et Tanguy, 1971) puis confirmée par d'au­tres études (Retig et Chet 1974, Carrasco 1976, Fleuriet et Macheix1980 et1981,Glazener 1982) tant au plan constitutif que lors desréactions au parasitisme.

3.5.2. Les principales substances (fig. 13)

Les dérivés de l'acide cinnamique sont l'acide p. couma­rique, l'acide caféique et l'acide férulique. D'aprês les analyseseffectuées en spectrométrie de masse, l'acide férulique prédomine}malgré l'importante dégradation)dans les extraits oü il se trouvesous forme de deux isomêrés. Nous avons indiqué ci-dessus quel'acide caféique est détruit lors des reprises des chromatographiessur résines échangeuses d'ions (amberlite XAD2 ou MR7) ainsi qu'aucours des chromatographies sur plaques de silice H et GF. De même,nous n'avons pas pu apprécier les pertes en acide férulique quiforme un dimêre à la lumiêre, substance jaune qui ne migre plus surplaques de silice (Lewis et al. 1984).

Parmi les dérivés de l'acide benzoïque, l'acide dihydroxy

3,4 benzoïque semble prédominer. Sous forme libre existent égale­ment la vanilline e~ la dihydroxy 3,4 benzaldéhyde identifiées aprêsmêthylation par le diazométhane. Dans ce cas, une autre" hypothèsecorrespondrait à l'existence de la diméthoxy 3,4 benzaldéhyde nonmodifiée lors du traitement au diazométhane. L'acide trihydroxy 3,4,5benzoïque est identifié aprês hydrolyse alcaline des tissus sui­vie d'une méthylation immédiate. Au cours des premiêres étapes depurification il est rapidement dégradé.

3.5.3. Les caractêres chromatographiques

3.5.3.1. En C.e.M.

Le tableau 5 résume les principales caractéristiques enC.C.M•• Nous avons observé d'importants chevauchements de Rf.

- 75 -

Récapitulation des caractères chromatographiques (~)

dans trois éluants de polarité croissante et des réac­

tions colorées après pulvérisation de trichlorure d1an­

timoine à chaud (SbC13 ) ou de p. nitraniline (PN) de

huit substances phénoliques extraites de la tomate.

Rf en C.C.M. Réactions colorées

Phénols Bx-Ae-Me Hx-Ae-Me Clf-MeSbC13 P.N.50 : 50 : 5 50 : 80 : 12 85 : 15

Acidedihydroxy- 0,25 0,50 0,34 bistre clair brunbenzoique

Acidetrihydroxy- 0 0,23 0,17 b leu turquoise brunbenzoïque

Acide 0,45 0,62 0,65 rose violacé rouge briquep. coumarique

Acide 0,20 0,44 0,35 bistrecaféique rose

Acide 0,50-0,59 0,62 rose soutenu rouge brique

férulique 0,40

Acide a 0,18 0,39 bistre bistrechlorogénique

Vanilline 0,75-0,80 0,90 jaune jaune orangé0,70

Diméthoxy- 0,80- 0,90- 0,95 jaune jaune trèsbenzaldéhyde 0,76 0,85 pâle

- 76

.~._.._..

.-'-_0_- .. __.........-.

... 1.' 1"\'",',1 .'-" r'"Q'=':"::";''':'::':.-:.l:":':_:.~

· - .... .-----r--

-~ --._-~--

: : :-:.r.:,:,: :

~::-rrT----'-'- -- --,_._.-~-_. -. -------- .....~. • -l-

· • -- r-".- - . , l , ..... ... .. ..

11

1" i it-. :: f [ ~•. , ' . I! ,

T:r:-::;[; ·:-TT::.::-r:l' - .;. - - .• ~ \ 1; L: ; n:::.. ·1 •• i t t, ., i-o . 't~ •

••••_..... :.. ~ 1" :.• L::li!l "1---'-'-'·'--'---:~~-:T::-:-- r'" :'~~=f9=t=+H-~+~-H~~~+-'.-.;.:.-~:"'~~'~'~IL.:..' :.'~,L~'~.i'~'_'~'~' l', . .. . .. ~ -- -.' -" ••_. • •• 1 f" ~ " ,.... ...· ~ ... r .• . •• _." 1" • , L ,. l , .... ,

l 'f' l ' • L II" .,_. l-:" _1 1.'11, !_'i '_' . .. !-,"';:-''",_'-'._____ ..•. , '. i ,', !. .~.: ;, _,. ,

- Chromat09'uph1e en C.L.H.P. lNr colonne cSe silice . ~:; ~'i;;::! ! :, 1: :_~:.-: :_',:--;-.'_' ',_.-':5 \1 - 3/8 ' x 30 CID - cS' un extrait mêthanol1que cSe ! : : '1 t 'tissus du cultivar Piêral1ne. Dêtection UV (-1 Il ~.-. :.' ::: r ;. "ri':_:'': ..

280 nIIl et rlifractomêtrJ.que (---, z. 1 Il 41. Cf. p.- _~~ 1.:Lilll ~I ~ ::! :' .. 'L' : '

pour la rêparUtJ.on des, ~I~bl~tlC~S·_!_t_!_.~_.•._.: .: :.: :: ;_.1 l.1: :~~Ir,r j!,~r'Ir '.. ~ ~~~~:~~'l-~ t'F~ .~ ':~T:::::'-'~: .r :-: . : T ; t i1': :': :il: ..: .' , ;.l ' , , , :: ; ft: . J..-,-I----::: 1~ r::- .-:-;-:-: ::.:' :r;--:-: :~::

: :;: \ ~ ~

~:JI'~~:iq ~:

1· -rIfT.....

_. - _ ... -.. _ _. 1 _. __ •... .. •. ~ •• .. - r"'- .-

- .. - - .. -'- . ---- - - .. -.. -

- Fig. 14

---:-

1-----+,---_.--1---

- 77 -

Ceux-ci sont provoqués, comme l'indiquent les enregistre­

ments de CG-SM, par la présence de lipides dont la nature des liai­

sons n'est pas élucidée. Nous avons réalisé des mélanges des princi-

paux composés phénoliques - acides et aldéhydes - avec de

l'a L palmitine, de la DL palmitine et du linoléate de méthyle en

différentes proportions. Au rapport de 1/50e le linoléate de méthyle

entraîne d'importantes quantités d'acide dihyqroxy 3,4 benzolque.

Au rapport de 1/100 les acides cinnamiques, surtout

l'acide férulique, et benzolques sont fortement entraînés. Par con­

tre, les co-migrations des aldéhydes benzolques sont moindres.

3.5.3.2. En C.L.H.P.

~ C.L.H.P. sur colonne de silice

Un échantillon méthanolique provenant d'une séparation

sur polyclar est chromatographié sur plaques de silice H prépara­

tives avec pour éluant le mélange Hx-Ae-Me (50 : 80 : 12). Les

fractions comprises entre les Rf 0,70 et 0,20 dans ce système sont

ensuite chromatographiées deux fois sur une colonne de silice 5 ~

- 3/8' x 30 cm -. L'éluant est un mélange Hx-Ae-Me dans des propor­

tions croissantes puis Ae-Me (5 : 1) et méthanol pur. Nous observons

une très -forte interpénétration des substances phénoliques. La

figure 14 indique les séquences de pics décelés d'abord eh double

détection puis en détection en ultra-violet à 280 nm à cause des

fortes teneurs en acétate d'éthyle. Le test de toxicité couplé avec

une détection par réaction de nitrosation permet de localiser les

substances toxiques.

zone 0Hx-Ae-Me

(50 : 80 12)

zone 0Hx-Ae-Me

(50 : 80 : 12)

les deux aldéhydes benzolques

acide férulique

acide p. coumarique

vanilline

acide p. coumarique

acide férulique

acide dihydroxybenzolque

- 78 -

zone ~ acide féru1ique

Hx-Ae-Me acide p. coumarique

(50 · 80 12) acide dihydroxybenzolque·acide caféique

zone ® acide dihydroxybenzolque

Hx-Ae-Me acide trihydroxybenzoique

(50 · 80 : 12) acide caféique·acide ch1orogénique

traces d'acide féru1ique

zone ~

Ae-Me

(5 : 1)

acide caféique

acide dihydroxybenzoique

acide trihydroxybenzoique

acide féru1ique

acide ch1orogénique

deux substances inconnues présumées glycosides

La reprise de chacune de ces fractions sur une colonne

de silice 7 ~ greffée en C 18 - 3/8' x 30 cm - avec pour é1uant un

gradient de 35% à 80% d'acétonitri1e confirme l'existence de plu­

sieurs substances décelées par réfractométrie et en ultra-violet

ainsi que de composés apo1aires décelés en ultra-violet au cours de

l'é1ution par l'acétonitri1e 80%.

~ C.L.H.P. sur colonne de silice greffée en C 18

Les essais de séparation ont porté sur des échantillons

de phénols é1ués de colonne de résines échangeuses d'ions XAD 2 et

MR7 ainsi que de phénols é1ués de colonne de po1yc1ar. Les sépara­

tions sont effectuées, avant de disposer d'un appareil à gradient,

par étapes successives soit d'acétonitri1e de 35% à 90% soit de

méthanol de 50% à 90%. Ultérieurement, la phase mobile a été acidi­

fiée par de l'acide acétique à 2% puis à 5% 0 pour faciliter la

séparation des substances phéno1iques. Dans tous les cas nous cons­

tatons des pertes en poids de substances de l'ordre de 25% à chaque

chromatographie. D'autre part, il persiste des chevauchements de

produits dans chacun des pics décelés en ultra-violet à 250 nm,

285 nm et 320 nm et par réfractométrie.

- 79 -

Par exemple, après une chromatographie de phénols préala­

blement séparés sur résine XAD 2 , les tests de toxicité pour le

c. aZadosporioides sur plaque chromatographique de silice associés

à une révélation par la p. nitraniline nous indique les groupements

ci-dessous :

Dans le méthanol 50%, la première fraction ne contient

pas de substances toxiques. La seconde correspond à un glycoside

présumé et non identifié, à l'acide chlorogénique, aux acides di­et trihydroxybenzolque et dans une moindre mesure à l'acide caféi­

que.

La fraction méthanol 70% contient ces mêmes substancesavec en plus les acides p. coumarique et férulique.

La fraction méthanol 90% contient essentiellement les

deux aldéhydes en mélange avec des substances apolaires.

Nous avons comparé les qualités relatives des purifica­

tions d'un même échantillon d'une part avec la succession colonne

de silice - colonne de silice greffée en C 18, d'autre part avec laséquence inverse (fig. 15 et 16). Il apparait que la chromatogra­

phie sur colonne de silice greffée en C 18 est plus performante. Lasuccession des séparations sur colonne de silice greffée en C 18

puis sur colonne de silice permet une relative purification des

substances. Cependant, les pertes de produits à chaque étape rendent

cette technique inutilisable tant pour des dosages quantitatifs parrapport aux poids de tissus frais que pour purifier finement les

substances toxiques.

3.5.3.3. En ~G~qM.

La plupart des spectres de contrôle ont été réalisés à

partir de fractions méthylés avant chromatographie préparative.Dans certains cas, les chromatogrammes d'élution permettent

d'apprécier les proportions relatives des substances. Nous indi­

quons, à titre d'exemple (fig. 17), les spectres de masse des aci­

des férulique et dihydroxy- 3,4 benzolque ainsi que de son aldéhyde.

.......- J

(j ~;

1 !

- 80 -

1 -

~_._j- --

- -

-_ .. 1. --111

1

-.10

Î- -1

i

10

- 81

l'ta

\0 0

\1A

\~O

,1

11

1-

1

1·

90

•• r .-.- •••• 1 • ~ ••

---_._--+:1

. - _.. '- --Î--: --::"'1':':----1":l~~"i _. ': 1. .....g0

III1 -:-L

- 1

~~O

1-rid:

:-tt-o1

r1

120

!r1

,J

._-.-:.;.,..

,.-:: :~ :-:'.

. \.,.. ~.

. .,'

. " 1(.\-

'~ ~u.......... -

-- ---

.....- ._..l:..l :...: ~. :

----~-_:-_--:--.~.~ -S._-~~ _ ....~., " • .-t.-____.

- 82

NUIMG-'SIDAA t 100. 101rELE: A' TOHATE23 . •TDnATE H'>'OROLYSE ACIDE· CPIJAl<:l7C8 llro---)200)!C(SlfC'oMID

100%. 2&83072 RT -14.43.4

0I-lU."':'8401-l1AP-l;I4

SCf.lU-1 092-1 0;"0

li

Fig. 17 - Spec~res de masse de composês phênoliques ê~ablis

en CG-SK aprée mê~hyla~ion •- Acide fêrulique ISc.l082).

- Acide dihydroxy 3,4 benzolque ISc.5201. 1~1

- Aldéhyde dihydroxy 3,4 benzolque 18c.4751. 1

1"3 14;" l~60 eo 100 120 140 160 Il!O

200 240 260 280 320 ~o

ItERnAO-'S1DAR t 100, 101rlLE AI T1II1ATE23TOMATE HYDROLYSE ACIDE: CPU~8 ISO--)2DO)!C(SIlC'M/'O

1001l- 2731008 RT -0;"'02.4

01-IIAR-8401-lIAR-e4

6

. :

160't'1"'~

~"iiIN

200 220 2010 260 280 300 320 340

t 100. 101~1D.:.R .rlLE: A' ~TE23TatlATt HYOROLYSE: ACIDE ~CB lSO---)ZOOllC(SMC'.t1tO

100%- 151:57376 RT -06'26.0

III

01-11"1"-8"Ol-lu..R-e-l

1 .6

- 83 -

4. La tomatine et la tomatidine

4.1. Techniques d'obtention

Ces produits sont partiellement purifiés par adsorption

des extraits bruts méthanoliques sur polyclar. Ils en sont élués

par le méthanol 50% et le méthanol 50% additionné de P04HNa2 à

pH Il. Trois tentatives de purification ont été réalisées, les

deux premières ont abouti à la dégradation de la quasi totalité des

substances toxiques, à l'exception de la tomatine et de son aglycone.

La dernière série (fig. 18) correspond à une fraction pesant 6 g

éluée du polyclar et chromatographiée sur plaques avec pour éluant

le mélange Clf-Me (1 1). Elle révèle deux zones toxiques pour le

C. aZadospopioides aux Rf 0,75 - 0,85 et 0,42 - 0,55. Dans ce sys­

tème chromatographique le Rf de la tomatine est 0,37.

Les 6 g de l'échantillon sont injectés en C.L.H.P. sur

colonne de silice greffé~ en C 18 - 1/2' x 50 cm -. L'élution est

assurée par un gradient d'acétonitrile de 15 à 80% dans une solu­

tion acétique à 5% 0 • Les fractions~et~decette élution

(350 mg) présentent les deux zones toxiques recherchées. Une deu­

xième chromatographie en C.L.H.P. sur colonne de silice greffée en

C 18 - 1/2' x 50 cm - par un gradient de 20% à 85% de méthanol en

solution acétique 2% permet de les séparer. Les fractionsQ)et~

pesa~t 191 mg de cette élution contiennent la substance toxique H,1

la fraction~ (156 mg) contient un mélange de produits oü la toma-

tidine semble majoritaire, elle est entralnée à partir de 75% de

méthanol.

4.2. La tomatine

Cette substance étant considérée de longue date comme

toxique (Drysdale et Langcake, 1973) n'a pas fait l'objet d'une

étude particulière. Elle est présente parmi les substances polaires

extraites des tissus par le méthanol et est fortement adsorbée sur

le polyclar. Elle migre à Rf 0,37 sur plaque de silice éluée par le

mélange Clf-Me (1 : 1). Elle se révèle à chaud par le trichlorure

d'antimoine à saturation dans le chloroforme et donne un spot de

- 84 -

Fig. 18 - Schéma d'extraction de deux fractions polaires de nature indéterminée

• fraction F proche de la tomatidine• fraction B contenant un diêne diol présumé

Extrait méthanolique de tissuschromatographié sur col. de polyclar

phase méthanolique (6 g)C.L.B.P. col. Si C 18 gradient acétonitrile

15% à 80% en sol. acétique 5%0

échantillon de 350 mg : 2 zones toxiquesC.L.B.P. col. Si C 18 gradient méthanol

20% à 85% en sol. acétique 2%

fraction 191 mg

toxicité Rf 0,75-0,85 en C.C.M. Clf-Me(1:1)C.L.B.P. col. Si C 18 gradient acétonitrile

10% à 75% en sol. acétique 2%

~fraction 117 mg

C.L.B.P. col. Si C 18 gradient méthanol5% à 55% en sol. acétique 5% 0

~chromatographie préparative

plaques de silice H

C.L.B.P. col. Si C 18 élution isocratiqueacétonitrile 55% en sol. acétique 5%0

~C.L.H.P. col. Si C 18 élution isocratiqueacétonitrile 95% en sol. acétique 5% 0

~fraction toxique B

(15 mg)

1fraction 156 mg

toxicité Rf 0,40-0,50 en C.C.M. Clf-Me(1:1)C.L.H.P. col. Si C 18 élution isocratique

méthanol 65% en sol. acétique 5% 0

C.L.B.P. col. Si C 18 gradient acétonitrile25% â 90% en sol. acétique 5% 0

~3 C.L.B.P. successives col. Si C 18élution isocratique acétonitrile 85%en sol. acétique 5%0

fraction toxique F(3 mg)

85

l--- ---iO, ,.----20----r·-r·30·--.---4IJ. .,'" __... _.. l, -----~SC -_._-90-.-;-

.. _. :. -- -- - - -­ '~--"'-'=:":':

"

- i -:$' '",?, ......"

.r ~ r7J _•••••.r ~ ..4(; . :.:- -.' ~IJJ.

_. _... "- - ...'-4_-:'~-':"'::-'-:-:"-:--f- . .~ ::.:._=_.:_._:..:...:..~.:.: :-._":":"':"-_~=-':":':_.:"::=-':":::"::-:_'::': .•:...: ..:-_-: ::....••. . .__ ._t:~":'::- --_:L-':':'::: .;_ ._ _-: --- ._. - -- .. ---- _o. :..'-_:.:...-:.-:

-~ .~~~-~ _::~:::.-~: :~~ ~--.'::~ :-~ii 70 ~:::::: : .<;:. 'f ,,~.'-~(.::'.._":':':.::.:..:.. -=- _. __

., .,.

.-

- 86 -

couleur bistre à violet. En C.L.H.P., llélution sur colonne de

silice greffée en C 18 avec des solutions acides de méthanol oudlacétonitrile permet sa séparation en début de gradient entre 5

et 15% de méthanol. Toutefois, la tomatine nlest jamais totalement

séparée des autres produits toxiques par les chromatographies sur

plaques et en C.L.H.P •. Elle a constitué un contaminant, certes

minoritaire mais três gênant, lors de la purification des fractions

contenant de la tomatidine et la substance H.

4.3. La tomatidine

Elle est purifiée par deux procédés en C.L.H.P. : sur

colonne de silice - 3/8 1 x 30 cm - et - 1/2 1 x 50 cm - où elle est

éluée par le méthanol et le méthanol 95% et sur colonne de silice

greffée en C 18 - 3/8 1 x 30 cm - et - 1/2 1 x 50 cm - à llaide desolvant aqueux. Ses caractêres chromatographiques sur plaques de

silice sont: Rf 0,62 à 0,76 ; Rf 0,80 et Rf 0,85 avec les mélan­

ges respectifs Hx-Ae-Me (50 : 80 : 12), Clf-Me (85 : 15) et Clf-Me(1 : 1).

A partir dléchantillons de tissus de racines et de col­

lets correspondant à 350 g de poids frais préalablement fraction­

nés sur plaques préparatives de silice H avec lléluant Hx-Ae-Me

(50 : 80 : 12), 20 mg de tomatidine ont été obtenus sur colonne de

silice - 3/8 1 x 30 cm - en C.L.H.P •• Compte non tenu des pertes au

cours des manipulations successives, cela correspondrait à une

teneur-moyenne dans les tissus de llordre de 60 ~g/g.F. La concen­

tration réelle dans les parties des plants où llinfection parasi­

taire est bloquée est vraisemblablement plus importante. La toma­

tidine est éluée difficilement par des solvants aqueux avec ou sans

acide acétique en C.L.H.P. sur colonne de silice greffée en C 18.

La figure 19 concrétise cette difficulté dans le cas d'une colonne1/2' x 50 cm éluée par un gradient de 5% à 99% de méthanol dans une

solution acétique à 5% 0 : l'élution va de 70% à 95%. Dans ces con­

ditions, les autres substances polaires toxiques, éluées à partirde 70% de méthanol, se trouvent mélangées à la tomatidine malgré

- 87 -

plusieurs fractionnements sur des pics reproductibles en détection

dans l'ultra-violet à 250 nm. C'est notamment le cas des deux pro­

duits décrits ci-dessous.

4.4. Interférences avec d'autres substances

4.4.1. La fraction F

La substance toxique a été purifiée à partir de l'échan­

tillon de 6 g élué du polyclar (fig. 18). Elle est fluorescente à

254 nm et migre à Rf 0,45 - 0,55 sur plaque de silice éluée par le

mélange Clf-Me (1 : 1). Après chromatographie sur colonne de silice

greffée en C 18 - 1/2' x 50 cm - avec élution isocratique par une

solution acétique à 5% 0 de méthanol 65% et double détection par

ultra-violet et réfractométrie, le produit conserve sa toxicité

mais ses caractères chromatographiques sur plaque de silice sont

modifiés. Après conservation au froid, son Rf se situe à 0,60 - 0,70

dans l'éluant Clf-Me (1 : 1).

Une chromatographie sur colonne de silice greffée en

C 18 - 3/8' x 30 cm - éluée par un gradient de 25% à 90% d'acéto­

nitrile et trois chromatographies successives sur colonne greffée

en C 18 - 1/4' x 25 cm - en élùtion isocratique par l'acétonitrile

85% dans une solution acétique à 5% 0 permettent d'obtenir une

fraction toxique de 3 mg au Rf 0,40 - 0,50 dans l'éluant Clf-Me

(1 : 1).

Cet échantillon a fait l'objet d'une étude structurale.

La spectrométrie de masse indique que la tomatidine est majoritaire

(fig. 20). Cependant, il existe un décalage net entre le Rf de la

tomatidine et celui de la fraction F dans l'éluant Clf-Me (1 : 1).

D'autre part, cette fraction diffère de la tomatidine par sa fluo­

rescence sous lumière ultra-violette à 254 nm et par son spectre

ultra-violet établi dans le méthanol redistillé. Celui-ci présente

en effet un épaulement à 322 et à 310 nm, un pic à 280 'nm et un

minimum à 270 nm alors que les longueurs d'onde caractéristiques

de la tomatidine sont des pics à 235, 230 et 215 nm e~ un épaule­

ment à 247 nm.

- 88 -

NE:Pfl':'GI'~ 1Cl.:>':'F'ILE: AI I1ITF.0125TOt1ÀTE: Co;. LIO

10"·;'" 240:'"9$;'";;: ,T :0021 40.01 4

[100, 10] 12-11I',I)-l;I412-1l"P-1;14

,::_ l'!~ 'El=-

~lL~J,III~-,UIII't-~111 l,~E~~O 100

344rh' , '1 \ 1

:S'50

NERII('G.I~ 1( ...RLIEPAP','I 1.II..ISrr.;.LIB

2

1 4

125

-';f. ~thll~~\~lrl,h,l ..\lIl50 100

152.1. 1. .1 , 192 2;;"32El;; ::11;t-l"'jr""......,I.o.'r",-Ir""I'......,.:,';:t.·;:.,-rI....-................-.-...,..., ..,,-...,T'..,.......T'.J.,.,,....:;:,~I.i;.......' "")-......., :"','i.T-,"T"""........,.."......, -

150 200 2~0 300 :S50

Fig. 20 - Spectre de masse de la fraction F (Sc.149) de

M+ = 415 comparé à celui de la tomatidine

(Sc.L 30005) en mémoire dans l'ordinateur du SM.

1;00550500

415

400

359371~-"""=+;rr'otU-r""""'........,..qL.""""""""""'r-r"""'""r-'T"""'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''...-r..,...,r-r-''''''''''''''''''''''''-'-'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''ï

650

- 89 -

Cette difficulté à identifier le second produit toxique

dans la fraction tient à plusieurs causes :

~ la mauvaise élution de la tomatidine qui est répartie sur plu­

sieurs fractions identifiées par des pics en détection dans

l'ultra-violet que ce soit à 250 nm, 280 nm ou à 320 nm.Dans le dernier cas, la tomatidine n'est pas décelable.

~ la probable toxicité des deux substances

~ enfin, une plus grande volatilité de la tomatidine vers 220°C

d'où l'obtention de spectres de masse, par introduction directe,+avec la fragmentation et le pic M = 415.

Précédemment, nous avons rencontré les mêmes difficultés

pour une tentative d'identification d'une fraction qui, à l'évi­

dence, ne correspond pas aux caractères chromatographiques de la

tomatidine.

4.4.2. Les cristaux D

Ces cristaux se sont formés dans une solution méthanoli­que de produits polaires pesant environ 2 g et provenant d'une sé­

paration sur plaques de silice H dans l'éluant Clf-Me (1 : 1) (zone

de Rf < 0,30) conservés à -18°C pendant six mois. Le poids de

l'échantillon recueilli par filtration est de l'ordre de 700 mg.

Les aggrégats ressemblant à des cristaux de couleur blanchâtre

fondent dans le méthanol à ébullition.

Le spectre établi dans l'ultra-violet avec pour solvant

le méthanol redistillé présente des pics à 270 et à 215 nm, des

épaulements à 275 et 260 nm et un minimum à 248 nm.

Le produit majoritaire migre au Rf 0,80 après élution

par le mélange Clf-Me (1 : 1) et manifeste une nette toxicité pour

le C. eZadosporioides. Il n'est pas détectable sous lumière ultra­

violette à 254 nm ou à 366 nm mais donne une coloration rosâtre

- 90 -

avec le trichlorure d'antimoine à saturation dans le chloroforme

après chauffage à 125°C. Une pulvérisation de p. nitroaniline nedonne aucune réaction. Les caractéristiques d'élution sur colonne

de silice greffée en C 18 par le méthanol sont très proches de

celles de la tomatidine.

Parmi les hypothèses avancées, deux seraient à approfon­

dir : la présence d'un sucre en C 6 et l'existence d'un produit

terpénique à structure proche de la nicotine.

5. La substance H

5.1. Techniques d'isolement

C'est une substance, ou un groupe de substances, dont latoxicité pour le c. aLadosporioides est décelée à Rf 0,75 - 0,85

dans le système Clf-Me (1 : 1) sur plaque de silice. Le produit est

repérable grâce à sa fluorescence bleue claire à 366 nm.

La purification partielle (fig. 18) est obtenue par plu­sieurs chromatographies en C.L.H.P. sur colonne de silice greffée

en C 18 - 1/2' x 50 cm -. L'élution est réalisée par un gradient

de 10 à 75% d'acétonitrile dans une solution acétique à 2% puis par

un gradient de 5 à 95% de méthanol dans une solution acétique à

5% 0 • A ce stade de purification, la toxicité est répartie sur

quatre fractions d'un poids total de 117 mg. Une chromatographie

préparative sur plaques de silice H permet d'isoler la bande à

fluorescence bleue claire à 366 nm caractéristique de la fraction H.

Enfin, une chromatographie en C.L.H.P. sur colonne de silice greffée

en C 18 - 1/2' x 50 cm - éluée par de l'acétonitrile 55% en solution

acétique à 5%0 et par de l'acétonitrile pur puis une chromatogra­

phie sur colonne de silice greffée en C 18 - 3/8' x 30 cm - éluée

par de l'acétonitrile 95% en solution acétique à 5% 0 avec double

détection en ultra-violet et en réfractométrie, permettent d'obte­

nir une fraction de 15 mg toxique en C.C.M. et en lames à concavité.

- 91 -

5.2. Caractêres chromatographiques

La substance toxique correspond à deux bandes de Rf 0,77

et 0,81 dans le système Clf-Me (1 : 1) qui sont colorées en ocre­

orangé et en bistre par le trichlorure d'antimoine à saturation

dans le chloroforme à 125°C. Il pourrait s'agir de deux isomères,

la fraction majoritaire correspondant au Rf 0,81. Les Rf sont res­

pectivement de 0,64 et 0,60 avec le mélange Clf-Me (95 : 5). La

substance ne fournit pas de réaction colorée avec la p. nitroani­

line et la benzidine diazotée. Le spectre dans l'ultra-violet,

établi avec du méthanol redistillé, fournit peu d'indications.

Aucun pic ou épaulement n'est décelé, à ce stade de purification,

entre 400 et 260 nm. Il existe deux épaulements à 254 nm et à

207 nm, un pic à 248 nm et un minimum à 220 nm.

En C.L.H.P. sur colonne de silice greffée en C 18

- 1/2' x 50 cm - avec détection dans l'ultra-violet à 250 nm, les

produits sont élués à partir de 60% de méthanol dans une solution

acétique à 5% 0 , le maximum du pic étant à 70% de méthanol.

Cet échantillon de 15 mg est scindé en deux lots. Le pre­

mier, de 6,5 mg, est destiné à l'étude structurale, le second, de

8,5 mg, est utilisé pour des tests de toxicité notamment de syner­

gie avec les composés phénoliques et la tomatine.

5.3. Etude structurale

Les spectres de masse sont difficiles à interpréter.

D'après les indications de l'élution en CG-SM, les produits présu­

més toxiques correspondent à deux pics dont l'intensité relative

est de l'ordre de 25%. Dans cette fraction existent, minoritaire,+le sesquiterpène polaire de masse M = 222 et un stérolde en C 21

de masse M+ = 316. Le poids moléculaire correspond d'aprês l'étude+en ionisation de champ par l'ammoniac à M = 326. Un gain de masse

de 16 par rapport à un alcool diénique peut correspondre à un oxygènesupplémentaire •. Il pourrait s'agir d'un diène-diol en C 18. Plusieurs

- 92 -

indications confortent cette hypothèse : la fragmentation en SM

comporte les pics 185/187, 153/155 et toute la zone des pics de

55 à 10 en commun avec l'alcool diénique. Après hydrogénation cata­

lytique, la SM en ionisation de champ dans l'ammoniac indique

M+ = 330, M + 1 = 331, M + 18 = 348 - m/z 313 (M + 1 - 18 soit H20) ,

246, 229, 204, 187, 155 -. Les pics 187 et 155 sont s~ilaires à

ceux du produit d'hydrogénation de l'hydroxydiène. Ces pics sont

nettement marqués après une seconde hydrogénation et une analyse en

CG-SM en impact électronique.

D'après ces résultats, M. Einhorn présume qu'il puisse

s'agir d'un ester méthylique d'acide gras en C 18 avec deux doubles

liaisons conjuguées en position 10-12 (d'où la fluorescence), une

des fonctions alcool étant en position 9.

Le spectre de RMN ne fournit pas d'informations complé­

mentaires. Ce produit est dégradé lors des essais de chromatographie

préparative en phase gazeuse. Des analyses complémentaires sont pré­

vues au lab~ratoire des médiateurs chimiques.

Ainsi, les substances polaires fortement inhibitrices

in vitpo pour le P. parasitiaa correspondent à plusieurs groupes

chimiques. Incontestablement la tomatidine est accumulée dans les

tissus parasités. De surcroît l'hôte élabore deux produits toxiques ­

non décelés chez le témoin -. Aucune des techniques de séparation

mises en oeuvre n'a permis de les séparer complètement de la toma­

tidine (cf. fig. 19). Au stade actuel, la substance F n'est pas

caractérisée tandis que l'hypothèse d'une relation des cristaux D

avec un dérivé de l'acide nicotinique serait à approfondir. Enfin,

la substance H dériverait vraisemblablement d'un lipide insaturé en

C 18 biogénétiquement relié à l'acool diénique (similitudes de spec­

tres de masse), sa polarité résulterait de la présence de deux fonc­

tions alcool secondaire.

2ème PARTIE

- 93 -

ETUDE DES REACTIONS A L'INFECTION EXPERI­MENTALE

1. Evolution des concentrations en phénols totaux

A l'issue de chaque série d'infections expérimentales

réalisées en serre ou in vitro nous avons comparé l'évolution des

teneurs en composés phénoliques dans les tissus inoculés et/ou

traités par rapport au témoin.

Les dosages correspondent exclusivement aux substances

phénoliques diffusant des tissus après broyage dans le chloroforme

ou dans le méthanol 50%. Ils correspondent donc aux phénols libres

- sous forme principalement d'esters et de glucosides (El Khatib

et al. 1974, Fleuriet et Macheix 1980 et1981 Elliger et al. 1981) ­

dans le cytoplasme, les vacuoles ainsi que les chloroplastes dans

le cas des tissus chlorophylliens. En principe, une proportion in­

fime des phénols estérifiés aux parois des cellules est libérée par

ce traitement. De même les dosages ne rendent pas compte de l'évo­

lution quantitative et qualitative des monomères incorporés dans la

lignine au cours d'éventuelles réactions de défense. Nous pouvons

présumer que les substances phénoliques ainsi dosées représentent

chez la tomate des produits constitutifs intervenant pour partie

dans l'élaboration de structures lignifiées pouvant représenter une

barrière à l'infection et pour partie comme inhibiteur de l'agent

pathogène au niveau des parois ou du cytoplasme.

1.1. Variabilité de l'accumulation des phénols totaux après

l'infection

Afin d'établir une valeur moyenne, représentative de l'en­

semble des tissus entourant la zone de pénétration du parasite, les

échantillons sont prélevés sur les extraits bruts après diffusion à

froid. Hormis les essais de modulation des réactions de défense de

l'hOte, les extraits correspondent à plusieurs kilogrammes de tissus.

- 94 -

Il appara!t que les modifications de synthèse de phénols

totaux dépendent à la fois des conditions de milieu - intensité etdurée d'éclairement, température nocturne de la serre - des culti­

vars et du parasite inoculé. Si nous considérons les teneurs déce­

lées dans les tissus des plants témoins des séries de traitement

par l'AOA réalisées respectivement en mars et en avril 1983 puis en

juin 1984 nous constatons des valeurs variant entre 390 et 500 ~g

d'équivalent en acide chlorogénique par gramme de tissus frais. La

nature des tissus influe également sur l'intensité de la réaction;

l'accumulation de phénols totaux paraIt plus importante dans les

feuilles que dans les bases des tiges et les racines. Ainsi, pour

le cultivar Piéraline, cette teneur est d'environ 500 ~g/g.F. enéquivalent d'acide chlorogénique dans les tissus de tiges et de ra­

cines, elle atteint 687 ~g/g.F. dans le cas de feuilles maintenues

en survie 60 h in vitro avec blessure en début d'expérience.

1.2. Influence des génomes confrontés

Nous avons tenté de comparer chez les deux cultivars

Piéraline (Ve, Ph + S) et Piéralbo (Ve), l'évolution des teneurs

en composés phénoliques par rapport au témoin suivant le parasite

inoculé (tab. 6).

Tableau 6--------- Comparaison des teneurs en phénols totaux exprimées en

~g d'équivalent d.'acide chlorogénique par g.F. dans les

tissus des cultivars Piéraline et Piéralbo inoculés par

le P. paraBitiaa et par le V. aZbo-atrum :

Piéraline Piéralbo

Témoin 500 590

inoculé P. paraBitiaa 720 695

inoculé V. aZbo atrum 690 785

stimulation par P. paraBitiaa 44% 18%

stimulation par v. aZbo atrum 38% 33%

- 95 -

Ces dosages correspondent aux tissus du collet et des

racines, l'inoculum dans les deux cas étant appliqué sous forme de

broyat de culture à la base de chaque plant. Dans nos conditions

expérimentales, il semble en première approximation que la réaction

de défense chez les deux cultivars inoculés par V. aZbo atrum cor­

responde à un taux d'accroissement comparable des teneurs en phénols

totaux. Nous observons que chez le cultivar Piéraline les concen­

trations dans les tissus des témoins sont inférieures à celles mesu­

rées dans ceux de Piéralbo. De même, les teneurs en composés phéno­

liques sont plus élevées en fin d'expérience (+13%) chez Piéralbo

que chez Piéraline. Ces deux cultivars possèdent l'allèle Ve de ré­

sistance àla verticilliose et ne manifestent pas, lors de la récolte,

dix jours après l'infection expérimentale, de symptômes de fanaison

ni de réactions de brunissement des vaisseaux de la base des tiges.

Par contre, la synthèse de composés phénoliques semble sti­mulée de façon différente chez les deux cultivars en réaction à l'ino­

culation par le P. parasitica. Alors qu'en début d'expérience,

les teneurs du témoin Piéralbo sont de 18% plus élevées que celles

du témoin Piéraline, lors de la récolte, nous observons une inver­

sion. Après dix jours d'incubation, les concentrations en phénols

totaux dans les tissus des plants de Piéraline sont légèrement plus

élevées (de 3,5%, différence mineure) que dans ceux de Piéralbo.

Par contre, la stimulation de synthèse est de 44% chez le cultivar

Piéraline pour seulement 18% chez le cultivar Piéralbo. Pour une

partie des plants de ce dernier~ nous avons noté un début de nécrose

du collet avec légère dépression des tissus parenchymateux ainsi que

de nombreuses lésions brunes de 5 à 20 mm sur les racines. Enfin, la

variabilité de la stimulation de synthèse phénolique chez le culti­

var Piéraline inoculé par le P. parasitica semble relativement peu

importante. En effet, nous avons noté dans les trois essais réalisés

en 1983 et 1984 concernant l'action de l'AOA que l'accumulation de

phénols totaux est respectivement de 36%, 38% et 42% (page 113) par

rapport à 44% dans l'essai comparatif de 1984.

- 96 -

Modalités d1élution de composés phénoliques en C.L.H.P.

sur une colonne de silice greffée en C 18 - 1/2 1 x 50 cm ­dans un gradient de méthanol et de solution acétique à

5% 0 - comparées aux migrations en C.C.M.

Rf en C.C.M. hplc CDS C 18en lis méthanol

Phénols Hx-Ae-Me Hx-Ae-Me Clf-MeSortie Pic Fin

50 : 50 : 5 50 : 80 : 12 85 : 15

Acidetrihydroxy- a 0,23 0,17 53 55 et 57 65benzolque

Acide a 0,18 0,39 57 - 59 62chlorogénique

Acidedihydroxy- 0,25 0,50 0,34 60 64 75benzolque

Acide 0,20 0,44 0,35 65 67 75caféique

Vanilline 0,76 0,80 0,90 65 65 et 67 70

diméthoxy- 0,80 0,90 0,95 67 71 79benzaldéhyde

Acide 0,44 0,62 0,57 70 74 et 75 80p. coumarique

Acide 0,41 0,59 0,52 73 75 et 77 85férulique

- 97 -

2. Etude chromatographique par C.L.H.P. en phase aqueuse

L'analyse des extraits sur colonne de silice 5 ~ greffêe

en C 18 - 1/2' x 50 cm - avec des gradients de concentration crois­

sante de mêthanol ou d'acêtonitrile dans une solution acêtique à

5% 0 nous fournit des infor.mations importantes.

Dans une première êtape sont chromatographiêes toutes les

substances de rêfêrence disponibles. Le tableau 7 rend compte de

leur position dans l'êlution avec un gradient de mêthanol. Cepen­

dant, nous n'avons pas pu repêrer les esters et les glycosides

d'acides cinnam~ques prêcêdemment dêcrits faute d'en disposer en

quantitês suffisantes. Nous prêsumons que plusieurs pics non carac­

térisés y correspondent.

Nous avons divisé les enregistrements en quatre zones de

A à D correspondant à quatre étapes de gradient de méthanol entre

5% et 99% dans une solution acêtique à 5% 0 • Nous comparons succes­

sivement l'incidence des diverses inoculations sur les rêactions

des cultivars Piéraline et Piêralbo. La dêtection est rêalisée à

250 nm dans l'ultra-violet.

2.1. Comparaison des extraits du cultivar Piéraline

inoculê par le P. parasitiaa (fig. 21)

têmoin/

~ zone ~ : êlution de mêthanol 5% à 10%. Trois pics en ultra­

violet (nO 1 à 3) sont observês,·dans cette zone d'élution. Leurs

temps de rêtention sont respectivement de 7, 12 et 13 mn. Ces

pics prêsentent sensiblement la même intensitê dans l'extrait

têmoin et dans l'extrait provenant de plants inoculês. Ces subs­

tances correspondent vraisemblablement à des glycosides phénoli­

ques. Cette zone d'êlution correspond aussi à celle de la toma­

tine connue pour ces propriétés inhibitrices mais elle n'est pas

visible à 250 nm, longueur d'onde à laquelle furent réalisês les

enregistrements.

98

A

.. - - :...... ..:;->~_.-; ~-~~t -- i

•.• ~ , - ~. ·-1

-- -. ~ _...-... -~.S~... , .

.: ~ ._.:-;--- -

0,64.=smV.1nm,250

Analyse comparative (~ 1 9 de tissus frais) enC.L.H.P. de la composition d'extraits méthanoliques

de tissus de plants du cultivar Piéraline témoins

(A) et inoculés par le P. pa~a8itiaa (B). Colonne

de silice 7 ~ greffée en C 18 1/2' x 50 cm

gradient de méthanol de 5% à 99% dans une solutionacétique à 5% 0 • Débit 2,5 ml/mn, défilement

5 mm/mn.

Détection UV

Fig. 21

- 99 -

X zone ~ : élution de méthanol 10% à 50%. L'enregistrement con­cernant l'extrait témoin montre l'élution de très nombreuses

substances à l'état de traces. Seul un pic en ultra-violet (nO 7)

élué à 42% de méthanol après 29 mn de rétention est nettement

distinct.

L'extrait provenant de plants inoculés présente trois pics prin­cipaux (nO 4, 5, 6) élués respectivement à 15%, 25% et à 30% de

méthanol après 18, 21 et 25 mn de rétention. Ces substances nesont pas présentes ou existent à l'état de traces chez le témoin.

Le pic nO 7, déjà observé dans l'extrait témoin présente une in­

tensité multipliée par 4.

La zone ~ correspond donc à l'élution de substances dont lasynthèse est fortement stimulée par l'inoculation du parasite.

X zo~e ~ : élution de méthanol 50% à 85%. L'extrait témoin con­

tient de nombreux produits à l'état de traces. Par contre trois

pics principaux (nO 8 à 10) de forte intensité élués respective­

ment à 52%, 66% et 78% de méthanol après 34, 41 et 47 mn de ré­

tention caractérisent l'extrait de plants inoculés.

X zone ~ : élution de méthanol 85% à 99%. Cette zone présentel'élution de nombreuses substances à l'état de traces. Seul un

produit élué à 99% de méthanol (nO Il) est fortement marqué dans

l'extrait provenant de plants inoculés alors qu'il ne se distin­

gue que très faiblement dans l'extrait témoin.

2.2. Comparaison des extraits du cultivar Piéralboinoculé par le P. parasitiaa (fig. 22)

témoin/

X zone ~ : élution de méthanol 5% à 10%. Aucune différence nota­ble n'apparatt entre les enregistrements concernant l'extrait

témoin et celui de plants inoculés : les trois pics présententla même intensité.

X zone ~ : élution de méthanol 10% à 50%. Les surfaces des pics

4 et 5 sont 5 fois plus importantes dans l'extrait provenant de

plants inoculés que dans l'extrait témoin. L'intensité des pics

6 et 7 est identique quel que soit l'extrait étudié.

100

~~~ht~S4~~~:;~;-~~f~t:_~,1~<!'~~,;~:~i1.-:~~~:~~~:~~~~-;' : ,'.-~. '_.; '~T-'. ::~~d;~~;:~~'~~~~~~~~;f:~~ti

. ! ...._._-_.- -~--_._-

Conditions(B) •papasitiaa

21.

P.fig.

Analyse

C.L.H.P.de

comparative (~ 1 g de tissus frais) ende la composition d'extraits méthanoliques

tissus de plants du cultivar Piéralbo témoins

(A) et inoculés par le

expérimentales: cf.

Fig. 22

- 101 -

* zone ~ : élution de méthanol 50% à 85%. Les pics 8, 9 et 10, à

l'état de traces dans l'extrait témoin, apparaissent nettement

dans l'extrait de plants inoculés. La synthèse des substances cor­

respondant à ces pics est cependant très modérée.

* zone ~ : élution de méthanol 85% à 99%. La synthèse des subs­tances correspondant au pic en ultra-violet nO Il est fortement

stimulée par l'inoculation. Difficilement décelable chez le témoin,

l'intensité de ce pic se trouve multipliée par 10 dans l'extrait

de plants infectés.

2.3. Comparaison des extraits du cultivar Piéraline

inoculé par le V. aZbo-atrum (fig. 23)

témoin/

* zone ~ : élution de méthanol 5% à 10%. Les substances éluéesdans cette zone semblent en moins grande quantité que chez le

témoin. Les pics l, 2 et 3 sont moins marqués.

* zone ~ : élution de méthanol 10% à 50%. A l'exception du pic 4,

inexistant dans l'extrait de plants inoculés, l'intensité des

pics 5 et 6 élués dans cette zone est augmentée de 4 à 5 fois par

rapport à celle du témoin tandis que celle du pic 7 est doublée.

* zone CS) : élution de méthanol 50% à 85%. La synthèse des subs­

tances éluées dans cette zone est fortement stimulée par l'inocu­

lation du parasite puisque les pics 8, 9 et la, à l'état de tra­

ces dans l'extrait témoin, présentent une importante intensité

dans l'extrait de plants inoculés.

* zone ~ : élution de méthanol 85% à 99%. Nous n'observons aucune

différence entre l'extrait témoin et l'extrait de plants inoculés

pour cette zone d'élution.

:.- :l

A

102

~fs~~~~B'~:r':1~~~s~tJr_~j;;~~!;~~1~:~~);~:~.~(.~.®<~"\':~~~~:\~ _::~~:.'//.;~:.< .;':'::":. :2::::::~

. .- .-- '- .- - .':':::=.-- ::=.': :-',- :::.:~ -~: .. --';'~.~-

:"';'..:- T:' ,:.::~;~":.":' ..' .:-:.'.:;~'~.'-.'.:'.':':}. :.,'_:'_~::: ~;.. :.;~: '.::'~_::_:i·.::._-::.:,:.-.Y :'. :.,:..ç_~'::~~::::':--~~:~:::T-.::::.-: -: - - -=~:..l:~-'~f-~ ~-.~-_'.:..:."~"..~~.:'.':~_:.:'.::-..~:_'.'-.::.!....r:._·~.~~.:-_·.·..:._._;i:-.~.·.· ..'.~,=~~-.~:-.:.~_'.:. ~.::-.: -~~.:_'-.'.'. '::.'.:'.-J.~.~~~ft-::~:::t~:-:~;,.~ ::,;~ :.'~~:~~~~gif~~ii:1~~i1ffi :~:;~~~r:h~~::i~~r~;~~~~!-i§;i: ~.~: .:: .:':::~k:::~~J:~=~~:;~~~i~~~-L~~~GF-: ~~E~~·:~:~:~F.~:~Ô~~t~}§~0[:~~

I!Iti~!lil~~_~.._. _.. -_ - ·-·t·-·--_ .. ·.. ·Ir -·E-.--·~%:

-_ ..-_.. '.. . -.- ...'- -... . _..- _.-=:;:::::T::"~:'7~-L:::~__~__~~t~;.~ ~:··~7 ~~~:;~- -:-::.:.-=;:,...:.:. =. -::::::_-:: =.::-::: ...:::~?~:=_ .. _, -0 • • ••• _~:.-~-.:_.::.::;~::_: :_; .:-~._:~.~~::~.:: • _

~~~i~ fr:~:~;~-'~·~';:~'~l?::"~~~:'::~::::.":~ ~~;~~~:~~~: ..­~~YB.i ~+$-=.:c·i~=:+i··: ~~.:~.~..~ .~~:~ :ç·.2:·Z~~~~_~~~i'.~~~:~6:(.i~\=;~r-=-.:t,:;"~j Ï/.· .. "'III'-: t~):·:t~ 'k t7f:-:- :- '.::' ::~::H~~'::P\~:D~J .S."~ . .:.'; : l' \.IlQ.r\ ~\'.!....~ . _.' -- .:':.'.. ' - .~~'.:.:-ï-t,c.:::;:: l.:A·. p.. S'°,(,o ~... A. 'A. ~a· . u~ !r,~...C::' ~=:::::À. ~i-:-(-:::..tï"':'-' -\Ï;-Ç~/;'::;- .. . '-1. -~ 'Ir........:.o.-:~...,:r-.:.r ... .... _..1.. . •.

B

Fig. 23 Analyse comparative (# 1 g de tissus frais) en

C.L.H.P. de la composition d'extraits méthanoliques

de tissus de plants du cultivar Piéraline témoins

(A) et inoculés par le v. albo-at'1'um (B) • Conditions

expérimentales cf. fig. 21.

- 103 -

2.4. Comparaison des extraits du cultivar Piéralbo

inoculé par le V. albo atrum (fig. 24)

témoin/

* zone ~ : élution de méthanol 5% à 10%. L'intensité des pics 1,

2 et 3 est moindre dans l'extrait inoculé que dans l'extrait té­

moin.

* zone ~ : élution de méthanol 10% à 50%. De faibles différences

d'intensité des pics nO 4 à 7 sont observées, nous présumons

qu'elles ne sont pas représentatives de la réaction de défense.

* zone (§) : élution de méthanol 50% à 85%. Nous observons une forteaccumulation des produits élués dans cette zone chez l'extrait de

plants inoculés. En particulier, les surfaces des pics nO 8 à 10

sont plus que décuplées.

* zone ~ : élution de méthanol 85% à 99%. Aucune différence n'ap­

parait entre l'extrait témoin et l'extrait de plants inoculés.

2.5. Comparaison des réactions des deux cultivars à l'infection

2.5.1. Infection par le P. pasàsitiaa

* zone ~ : Aucune différence n'apparait entre les deux cultivars

pour les substances éluées dans cette zone en réponse à l'infec­

tion.

* zone ~ : La synthèse des substances correspondant aux pics 4 et

5 est beaucoup plus stimulée chez le cultivar Piéralbo que chez

le cultivar Piéraline. Le pic 6 inexistant chez Piéralbo présente

une forte intensité chez Piéraline.

L'importance du pic nO 7 est la même dans les extraits des 2 cul­

tivars inoculés. Cependant les substances de ce pic correspondent

à une stimulation chez Piéraline alors que le cultivar Piéralbo

témoin présente déjà un pic 7 important.

104

\ .. -•• • • ., .• _..... _0 po. _ •••0' •

.... • '.: .j,.O ':.. .'r-:-:.:O·:j -:. 1 : ..:. '-.-::'"-..:._.~- ~:-' __ 0""_

i.o,.:: :;;:,,-.. '1 :,.:.: - ••- :i~'::. ... 00:";' .:: :'._ '.: ; •••

.~.~..J.·~·.;.:;.~.;.q;o:à:~,~ ..\.U;:.TI ~.::-.::::.:~,.:~.~-< ~.~~~;;. -'~'- ,:' --: ~i~:~' ..~~:~~

. . . :,.:. ::.~:- -_.__..IT~~;::::i~T·.:i~ ::_: @:(:-:;: .. -:."~ 0'-" ,-:-.--- ., '-:~-:-:r

p.~~F:r;: ',::: ::'~''- :-- -""._. .-. ~., .. -~ -:":·.:.1Ç:'_:~. ·!.::·_:·.o __ ~.&·~_o_.·_iç. _:._g._.. _.• ,!. __ i;:',:._o __"'._:.':.::"':":',:":-.:.::':.:~~:-.!!!:_.~~:;::'::.!,:: ;.: :.ô·;::.

.: ._::~::,:: ~••: •• : •• ""__ - _.;:_.:: :: • ..:_.~:';: ~o

:~~~;~~. '.:;;<: ::. '_"'_"~'~_:_'.~~'-'_""'-_::_'-'--,.':'. ~ ~~: :~g=:-":: '.:: ;-.-: . ..: .-..: ... .' ! :: ~::=~;:~~~~l:'-~-.2.'J~~ 0_ .:-= ,.-;:1_- ...: ':'::; .. "0 -_.: '0-

~....-_". :'t0 -:-o.:.:.! . -;.

...

~2~~?~~~~~;:F>~::-;.)~···.'-:- <. - ... ..~~__:-::;-.=:..~.~_:-=;_'-:-: .. _.. ~'__a. __: __ •• _. ., ::-~~ _ -

:=:='::'';:l:::::':':~~::~::-::...!.:'''::~.:.::..:.. ---'::"_~-'::.:: .. ':_:' ._. o. _. ':_-.:~_ -..:.:_

~fL~;~~~~~è~i ~~:_::':,.:~:: ..:~~ ;.;o:..~~:~:<:~~.: ~~:-':::' ~~.A~~ 'liti:..i""'·/v;~·.:i.L;1='"':J 'J 1'~"\':f:"c - '~-:7'-~~~::';::'

;f~~~~~-\i;_JJ~ ~;;L\~~~lU.~H~ !.;o~~: ::··'~:'~~~~;~~~~~'F .. _.S? L-...:l. IL':.. ~~o _ .. , ~IA. 5 '1>0 "- -- •• • ..... -- '" ..=-T~a-:':-i7"r-~--'-: ,,-.--!'· .. ··7-··· ~-Unrti.;::-... ·... · .§~:;:~~~::~~;/-·":o:.:~·~ :~:\' ~-.;:-. ~.: :~~i:~ \f7;'.~!';::==-~ .,,'" ._.... ', ·0 , •• _ o. _. .• . •._ - . 0A

_.- -"'--,-.::;:::.. .::.F=: '.: -:i:: ":""-. ~!:.!!9M·:t.=-::::,::. 1..:....~

~~~~~=~~;~f~~~ ~~:l:::.,;.::.a_": .. :: ~.:~

B

21.

le v.fig.

(# 1 g de tissus frais) en

composition d'extraits méthanoliques

du cultivar Piéralbo témoins

aLbo-atrum (B). Conditions

comparative

de la

tissus de plants

et inoculés par

cf.

(A)

expérimentales

Analyse

C.L.H.P.

de

Fig. 24

- 105 -

2 zone <ê) : La synthèse des substances éluées dans cette zone estfortement stimulée chez le cult~var Piéraline, elle est très fai~

ble chez Piéralbo9

2 zone ~ : Les substances du pic 11 sont beaucoup plus accumuléeschez Piéralbo que chez Piéraline.

Les deux cultivars répondent de façon différente à l'ino­culation par le P. parasitica. Les substances dont la synthèse eststimulée par ce parasite ne sont pas les mêmes dans les deux cas.Nous tenterons dans le paragraphe naction des médiateurs n de pré­ciser la nature de ces substances à partir des références présen­tées dans le tableau 7.

2.5.2. Infection par le V. aZbo-atrum

Les enregistrements des extraits de Piéraline et dePiéralbo par le V. aZbo-atrum sont totalement similaires. Les 2cultivars réagissent de la même façon contre le parasite contrai­

rement à ce que nous observons pour l'inoculation par le P. para­

sitica. Les deux cultivars possèdent en commun l'allèle Ve de résis­tance à la verticilliose.

2.5.3. Différences de réaction selon le parasite inoculé

Les chromatographies indiquent que la réaction de défense auP. parasitica des deux cultivars correspond à des accumulations plusimportantes de substances inhibitrices que celle au V. aZbo-atrum.

Contre celui-ci d'autres barrières sont élaborées (Hutson et Smith1980) et nous notons l'étroite similitude des chromatogrammes desextraits des deux cultivars isogéniques pour l'allèle Ve.

Les deux parasites provoquent d'importantes accumulations desubstances phénoliques éluées dans la bande ~. Par contre, l'inocu­lation du P. parasitica stimule les synthèses des produits élués dansla bande ~ - probablement des glycosides - et dans la bande ~ ­tomatidine, substance F et dans le dernier pié des dérivés oxygénésd'esters méthyliques d'acides gras insaturés -

- 106 -

'fTïH"lTmll'ITTl ---, , .--~~--~~-.'11'1 1i 1l,! 'I~~ i! Il ~I~ !i !I! 1 Fig. 25 - Analyse comparative (# l 9 de tissus frais) en ,'::: 1: 1l'''I·~<.J'P:I .!QI;;: 1 ;:i l C.L.H.P. de la composition d'extraits méthanoliquesIII c,-- PII~. • " 1 1, ·;-.....·r: i':~! .,' "I! de tissus de plants du cultivar PUral1ne témoins

i ~ ': 'l' r:f:;;r:W:'I:; ,'iTT')' (A) et inoculés par le P. pal'asitiua (B).

\11" ,.1: '....1fl't ',: 1: ': l'Il i Colonne de silice 5 \1 - 3/8' x 30 cm - gradient, 'III" l'L~' II' ,i C"l i i, ! :'I-':'~ "J' '1: .: 'l' d 'hexane et d'un mélange acétate d' éthyle - méthanol'. l ": '11 ' Il ' , L ,1 t'on;, ,,W' " J' ' , . ,-;",t).;!, ·W;)...~·lrrl,·T (10,1) en proportion 50,50 a 5, 95. :,";'.-"

i~N:~" in; 1~~!~.I: 'l': ,1 Débit 2 ml/mn, défilement 5 mm/Mn. " : i'. 1" II 1ta: ~ .. I i..~ t: 1 ~ Il . i. 1:':; .1' ~~Cll'I"" "1 Détection UV , 280 nm, 1 mV. S co 0,16. .' ... ,.--" :ii j'f>':;)! .... illili I:.~ "."'i .~", ::t1 f!l::FI+'+'-i ~TI'r'l'r:11~ml·tr!,j-I':'l-'I'·1:':i1ï'I·"·'lt1i11l1[··t.;-, ..,.."-I;'jè5':':' ,~·.I~~:-r::t':';"(-::;;':-:-::'1 ;•.,"'j--; ••'I ~i!"" p.:' 'l', :LI: "'1, l, ~'i il: 1 ri' ."! 1i·, ,: i i '::: ":: 1: ' 1: ~·I:':; 'I! ri':' .', :,'.; .,J , 1l1J 1 " 1i11 ! ;. .• ; !',. 1 Il " ... l ' 1'1 l,! I" 1: '1 ' 1" 1 l 'i 1d 1 1l ' 1. • l 'i' 1. 1. , !, , ... ,, l',": 1: i <:::C'~'I:":;I:I.!·~I.! 1:\1'11.1.,1.11' ~ I ...!'1lqj H'lll,dl~"l'i,~ii 1 : Ji l' f',' 'l~:::: ';=j;:';:iT!I:, ';1:;::11 1.. 1: p, i -1+.\'' 1.. LI. ï Il i 1il: :1 , p.' 1 1 '~ll 1+ P'L .! 1;., l'!: l,:! ",' 1· :. l,: '1 .. : 1';,:"',.'," .. :'., ' '1 '.... '-'.-! .r• .:.~•• ,. "l' ".~,. ,,·J1T • +:'1-1· /'/'1 ,.,·1'··'·....,..· ·"j··-l'l~: ,. " l, il';" 1" .• ' l, _.!,'~ •. , - :, ... 1 ", ~ ,l ,; ! ". l.l.I' " 'III" l, 1"1 ' !J" '1 ., ," ' ,.. 1 Il ~ "." 1t, -, III· ',". • ",.'" .. ,. ,1 "', .. l '1 J.

t ri' ~' ~ " 1'" 1 ; i j "'1'°11 r ll 11 Jri' 1'. '. j l' ~ 1 1 ~ • 1 1: 'l' .t 1.' 'r • • 1 : ~ III , . 1 . • . • . 1• l' " •:!.--'.:,:~: ',"II',illl !I!:·.I, !.lI·I ..•. !.!:\!! t' II~rllIP,., 1:~~1 ,':)".,::':; ;';',' :,i ;,'," : :i ~, , : 1: ,;: " Il i :,; 'l" 'II'! l ' 1d'l 1:: II ': l, o!' II:·! 1 !',: '" ' :, '1 il: ".. ' ., ,1 ! : !; 1 1 ; , " ' : , : ' : •• '" ,'.'.

:":'~:..:!) iil 'Hi'ilil~':1.1' ,..!:. li~il i: ;:, .tl!· :I··!; :·.IIt:!!' ,:11 ! ! :." .. '.,':',! ',.1 ,.';: i' ".:)~"\ I!' ••..Jl.,.~. ';.' $.". ~.II, fi ".1 1 I .. !. '·'dl.II';;1 'Ill" " ... ',j'@l.. ,. 1

1 I~ •.:

!r~'r;; ~ :m;1;114IH LI" l·ll :!t1!Ji rlli "lF11'! iIl'P'li1'1 rg l'tH l' i i.! j1i; fi 1;'1!.): '; 1:;; ~ I!::: i' !: iri: ~Î :j:: 1~ 1

'1' ; ":;ll,;Îl iLII,I!·;;1 ir~ll' J'ï-I'I"~':1 ::I.til;~·II~jj·I~lllit·ltil{ li!fli;;·"I':i':;:i!::II;:~·:,::;:l:;,::.;:;·~:;:':I':," l 'l' 1. 1 1 l ' ,Il:ti . Il'LJ:t '1 jJ JIll 1~ , • l' -t •• " .'. ,', 1 1 1 l, ,. l 'l' ' l ,., "l'';'::"1;. it:P·j !~: ci ll·~ 1,1-1'1'1'1'1"11.1:1';'1' 1': :ltl j', '1:T1"j 1:'1~lfîfJ+1 1~I'lHtl-~llr;i'I'H;: ~,~ ~ i ;'! :-i'-:-ii'; ;.: :-'1' '::i':~';~~; :;.: :~ i :-: ! :,A; ; Q:;~! li; I! ! Il ,i 1" ·t: 1 :J r [H 1r j.; l" " :', Il ;,' i ::'!; 1:': II: : i : \" ':t:. l" i: l' , :, ' 1·" , i.... ,!~ l'l,. l' 1 1111 ' r ,1; l ,'II ri' ,1 Ill:' . ,. l 'i :, " L' 1 '1 11 i i "', " :' • j ,. 1 .: ,.',' l ' . : ', l' lA j ~I 1 . 1 l' . .. !lit • f Il ' l' 'l' '1 1 J • • " •• '1'1 " 1 • l ,. l' 1 • 1"l, ' . tll , 1 i , ~ " 'I 1 LI Il 1 1·1 j: ï Il 'l' il, 1 ; l" 1: • ,: l' " 'i"" : " ' " "l' " ' ., ,'::'i: q::: ~i''':'; i il: ri! 't' t 1il l'i!f 11j 'tll.1l i ·'ll ffil'i!ï ilt'1iJi: I!!: il! ::11~;.: ;;: :;: >:: i:: '! ' l' ;; ';.:: .! : / ~. ; ,;.;: il <:~, 1.:. '-l'i I,. lîl'iITIiF,'il 1 Tl. Il',I..-,.i1-'I''! !il, '1Ill'~I~I~:i j';::;':",,:;: ;';'q :';1';"; :';1'!' ~;" l-', ,.; "':'; :::,l "i 'CIll!'I" ' l , . 1 l, . 1 j l' '1 j 11 1" , '1 •• l' l' l ' 'l' 'l' ' .' , .' 1.. , 1Il ,1 -1 11 l'" , 1 il" '1 i'.:. ~ I l :'\ :'1' 1'1111111 ,'1· 1 1 tl'IJ'II'j1i:; 1 Il! :, li;ili';;j"I. q!:f'i;~ ·,.:I .• '!j':·1 :,'" ! 1:<C,~! . Il ',;: '1·. l 'r ': i III 'II, 1 ;: ; 1i Ill! li '1 :i , . 1:., .' f : l ' i : j , ' : ' ; 1;; '! ;l " i : :' 1.. : '1 ", "1 "," l' . l'l' l,III ~I ilili ,1. ~III Iq1~II1.r l": . '1"lli~I':"I!\l""'lllll! '/.01

1,; l" ·i·' ",:' l,Il • 1 ~.. 1 1 II . 1 1 • J '·t· f"L l' 1:· III li l' 1 11 1 1 .' ,,1. 1 • 1 " 1 1 4 •• 1 • 1 1

,;.;-. :., ,~ :Il!! '\:'1' il i :,';-; 1"I'lnHtî t\111- -!1 "G,'lr-jT,1 iTt,I"I'll'!'! 1f!'j::1 rfi n~J'-1 i! l ,~ :" !': :-:--r:-:" :.: .-, .-~ " '~f''-:; 1 :~.11 i : 1q,ilJl 1: l' '. '1 !l ,! 1 . l'" il 'l" 1.1.1. ~ II li ,.; 1 l.: 1 !, l" l' 1: i i , "! :: :! li : , l " l' l , 1 ji : i ! ; :J 1i Î : : ï :,:' 'I~I 1 .. 'Il: .:11: 1

'.: II' 'i 1 JI ~I Hli ~ !,Ill!: l, .', •• ~, Illj!:III:~: ~:'I'i:!I",,; 01" II~:' ::"11 l'! 1 l'II 1,1 Il' , '1 l'! Ill' ,1 l',. ",":: i"'I'" :"1" '~Î'" 'j' i1 ~ ~. :,.; 'Il II ": 1. ..~ i '.:' "l 1ri; ': 1 1 1 ;. 1. i:: 1 ;: 1 1 ~:: rI: ; !: .; ~ I, : : 1 ; 1 .. 1 i : , ! l ,: : 1 •

.;~,; ;~:Îi",,·t ~t'I·lïn'''. '~'i-t "1" ~ !1'lijl, '(1-' '~ITïilï) ',"-:' ;:r'jo";:'11': 'iT:I-:-i~':I~~I";-l" ',I.~

~~ :.. ' .' ; II 1"11 l': l' r' : 1Il 11/ : '1' 1Lil 1: '[1'" i Il l" 1; Il i : 'j ~ "'·1 ';: :. 1; ; i :' ,,:;,:: 1 : 1; •.. 1 l , ',.....,. ,'l, Ul" 1 ~~, l , l ', .., 1 1 l" l '" ' " .. l '1'" 1 Il ' ".LOo ,," ,1 l '1.,: ,..,~ ,,'. l' 1: j" . , .. '1" ,<b : , , , '1 "... ", ,1 ..

Il :~ : l'III Il !1 1 ~. i '. ". : 1· 'l' illllliJ'!1j1 1: iiL~ il: J li": l' Il ; :Ul ; 1: ~ :il; :::j,! :l , Il • . 1 g"L.1.11~J lil.!. li L!.HlU Ill,

- 107 -

3. Etude chromatographique par C.L.H.P. en solvants organiques

La composition des extraits est analysée sur colonne de

silice 5 ~ - 3/8' x 30 cm - éluée par des mélanges en proportion

croissante d'hexane, d'acétate d'éthyle et de méthanol. Par ce pro­

cédé, sont essentiellement élués des sesquiterpènes, des produits

d'oxydation d'esters méthyliques d'acides gras insaturés, des phé­

nols peu polaires. Enfin, le méthanol élue la tomatidine et une par­

tie des composés phénoliques simples. La détection est réalisée à

280 nm dans l'ultra-violet à cause de l'absorbance de l'acétate

d'éthyle. Les enregistrements présentent les séparations corres­pondant à trois zones d'élution de 50% à 95% d'acétate d'éthyle et

5% à 9,5% de méthanol (symbole Ae-Me) •

3.1. Comparaison des extraits du cultivar Piéraline

inoculé par le P. papa8itica (fig. 25)

témoin/

X zone ~ : de 50% à 60% de Ae-Me (10 : 1). Elution de plusieurs

substances entre 50 et 51% de Ae-Me (10 : 1) avec 4 à 10 mn de

rétention. L'intensité des pics observée est à peu près équiva­

lente entre l'extrait témoin et l'extrait de plants inoculés.

Cette zone d'élution correspond, d'après nos essais de chromato­

graphie de produits de synthèse, aux esters méthyliques d'acide

gras et à leurs dérivés.

X zone ~ : de 60% à 90% de Ae-Me (10 : 1). L'enregistrement de

l'extrait témoin ne révèle que des traces de substances alors que

celui de l'extrait de plants inoculés présente deux pics dans

l'ultra-violet nO 1 et 2 bien marqué. Ces substances sont éluées

respectivement par 70% et 83% de Ae-Me (10 : 1) après des temps

de rétention de 18 mn et 26 mn.

X zone ~ : de 90% à 95% de Ae-Me (10 : 1). Un pic ultra-violet

élué à 95% de Ae-Me (10 : 1) après 37 mn de rétention présente

une forte intensité chez l'extrait de plants inoculés alors qu'il

est inexistant dans l'extrait de plants sains.

3.2. Comparaison des extraits du cultivar Piéralbo : témoin/

inoculé par le P. papa8itica (fig. 26)

X zone ~ : de 50% à 60% de Ae-Me (10 : 1). Nous observons uneforte accumulation des produits élués dans cette zone dans l'ex­

trait de plants parasités alors qu'ils ne sont qu'à l'état de

traces dans l'extrait témoin.

- 108 -

~nn~~.n '1 )( 1 . TITTTTTIl1111! I:! 1: ITlTlT. ;71"-.. -.,!r:'1Til'!::r'i:~I!:"1 !1

.. i;1 ~., : '~ 0,; :II' ~ l Fig. 26 - Analyse comparative (# 1 9 de tissus frais) en 1 : 1'~'II (J--, •. ,'~' 113:,..:.1: ~{':~~'.:. ''''!I?I.J.~lLU_~ C.L.H.P. de la composition d'extraits méthanol1ques ;~~~, l' . , " ", l ',' ln,! '1 'II de tissus de plants du cultivar Piéralbo témoins . ,'1: :, .. , ..~ 1 ""1 .. ,'. 1;: i ,.!!. : :: ;! 1'1 '1' (A) et inoculés par le P. pal'asitioa (B). Conditions: 1i i'Ii 1l' ,:; li: i: .!l' f: 1 expérimentales 1 cf. fig. 25. . . 1:• ! ,; t1" k" '1 ( l' I.u. :.r'~~'I'RI'~ :; l ,ï~;"~·g.11 I~ i~' 'l~li"'1:::IITllTTflfm,f;'!!IT:Tl'lïfT'!,'TI' :·~I·T:~ ~':::I'?;; 1;,-:! :. '1' ij ;.;;: 1::; '11~ï-·IU.1' ri' ~', ", 1• , ·1 l' I! l' '1· 1", 1:' . 'II ' :. , ,,', . 1'" 1 l' " , "., Î"" ,:1 ." 1 1 1 1 J' . Il 1 . Il'' 1. 1. Il 1 ,II " 1·1 • III 1 •• ' l , Il 1 •• 1.11 " r. il: .1 : '! IIITI.! l" r Il!! 1•• ' ••1: l',::: 1 ~. j: 1, 1:": JI 1 .1 .• iJ;: 1 :::,':'; ,(, .: ;; ..: ' 1. : : ~ ~I il'!' l' "I f "1' i! ;j l'III" l, Il ,l., 'l' Il' , • ;, ,. 1." i ' 1 1 .. , ." • ,\ 1,,· . .. , "1"1---1~"I~1 : :li11 !! itl '1'· 111,'1.,1.1.11.1; '1:, ·1.;I~'·'I!"III:;.:, 1;'1. : :::~I:I:'I!I: :.i:··~..!~.. ;.i 1=1'~..~. ~-!..J. +j L. •...;~. ;-:__L r'·""j-ii 1" to,[,;;..-I.:-.:, \'I:L.. . .. - ......15"_,:,.",, .'-'--, --'- , ...... :._~· 'il:.; iki~;II! Il ;J:flj.! ~~:!tjU'! II~i'III'II!: IH: :1 ii'j! ij; li i,i:: ::i; :.l';·~: i';:: !!r: 'l:::;!::;: l;:!:

1::1: . : L.;..;i q.: i i: i 1.1111.11 H11i·\·q 1 i II' ~ i,.~ l' 1il 1:;:: 1: I! l' ;;" ;" 1 :': i: .1 • ; : : 1 :,! 1 j' J ; , •• : :! 1 i::1 il: !·:o""~!I:I~'II' '1"'1:::'" :Lrl{' ri Il!' .ll! t l " ;jr! !.,.'!Ii.:: ':'1 ,',,1'," I;i,;:,'i', .. ,!: .!." .. :,. , l '1· Lili' 't'U Il 1'11 I~I LI, o/!I',d' "II"':;' ' .. , ' 1 ·1""1'" 1.1,., "1:' t 1 l '1 .. .f • 1- 1 ~ , LU 1 l' -,. 1 l '1 t 111 • 1'· l.·. • 1 1 ,"" 1 • : • J -

, :~: 'Ii': .~. : ~r'f."r~'rt'Vl;iilj't,TrI' "IT' iflT./·i. T~ 11'1':-:-1~T;I :t,':1Tt'1'\';', ;--: j-:" ~ :~~~". i: :'.~! ::.: i :-::.i': :';' i; :.~.~:"'l':i11 '.'d,l'....,(JI "1, ';1'11 l' ,,,l''j IJII 1 l, ,... 11"""1 :,.1 ,1/ .1" ':·'l', .. ·'!'' , .,1.'!~I~I ':';1 t!ïJI1' !I!'!I'II~' '! ; ~IJ: '1" ;:I~.I,oi! :'·.i:'; l ''! ,:.:" .;':,1'. '!.l''!.,': 1'.;11 . , ! .. 'Hf,+1., -....: 1. 11. .,' 1'@"'" i , .. f . l ')(" ..@ " ". "'" i !."'1,1 1 '1:,1 1', 1 .,1 JI'"'j' • 1'1 Il 1 " 1 .1,. l, ' III I.j. ·Ii i . .,.. .., .• ,1 '1 , ;..;.L'" ." !If LI" • , tlfl'H ·1, .,' """1 .. "." .,'." ", , .•.. , .. , 'J

;~~i'; r~1:;';'~'~~l:\11 ~lilfjlulit!II:~41':Jr'll;"rfIHI'!rrl' ·ltl.jT·~I"1 illl1r rj~ Iri i:!; if 11 ~~': If ~~ lfi ~'i !': ?11~~ i;j ;;:i r; }1(:; "!I,d~:l I:,! I~'+ 1:11.1 ,- UI Il J' ur I,hl,'jll]! !i'I:Ir.:!:;I:ll:'I~;:'!;:·I:I'il:,1;!I:';: ;~l:i:;:.;II:1:J! .l'~ 1"'GI~11 . ,·t . '11tl fi, ,1".t.t... 4, ft""' ~I' l ,. 10 1 11

Il'."" 1 '0' "ill II" ,1. 1.-.. l"~ .-r' .' ~""r'''' . "'''''1' .:. ...1.: 1i1~1 ~ .,..... 1' ..J"l'-,-' ,.. ,-~ ...... - 0·-" '-:'--'-- ,- ••" :--.' •........::.;".: . III ',1C:1"', I,PI ill' 1]"1' ['I!I""'II!I'li ':'1' '1',' ill'lil.'I':' j.;"', :',::::i:"::'j·,,:,:;,:'I'[' .....1:-r,,' t ". II 1 1 1 '" Il'' 1; Il 1" 1 1 .,. 1 • 1 ., l' i" 1 .' t 1 •••••• '. j. ,

~'1 -, rr.;" '1 ' , ' , l' ',.' i . l ' ,'," ,'" ' . ,1: . : '1" ,.,. ".""," 1• . . .. ï" , l' •

: i''':· ~ ,.1:: " :I!: I" 1i. : -II LI l' ri! 1d . i 1i i l! 1 i 1 il!; ;1 : ~ l'! : i 1 i .! 1 '. :: i'; .!:.; t. :;: ': : :.1· : l': t-oJ"..-L:: .. " I:!,' 'II :' l , ,: l' ,l' .,. )l' l' ."., .,l' , . , ., , . '. i , ','.. . ! ", i 1• l ,'1 ---;~ Of l'l" •• ' 1·. II "1 'II ' 1'11'1. :1 .. , l' 1 l' ," .1. l " .•. ," l'": •. ,: , .• ~. , • . .•.. " 1.. Il'!': l ". Il' ! . . l , . l , , .1 ,', •. , • 1 ", 1 • , •• '., ". • " ": .. " , •••• : 11 ,.;.• , •• , +'''::- ·.. ~.-, ..I·,·..,t ""'1._ 1 r ·-I """'1" '.·r l .,... . '10.1 " ·,··ot 1'" .: ._., .· 1 Il ~~ ,. i' i I~ 1 l"" 1, Il' 'I· l "f li " Il ~ " 'I: 1 . i 1 1. , '. ~ "', 1 .• 1 1" .: !d:~"'i-i'" 1i : : : Il i;.: l, ili !III 1ql !if Il !Il '1' Il 1!. 1: Il :1 ~ !1• t ' ,l' ;':::,:1: !·I;! :1il :: 1.; : ! , : ' : ~ : : : ~.:!'I,'I~"':':I;:"I:'PII'!""'!'I'I '['1 'l' Il. 1,111,·,·1 1 III.! :.' '1' '11:,:',," /,,,,1···.,' "':'11. -III' 1 1 1·' 1" 1 l , 1 1· 1" l'" 1" If l' '" "'1 l ' ''''" 1. t • ,1.'\1.:"! ·.,i, ,'i, jP"'j': 1: ,II J l' JI'; l, • " .. '\ 1 1.,1. ·.":.:1·· .. '··"1:·'·' .. :,' ":' .. 1i ;; If ~.; ! 1: ' ' Il ;".1 ··:·11!. !.! :, ·t'·!·rn 1'1:'1 q. r!' li 1 : 1" :i ;1: .'J'I ;" .' l"·' ··,.!· '1 ; ; : ; , . ; : . : . : , ; !; :.;

· ~.".~ ,Il 1-1""1" - ..-I·'····· ··1···· ·t"-rlT-l~ )'" "1"" ".,. ',1+ ~ '•. - ·..·I~ - '1-" '~•• _" .

: '1 ~ i .... 'l' l, ' '1' ,1~.JI ~ 1~·!.I i 1.1" 'f ~ 1. .! Il l' J11L l ,III i 1il ' ,:: .. , i . .:: ::-. , "" .. ,:' ., ,; :ii.il·jcl !'~i!II'! '1 1 1! !I! l'" 1.11 1' 1'11'" l'fll .!llli'iil':;·!i.!./: ... j' :,'., . \ ... :j'.:, .;· l' "'., . , ,;, l':' 1 Il ·'1 I·H 1 1 l '1' l'" :., ·1 .. /." i' . . . l' ."! ' , ,. 1'" ' '1

.. 1il :~.: Il' 1i : 1 1; 1 i i l' 11 r.Lb'1 ·/l i" 'II i : 1': ' ,': ;!:! l ' ' .. ' .. ,.. : ' .,: 1. ;; ,. ; : • , : i :, ; l : ; •

,,1 • I,~ i ,1: '1: i Il 11,1 il! ,'1 1 j,l' :, . ""1,, 1:'. 1..::.:'.1: :;;.!.;:: l'···'::ï: ~~'I' "'~; 1!T~~ 1·1.:r.' 8t1 , -\ï . '~~1' '.. '. J~ ;11', +;' -: :.~~ 'l,ï ;'I;':~ 1':-, :-'1°':: 1:~';~"I; .; ;"I~;; "1' ;-:.: , i";-; " 1; l " , .;. , : t " 1 1 .. • l' 1 1" i,: , l' , ' '1 .. ' 1"" .' l' :' :.. ..', . , 1 .,. i~ r f· 1 1 • 1 j 1 0" -l, l' 1 1 1 1 ! . 1 i:: 1 ~ 1 l ,.: : •• ' :.,' L ~ :; : : , 1 1; " ' .. : . 1 :Ii1~ l' l ,. l' .; Il 1 1 11 l' 1 I~ 1 . 1 l, 1111 "Il if" .••. ,1 (D' J: 1 : ~ : 1 t .. , l , . 1 • '1 1 •• ~" 1 'l'I'~' .Il' 1· .. ,., •. , '1 U"i""" . 0'·1 " ..... ". I··"'''i'i .·1 .\ '1" ; i '1 _. Q]'. . Il .:' , ::' u.i , .\' ::. '1;: ~a':"; 1: l'J!' 1 :::, : I! : : : l" 1·l, .. 1:,1 . ~. ~ . . Il IJ :,L j 1D,"l~ ... 1 .!.L~J 11.IJJili1J.llW1.ll

'l' ,1~mrr 1 ... " 'ml' .. .. . ., !llT' ri IT , .' 'ï-:r.. ,III. \ i • ,! il·. 1 1 LTT;11T" l, ...... :'I~I(; "1 ' 1 • 1 . !, ". ,., 'l'· .. ·· ... ' .. :. ' .. ,,,,' .. :',':•• :1 Il "1 l'" 1\'")(''''''''' .. ,...... ,,,."" Il !"'".~ ,.•1,: 1 • 1 l 'Ij , ,., 'l" .. ,,: '.' ',,,...' ....... ~ " l, 1 l 'II .. • .. :"O. ',' 1. • • • • 1 •• ' 1 l' r.·............. ," :;"10 j::il,l\ .1:' 1. 'Il 1.!01 l' '. I\,;~., ...... ,',,,. .: .. , ...... ' .~ 1 1 CI~. .1.... Il' , t 1 l '1 " 1.11' 1 . r""';.. 1 • 1. Il •• '1 !.... ' ..~•. 1~ : a- . , .. , 11 Il,''' 1 : 'II 1 l , ,1. '1.. , 1·"·'·: •..• , ". ' . . ., .' . ":".:~:! ,: f'~~ frj·:·ft···t·:~, :l'1·.l·'I·c;.,.~.,.I : l'li.! ...:.t.j. .q..":' .' ·:'I:·'J J~. ~I, ~:'l' ..:. :.: '_.: '.:"':.- :.. : '.. ' ..

•. . 1 1 r, •• ,., '11 'l' 1 1. , 'j' . r . , .• ,r '" .... \, ' .· . : •1 . 1. i ,: 11·, 1il' , , 1 Il l "i l '. 1 il,,· " .... , . . ." ',. ,: • : i • t 1 1 ;:; ~~. 1 1; 1 i 1. i ~: 1:. t.rl- 1::: l '1 ; i ;: t: ': 1 l' :: : '. ; •• l' .' I, ., .': .J.Ij~i o!ll'l~'ILll i1li ,,·11·' "JI' 1" Il: 1··:, ), '1 ' .. " l' "." ,'. . ....f ~ 1 Il ~d' III •• .1 • '1 i .. '!': 1: il:. 1"'1:;;' ...• ' .... :. : l',: .',.~,!"I.:.lltt~lilfl'II'~IIIIII:LII~I 111 1.[11 "ll'il~JI.I1."I""i" l'" l'l"!' "1 ,1 .'

1 ~':.~l!~'I-Ioi':.:,-l.:.!. J,;r ' !' t "lt' !.It'II .~, I.! li . 'l'•. .J..LL'..:....:12~ •• :.:.- ... -:..·1.....:. .. ·.~.1_ .... _,'., ..'~:·:-"C-:·!<·I·I·I~I"1.,;0''''i11' ··"TI'·j

.: ~ l ,1" 'r r j'['1 11::n , 1'1 1'1"i: '''!'' 1,,· l,':'" '," ': .~ N : 1 • ( • 1~: : 1 î 1 i i il· 1 : L : ... : .: ; t !ï 1 : :;: • ; 1 :;.' 1 1 , •• 1 1 1 1 :. : :. .:.; 1 1. ,::.;1~ '1 If 1; ~ ",: ',., 'III l, Il 'II'! Il Il.' tl .. . l"!' '1'1' ,1. '1' . 1· . 1" ~ ". , . ,1., •• ; . ., .,'D .Il, ~' ,,' .' 1 l '.'. l 'l' '1 l"" 1 ",' • • 1 • 1" ,'. . .1 : l' Il :' "1 t L:.• ;; 1i i', /"11 l' l" 1.1 l 1 il. il· o. '. 1.' !. .... 1.':

1 • • la. .... ! '. t,,'. '0.' • 1 ., .,., • f'

il.Il! .• t ,.1'1' ,II' l, Il lit l, '! ..1 .. 1 1· Il, d 1 1 Il Il 1 : 1... I! .' 1 l' 1 1·· .• 1 •• ~ • '. ,':·f t 1 1.. . • 1 III, 1 1. 1 r .,., l'''l If • ,.~~., ~:,.~J..:.L "iL... -tt"t..L~ J ,..JJrf

1.•. l.1-tlAli i 1.. ~. ,. '/":"-1,1,:,", ,.!-~ .: ·..··1-··'.·.·..._....,...·-1 ..•.:~f. ',l , , ~ ra li ~~ lj'! F:f l"@I"I:I";!l"I" i H I~. 1:,)"1 1: :: : i 1 ,j ~ il :,,: 1 : : ~ :, 11 .: • • :: :: ï'. ;; ., :1,'li;""';: ~'1·· : j.' 1:, 1 i 1'" " ":' .• " 1ri'Io ' ,. "',,' )': .: ; t 1 r:~G'I l,.. .;.• , 1 :' i lit' .. Q:J. •• t Il!' 1 "1' 1 ~ 1 Il --:-:-:~ 1.. i ,:,"',::: '. ~ ,II ,IL .. i: Iii!:' Il 1 Il! :." :·;."','1I:'j j: .hi.·.· ·.. ,i: ,1 . ~ " •.. '

::! ,!' 'I~~!.. lll·I:!':~j'I·I' '1Ii'I'I;lI!1 ·11 'U'II i ~l; 1 dl'!!! !I!" Il ): 1l" :' "i·."··':::.!·'·1 : \',.M' ,., III l ,. : 1 l. 1 1 Il '! . ~ 14.' ' •.': '~,,_•• '.' .~:' .L:...:. .f.I.:J ' , 1 • ,.1 1 :.. _ 1 •• 1.. r,. ..':'''l''!'~::: î:r.11· .. ·,tl'tl·'-I'I-:'·i"iï:t(I·litl.. 1 1 [' ';:'j.. r"'I",f ""j':'::' ,.";' :'''' , ;.!, . \ ,:.. ,!:.,1! ï ! p;\. l ' ,j : : : 1; , . , '.. 'l'! Il. -1 d 1 1 1:' ! Il' ':: ~ ;'~T;' !! i ,. '. 1 ' .. 1. • • , •• ' ':,' i :.',.'Î<'.,.; \. 1: 111,\t l·i l " ~ . , '1 ! ~; l' 'I! III .~ ') 1

1

1'1 ..rI.! Il'I :j.:! !::! Il' !l'I 1IIIj .!:,. .' . 1,'" i: .' 1 '.:,.,.,:· . ".:J 1 1 1': Il ! 1 11. 1 .! " , 11 1 1. , 1 1 • l' , , • r'. .' 1 • 1 • 1 1 • 1 ~

.. :.l',,!~~:,,rr;i; :d1 :!11 .r!iiiidll·~, H!., JilL '.ill !l'!.,!!.ll'Il li ::::' ,:;.;:I·.;;:::::,;;·;,.·k

.v\!~. ..'\f.:"!.... '.- -,-l';'·jn-ll"m' '.~. 'ml ..- ~::T' 'T:t"\'''~H'":1~-: .j r "''1 " '~'i'.'::;';,' :'.,' _.......,. '1"': Q.i$:'I t · j'il' 'il I l :'1'1,', tl·:L ·lt./iiiii !'l'' Il;' .1.I,l":i l ,.i, '" 1 :1"':'1""'''' :·",1 ..~ '.: •. 1 ':1' " .":' 11 1 "1 l' 1'1 '1' '! j"l Il Il!oI ·,'1".: :''j" ""'1: :.j!.ii!·:

, ; :ilj:::'·t'i!; !Ii li! 111'·,·1i11 ]:', ·1 i l'l, ;:I:I"I!! 'I·ill·' i:l :: :,il :"1 ;"'I::~~'I":;I' '.!~'. 1,:,<>1 i{tj "', l' 1 Il' 1 ".,. '1 11 '1 .. "1 " "." , .. " '1· V""".. , 1 ! 1 l t i ~ 1 • ..! .. r 1 1 1 fil .:! JI! l ' 1 • 1 1 • l' l ,. , l, l, : 1 l" t 1

' , ,'. ." l' l ' : ,. ,1 ...1 . l-. • 1 l : • 1 • \ 1 l,' ., , , l , , . 1 l '!' ~'~Ul'.~: ~'ri:":1; ..... r·'1·'oj· +!.,{~. :.ul~l..l·q·r'T1J"·IP;i,l" 'H-.j..u r ':',~"' .L,.I! ,'.- , .....; .~...,... ;, ',' ,., . '::: ..fD':'I~~l'Wl" i 'II! l' 'III !1Il ~ 111 l' 11 11 '1 li II 1111 : 1il '.:' 1 .: l ' i : 1: • :J ::l , : ; •• ~, '!.!.,,l'i i·.. ',~, 1; 1', l, Il • 1 ~ 1 ri:.• J !.' j .': '.,. l' l' .. '. l,' 1 '" fi

, .. , i ~ :: . :cl>: '111. :.: 'i!.!!! i I.! i l,:! 1! :.1 ,'1'1\ l',! i!, : '," ! Ij, Il!: 1:', :: 1: ' 1:: 1 . !," 1. • !' .. i. ," 1 •• 1 l , l' ". '. " r • •• ,1.., •• ' •

"j' • i~,':i:I!.: :;!II'i!llil:JI!III!I!!lltv~ Ir.~ :r1J!.j :', il!:"'!;.!I':::: .:. 1.' 'l:,:-\I::'!::' !:', l ', :.1",,:, '.1,,\'\.1., ·1..·.·.'. IJ.r'I-l-l'ILU., _',' 1'::+'.1'1"_'." 'l' ·1.'" ... ' ," -. .....,.... ','"

1 1 l' .: '''; , l , 1 l ' ri 1 1: 1 i: 1 1 4 ~ l ":J. 1 • 1 1. • : ~! i 1 i 11: 1: il:: 11 :' l" l!'" 1 : f " 1 • '. .'

· .. '1 . , 1~d :! :' ! 1'1 ' , i '1\" 'Il id Il J' l' 1 J l, '1 1'1 1111.11 i 1 i ! III i , '.' 1: :: ! t :. l " j'!,: i' :; . .' : ': ' :. ' " '1' 1'1 . l '" .' l ,1. l' \]1' 1 ~ . 'ï 1· l, "",' l' ",' t' """" .l' l",.! .!j 1 Ç;I :i ! il: : I::! j il! '! . :''l'l' 11 II .j 1! i l'l':' r.! il l ; ;;'.1: ; '1:::: ;-.: 1-:: \. : ;. : i ; , ' .i: 1 •~., 1 .,< ,1. 1 'I. l ",! ,1 -1' 1 l'" : .... ~ ..• : :.' Iii '1:' '1'1:, .l-ili .,.' Il' .• ,,1.

J;:: l' ~ :~.ll),i ~.I .; L.' l.l !~Jj.!.:!.llt!~'~111.jj ~J ~~~II~ h..... I ) ..hJ~H '·:i.q··:, ,J,é:: ",,1: .li: t+: ,~ i ! .if i ',: Il , .111, Ji 1'1:: 1 !1 _111 1. 1'11 1"1 !. 1i.l (11111'li q:!! !1~ 1Ir:' :, il '1 i ! : :, '11 11 : ',' i " ~ l'! . "1 ' :., j, ! 1 f: "

.' • • • 1 1 1 " ~ . 1. 1 1 l ' r'l 1 • 1 • ,t· 1 1 ••, • 1 . 1 fl, :~ ! :PI: !.; ;1 .l :' ,: 1 • : ::! li 1t' li 1· " '1: !', Il 1:' 1i1,1 ;! 'l'! Il :1; : ! ' !!:: i i . 1il: :.,1: •Pli'; :i . :. . .., : ; ; i" . ~i 1il: 1 ::,' i :dl, .JI !1i! i: III i:' 1il' ,i ~ : \1iiIII ~ I,r' j 1!il' 1Il i ! ~ l' l, i ,i!! '\ ' ~ !; !; i;1 ~ , .' :'"""J

I;1'" ..Ltll.!., ..IJi.' 'J. 1 .d' ..~·-,.tl1"" ·....i..... u·f'~~· J.1·1.1·,:·dl

"'·, IJ:I·li··'J·I'!'~·I""·!~;:· :.',1 !i,i 1;: 'fl',li :", ; l' ' 1 1'1 1 ~J'II!III 1;111 i:!' :;, .!,j /':'1'·"1":';'" ',:: l, l,.. ' Iii Il'' ,:J'II 'i Il'111 lUI l' Il '11' "1 \llll'! lU) ~I: Il!!II:::i .:l'I:;::I.'':! .~ '1 1 \1'" Il '1. '~., 1 1 1 1 l' 1 1"0" .', ,.. , ".,'" .' ;.~.... il'! l';! 1.,., l' Il 1 . "1 :, i" ," "1' .", /",1", " .,' •.:•.J :! 10: " ' 1 • ô 11li 1 1 l '1 • .:... 1 1 11 1 Il j :~ il: ! 11 ~:. ~ 1 : , •• f l : : : 11 •. 1 t !i~; ill i Iii ...idll; i IJ l.1l1 Jli1! ;j li ~I.J]U •.u.lb. illJ Id! ",.; '" 1i "II" i li" ,:il, ,,"," l,

- 109 -

~ zone ~ : de 60% à 90% de Ae-Me (10 : 1). L'intensité du pic

nO 1 est équivalente dans les 2 extraits. Par contre le pic nO 2

présente une intensité environ 40 fois plus importante dans l'ex­

trait de plants inoculés.

~ zone ~ : de 90% à 95% de Ae-Me (10 : 1). Un fort pic en ultra­

violet révèle dans l'extrait de plants parasités la forte accu­

mulation de substances inexistantes ou présentes à l'état de tra­

ces dans l'extrait témoin.

3.3. Comparaison des extraits du cultivar Piéraline

inoculé par le V. aZbo atpum (fig. 27)

témoin/

~ zone ~ : aucune différence notable n'apparaît entre les deux

extraits étudiés.

X zones ~ et ~ : nous observons des traces de substances dans

les deux extraits.

~ zone ~ : élution en Ae-Me (10 : 4). Deux pics en ultra-violet

d'intensité différente sont élués après 9 et 10 mn d'~lution par

ce système. Ils sont absents chez le témoin.

3.4. Comparaison des extraits du cultivar Piéralbo

inoculé par le V. aZbo-atpum

témoin/

Les résultats obtenus sont identiques à ceux observés

dans les extraits du cultivar Piéraline.

3.5. Comparaison des réactions des deux cultivars à l'infection

3.5.1. Infection par le P. papasitiaa

La synthèse des produits élués dans la zone ~ (pic 2)

est beaucoup plus stimulée chez le cultivar Piéralbo que chez le

cultivar Piéraline. Les substances des zones ~ et ~ semblent

en quantité équivalente chez les deux cultivars inoculés.

- 110 -

Fig. 27 - Analyse comparative (~ 1 g de tissus frais) enC.L.H.P. de la composition d'extraits méthanoliques

de tissus de plants du cultivar Piéraline témoins(A) et inoculés par le v. albo-at~um (B). Conditions

expérimentales: cf. fig. 25.

. -.- . - -, .

- III -

3.5.2. Infection par le V. aZbo-atrum

L'unique différence entre les deux cultivars réside dans

l'intensité du 2ème pic élué par le mélange Ae-Me (la : 4). Ce pic

est en effet 4 à 5 fois plus important dans l'extrait du cultivar

Piéralbo.

3.5.3. Différence de réactions selon le parasite inoculé

L'inoculation par le V. aZbo atrum entralne la stimula­

tion de synthèse de substances plus polaires que l'inoculation par

le P. para8itica. En effet, ces produits de réactions sont élués

entre 60 et 95% de l'éluant Ae-Me (la : 1) dans le cas d'une infec­

tion par le P. para8itica alors qu'un mélange Ae-Me (la : 4) est

nécessaire à l'élution des produits de réaction à l'infection par

le V. aZbo atrum.

Nous pouvons formuler deux hypothèses : ou bien les pro­

duits de réaction aux deux parasites sont totalement différents,

ou bien ce sont des dérivés présentant, dans le cas d'une infection

par le V. aZbo atrum~ une fonction hydroxyle ou un glycosyle leur

conférant une nature plus polaire. La deuxième hypothèse semble la

plus plausible puisque les différences, entre les deux réactions,

enregistrées sur colonne de silice greffée en C 18 sont peu impor­

tantes.

3ème PARTIE

- 112 -

ETUDE DE LA MODULATION DES REACTIONS DE

DEFENSE

Nous avons donc observé qu'à l'infection par un champi­

gnon parasite correspondent d'une part des augmentations de teneurs

en composés phénoliques totaux, d'autre part d'importantes modifi­

cations de composition des extraits bruts de tissus. C'est pourquoi,

nous avons essayé de modifier la réaction de défense de l'hOte soit

en inhibant la synthèse de composés phénoliques ou terpéniques, soit

en essayant de stimuler globalement l'élaboration des barrières op­

posées à l'agent pathogène.

Parmi les inhibiteurs nous avons appliqué des produits

Smith Klein et French dont la cible est le malonyl co-enzyme A et

le mévalonyl co-enzyme A. Les résultats obtenus étant douteux,

nous n'en ferons pas état. Nous limitons l'exposé à l'action de

l'acide a oxy-amino-acétique (AOA) inhibiteur compétitif de la

phénylalanine ammonialyase (PAL).

Pour les stimulations des réactions de défense nous avons

comparé l'action du tris-O-éthyl phosphonate d'aluminium (TEPA) sur

des feuilles en survie des deux cultivars inoculés par le P. para­

sitiaa. Puis pour le cultivar sensible, nous avons comparé l'inci­

dence du TEPA à celle de deux éliciteurs - acide arachidonique (du

P. infBstans) et glucosamine (proche du Fusarium soZani).

1. Evolution des concentrations en phénols totaux

1.1. Action de l'AOA sur des plants cultivés en serre

Les trois séries d'expériences réalisées en serre (mars

et avril 1983, juin 1984) fournissent des résultats convergents

récapitulés dans les tableaux 8 et 9.

- 113 -

Concentrations en composés phénoliques totaux exprimées

en ~g d'équivalent en acide chlorogénique par gramme de

tissus frais établies par dosage de Folin Ciocalteu

dans les tissus de cultivar Piéraline pour les trois

essais d'application d'AOA.

lêre Série 2ème Série 3ême Série

Témoin 390 420 500 .

Témoin + AOA 310 332 360

Inoculé par 530 580 710P. parasitica

Inoculé par 435 440 535P. parasitica + AOA

!~~!~~~_~: r~o~ulation de la synth~se de comFoste ;.hénoli~es Far

l'arrlic~tion d'AO~ à des plants de cultivar Piéraline

- avant ou aprês inoculation - comparée à la stimula­

tion provoquée par l'infection expérimentale par le

P. parasitica.

1ère Série 2ème Série 3ême Série

Témoin + AOA/ -20% -21% -28%témoin

Inoculé +36% +38% +42%P. parasitica/témoin

Inoculé P. parasitica -18% -24% -26%+ AOA/inoculé

- 114 -

Le tableau 8 indique les résultats des dosages des phé­

nols totaux exprimés en ~g d'équivalent d'acide chIorogénique par

gramme de tissus frais pour les trois séries d'essais. Le tableau 9

précise l'amplitude de la modulation de la synthèse des composés

phénoliques par l'AOA avec ou sans inoculation du P. papasitiaa.

Ainsi, nous observons que la stimulation par le parasite est dans

tous les cas supérieure à l'inhibition provoquée par l'application

d'AOA. Dans ces essais, il apparait une relative cohérence de l'ac­tion de l'inhibiteur: la réduction de synthèse varie de 20% à 28%

chez les plants témoins, elle s'établit entre 18% et 26% chez les

plants inoculés. Pour ces derniers, en fin d'expérience d'importan­

tes nécroses brunes sont décelées sur l'ensemble du système raci­

naire. Cependant, seulement dans la 1ère série - mars 1983 avec des

températures nocturnes inférieures à 20°C - sont observés des cas

de pourriture du collet avec constriction des tissus parenchymateux,les symptômes n'aboutissant jamais à la pourriture molle caracté­

ristique des attaques du parasite sur des plants sensibles (plan­

ches 1 et 2).

1.2. Essai de stimulation de synthèse de composés phénoliques

sur des feuilles en survie

Les trois expériences d'inhibition par l'AOA du flux de

synthèse des composés phénoliques réalisées en serre ayant mis en

évidence une variabilité non négligeable dépendant des conditions

de culture (température nocturne, longueur du jour), nous avons

effectué les essais de stimulation de synthèse sur des feuilles

maintenues en survie in vitpo. Les expériences sont réalisées selonle dispositif mis au point par Vo Thi Hai et al. (1979). Les feuil­

les sont déposées à la surface d'une solution de tampon phosphate

Sorensen à 1/15M à pH 6,5. La température d'incubation est de 25°C.

Les feuilles sont blessées avec un emporte-pièce de 8 mm de diamètre.L'inoculation est réalisée avec des implants de 12 mm de diamètre

d'une culture gélosée de P. papasitiaa.

- 115 -

1.2.1. Cas de feuilles du cultivar Piéraline

La comparaison porte sur des feuilles témoin blessées

avec ou sans TEPA à 200 ~g/ml et des feuilles blessées et inoculées.Aprês 60 h d'incubation, les limbes des feuilles inoculées sont par­

tiellement envahis sur une longueur de 2 à 3,5 cm par les filaments

mycéliens. Par contre, les feuilles placées sur solution de TEPA

présentent des lésions de 1,5 à 2 cm limitées par une zone brunfoncé large d'l à 3 mm. Le tableau 10 indique les résultats des do­

sages des composés phénoliques totaux.

Teneurs en phénols totaux exprimées en ~g d'équivalent

d'acide chlorogénique par gramme de tissus frais dansles tissus de feuilles du cultivar Piéraline aprês

60 h de survie sur solution de tampon phosphate

Sorensen 1/15M à pH 6,5, selon le traitement - limbe

blessé/limbe blessé et inoculé avec ou sans TEPA à

200 ~g/ml.

Teneurs en Modulation parphénols totaux rapport au témoin

Témoin 687

Témoin + TEPA 640i

- 7,8%

Inoculé par 785 +14 %P. parasitiaa

Inoculé + TEPA 857 +24 %

Nous constatons qu'à la progression limitée des hyphes duparasite dans les tissus des limbes inoculés correspond une nette

stimulation de la synthêse de substances phénoliques. Celle-ci estaccrue, par l'application du TEPA, de 24% par rapport à 14% et cor­respond à une réduction de la colonisation des tissus. Dans ce cas,

la marge brune en front de progression parait moins nette que celle

~ 116 -

observée par Vo Thi Hai (1978). Nous notons aussi une importante

accumulation de phénols totaux dans les limbes des feuilles témoins

seulement blessées en comparaison des teneurs moyennes des tissus

des plants inoculés en serre. Par comparaison avec les résultats

de Vo Thi Hai et al. (1979), nous constatons que la progression du

parasite est naturellement bloquée dans les tissus des limbes du

cultivar Piéraline au lieu d'une colonisation régulière de ceux de

feuilles de cultivar Roma ; la réaction est plus rapide en présence

de TEPA. Ces processus physiologiques vont de pair avec une accumu­

lation notable de substances phénoliques.

1.2.2. Cas de feuilles de cultivar Piéralbo

Ce cultivar ne possédant pas de caractère de résistance

aux Phytophthora sp. nous avons cherché à étudier l'influence du

TEPA sur la colonisation des tissus, avec une incubation de l'ordre

de 110 h. De surcroit, si l'inhibition du parasite est liée à une

stimulation des synthèses de composés phénoliques, celle-ci pour­

rait être déclenchée par des éliciteurs fongiques de la même façon

que par le TEPA. C'est pourquoi, nous avons comparé l'influence de

deux éliciteurs - l'acide arachidonique à 40 ~g/ml et la glucosa­

mine à 35 ~g/ml - avec celle du TEPA. Le tableau Il indique les

résultats des dosages des phénols totaux.

Les deux éliciteurs fongiques induisent une nette stimu­

lation de la synthèse en composés phénoliques totaux dans les

feuilles en survie du cultivar Piéralbo. Cette stimulation est ce­

pendant bien moindre que celle obtenue avec un traitement par le

TEPA.

- 117 -

!2È!~~~-!! : Teneurs en phénols totaux exprimées en ~g d'équivalentd'acide chlorogénique par gramme de tissus frais dans

les tissus de feuilles de Piéralbo après 110 h de sur­

vie sur solution de tampon phosphate Sorensen 1/15M à

pH 6,5, selon le traitement - limbe blessé/limbe blessé

et inoculé avec ou sans TEPA ou éliciteurs.

Teneurs en Modulation parphénols totaux rapport au témoin

,Témoin 520

Inoculé par 410 - 2%P. parasitiaa

Inoculé + TEPA 855 +64%

Inoculé + Acide 645 +24%arachidonique

Inoculé + glucosamine 640 +23%

2. Etude chromatographigue par C.L.H.P. en phase aqueuse

Les techniques de chromatographie et de dépouillement des

enregistrements sont analogues à celles utilisées pour comparer les

réactions de défense.

2.1. Cultivar Piéraline : comparaison de .l'action AOA/TEPA

(fig. 28)

2.1.1. Zones ~ élution de méthanol 5% à 10%

* AOA : Les pics l, 2 et 3 observés dans cette zone d'élution chez

le témoin et dans l'extrait de plants inoculés sont totalement

inexistants dans les extraits de plants sains traités à l'AOA.

L'extrait provenant de plants infectés et traités à l'AOA pré­

sente, dans l'ultra-violet, des pics dont l'intensité est réduite

de 50% à 70% par rapport à ceux de l'extrait de plants inoculés.

",.

- 119 -

2 TEPA : Ce médiateur ne provoque aucune modification tant chez le

témoin que chez les plants infectés.

La synthèse des substances éluées dans cette zone du gra­

dient méthanolique est considérablement diminuée par l'action de

l'AOA. Cette inhibition n'est cependant pas totale puisque les pics

1, 2 et 3 sont encore présents aans l'extrait de plants infectés et

traités. Ces produits sont vraisemblablement de nature phénolique ;

ils sont élués par des solvants très aqueux : ce sont des glycosi­

des. Cette zone d'élution correspond également à celle de la toma­

tine non décelable à 250 nm.

2.1.2. Zones ~ élution de méthanol 10% à 50%

2 AOA : Le traitement des plants sains par l'AOA inhibe totalement

la synthèse des substances éluées dans cette zone. Par contre,

l'application d'AOA sur des plants inoculés n'annule pas complè­

tement l'accumulation de ces substances, l'intensité des pics

n'étant réduite que des 2/3.

X TEPA : Ce médiateur semble avoir peu d'action sur la synthèse des

substances éluées dans cette zone.

L'AOA permet d'atténuer mais non d'inhiber totalement la

réaction au parasite et la stimulation de la synthèse des produits

élués dans cette zone. Les pics 4, 5, 6 et 7 ne correspondent pas

aux acides phénoliques de référence chromatographiés dans les mêmes

conditions ; ce sont vraisemblablement des esters ou des glycosides

de substances phénoliques.

2.1.3. Zones ~ élution de méthanol 50% à 85%

2 AOA : Les pics 8, 9 et 10 ne se trouvent qu'à l'état de traces

que l'AOA soit appliqué sur des plants sains ou infectés.

120

• __._-_;:-.: __ ••l_":'~ 1._ •••• 1 •• _•• _...... __ •••••• - .' __ •• _._ ••_..=. :..: .: ":~_':';::-;~~':ï:::=:=-== :: .;-0- ::--::.: ::; ~:: i· . _"':" -_.- -:..:: ..~--:-.:- ..-:-: :::..==..~~'L.-:"'.::::.:::

"

- ...- _.1 ..

.. ,. ..::

.;-:.--@.-:.;-- .. _--.. - ..

~~~=~~t~~~1B~~~{t~i~~~1~~~?:~:~l~Z1~

:n~1f- t,......\'" 1.",J. I-.G 1~ .~ q .. Ji .bf ..~ _.. _..- _.. :r:::....... _... . ..- _. .-:.:. A;' r "H "J.. .' - . r,(~l!~"i'-: :~.:."::~::'~~:'::.-::~: ::t;.~~~:~·:ç·:c.,t.--tM":·,,,,-~W~-~';'~-:\ti~_'::";·~:-"'r" .... In, 0 S -->:> l T :J"'~ .-.. .•.•• •.. ••.• • . " .- .. r- - ...... ~ ---I::; ~~: ï': - A.::.Pl. ~Ol..o·- '. ,,' A J 'Y~~~-.~7' -=·-:·.~·i -.,~·~i .~~: ~-- ~~;'I;:~!-~~\-.~.+-'.f ~~.ë ~A l:=-~ _.~, ~ ~.~ 1:-. -:::':'~>:::: :~_. ~::~.~-~~:. l.':-.ç" ;;.t1=..;;,. -'-7':,: V~.·--;·:;';;:1,;;:.;;:::-- ---;- :::::.: 7.::-':0 '4 -:~""-Cloo~~~11(1 ra rU!; 'rnre"! !U .. _..- --- ....-....:....- --:-.._, . ...- . -:-.... ::.:: .. :l.. :2'10/'.;•••.-:: A.tI.s1- --' It.A."t,,;. . ',' ...

:=;:-::::-;~·ër.~z;?:.:ii-'•.::· '\Ï~-i-~T":"-- - -Ü\Jzr~~ ~:.;~~A ---- --· .. 'a·" ..--·_-- ·-- .. ··.1': ··_-.

:::=_ 1. .~:~~.:.'.... .~ "' L._ ~~~_ t~" _ - .. . 1 .• - -

C.L.H.P.

de tissus

Fig. 29 Analyse comparative (~ 1 g de tissus frais) en

de la composition d'extraits méthanoliques

de feuilles du cultivar Piéralbo inoculés

par le P. papasitica (A) et inoculés et traités par

le TEPA (B). Conditions expérimentales cf. fig. 21.

- 121 -

~ TEPA : Chez les plants sains traités, nous observons une forte

accumulation des substances éluées : l'intensité des pics est

doublée. Cette stimulation de synthèse est particulièrement mar­

quée pour le pic 10 élué à 78% de méthanol. Le traitement par le

TEPA induit de grosses teneurs pour les trois groupes de substan­

ces caractéristiques de cette zone d'élution. Les pics 8 et 9

deviennent coalescents tant la réaction est importante ils se

présentent en un pic unique.

Les actions symétriques, dépressives pour l'AOA et stimu­

latrices pour le TEPA, semblent les plus marquées dans cette zone

d'élution. D'après les enregistrements en C.L.H.P. des substancesde référence, cette zone correspond à des acides cinnamiques et

benzoiques, à la substance H et à la tomatidine (ou substance F) .Nous notons en particulier des similitudes d'élution entre le pic 9

et les acides chlorogénique, dihydroxy 3,4 benzoique, caféique et

la vanilline. Le pic 10 correspond principalement à l'élution del'acide férulique mais aussi à celle de l'acide p. coumarique et

de ladiméthoxybenzaldéhyde.

2.1.4. Zone ~ : élution de méthanol 85% à 99%

AOA et TEPA n'ont aucune influence sur la synthèse des

substances éluées dans cette zone. Ces dernières ne sont pas des

cibles importantes de l'action des médiateurs sur le métabolisme

des tissus infectés.

2.2. Cultivar Piéralbo comparaison de l'action TEPA/éliciteurs

Les figures 29 et 30 indiquent les effets du TEPA et del'acide arachidonique sur l'accumulation de produits de défensedans les tissus de feuilles du cultivar Piéralbo. Les similitudes

observées indiquent que les deux traitements stimulent probablementles mêmes réactions. Il en est de même dans le cas de l'applicationde glucosamine. L'augmentation des surfaces des pics correspondant

à des substances phénoliques est à mettre en relation avec les

accroissements quasi identiques des teneurs en composés phénoliques

totaux dans les trois traitements.

122

=:.

1.

-.'

1.

~. ~ --:~.~'~':/ -:.~.> ~~,:::..,--,..,.. ;:.,.: ..-~~. _ .

.:. of··

r

.1

-"·:-1-;-_. . -

~;~:.!..@-

!.-__ ...Il "0°._ ~.

B

O__.l.!.::...!- ...... _. _....

. .----- -- ---_. -...- -_. .. .

·~ot~-éi:!):';: E" :-'.m.:. ....~<..t.:...-il\.ô., --p.:';ité, '"-D ---;-:~

~i~Ïi4..:.V-tl,o ... -4' ~ A...·oü AY'..c!:.t.._,.....-: - .. - .... ..; ..;.'~

- .."",.l:v..\--If1cCI1-~·.l.. --- \n,~ ~~04·· _·clt_._ _"_,, _s~. _:: A..... s~._. __.__ ... .__-+."....,"':

'd..-'.2,~_~! .V.,{_I-:- l..iv~iu_ ";.-::;. ·A:•• ,,·

---- ..._- . -.-

~-< .-:---.t::::::·;· :;~~::~.~\~=<~'~ ~:::~~_~--_~-

~~~~~: :~~j~4~~~i\?-~4E~ :::::f~:~~~ ..:~:~:.:~_~~:::::~{<~~~~~~_~®~~.~~:.~:y.~~:~~~~~~~:-~ ~~~:~~~:~:~:.::s~;:~: ~·i{· I_~:~~~~tstt~: .. ~>,.--:~-~~-:=-=.:.~.~~ ~:~-~~~1~~~: .:Lt< :-~'-:;'~~.-~'~'~' ~ -~-~~ ~.:~'-~~ ...:-- ..-- -- -_. -s%~::.:_:: :.i··:;O:.' ~. :.-==:::·~r:-::·:--·---"·- - .._..- -- ----- .- - -- ..- ... .. ..

..... --1- ----_._.- --------

:; ." .. r'- ...._-- ._- ..... -... ..

1- :: ;:-

"._... _:t-:,_._::&:.":_' _

:c.v-L' ... ':l, ~J ./.0 1Il •• :I • • I_~p ..~~.~ .. __ .. 0 _

__ !~r:- t.r.M.,.__ .1 CI'\&.oChO. -"f ~. ù-:~·-.~.a·-:-.eo:-.:':r-::-":==---:7'"-:-::-.:....-:::·,;.;,,..l;v..'rl"r OH S "J..' ("tOI1 !1!").. -: :. - .' -.,: , .~o. ~.~ :~:-.::-·s·----- ._- A - ..... r-O" - - --,:>.. --A -,.. Dr. ----.--.---~~ .~- --2::::-:-:::(- .~,,_ ........ : A -;' ..'~~: J. -.:.:~.,:,:.'l_:~:;'-::;;:-:i _·-'-~;;.r1-----·V--t;·---I---·--_·_------;~~-: .~.~ .,'. .-:-: ..-:;.: -. ~. ':~'.'.;. -->::=::: :~::~!<°l~~

A

~--_.C:,_.::-::.;--- -'

par

expérimenta-

(A)

(B) •

1 g de tissus frais) en

composition d'extraits méthanoliques

cultivar Piéralbo inoculés

et inoculés et traités

Conditions

comparative (#de la

tissus de feuilles dude

par le P. parasitiaa

l'acide arachidonique

les cf. fig. 21.

Analyse

C.L.H.P.

Fig. 30

- 123 -

3. Etude chromatographique par C.L.H.P. en solvants organiques

Nous avons procédé de la même façon que pour la modula­

tion des réactions de défense. L'application de TEPA modifie légère­

ment, dans le cas du cultivar Piéraline, l'amplitude des pics cor­

respondants aux esters méthyliques des acides linoléique et linolé­nique. Un pic réfractométrique, dans cette zone, correspond à l'accu­

mulation des sesquiterpènes des phases apolaires. Une augmentation

des pics réfractométrique et en ultra-violet correspondant à unesubstance très fluorescente indique une accumulation de ce que nous

présumons être un alcool diénique. Comme les monoépoxydes des deuxacides gras insaturés sont élués au même niveau, nous ne pouvons pas

affirmer que l'augmentation de surface du pic correspond à un seul

produit. L'application de TEPA est accompagnée par l'apparition (ou

une augmentation de concentration) d'une nouvelle substance décelée

dans l'ultra-violet. Ces chromatographies, malgré les différences de

dimension des colonnes analytiques de silice, sont en tout point com­

parables à celles établies en 1978 lors des premières recherches réa­

lisées avec le P. aap8~a~. Nous ne pouvons pas déceler de différences

analytiques entre les traitements par le TEPA et par les éliciteurs

dans les extraits de feuilles du cultivar Piéralbo.

4. Bilan des réactions de défense et de leur modulation

L'inoculation différentielle de parasites cryptogamiques

comme l'application de médiateurs chimiques modulent l'accumulation

de plusieurs substances dans les tissus.

Parmi les substances apolaires, les indices concernent

l'augmentation des pics réfractométriques correspondant à des ses­quiterpènes de masse M+ = 220, 222 et 236. Dans la même zone, nous

constatons l'accroissement des teneurs en esters méthyliques desacides gras insaturés en C 18 ainsi que de leurs dérivés oxygénés.

Les recoupements sont établis par comparaison des chromatographies

en C.L.H.P. et les spectres de masse des fractions correspondantes.

- 124 -

Pour les produits polaires, les réactions semblent encore

plus complexes. Nous avons vér~f~é pic par pic et pour plusieurs

séries d'~nfections expérimentales, la local~sation des substances

toxiques pour le C. aladospopioides en C.C.M. et le P. papasitiaa

en lames à concavité. Dans la zone ~, les pics 4 à 7 fortementtoxiques correspondent à des produits donnant des réactions de nitro­

sation positive, présumés phénoliques et instables. Il pourrait

s'agir d'esters d'acides cinnamiques étant donné leur élution dans

une phase très aqueuse (de 10% à 50% de méthanol). Nous n'avons pas

pu faire établir leur structure. Mais le plus important est la pré­

sence de la fraction H qui contient un stéroide en C 21, un alcool

sesquiterpénique et surtout le produit présumé être un diène diol

dérivant d'un acide gras en C 18.

Dans la zone (S), les pics majeurs correspondent non seu­

lement aux composés phénoliques (cf. tab. 5) mais aussi à la toma­

tidine. A tous ces pics est reliée une nette toxicité in vitpo. Tout

particulièrement les acides caféique et férulique, dihydroxy 3,4

benzoique et les deux aldéhydes benzoiques sont accumulés. Les spec­

tres de masse comme les chromatographies tendent à indiquer que

l'acide férulique (ou peut-être l'alcool correspondant) est majori­

taire.

Dans la zone ~ sont élués tous les dérivés des acides

gras en C 18. Nous avons tout particulièrement repéré les positionsde leurs esters méthyliques, des monoépoxydes et de l'alcool diéni­

que. Ainsi, nous pouvons corroborer dans cette zone les résultats

des analyses en C.L.H.P. sur colonne de silice avec des éluants or­

ganiques. Certes, d'autres lipides sont élués dans la zone ~ et

ne participent pas à la toxicité. Néanmoins, l'examen des chromato­

graphies concernant le cultivar Piéraline et l'action du TEPA et deséliciteurs indique nettement un phénomène d'accumulation.

- 125 -

. 4ème PARTIE : ETUDE IN VITRO DE LA TOXICITE DES PHYTO­

ALEXINES

1. Les dérivés d'esters méthyliques d'acides gras

Les monoépoxydes de 3 esters méthyliques d'acides gras ­

oléique, linoléique et linolénique - et l'alcool diénique de l'acide

linoléique ont été synthétisés par MM. Einhorn et Kunesch au labo­

ratoire des médiateurs chimiques. Nous avons testé leur toxicité in

vitro en lames à concavité et nous l'avons comparée à celle des pro­

duits naturels extraits de tomate.

1.1. Gamme de concentration

La toxicité des produits naturels ou de synthèse est étu­

diée pour une gamme de concentration allant de 50 à 200 ~g/ml après

24 h d'incubation (fig. 31).

Aux concentrations étudiées, l'acide oléique n'est pas

toxique, la croissance des hyphes est équivalente à celle du témoin.

Par contre, le monoépoxyde correspondant provoque une réduction de

croissance et des malformations des hyphes dès 50 ~g/ml. Dans ces

conditions, la fonction époxyde confère une nette toxicité.

L'inhibition de croissance varie selon les produits de 50

à 70% par rapport au témoin entre 50 et 75 ~g/ml. Elle dépasse 90%

avec 150 ~g/ml de monoépoxyde de linolénate de méthyle et avec l'al­

cool diénique de l'acide linoléique. Dans nos expériences, à concen­

tration équivalente, les produits de synthèse sont plus toxiques que

la substance naturelle. Ce résultat tient au degré de purification

incomplète de l'alcool diénique extrait de tomate (cf. fig. 10) et

à l'impossibilité de la parfaire par chromatographie en C.L.H.P ••

Si nous nous référons à la toxicité de l'alcool diénique de synthèse

- dose létale inférieure ou égale à 200 ~g/ml - le produit naturel

doit être beaucoup plus toxique ; en effet ce résultat correspond à

l'inhibition provoquée par plusieurs stéréoisomères dont les acti­

vités biologiques peuvent différer.

- 126

0• 0

"!C0.... E~,.... mC:::l....~ c:c CU0

0 U

• .0P'4

+0

o

Fig. 31 - Incidence de la concentration en monoépoxydes d'aci­des gras naturels ou de synthèse incorporés au mi­lieu de culture sur la croissance des hyphes deP. paraaitica. Incubation : 24 heures, tempéra-ture 1 21 Ge.

- • - 1 oléate de méthyle (croissance équivalenteIl celle du têmoin).

- 0 - 1 monoépoxyde d'oléate de méthyle obtenu parsynthèse.

- • - 1 monoépoxyde de linolénate de méthyle obtenupar synthèse.

- + - 1 dérivés oxygénés d'esters méthyliques natu­rels d'acides gras insaturés partiellementpur1f1ês.

- 0 - 1 alcool diénique de linolêate de méthyleobtenu par synthèse.

0

* 0

1

~

'*en

1CU.r:.Co

0>t~ * .0.r:. 0en ,...CU )('tJ.. E:::J~CU

~ CC) CUC0

- 127 -

Même aux plus faibles concentrations en inhibiteurs, la

diminution de croissance des hyphes s'accompagne d'une réduction de

la densité du thalle qui n'atteint pas le diziême de celle des cul­

tures témoins. La germination des sporocystes est retardée et les

tubes germinatifs formés présentent les mêmes perturbations cyto­

plasmiques que les hyphes de l'implant avant d'être tués dans un

bref délai.

1.2. Influence du pH

Nous avons étudié l'influence d'une gamme de pH comprise

entre ,pH 4 et pH 8 respectivement dans des tampons phosphate et

tris HCI.

L'ionisation du milieu de cu+ture ne semble pas influer

sur la toxicité de ces produits pour le P. parasitiaa. Dans ces

conditions, les essais d'inhibition sont réalisés à pH 6,2. Par

contre, pour les études de synergie avec la tomatine ou son agly­

cone le pH est ajusté à 5,2 (cf. infra).

1.3. Etude de la toxicité en fonction du temps

Comme nous l'indiquons ci-dessus, les modalités d'inhibi­

tion du P. parasitiaa par les différentes substances sont sembla­

bles. Afin de simplifier l'exposé nous indiquons les résultats obte­

nus avec le monoépoxyde du linolénate de méthyle (fig. 32).

L'inhibition s'établit en plusieurs étapes. Aux concen­

trations de 50 et 75 ~g/ml la croissance démarre sans délai mais

aprês 3h30 d'incubation elle est inférieure à celle du témoin~ Par

contre, dês le seuil de 100 ~g/ml appara!t une phase de latence

d'autant plus importante que la concentration en inhibiteur est

élevée. Cette phase de latence, reproductible d'une expérience à

l'autre, est de 3h30 à 100 ~g/ml, elle dépasse 7 heures pour

150 ~g/ml. Simultanément, des altérations cytoplasmiques sont déce­

lées dans le thalle aprês moins de 3 h d'incubation. Au bout de

24 heures; la croissance est totalement bloquée dans tous les motifs,

-1

28

-

Fig

.32

-C

roissan

ced

esh

yp

hes

de

P.

pa

pa

sitioa

invitp

oen

fon

ction

de

laco

ncen

tratio

nen

monoêpoxyde

de

lino

lên

ate

de

mêth

yle

ob

tenu

par

syn

thèse

1

ap

rès

3h30d

'incu

batio

nap

rès

7hd

'incu

batio

n-.-

ap

rès

24hd

'incu

batio

noo01

E-.......t»

0:a..

10e

,..-4Q

)

e0.-~.-

.ca

10~

01~e

,..-4Q

)(Je0(J

~:::sQ)

:::st»eo- CI)

Q)

.c0-

~~

CI)

0Q

),...

"C)(E:l.-eQ

)

-.

-.

(

..-.-.

.__

._e_

e_

e_

e_

e_

e_

e_

._.

e_

e

oS

-1

28

-

Fig

.32

-C

roissan

ced

esh

yp

hes

de

P.

pa

pa

sitioa

invitp

oen

fon

ction

de

laco

ncen

tratio

nen

monoêpoxyde

de

lino

lên

ate

de

méth

yle

ob

tenu

par

syn

thèse

1

ap

rès

3h30d

'incu

batio

nap

rès

7hd

'incu

batio

n-.-

1ap

rès

24hd

'incu

batio

noo01

E........t»

o::a..

10C

~Q

)

Co.-~ca--"."

~--

~."~

01c

~Q

)(JCo(J

.e_

._._

.e

e_

.._e

e__

CI)

.!Q.

>.

J:~

CI)

0Q

)....

"C)(

~E

~::1..

~C

t»Q

)Co-

--

(

..-.-. -

-o~10t-o10r-

~01

.-4

- 129 -

l'autolyse du cytoplasme importante. Des résultats identiques sont

obtenus avec des microcultures réalisées avec des implants consti­

tués de mycélium et celles oü sont incorporés des fragments de cul­

ture gélosés. Les réserves nutritives n'influent donc pas sur

l'inhibition.

Parallèlement, nous avons étudié l'incidence de la toxi­

cité sur la reproduction asexuée. A la concentration de 50 ~g/ml,

la germination des sporocystes est de l'ordre de 10% par rapport

au témoin. Elle s'annule aux concentrations supérieures. De plus,la germination est précédée d'une phase de latence.

1.4. Influence de la durée de contact sur la survie

Quelle que soit la concentration en monoépoxyde de lino­

lénate de méthyle incorporée au milieu de culture, l'aspect du

cytoplasme des chlamydospores n'évolue pas au cours de l'incubation

ceci laisse présumer une faible perméabilité de leur paroi aux inhi­

biteurs. Afin de vérifier cette hypothèse, après des incubations de1 à 6 jours, les microcultures sont transférées en tubes sur milieu

nutritif gélosé et supplémenté en thiamine. Les microthalles dépour­vus de chlamydospores ne survivent pas à une période de contact su­

périeure à 24 heures, même lorsque l'implant comporte un fragment demilieu nutritif. Par contre, après des incubations de 4 à 6 jours,

une partie des microcolonies comportant des chlamydospores peut en­

gendrer un thalle. Cependant, le temps de latence de la reprise estsupérieur à celui des témoins. Les cultures provenant de microthalles

traités par le monoépoxyde de linoléate de méthyle ont le plus sou­vent une croissance lente et intramatricielle : c'est probablement

l'indice d'une perturbation physiologique durable.

2. Les composés phénol igues et les alcaloldes

De nombreuses études indiquant la toxicité des composés

phénoliques de la tomate (Ravisé et Trique 1972, Davet et Ravisé1976, Vo Thi Hai et al. 1979 inter aL.) nous avons seulement véri­

fié les inhibitions provoquées par les acides cinnamiques et ben­

zoIques et deux aldéhydes qui en dérivent. De même, nous n'avons

- 130 -

pas tenté de reproduire les recherches antérieures sur la toxicité

de la tomatine et de la tomatidine (Arneson et Durbin 1967, Roddick

1974 et 1976 intep aZ.).

2.1. Influence du pH

Comme pour les dérivés oxygénés d'acides gras insaturés

les modalités de l'inhibition sont étudiées pour une gamme de pH

comprise entre pH 4 et pH 8. Si les composés phénoliques sont légè­

rement plus inhibiteurs en milieu acide qu'alcalin, la tomatine et

son aglycone perdent pratiquement toute activité à partir de pH 6.C'est pourquoi les tests concernant les substances phénoliques sont

réalisés à pH 6,2 tandis que l'expérLmentation avec la tomatine ou

la tomatidine est effectuée à pH 5,2.

2.2. Etude de la toxicité en fonction du temps

Les observations sont échelonnées entre 3 h, 24 h jus­qu'à 72 h d'incubation. Les résultats de notre étude recoupent ceux

des investigations antérieures sur les composés phénoliques. C'est

pourquoi nous indiquons seulement les effets de l'inhibition provo­quée par une concentration de 100 ~g/ml (fig. 33) de phénols. Les

composés les plus toxiques sont l'acide dihydroxy 3,4 benzoïque,

les acides p. coumarique, caféique et férulique. Ceux-ci induisent

une phase de latence d'au moins 3h30 avan~ la reprise de croissancedes hyphes. Par contre, les deux aldéhydes benzoïques et l'acide

chlorogénique s'avèrent moins toxiques. Ce dernier est d'ailleursle seul à ne pas induire de phase de latence.

La tomatidine est, à concentration égale, moins toxique

que la tomatine. La dose létale de l'alcaloïde pour le P. papasitica

est de l'ordre de 200 ~g/ml selon l'état physiologique des thalles.Avec l'alcaloïde à 100 ~g/ml la phase de latence est moins marquée

que dans le cas des acides cinnamiques.

L'ensemble de ces substances inhibe de façon quasi sem­

blable la germination des sporocystes. Dans la plupart des cas,

celle-ci ne dépasse pas 20% en 24 h ; lors de libérations de zoo­

spores celles-ci sont tuées dès l'émission de tubes germinatifs.

131

co

..~

CD....-.Q~C,...,.

- .. -.-.-._.

7h/-'- 1 après 24h d'1ncuba~ion

4 1 acide cafêique5 1 acide fêru1ique6 1 acide ch1oroqênique7 1 vanilline8 1 d1lDêthoxy 3,4 benza1dêhyde.

Fi9' 33 - Evo1u~ion en fonc~ion du ~emps de l'inhibi~ion dela croissance des hyphes de P. paraa~t~oa ~n vitro

par des composés phénoliques a la concen~ration de100 119/101.

--- 1 après 3hJOI - - 1 après'1' 1 témoin1 1 acide dihydroxy 3,4 benzolqueZ 1 acide trihydroxy 3,4,5 benzolque3 1 acide p. cOUIDArique

_._e_._. _

...

_ ._._e_._.

E:l.-e:Q)

..~

CD~Q')r::o

enCD

-a>C")~ 0(1) -CD )(

"C

....

-1

32

-

Fig

.3

4-

Incid

en

ce

de

laco

ncen

tratio

nen

su

bsta

nce

Hsu

r

lacro

issan

ce

invitp

od

es

hy

ph

es

de

P.

pa

pa

sitiaa

.

Incu

batio

n:

24

heu

res.

o'0-

E......C')

~c:CDc:o...ca......c::CDuc::ou

oo-o

/enCD

.c:Co

>-~C")0

en-CD)(

"'C...E

~~

CD~c:

C)

CDc:0

C"Il-

- 133 -

3. La substance H

3.1. Gamme de concentration

La toxicité de l~ fraction est étudiée après 24 h d'incu­

bation en fonction de sa concentration dans le milieu de culture

(fig. 34}.

Cette substance se révèle fortement toxique puisqu'à la

concentration de 30 ~g/ml la croissance du champignon est réduite

d'environ 2/3 par rapport à celle des cultures témoins. Dès

100 ~g/ml la croissance est totalement inhibée. Aucun sporocyste

n'a germé quelle que soit la concentration.

3.2. Etude de la toxicité en fonction du temps

La phase de latence (fig. 35) est proportionnelle à la

concentration aux doses de 50 et 75 ~g/ml. Dans ces conditions

seule une très faible partie des hyphes est susceptible de croître

dans un délai de 3h30. Les altérations cytoplasmiques apparaissent

plus vite que dans le cas d'inhibitions provoquées par les phénols

ou les produits d'oxygénation des esters méthyliques d'acides gras.

En particulier l'autolyse cytoplasmique intervient en moins de

24 h à la concentration de 75 ~g/ml. A la concentration de 100 ~g/ml,

même avec des implants gélosés, aucune élongation de filaments n'est

observée après 48 h d'incubation. Ce résultat tend à indiquer que le

P. parasitiaa ne parvient pas à dégrader l'inhibiteur au cours de

cette période.

Dans toutes les expériences réalisées avec cette fraction

toxique, même à 50 ~g/ml, nous n'avons jamais observé de germina­

tions de sporocystes cependant décelées chez les témoins de toutes

les séries.

-1

34

-

Fig

.3

5-

Inh

ibitio

nin

vitp

od

ela

cro

issan

ce

des

hy

ph

esd

e

P.

pa

pa

sitica

en

fon

ctio

nd

ela

du

rêe

d'in

cu

batio

net

de

laco

ncen

tratio

nen

sub

stan

ce

H.

3h

30

d'in

cu

batio

n7

hd

'incu

batio

n

-.-

:1

5h

'd'incuba~ion

-:

24

r.d

'incu

batio

n4

8h

d'in

cu

batio

n

<::>o~-E- en:::1...c0)c:

00

~'';;

co.......c:CI)

(Jc:oQ

g....

.-._

._._

._.-

enQ)

.r:.Co

>­.J::.C

W)o

en....

Q)

X"C...

E:::J

:J...Q

)c:

5,0)c:.2

..........,.... ............... .....

.'---------

....Le)

o

- 135 -

4. Recherche de synergie entre inhibiteurs

4.1. Entre dérivés oxygénés d'acides polyéniques

4.1.1. et des composés phénoliques

Des résultats très proches sont obtenus en associant d'une

part soit un monoépoxyde soit un alcool diénique d'acide gras insa­

turé avec d'autre part l'un des huit composés phénoliques pour ,les

tests d'inhibition du P. parasitiaa in vitro. Nous présentons seule­

ment la synthèse de ces expériences.

L'action inhibitrice du linolénate de méthyle ou de l'al­

cool diénique à 50 ~g/ml est complémentaire de celle des substances

phénoliques à 100 ~g/ml. La synergie entre ces deux catégories d'inhi­

biteurs décuple la toxicité pour le P. parasitiaa comme l'indique la

figure 36. Les inhibitions les plus importantes sont obtenues avec

les deux aldéhydes benzoïques.

Puis dans l'ordre, les acides caféique et férulique,

p. coumarique et dihydroxy 3,4 benzolque s'avèrent de bons effecteurs

en présence des dérivés oxygénés d'acides gras polyéniques. Les pha­

ses de latence de reprise de la croissance varient de 3h30 à plus de

7 h selon les associations. Dans tous les cas étudiés la croissance

est bloquée en moins de 24 h. L'élongation des filaments est de l'or­

dre de la à 15% de celle des cultures témoins. Il est remarquable que

seule une très faiale partie des hyphes parvient à survivre et à

croitre au cours de cette courte période. De plus nous observons que

pratiquement aucun sporocyste ne germe dans ces conditions.

L'association des deux catégories d'inhibiteurs provoque

des altérations cytoplasmiques plus rapides : la dégénérescence lipi­

dique est décelable après 3 à 5 h de culture.

4.1.2. et la tomatine et la tomatidine

Cette association ne fournit des résultats probants qu'aux

pH acides. C'est pourquoi les essais sont réalisés à pH 5,2. Dans

ces conditions, le monoépoxyde de linolénate de méthyle et l'alcool

-1

36

Fiq

.36

-In

hib

ition

de

lacro

issan

ce

des

hy

ph

esd

ePo

pa

ra­

sitio

ain

vitr

oselo

nle

seffe

cte

urs

T1

témo

in---

1u

nse

ul

inh

ibite

ur

1nO

lm

onoépoxyded

elin

olê

nate

de

méth

yle

de

syn

thêse

l50

~qlml

nO2

l9

1100

~qlml

de

composés

ph

êno

liqu

e,re

spectiv

em

en

tOA

od

ihy

dro

xy

3,4

ben

zolq

ue

(2),

A.

trihy

dro

xy

3,4

,5b

enzo

lqu

e(3

),v

an

illine

(4),

dim

étho

xy

ben

zaldêh

yd

e(5

),A

.café

iqu

e(6

),A

.fé

ruliq

ue

(7),

A.

p.

cou

mariq

ue

(8)et

A.

chlo

roq

éniq

ue

(9).

---

1asso

cia

tion

de

50~q

de

monoêpoxyde

de

1in

o­

lên

ate

de

méth

yle

et

100~q

de

com

po

sêp

hên

o­

l1q

ue.

-~------------

____________I~

.----1

11_

-------

-1

11----

--

0)

'-::JCI)

o~

COoC.cc::

!------------[I.e)

1------

1--

--

--1C'4

'--

--

--

'------1

enCI)

.r::.Cl.

C")>.r::.

~en

)(

CI)

-cE

'-.~

:JCI)

c:::J

CI)

enc::01

-

._------

11--....

- 137 -

diénique à 50 ~g/ml abaisse le seuil de toxicité de 1/4 avec la

tomatine à 100 ~g/ml et de 1/3 avec la tomatidine à la même concen­

tration dans un délai de 17 h. Puis, les symptômes d'inhibition

évoluent plus lentement que dans le cas de l'association avec les

composés phénoliques.

4.1.3. et phénols et alcaloide

D'après nos essais, l'incorporation simultanée au milieu

de culture d'un dérivé oxygéné d'acide polyénique, de composés phé­

noliques et surtout de tomatidine soit à 50 ~g/ml soit à 30 ~g/ml

de chacun d'eux provoque des altérations importantes des microthalles

de P. parasitica (fig. 37). Celles-ci sont bien supérieures à l'inhi­

bition que pourraient laisser escompter les associations des effec­

teurs deux par deux. Dans le cas de l'association à 30 ~g/ml compor­

tant la diméthoxy 3,4 benzaldéhyde et l'acide caféique, les quatre

inhibiteurs provoquent un très important retard de croissance des

quelques hyphes survivants jusque vers la septième heure. Au bout de

quatre joursd'incubation les produits ne semblent pas dégradés;

avant la mort des filaments leur croissance est de l'ordre de 1/10e

par rapport au témoin.

4.2. Entre la substance H et les autres inhibiteurs

La nature chimique de cette fraction étant esquissée tar­

divement nous avons étudié l'éventuelle complémentarité de sa toxi­

cité avec celle des autres inhibiteurs.

Etant donné l'importante toxicité de cette substance nous

avons principalement étudié la synergie entre 30 ~g/ml de fraction

H et 50 ~g/ml soit de diépoxyde de linolénate de méthyle (les mono­

époxydes étant épuisés) soit d'un composé phénolique soit de toma­

tine ou de tomatidine. Pour ces tests, 5 mg de fraction H sont uti­

lisés.

Nous notons une nette synergie entre la fraction H et le

diépoxyde de linolénate de méthyle : le blocage de croissance sem­

ble intervenir entre la 3ème et la 7ème heures d'incubation. La

- 138 -

4

longueur des -hyphes

en)Jm x 103

Fiq. 37 - Influence de l'association des inhibiteurs, en fonc­tion du temps et du pH, sur la croissance in vitro

des hyphes de P. parasitica.

A pH 6,2 B : pH 8

: 3h30 d'incubation 1 7h d'incubation-.- f jours d'incubationT têmoin

l et 2 : association à 50 ~q/ml (1) ou a 30 ~q/ml

(2) de monoêpoxyde de linolênate de méthyle,de tomatidine, d'acide cafêique et de di­mêthoxy 3,4 benzaldêhyde.

3

2

1., 1

•2

inhibiteur

A......

1.1

~

1

1

1

A B"'"...._-......_--"A B

"'-...._-.........---/T

1

- 139 -

synergie est très forte également avec les deux benzaldéhydes,

l'acide dihydroxy 3,4 benzolque et l'acide caféique. Nous notons

une meilleure efficacité pour l'association avec la tomatine par

rapport à celle avec la tomatidine, la nuance étant cependant fai­

ble : délai de 3 à 6 h d'apparition de l'autolyse cytoplasmique.

5. Symptômes d'inhibition (pl. 3 à 5)

Les observations des microcultures en microscopie photo­

nique, aux grossissements compatibles avec une bonne profondeur de

champ, ne permettent pas de distinguer des différences entre lesmodalités d'inhibition provoquée par les substances éprouvées.

En moins de 3 h d'incubation, les premiers indices sontdécelés vers l'apex des hyphes en cours de croissance. Leur cyto­

plasme devient granuleux, vacuolisé. Entre 6 h et 12 h de contact

la paroi des apex des hyphes semble s'épaissir et devient plus

réfringente. Dans le même temps, les apex se renflent en spatuleou se spiralisent. Les hyphes en élongation deviennent toruleux,

grêles et fréquemment ramifiés en arbuscules coralloldes. La gra­

nulation du cytoplasme évolue en dégénérescence lipidique, de très

nombreux globules commencent par se former dans les parties dis­

tales. De fausses cloisons limitent fréquemment des segments d'hyphes

sans toutefois arrêter la progressionde la désorganisation cytoplas­mique. L'autolyse du cytoplasme est achevée en 24 heures dans le cas,

par exemple, de l'incorporation de monoépoxyde de linolénate de mé­

thyle à 75 ~g/ml. De même, le contenu des sporocystes, malgré un

épaississement relativement rapide de la paroi, dégénère dans des

délais compris entre 24 h et 36 h (pl. 5). Seules les chlamydospores

semblent peu atteintes par les substances toxiques et nous avonsindiqué ci-dessus leur aptitude à engendrer parfois un thalle après

incubation.

- 140 -

LEGENDES DES PLANCHES III A V

PLANCHE III

Photo N° l - Aspect d'une microculture témoin en lame à

concavité de ~. parasitica après 7 heures

d'incubation à 28 0 C •

Photo N° 2 - Aspect d'une microculture dans les mêmes condi­

-tions en présence de 50 ~g/ml d'alcool diénique

de synthèse;noter l'apparition de fausses cloisons

et un début de granulation du cytoplasme.

PLANCHE IV

Photo N° 3 - Aspect d'une microculture dans les mêmes condi­

-tions après IO heures d'inc~~ation en présence

de 50 ~g/ml d'alcool diénique de synthèse.Les

parois des hyphes se sont épaissies, ceux-ci devien-

-nent de forme irrégulière.La èégénérescence du

cytoplasme dédute par l'apparition de globules

lipidiques.

Photo N° 4 - Conditions expérimentales identiques à celles de

la photo N° 3,après 24 heures d'incubation:

le cytoplasme semble totalement désorganisé, une

partie du contenu des hyphes est répandue dans la

concavité de la microculture.

PLANCHE V

Photo N° 5 - Aspect en microculture d'hyphes et de sporocyste

de ~. parasitica anrès 24 heures d'incubation

en 9résence d'un mélange de monoé/oxyde de lino­

-lénate è-e mÉthyle à 50 }lg/ml et d'o acide féruliaue

à IOO jUg/ml.

10,um

pl. 3

DISCUSSION

- 141 -

DISCUSSION

Les études réal~sées sur deux interactions Lyaopepsiaum

esaulentum - Phytophthopa papasitiaa d'une part et L. esaulentum ­

Veptiaillium albo-atpum d'autre part tendent à indiquer que des

biosynthèses actives interviennent au cours des réactions de défense

de la plante. Les inoculations croisées effectuées sur les cultivars

Piéraline - possédant les caractères de résistance au mildiou et à

la verticilliose - et Piéralbo.- avec uniquement l'allèle de résis­

tance à la verticilliose - indiquent nettement une modulation des

mécanismes impliqués chez l'hôte selon la nature de l'agent patho­

gène. Cependant, même lors de l'infection expérimentale d'un culti­

var ne possédant pas de gènes de résistance contre le parasite,

nous observons une réaction de défense.

La complexité des synthèses et la multiplicité des bar­

rières opposées par la tomate fait présumer la stimulation de plu­

sieurs voies métaboliques. Cherchant essentiellement à identifier

les substances de nature.phytoalexinique nous n'avons pas tenté

d'établir les séquences de leur intervention dans le processus para­

sitaire mais bien plutôt à définir les groupes chimiques auxquels

elles appartiennent. Nous avons d'autre part considéré comme acquise

la notion de barrières mécaniques élaborées en réaction à l'infec­

tion notamment l'établissement de cals (Aist 1976, Kounoh et al.

1978, Hachler et Hohl 1984) et l'élaboration de lignine chez le

blé (Ride 1980, Maule et Ride 1982), le radis (Ohguchi et Asada

1975) la pomme de terre (Friend et al. 1973, Burchert et Decedue

1978) et les fruits de tomate (Glazener 1982).

A l'évidence, les principales synthèses stimulées corres­

pondent à la voie des phosphopentoses et de l'acide shik~que ainsi

qu'à celle du glucose - 6 - phosphate débouchant sur l'acétyl co­

enzyme A, le malonyl et le mévalonyl co-enzyme A.

- 142 -

1. La diversité des substances inhibitrices

Au stade actuel des investigations nous pouvons regrouper

les substances toxiques pour le P. parasitica, diffusibles lors

d'extractions simples par le chloroforme et par le méthanol, en

cinq groupes principaux :

- dérivés d'acides gras insaturés,

- sesquiterpènes,- phénylpropanoldes,

- stéroïdes,- alcaloïdes.

1.1. La tomatine et la tomatidine

11 est indéniable que l'alcaloIde et son aglycone, pré­

existants à l'infection, s'accumulent dans les tissus au cours de

la réaction de défense. Il existe de forte présomptions, d'après

nos études chromatographiques, que la substance D décrite par Neema

(1983) comme s'accumulant entre le 3ème et le 10ème jours suivant

l'inoculation de P. parasitica sur tiges de tomate décapitées cor­responde à la tomatidine (vraisemblablement de la tomatine hydro­

lysée au cours des manipulations). Le dosage à l'anthrone étant per­

turbé par de nombreux artefacts (tous glucosides des extraits) et

celui de Lieberman - Burchard insuffisamment spécifique (stéroïdes

sensu Lato) , nous ne disposons pas de valeurs précises à l'échelle

de l'assise cellulaire infectéé - pénétration au collet, lésion

racinaire cicatrisée -. Nous déduisons des analyses chromatographi­ques que la teneur moyenne en tomatidine avoisine 60 ~g/ml de tis­

sus frais. De même, les chromatogrammes en C.L.H.P. sur colonne desilice greffée en C 18 mettent en évidence l'accumulation de toma­

tidine dans la zone correspondant à l'élution par le méthanol dansune solution acétique à 5% 0 ,

Notre interrogation converge vers celle de Drysdale etLangcake (1973) qui établissent dans le cas d'une infection avec le

Fusarium ozysporum f. Lyoopersici une relation entre une fraction

- 143 -

inhibitrice et la tomatine sans que les concentrations, fortement

accrues dês le premier jour d'incubation, justifient à elles seulesle blocage de l'agent pathogêne. Des observations analogues sont

rapportêes par Hammerschlag et al. (1975) qui dêtectent une concen­

tration en tomatine de 180 ~g/g de tissus frais chez un cultivar

rêsistant à la fusariose.

D'après les rêsultats de nos tests de toxicitê in vitro

pour le P. parasitiaa, la tomatine provoque un blocage de crois­

sance à la concentration de 200 ~g/ml en 7 heures. Cette dose lêtale

est abaissêe à 100 ~g/ml en prêsence de monoêpoxyde ou d'alcool diê­

nique d'ester mêthylique d'acide gras insaturê et d'un ou de plu­

sieurs composés phênoliques. A pH acide (Arneson et Durbin 1968,

Roddick 1978) la tomatine ou son aglycone sont susceptibles de con­

tribuer à l'inhibition du parasite. Cette action est renforcêe par

d'autres inhibiteurs élaborês après l'infection. Rêcemment, Defagoet al. (1983) et Kern (1984) ont dêmontrê que des mutants de Fusa­

rium soZani rêsistants à la tomatine (croissance en prêsence de800 ppM) sont davantage pathogênes pour les fruits de tomate imma­

tures, les plus riches en alcaloIde, que la souche sauvage.

1.2. Les sesquiterpènes

La plupart d'entre eux ne sont pas dêcelês en chromato­

graphie par C.C.M. et par C.L.H.P. dans les extraits de tissus

sains. Par contre, aprês inoculation par le P. parasitiaa, s'accu­

mulent vraisemblablement six sesquiterpènes. Deux d'entre eux sont

trouvês dans des fractions polaires, quatre autres séparês avec desdérivês oxygênês d'acides gras insaturês. La toxicitê de ces frac­

tions issues de dix sêries d'infections expêrimentales ne peut pasêtre mise en doute. Cependant, nous n'avons pas pu purifier des

quantitês suffisantes de produits pour êprouver in vitro leur toxi­citê. Certains des sesquiterpènes, proches de la solavetivone sont

extrêmement instables, tout comme les produits de rêfêrence envoyês

du Japon par le professeur Murai. D'après les fragmentations indi­quêes par les spectres de masse et les pics molêculaires, les ses­

quiterpènes prêsents dans les fractions toxiques correspondent à

- 144 -

des vestipêranes et à des norsesquiterpènes, la polarité de deux

d'entre eux étant probablement d~e à des substituants. Aucun des

spectres ne correspond exactement à celui de la rishitine. La com­

plexité de la biosynthèse de sesquiterpènes chez la tomate est iden­

tique à la situation observée chez l'aubergine par Ward et al. (1975)

qui décrivent sept structures différentes. Cette réaction multiforme

a été précédemment décrite chez la tomate en réaction à la verticil­

liose par Tjamos et Smith (1974, 1975) ainsi qu'à la fusariose

(Hutson et Smith 1983). Dans ces cas, seule la rishitine fut iden­

tifiée par chromatographie en C.C.M •• D'autres auteurs (Elgersma

1980, inter aL.) décèlent la rishitine dans les tissus vasculairesde la tomate en réaction à la verticilliose tandis que Mc Cance et

Drysdale (1975) s'interrogent sur la contribution de la rishitine

aux mécanismes de défense contre la fusariose par raport à celle de

la tomate.

Dans notre étude, la toxicité des sesquiterpènes n'est

appréciée qu'à partir de fractions purifiées par C.L.H.P. et conte­

nant d'autres produits, parfois des dérivés oxygénés d'acides gras

insaturés. Par contre, Kuc (1983), étudiant l'accumulation chez le

tabac en réaction au Peronospora tabaaina ou au Pseudomonas Lachry­

mans, a démontré l'accumulation de six sesquiterpènes. Ils inhibent

in vitro la germination de spores de P. tabaaina dès la concen­

tration de 10 ~g/ml.

1.3. Les composés phénoliques

La stimulation de la synthêse des phénylpropanoIdes estobservée lors de l'inoculation du P. parasitiaa et du V. aLbo-atrum,

la réaction du cultivar Piéralbo portant l'allèle Ve au P. parasi­

tiaa étant la moindre.

Tant d'après les résultats des dosages de composés phéno­liques totaux que d'après les analyses chromatographiques par

C.L.H.P. des extraits bruts, il semble certain qu'il s'agisse de

la réaction physiologique la plus importante de la tomate au para­

sitisme dans le cas de nos essais. Des études concernant la résis-

- 145 -

tance à la fusariose (Matta et al. 1969, Danko et Corden 1981) indi­

quent des réactions semblables associées à la résistance. De même

Hutson et Smith (1980) notent une accumulation différentielle de

composés phénoliques, allant de pair avec celle de sesquiterpènes,

chez une même variété selon qu'elle est inoculée avec le Fusarium

oxysporum f. Zyaopersiai ou le VertiaiZZium dahZiae. Cette réaction

non spécifique de la tomate au parasitisme est indiquée par diffé­

rents auteurs (Ravisé et Trique 1972, El Khatib et al. 1974, Davet

et Ravisé 1976, Trique 1981 inter aZ.) à tous les stades végétatifs.

Glazener (1982) observe, dans les fruits de tomate, l'accumulation

de produits phénoliques notamment d'acides cinnamiques et de leurs

dérivés. Comme cet auteur, nous notons une forte accumulation de

ceux-ci principalement de l'acide férulique et dans une moindre me­

sure de l'acide caféique soit sous forme diffusible - vacuolaire ou

cytoplasmique - soit estérifiés aux parois. L'accumulation d'acide

dihydroxybenzolque et d'aldéhydes benzoIques parait aussi caracté­

ristiques des réactions au P. parasitica et au V. aZbo-atrum chez

les deux cultivars. Ce phénomène est mis en évidence par l'analyse

chromatographique en C.L.H.P .. Nous n'avons pas repris l'étude de

l'évolution des esters et des glucosides des acides cinnamiques

(El Khatib et al. 1974) ni tenté de reproduire celle de Glazener

(1982) sur les processus de lignification. Vraisemblablement, l'éla­

boration de barrières de lignine (cf. supra) et l'estérification de

dérivés d'acides cinnamiques sur les parois (Whitmore 1976, Hunt et

Baker 1980, Newby et al. 1980, Fleuriet et Macheix 1980 et 1981 ,

Elliger et al. 1981) peuvent contribuer chez la tomate au blocage

de la progression de l'agent pathogène comme chez d'autres plantes.

Plusieurs exemples sont cités par Friend (1981) notamment

dans le cas de l'orge et de la pomme de terre. Cependant, si impor­

tante soit-elle, la stimulation de synthèse de substances phénoli­

ques n'est pas caractérisée chez la tomate par l'accumulation de

produits majeurs tels que les ptérocarpanes des légumineuses ou les

stilbènes de la vigne (Raynal et al. 1980, Bailey et Mansfield

1982 inter aZ.). Il n'en demeure pas moins que les composés phéno­

liques contribuent activement (cf. infra) notamment en synergie avec

la tomatine et les produits d'oxydation des acides gras-insaturés à

- 146 -

l'inhibition du P. parasitiaa in vitro. Cependant, n'ayant pas mai­

trisé les phénomènes d'oxydation, nous ne pouvons pas indiquer la

nature exacte de tous les produits impliqués in vivo dans les réac­

tions de défense. Il est vraisemblable que des substances phénoli­

ques forment des complexes avec divers lipides, comme nous l'avons

démontré in vitro, soit par liaisons hydrogènes soit par covalence

qui représentent des barrières localisées. Ainsi Friend (1976) in­

dique que chez la pomme de terre, le suber élaboré en réaction au

P. infestans contient environ 1/3 de composés phénoliques sans pou-

~voir préciser les modes de liaison. Nous examinons ci-dessous d'au­

tres hypothèses concernant les sécrétions lipo-phénoliques.

1.4. Les esters méthyliques d'acides gras insaturés et leurs

dérivés oxygénés

Ils représentent, comme l'indiquent les chromatogrammes

d'analyse en CG-SM (fig. 10) les constituants majoritaires des frac­tions toxiques apolaires. Ils constituent aussi l'écueil principal

de cette étude puisque, deux ans après leur détection, la structure

réelle de plusieurs dérivés oxygénés nous échappe encore.

Il pourrait s'agir d'une réaction physiologique au para­

sitisme générale dans le monde végétal. Des sécrétions lipidiques

sont décrites dans tous les types d'infections. Rappelons succincte­m~nt le cas d'infections de racines d'Eucalyptus attaquées par le

P. ainnamomi (Tippet ët al. 1977), des infections vasculaires avec

des réactions au niveau des cellules parenchymateuses chez le Car­

thame infecté par le V. albo-atrum (Robbe et al. 1978). Il en estde même pour des infections foliaires notamment de la tomate : en

réaction à la cladosporiose (Lazarovits et Higgins 1976a et b), en

réaction au P. aapsiai dans le cas des nécroses bloquantes provo­quées par le TEPA (Bompeix et al. 1980, Durand et Sallé 1981). Chez

le riz, Kato et al. (1983) ont démontré que des monoépoxydes de

l'acide linolénique sont estérifiés aux parois et inhibent in vitro

le Pyriaularia oryzae. Le linolénate de méthyle et ses produitsd'oxydation sont aussi toxiquœpour ce parasite (Shimura et al.

1981). De même, différents substituants d'acides polyéniques (Le

Baut et al. 1983) et des alcools d'acides hexadécanoiques (Sugai

- 147 -

et Mori 1984) possêdent des propriétés inhibitrices. D'aprês des

études cytologiques, différents degrés de résistance au P. infes­

tans au niveau du feuillage de variétés de pomme de terre corres­

pondent à des sécrétions glucidiques, lipidiques et phénoliques,(Coffey et Wilson 1983) sans accumulation de rishitine (Kuc 1972).

Au stade actuel des études réalisées par M. Einhorn, il

existe de fortes présomptions pour que les produits partiellement

purifiés en fin de séries chromatographiques correspondent à des

alcools diéniques dérivés du linoléate de méthyle et du linolénate

de méthyle. Toutefois, eu égard à la grande instabilité des produits,

il se pourrait que les sécrétions lipidiques décrites par Durand et

Sallé (1981) nettement toxiques pour les hyphes de P. aapsiai con­

tiennent un mélange de monoépoxydes et d'alcools diéniques des esters

méthyliques d'acides gras insaturés en C 9, C 16, C 18, C 20 et C 21.

Cette hypothèse est compatible avec les étapes biosynthétiques indi­

quées par Kollatukudy (1977) aboutissant à différentes formes de

suber. Nous pensons qu'une des approches possibles serait l'analyse

séquentielle comme dans le cas du Sorgho (Espelie et Kollatukudy

1979) •

1.5. La substance H

Cette fraction manifeste in vitro une importante toxicité

pour le P. parasitiaa. Les produits qui la composent s'accumulent

notablement dans les tissus infectés, cette synthèse est stimulée

par l'application de TEPA et d'éliciteurs.

+Un stéroide en C 21, un sesquiterpène (M = 222) et un

produit majoritaire dégradé en CG préparative constituent cette

fraction. Selon M. Einhorn, le produit majoritaire pourrait corres­

pondre à un diène diol dérivé d'un acide gras en C 18. Cette hypo­

thèse semble, au plan biogénétique, cohérente avec des étapes suc­

cessives d'oxydation et de condensation (Kollatukudy 1977). Cepen­

dant, il reste non seulement à confirmer la structure de l'inhibi­

teur mais aussi à élucider plusieurs énigmes : la nature des liai­

sons entre les trois produits, la cause du blocage de la condensa­

tion à cette étape avant l'élaboration présumée du suber, les moda­

lités de l'inhibition in situ du parasite.

- 148 -

2. La toxicité in vitro

Les substances élaborées par plusieurs voies métaboliques

stimulées lors de l'infection, ou modulables par des médiateurs chi­

miques, sont toxiques in vitro pour le P. parasitica.

Pour les composés sesquiterpènes, les modalités de la toxi­cité sont analysées en fonction de leur structure, notamment pour

la rishitine (Ishiguri et al. 1978). Par ailleurs, les sesquiterpè­nes élaborés par le tabac en réaction à diverses attaques s'avèrent

très toxiques in vitro pour les spores de P. tabacina (Kuc 1983).Il ne semble pas nécessaire de rappeler les nombreuses études por­

tant sur les propriétés inhibitrices de la tomatine (Roddick 1978

inter al.) et des composés phénoliques (Ravisé et Trique 1972,Ravisé, Kirkiacharian, Chopin et Kunesch 1980 inter al.). Cependant,,comme Ku~ dans le concombre (1983) nous observons une importante

augmentation des teneurs en acides cinnamiques, en particulier

d'acide férulique. Son dérivé, l'alcool coniférylique est toxiquein vitro pour plusieurs champignons parasites en C.C.M. à des con­

centrations de l'ordre du ~g (Hammerschmid~ 1980; Hammerschmidt et,~

Kuc 1982).

Nous attachons de l'intérêt à l'augmentation de la toxi­

cité in vitro qui résulte de l'association de plusieurs inhibiteurs.

Les concentrations employées dans nos expériences correspondent à

des teneurs réalisables dans les tissus (cf. les dosages de composés

phénoliques, l'estimation de la tomatidine). Alors que des études

cytologiques indiquent la co-migration de lipides et de composésphénoliques (Lazarovits et Higgins 1976a et b, Durand et Sallé 1981)

dans les tissus de feuillage de tomate où sont bloqués les agentspathogènes, nous observons une stimulation de 10 fois de la toxicité

d'un dérivé oxygéné d'acide gras insaturé en présence d'acide oud'aldéhyde phénolique. Lorsque l'alcaloide ou son aglycone sont

ajoutés, la synergie augmente.

- 149 -

Précédemment, des effets de synergie ont été décrits. .

chez plusieurs plantes, en particulier le haricot contre le Botrytis

ainerea ou le Colletotriahum lindemuthianum (Garcia Arenal et al.

1978, Bailey et Rowell 1980, Fraile et al. 1982, Theodorou et al.

1982 inter al.).

Dans nos expériences, la synergie aux pH acides voisins

de ceux des tissus, abaissant sensiblement le seuil de toxicité,

tient probablement à la complémentarité des cibles. Les acides ben­

zoïques et cinnamiques oü leurs dérivés perturbent le cycle de la

glycolyse (Krebs et al. 1983), provoquent un découplage partiel en­

tre l'oxydation et la phosphorylation oxydative (Benz et Laughlin

1983), inhibent la synthèse et l'activité d'enzymes lytiques (Ravisé

et Kirkiacharian 1976, Ravisé et Chopin 1981). La tomatine ou sonaglycone·ag~t sur les mitochondries, les chloroplastes et les lyso­somes entraînant en particulier des perturbations de l'activité

phosphatase acide (Roddick 1978). Enfin, la fonction époxyde - et

vraisemblablement alcool diénique - agissant au niveau des phospho­

lipides de la membrane peut modifier leur degré d'insaturation,

leur fluidité donc leur perméabilité (De Giers et al. 1982'. Ses

propriétés alkylantes provoquent également la rupture de doubles

liaisons dans les bases de l'ADN et de l'ARN des cellules animalesd'où parfois des perturbations carcinogènes (Oesch 1973) •

3. La modulation de la réaction de défense

Nos résultats correspondent à des dosages de phénols

totaux dans l'ensemble des tissus concernés par une infection au

niveau du collet et des racines que corroborent les analyses chro­

matographiques par C.L.H.P. de l'évolution des substances impli­

quées dans les réactions de défense.

3.1. Modulation selon les génomes confrontés

Dans nos essais, les deux cultivars possédant l'allèle

Ve de résistance à la verticilliose réagissent de façon similaire

à l'inoculation du Vertiaillium albo-atrum. Par contre, nous obser­

vons une réaction différentielle à l'égard du Phytophthora parasitiaa.

- 150 -

Des différences semblables sont observées chez des cultivars de

tomate résistants à la verticilliose selon qu'ils sont inoculéspar le V. albo-atpum ou par le Fusarium o~ysporum f. lycopepsici

(Hutson et Sm~th 1980) ou chez différentes var~étés d'Eucalyptus

selon leur sensibilité au Phytophtkora cinnamomi (Tippet et al.

1977) •

3.2. Modulation physiologique

3.2.1. Rôle des inhibiteurs

Si nos essais d'inhibition de la voie du malonyl Co A

par des inhibiteurs de Smith Klein and French ne fourn~ssent pas

de résultats interprétables, ceux d'inhibition de la synthèse des

phénols sont probants. L'application d'AOA inhibiteur compétitifde la PAL diminue d'environ 25% chez le témoin non inoculé les

teneurs en plusieurs composés phénoliques. Les résultats de trois

essais en serre sont concordants. La réaction de défense du culti­

var Piéraline au P. parasitica est atténuée mais non bloquée : les

dosages de phénols' totaux comme les analyses chromatographiques en

C.L.H.P. démontrent nettement les conséquences du traitement. Lesteneurs en acides cinnamiques - Acide caféique et acide férulique ­

et en dérivés de l'acide benzoïque - vanilline, acide dihydroxy 3,4

benzoïque - régressent. Cette modulation correspond en serre à

l'apparition de symptômes de sensibilité chez une partie des plants

traités. Les résultats obtenus avec l'AOA ressemblent à ceux de

Massala et al. (1982) qui établissent chez le tabac une relation

entre la réduction de synthèse des phénylpropanoïdes et une augmen­

tation du nombre et de la surface des nécroses de feuilles de Nico­

tiana samsum N.N.~ naturellement résistant par hypersensibilité,inoculées par le virus de la mosaïque du tabac. De même, la forma­

tion de nécroses bloquantes sous l'action du TEPA chez des feuillesde tomate inoculées par le P. capsici peut être diminuée voire an­

nulée par l'application d'AOA ou de glyphosate (Fettouche et al.

1981, Fettouche 1982).

- 151 -

3.2.2. Stimulation de la résistance

3.2.2.1. Par le TEPA

Reproduisant les expériences antérieures sur feuilles de

tomate en survie (Vo Thi Hai et al. 1979, Bompeix et al. 1980,

Fettouche 1982, Guest et Bompeix 1983) inoculées avec le P. para­

sitiaa nous avons analysé par chromatographie en C.L.H.P. la nature

de la stimulation des réactions de défense provoquée par le TEPA.

Ainsi, nous décelons un léger accroissement des dérivés oxygénés

d'acides gras insaturés - avec l'apparition d'un nouveau pic - et

une forte accumulation d'acides cinnamiques - principalement dans

la zone de l'acide férulique - ainsi que de la fraction H. Les tra­

vaux de Abu Jawdahet Kummert (1981, 1983) concluent à la stimula­

tion par le TEPA de la résistance du haricot à l'agent de l'anthrac­

nose et au virus de la mosaïque de la luzerne. Dans ce dernier cas,

ils décèlent une stimulation des activités péroxydasiques conco­

mitantes d'une réduction de l'infection virale. Il serait impor­

tant de prolonger l'analyse des mécanismes stimulés par le TEPA par

une recherche des lignines de néoformation pour comparer la stimu­

lation de la réaction avec les mécanismes naturels décrits chez le

tabac (Massala et al. 1980), la pomme de terre (Hammerschmidt 1984),

le blé (Ride 1980, Bird et al. 1981, Maule et Ride 1982). Cependant,

les substances diffusibles dont la synthèse est stimulée par l'appli­

cation de TEPA doivent contribuer par deux processus à l'inhibition

du parasite. Selon les études cytologiques de Durand et 'Sallé (1981),

des produits indépendants de la sécrétion lipo-phénolique tuent des

hyphes dans les espaces intercellulaires tandis que la bande osmio­

phile diffusant des vacuoles vers l'espace 'intercellulaire provoque

la mort des filaments à son contact.

3.2.2.2. Par des éliciteurs fongiques

Nous avons comparé chez des feuilles en survie du culti­

var Piéralbo sensible au P. parasitiaa la réaction provoquée par le

TEPA à celle induite par deux éliciteurs fongiques. L,'acide arachi­

donique est l'un des constituants de la fraction élicitrice du

P. infestans (Bostock et al. 1982, Darvill et Albersheim 1984). Il

- 152 -

provoque, sur feuilles en survie de Piéralbo, un blocage de la pro­

gression du P. parasitiaa avec la formation d'une bande brun clair

d'environ 5 mm de large présentant d'importantes analogies avec

celle provoquée par le TEPA dans les mêmes conditions. L'analyse

chromatographique par C.L.H.P. confirme les similitudes, avec toute­

fois une moindre intensité de réaction et vraisemblablement des dif­

férences de proportions des composés phénoliques.

Avec la glucosamine constituant des éliciteurs de Fusarium

soZani (Hadwiger et Beckman 1980, Stoessl 1980, Hadwiger et Loschke

1981), nous obtenons des résultats similaires.

3.3. Comparaison avec d'autres procédés de stimulation

D'après ces résultats convergents, il semble probable que

la modulation de réaction de défense soit non spécifique comme le

font présumer nombre de publications (Keen et Bruegger 1977,,Albersheim et Valent 1978, Kuc 1982, Stoessl 1983, Darvill etAlbersheim 1984). C'est pourquoi, il semble possible de comparer

nos résultats à ceux d'autres essais de stimulation des réactions

de défense chez la tomate. Deux d'entre eux concernent l'augmenta­

tion des teneurs en composés phénoliques par des voies indirectes

(Retig et Chet 1974, Carrasco et al. 1977), un autre l'application

de fongicides et d'acétyl Co A avec modulation de l'activité de la

PAL (Trique 1981). La résistance à la fusariose est accrue parl'apport de catechol ce qui se traduit, chez une variété sensible,

par l'accroissement, dès le premier jour du traitement, des teneurs

en phénols totaux. L'arrosage avec une solution de quinate de sodium

aboutit aux mêmes résultats avec augmentation des esters cinnamiquesde ce produit. Ces travaux confirment les analyses d'évolution d'es­

ters et de glucosides d'acides cinnamiques en réaction à des infec­tions au champ (El Khatib et al. 1974). Il existe ainsi un faisceau

de présomption qui concorde avec nos analyses chromatographiques parC.L.H.P. et tendant à indiquer la contribution, modulable par l'AOA

et par de multiples stimuli, des composés phénoliques aux mécanismes

de résistance.

- 153 -

CONCLUSIONS GENERALES

Notre tentative d'élucidation de la nature des facteurs

de résistance de la tomate à des infections cryptogamiques s'insère

dans un vaste dessein, sans doute à l'échelle de l'importance ali­

mentaire de cette culture et à celle des surfaces cultivées. En deux

décennies, maintes études ont aémontré que la réaction de défense

correspond à plusieurs modifications métaboliques.

D'après nos résultats, il apparait que les processus de

biosynthèse ou les phénomènes d'accumulation de substances inhibi­

trices diffèrent selon les génomes confrontés de l'hOte et des para­

sites fongiques. En outre, plusieurs voies métaboliques sont modi­

fiées en réponse à l'infection. Nos observations réalisées à la fin

de l'élaboration des différentes barrières biochimiques contre le

P. papasitiaa ou le V. aZbo-atpum ne rendent pas compte de la dyna­

mique de la réaction de l'hOte. Nous constatons, par contre, que

s'accumulent différentes substances. Dérivant de la voie de l'acide

shikimique, nous décelons des accroissements importants de teneurs

en composés phénoliques, principalement d'acides cinnamiques mais

aussi de dérivés de l'acide benzoïque. Les stimulations d'activités

métaboliques de la voie de l'acétyl co-enzyme A et de ses dérivés

sont multiples: élaboration de plusieurs sesquiterpènes, de toma­

tine ou de son aglycone, d'esters méthyliques d'acides gras polyéni­

ques et leurs dérivés oxygénés en cours d'identification. Ainsi,

nous vérifions chez la tomate que les barrières opposées à l'infec­

tion, comme chez les autres plantes cultivées, sont multiples.

Selon Stoessl (Zoa. ait.) elles correspondent à six voies métaboli­

ques chez la pomme de terre, presqu'aussi nombreuses chez le tabac,d'après Kuc (Zoa. ait.).

La collaboration établie avec MM. Kunesch et Einhorn, chimis­tes spécialistes des substances naturelles, les études structurales et

les synthèses qu'ils ont effectuées ont permis d'approfondir la

connaissance des substances élaborées par l'hOte face à deux agents

pathogènes. En particulier, apparaît la contribution d'esters méthy­

liques d'acides gras polyéniques et surtout de leurs dérivés oxygé­

nés. Au stade actuel des investigations réalisées par les chimistes,

- 154 -

des deux hypothèses - monoépoxydes ou alcool diénique d'acides gras

insaturés - la seconde semble la plus probable. Dérivant de la même

voie biosynthétique s'accumule aussi un produit qui semble corres­

pondre à un diène diol d'acide gras insaturé. Ces acquisitions dif­

fèrent de celles de wit et al. (Zoa. ait.) qui ont décelé des al­

cools polyacétyléniques dans la confrontation Lyaopersiaum esauZen­

tum - CZadosporium fuZvum. Cependant, nos résultats semblent en con­

cordance avec les observations cytologiques (Lazarovits et Higgins,

Durand Sallé Loa. ait.) concernant plusieurs interactions. Ils expli­

quent en particulier la toxicité des sécrétions lipidiques possédant

aussi une réaction cytochimique de phénols. Il pourrait s'agir d'un

mécanisme général dans le monde végétal - un processus similaire

vient d'être décrit chez le riz en réaction contre le PyriauZaria

orY2ae - susceptible d'être utilisé dans la lutte contre les agents

pathogènes.

Or, nous avons vérifié la possibilité de moduler la réac­

tion de défense soit par l'application d'un inhibiteur de synthèse

des phénylpropanoides soit par un fongicide systémique, peu ou

non toxique pour le P. parasitiaa in vitro, ou par celle d'élici-

teurs fongiques. De la même façon, chez deux cultivars isogéniques,

différant par les allèles de résistances incorporés - de phénotype

Saint Pierre - nous observons par analyse en C.L.H.P. une modulation de

la réaction de défense selon le parasite inoculé.

La plasticité des mécanismes de l'hôte, les possibilités

de modulations ouvrent plusieurs prespectives d'application. Tout

d'abord, par des techniques analytiques simples, il nous parait pos­

sible de déterminer les facteurs qui contribuent à la résistance à

un parasite fongique. Peut-être cette méthode pourrait-elle être

transposée à d'autres interactions, notamment avec le Pseudomonas

soZanaaearum parasite majeur en régions chaudes. D'autre part, les

analyses permettent de déterminer, au stade plantule, le transfert

par hybridation de l'aptitude à élaborer les barrières physiologi­

ques. Certes, l'ensemble de celles-ci n'est pas appréhendé - notam­

ment une partie des synthèses aboutissant aux barrières physiques

et les modifications hormonales -. Cependant, l'expérience prouve

- 155 -

(El Khatib et al.) qu'un certain degré de protection en culture

peut être obtenu par l'association de plusieurs caractères de ré­

sistance. De nos expériences, il semble se dégager l'impression

qu'il existe un tronc commun de réaction concernant le métabolisme

d'acides polyéniques, de terpénoldes et de phénylpropanoldes. Pour

ces derniers, au moins, il apparaît que leur synthèse peut être

stimulée par un fongicide non polluant ou des méthodes simples

d'élicitation jusqu'à un niveau accru de tolérance au P. para8it~aa,

ouvrant ainsi des perspectives d'applications nouvelles.

- 156 -

RESUME

L'étude tend à élucider les structures des phytoalexines

élaborées par le Lyaopersiaum esauZentum en réaction à des infec­

tions cryptogamiques selon les génomes de l'hôte et du parasite

confrontés. Les étapes de recherche et de purification des phyto­

alexines par différentes méthodes chromatographiques et analytiques

sont décrites afin de préciser les causes de dégradation et de che­

vauchements des produits. Seule une partie des résultats des études

structurales et des synthèses chimiques réalisées au laboratoire

des médiateurs chimiques est présentée. La résistance au Phytoph­

thora parasitiaa est associée à la stimulation de synthèse d'au

moins six sesquiterpènes, de composés phénoliques - principalement

des acides cinnamiques - et de dérivés oxygénés d'acides gras poly­

éniques. Parmi ceux-ci prédominent les esters méthyliques des acides

linoléique et linolénique avec soit des monoépoxydes soit des al­

cools diéniques en dérivant. La synthèse de monoépoxydes, de diépo­

xydes et d'alcools diéniques a permis d'une part d'établir in vitro

la toxicité de ces substances d'autre part d'affiner les hypothèses

sur la nature des facteurs de résistance gr4ce à des analyses de

microchimie et des études structurales (laboratoire des médiateurs

chimiques). Une autre substance, présumée correspondre à un diène

diol d'acide gras en C 18 s'avère très toxique in vitro pour le

P. parasitiaa.

Nous avons contrôlé que la modulation de la synthèse ou

de l'accumulation des facteurs de résistance dépend des allèles de

résistance incorporés dans deux cultivars isogéniques de phénotype

Saint Pierre confrontés soit au P. parasitica soit au VertiaiZZium

aZbo-atrum.

De même l'application d'un inhibiteur compétitif de la

phényl alamine ammonia lyase réprime la synthèse des composés phé­

noliques tandis que l'application d'un fongicide systémique, non ou

peu toxique in vitro pour le P. parasitiaa, le tris-o-éthyl phos­

phonate d'aluminium (TEPA) la stimule nettement. Deux éliciteurs

fongiques provoquent une accumulation identique de facteurs de ré­

sistance analysée par chromatographie en phase liquide à haute per­

formance (C.L.H.P.).

- 157 -

Les composés phénoliques, principalement l'acide féruli­

que, les dérivés oxygénés d'acides gras insaturés, la tomatine ou

son aglycone ainsi que la substance indéterminée sont toxiques in

vitpo. L'inhibition du P. papasitiaa peut être décuplée lors de

l'association de ces substances, en particulier des dérivés d'~ci­

des gras polyéniques et de composés phénoliques. La synergie des

inhibiteurs semble stable au cours des étapes aboutissant à l'auto­

lyse des microthalles du P. papasitiaa in vitpo. Des perspectives

d'application, notamment en phytopathologie tropicale, sont envi­

sagées.

MOTS CLES

Lyaopepsiaum esauZentum - phytoalexines - composés phéno­

liques - sesquiterpènes - tomatine - dérivés oxygénés d'acides gras

polyéniques - Phytophthopa papasitiaa - VeptiaiZZium aZbo-atpum ­

Analyses C.L.H.P ••

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

- 158 -

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Abu Jawdah Y., 1981 - Etude de l'effet du phoséthyl aluminium

(Aliette) vis-à-vis de ~'anthracnose du haricot. Parasitica,37, 3-13.

Abu Jawdah Y. and Kummert J., 1983 - Effects of aliette on AMV in­

fection of bean leaves and on the resultant alterations in the

patterns of proteins and peroxidases.

Phytopath. Z., 108, 294-303.

Aist J.R., 1976 - Papillae and related woundplugsof plant cells.Ann. Reviewof Phytopathology, l!, 145-163.

Albersheim P. et Valent B.S., 1978 - Host-pathogen interaction inplants. Plants, when exposed to oligosaccharides of fungal

origin defend themselves by accumuling antibiotics. J. of

Cell Biology, 78, 627-643.

Alibert G., 1973 - Séparation et dosage automatisé des acides phéno­

liques végétaux par chromatographie sur colonne de polyclar

et spectrométrie dans l'ultra-violet. J. Chromatogr., 80,173-185.

Arneson P.A. et Durbin R.D., 1967 - Hydrolysis of tomatine by Sep­

to~ia Zyoope~sioi : a detoxification mechanism. Phytopatho­

logy, 57, 1358-1360.

Arneson P.A. et Durbin R.D., 1968 - Studies on the mode of actionof tomatine as a fungitoxic agent. plant Physiol., 43,683-686.

Bailey J.A. et Mansfield J.W., 1982 - Phytoalexins. Blackie ed.,Londres.

- 159 -

Bailey J.A., Rowell P.M. et Arnold G.M., 1980 - The temporal rela­

tionship between hast cell death, phytoalexin accumulation

and fungal inhibition during hypersensitive reactions of

Pha~eoZuB vuZgariB to CoZZetotriahum Zindemuthianum. Physiol.

Plant. Pathol., ~l, 329-339.

Benz R. et Mc Laughlins, 1983 - The molecular mechanism of action

of the proton ioniphore FCCP (carbonylcyanide p-trifluorome­

thoxyohenylhydrazone). Biophys. J., 41, 381-398.

Bird P.M. et Ride J.P., 1981 - The resistance of wheat to Septoria

nodorum : fungal development in relation to host lignifica­

tion. Physiol. Plant Pathol., ~ (3), 289-299.

Boccas B., 1978 - La reproduction sexuelle chez les Phytophthora.

Thèse de doctorat d'état, université de Paris XI. ISBN:

2 - 7099 - 0542 - 6.

Boisson C. et Lahlou H., 1981 - Polymorphisme intraclonal des sou­

ches marocaines du VertiaiZZium aZbo-atrum Reinke et Berthold,

forme à microsclérotes. C.R. Acad. Sci., série D, 290, 915-918.

Boisson C. et Lahlou H., 1983 - Etude du polymorphisme intraclonal

chez le VertiaiZZium aZbo-atrum, forme à microsclérotes.

III Morphologie et morphogénèse comparée de deux isolats de

phénotype sauvage et de leurs principaux variants. Cano J.

Bot., 61, 188-196.

Bompeix G., Fettouche F. et Saindreman P., 1981. Mode d'action du

phosetyl Al. Phytiatr. - Phytopharm., 30, 257-272.

Bompeix G., Ravisé A., Raynal G., Fettouche F. et Durant M.C., 1980 ­Modalités de l'obtention des nécroses bloquantes sur feuilles

détachées de tomate par l'action du tris-O-éthyl phosphonate

d'aluminium hypothèses sur son mode d'action in vivo. Ann.

Phytopathol., 12 (4), 337-351.

- 160 -

,Bostock R.M., Laine R.A. and Kuc, ~982 - Factors affecting the eli-

citation of sesquiterpenoid phytoalexins accumulation byeicosapentanoic acid and arachidonic acid in potato. Plant

Physiol., 70 (5), ~417-~424.

Brueske C.H. et Dropkin V.H., ~973 - Free phenols and root necrosis

in nematex tomato infected wîth the root-knot nematode.

Phytopathology, 63, 329-334.

Burchert R. et Decedue C.J., 1978 - Simultaneous separation of acidicand basic isoperoxidases in wounded potato tissue by acryla­

mide gel electrophoresis. Plant Physiology, 62, 794-97.

Carrasco A., 1977 - Répercussion d'une stimulation provoquée du con­

tenu phénolique de Lyoopersioon esouLentum. Mill. sur la ré­

sistance à la fusariose. Thèse de doctorat de 3ème cycle ­

Toulouse.

Carrasco A., Boudet A.M. et Marigo G., 1978 - Enhanced resistance of

tomato plants to Fusarium by controlled stimulation of their

natural phenolic production. Physiol. Plant pathol., ~,

225-232.

Carrasco A., Marigo G. et Boudet A.M., 1977 - Induction d'une résis­tance à la fusariose par augmentation du contenu phénolique

chez Lyaopersioum esouLentum. C.R. Acad. Sc., série D, 284,1801-1804.

Coffey M.D. et Wilson U.E., 1983 - An ultrastructural study of thelate-blight fungus Phytophthora infestans and its interaction

with the foliage of two potato cultivars possessing differentlevels of general (field) resistance. Cano J. Bot., ~,

2669-2685.

Conde M., 1984 - Segou - Robert Laffont éditeur.

- 161 -

Danko S.J. et Corden M.E., 198~ - Partial purification of fungitoxic

substances from tomate plants inoculated with Fusarium oxyspo­

rum f. sp. lyaopersiai. Phytopathology, 7~, 104.

Darvill G. et Albersheim P., 1984 - Phytoalexins and their elicitors.

A defense against microbial infection in plants. Ann. Rev.

Plant Physiol., 35, 243-275.

Davet P. et Ravisé A., 1976 - Inhibition du Colletotriahum aoaaodes

(Walbr.) Hugher, du Pyrenoahaeta lyaopersiai Schneider et

Gerlach et de leurs enzymes pectinolytiques par les substances

élaborées chez. quelques LycQpersicon Mill. en réaction a l'in­

fection par le complexe parasitaire des racines. C.R. Acad. Sc.,

série D, 282, 1351-1354.

Defago G., Kern H. et Sedlar C., 1983 - Genetic analysis of tomatine

insensitivity, sterol content and pathogenicity for green

tomate fruits in mutants of Fusarium solani. Physiol. Plant

Pathol., 22, 39-43.

D~ Gier J., Van Echteld C.J.A., Van der Steen A.T.M., Noordam F.C.,

Verkleij A.J. et De Kruljff B., 1982. Lipid organization and

barrier functions of membranes. In Biochemistry and Metabolism

of Plant Lipids (J.F.G.M. Wintermans et P.C.J. Kuifer, eds),

pp. 315-325. Elsevier Biomedical Press, Amsterdam.

Deverall B.J., 1977 - Defence Mechanisms of Plants. Cambridge Univ.

Press, London, 110 p.

De Wit P.J.G.M. et Flach W., 1979 - DifferentiaI accumulation of

phytoalexins in tomate leaves but not in fruits after ino­

culation with virulent and avirulent races of Cladosporium

fulvum. Physiol. Plant Pathol., 15, 257-267.

De Wit P.J.G.M. et Kodde E., 198~ - Induction of polyacetylenic

phytoalexins in Lyaopersiaon esaulentus after inoculation

with Cladosporium fulvum (syn. Fulvis Fulva). Physiol.

Plant Pathol., 18, 143-148.

- 162 -

De Wit P.J.G.M. et Spikman G., ~982 - Evidence for the occurence of

race and cultivar-specific. elicitors of necrosis in intercel­

lular fluids of compatible interactions of Cladosporium

fulvum and tomato. Physiol. Plant Pathol., 2~, 1-~~.

Douglas T. et Paleg L.G., 1974 - Plant growth retardants as inhibi­

tors of sterol synthesis in tobacco seedlings. Plant Physio­

logy, 54, 238-245.

Drysdale R.B. et Langcake P., 1973 - Response of tomato to infection

by Fusarium ozysporum f. Lycopersici. In : R.J.W. Byrde and

c.v. Cutting (eds.), Fungal Pathogenicity and the plantis

response, 423-436. Academic Press, London.

Durand M.C. et Sallé G., 1981 - Effet du tris-O-éthyl phosphonate

d'aluminium sur le couple Lycopersicum esculentum Mill. (Var.

Piéraline)-Phytophthora capsici Léon. Etude cytologique et

cytoch~ique. Agronomie, l, 723-732.

Elgersma D.M., 1978 - Rishitin accumulation in susceptible and resis­

tant tomato cultivars after inoculation with Verticillium

albo-atrum. Communication au 3ème congrès international depathologie végétale, Munich 17 aoQt 1978.

Elgersma D.M., 1980 - Accumulation of rishitin in susceptible and

resistant tomato plants after inoculation with Verticillium

albo-atrum. Physiol. Plant Pathol., ~ (2), 149-153.

Elgersma D.M. et Overeem J.C., 1981 - Identification of a polyace­

tylenic phytoalexin in tomato plants after inoculation with

Verticillium albo-atrum. Neth. J. Plant Pathol., 87, 69-70.

El Khatib A., Aramouni A., Hassan A. et Ravisé A., 1974 - Accumula­

tion de composés phénoliques et de phytoalexines par des va­

riétés de tomate cultivées sur des sols infectés au Liban.

Phytopath. Z., 8~, 23-37.

- 163 -

Elliger C.A., Lundin R.E. et Raddon W.F., 1981 - Caffeyl esters of

glucaric acid in Lyaopersiaon esauLentum leaves. Phytoche­

mistry, 20 (5), 1~33-1134.

Espelie R.E. et Kolattukudy P.E., 1979 - Composition of the aliphatic

components of suberin of the endoder.mal fraction from the

first internode of etiolated Sorghum seedlings. Plant physio­

logy, 63, 433-435.

Esser K. et Kuenen R., 1967 - Genetics of fungi. Springer Verlag

Berlin.

Fettouche F., 1982 - Etude de l'action du tris-o-ethyl phosphonate

d'aluminium dans l'interaction tomate - Phytophthora aapsiai

Léon. Thèse de doctorat de 3ème cycle. Paris VI.

Fettouche F., Ravisé A. et Bompeix G., 1981 - Suppression de la résis­

tance induite - phoséthyl Al - chez la tomate à Phytophthora

aapsiai avec deux inhibiteurs - glyphosate et acide a amino­

oxyacétique. Communication 20e colloque S.F.P. Brest 7-9 Mai

1981.

Fleuriet A. et Macheix J.J., 1980 - Dérivés glucosés des acides

hydroxycinnamiques de la tomate : évolution au cours de la

vie du fruit et formation in vitro. Phytochemistry, ~,

1955-1958.

Fleuriet A. et Macheix J.J., 1981 - Quinyl esters and glucose deri­

vatives of hydroxycinnamic acids during growth and ripening

of tomato fruit. Phytochemistry, ~ (4), 667-671.

Folin O. et Ciocalteu V., 1927 - On tyrosine and tryptophane deter­

mination in proteins. J. Biol. Chem., 73, 627-650.

- 164 -

Fontaine T.D., Irving G.W., Ma R.M., Poole J.B. et Doolittle S.P.,1948 - Isolation and partial characterization of crystalline

tomatine, an antibiotic agent from the tomato plant. Archives

of Biochemistry, 18, 467-475.

Fraile A., Garcia-Arenal F., Garcia-Serrano J.J. et Sagasta E.M.,

1982 - Toxicity of phaseollin, phaseollinisoflavan and

kievitone to Botrytis ainerea. Phytopath. Z., 105, 161-169.

Friend J., 1976 - Lignification in infected tissue. In Biochemical

aspects of plant-parasite relationship. J. Friend et

D.R. Threlfall. Academie Press London.

Friend J., 1981 - Plant phenolics, lignification and plant disease.

Prog. Phytochem., ~, 197-261.

Friend J., Reynolds S.B. et Aveyard A., 1973 - Phenylalanine ammo­nialyase, chlorogenic acide and lignin in potato tuber tissue

inoculated with Phytophthora infestans. Physiol. Plant. pathol.,

l, 497-507.

Galanos D.S. et Kapoulos V.L., 1962 - Lipids extraction from natural

juices. J. Lipid.Res., l, 134-137.

Garcia-Arenal Fo, Fraile A. et Sagasta E.M., 1978 - The multiplephytoalexin response of bean (PhaseoZu8 vuZgaris) to infection

by Botrytis ainerea. Physiological Plant Pathology, !l,151-156.

Glazener J.A., 1982 - Accumulation of phenolic compounds in cells andformation of lignin-like polymers in cell walls of young tomatofruits after inoculation with Botrytis ainerea. Physiol. Plant

pathol., 20,11-25.

Gottlieb D., 1943 - Expressed sap of tomato plants in relation towilt resistance. Phytopathology, 33, 111~-1117.

- 165 -

Guest D.I. et Bompeix G., 1983 - Fosetyl-AI as a tool in understand­

ing the resistant response in plants. Communication au 4e

congrès international de phytopathologie. Melbourne 16 Aoat

1983.

Hachler H. et Hohl H.R., 1984 - Temporal and spatial distribution

pa~terns of collar and papillae wall appositions in resistant

and $usceptible tuber tissue of Solanum tuberosum infected by

Phytophthora infestans. Physiol. Plant Pathol., 24, 107-118.

Hadwiger L.A. and Loschke D.C., 1981 - Molecular communication in host

parasite interaction : Hexosamines polymers (chitosan) as regu­

lators compounds in race-specifie and other interaction.

Phytopathology, Il, 756-762.

Hammerschlag F. et Mace M.E., 1975 - Antifungal activity of extracts

from Fusarium wilt-susceptible and resistant tomato plants.

Phytopathology, 65, 93-94.

Hammerschmidt R., 1980 - Lignification and related phenolic metabolism

in the induced systemic resistance of cucumber to Colletotriahum

lagenarium and Cladosporium auaumerinum. ph. D. Dissertation,

University of Kentucky, Lexington.

Hammerschmidt R., 1984 - Rapid deposition of lignin in potato tuber

tissue a~ a response to fungi non-pathogenic on potato. Physiol.

Plant Pathol., 24 (1), 33-42.

,Hammerschmidt R. et Kuc J., 1982 - Lignification as a mechanism for

induced systemic resistance in cucumber. Physiol. Plant.

Pathol., 20, 61-71.

Hillis W.E. et Ishikura N., 1968 - The chromatographie and spectral

properties of stilbene derivatives. J. Chromatogr., ~,

323-336.

Hunt G.M. et Baker E.A., 1980 - Phenolic constituents of tomate fruit

cuticles. Phytochemistry, 19, 14~5-1419.

- 166 -

Hutson R.A. et Smith I.M., 1980 - Phytoalexins and tyloses in tomate

cultivars infected with Fusarium ozysporum f. sp. Zyaopersiai

or VertiaiZZium aZbo-atrum. Physiol. Plant Pathol., 17,

245-257.

Hutson R.A. et Smith I.M., 1983 - The response of tomate seedling

roots to infection by VertiaiZZium aZbo-atrum or Fusarium

o~ysporum f. sp. Zyaopersiai. Ann. appl. Biol., 102, 89-97.

Ishiguri Y., Tomiyama K., Murai A., Katsui N. et Masamune T., 1978 ­

Toxicity of rishitin, rishitin - M.1 and rishitin - M.2 to

Phytophthora infestans and potato tissue. Ann. Phytopath. Soc.

Japan, 44, 52-56.

James J.T et Morris w. , 1964 - New biochemical separations. Van

Nostrand editr , Londres.

Kaan F. et Laterrot H., 1977 - Mise en évidence de la relation entre

des résistances de la tomate à deux maladies vasculaires : le

flétrissement bactérien et la fusariose pathotype 2. Ann.

AIDél. Plantes, 27, 25-34.

Kanazawa K., Danno G. et Natake M., 1983 - Sorne analytical observa­

tions of autoxydation products of linoleic acid and their

thiobarbituric acid reactive substances. Agric. Biol. Chem.,47 (9),2035-2043.

Kato T., Yamaguchi Y., Uyehara T., Yokoyama T., Namai T. et

Yamanaka S., 1983 - Self defensive substances in rice plant

against rice blast disease. Tetrahedron Letters, 24 (43),4715-4718.

Keen N.T. et Bruegger B., 1977 - Phytoalexins and chemicals that

elicit their production in plants. In Host Plant Resistance

to Pests, Hedin P.A. éd., A.C.S. Symposium series, ~, 1-26.

- 167 -

Kern H., 1952 - Uber die Beziehungen zwischen dem Alkaloidgehalt

verschiedener Tomatensorten und ihrer resistenz gegen

Fusapium Lyaopepsiai. Phytopath. Z., 19, 351-382.

Kern H., 1984 - Preformed biochemical resistance factors in higher

plants. Comm-nication au 4e congrès de la fédération des

sociétés européennes de physiologie végétale, Strasbourg

3 ao~t 1984.

Ki Zerbo J., 1972 - Histoire de l'Afrique noire. Hatier éditeur.

Kollatukudy P.E., 1977 - Biosynthesis and degradation of lipid poly­

mers. In : Lipids and lipid polymers in higher plants (Ed. by

M. Tevini et H.K. Lichtenthaler). Springer-Verlag. Berlin.

Kunoh H., Takamatsu S. et Ishizaki H., 1978 - Cytological studies of

early stages of powdery mildew in bailey and wheat.

III. Distributions of residual calcium and silicon in germi­

nated conidia of Epysiphe gpaminis hopdei. Physiol. Plant

Pathol., !l (3), 319-325.

Kunoh H., Tsuzuki T. et Ishizaki H., 1978 - Cytological studies of

early stages of powdery mildew in bailey and wheat.

IV. Direct ingress from superficial primary germ tubes and

appressoria of Epysiphe gpaminis hopdei on bailey leaves.

Physiol. Plant Pathol., 13 (3), 327-333.

Krebs H.A., Wiggins D., Stubb M., Sols A. et Bedoya F., 1983 - Studies

on the mechanism of the antifungal action of benzoate. Bioehm.

J. 214, 657-663.

,Kuc J., 1972 - Phytoalexins. Ann. Rev. Phytopath., 10, 207-232.

,Kuc J., 1982 - Induced ~unity to plant disease. Bioscience, 32,

854-860.

,Kuc J., 1983 - Induced systemic resistance in plants to diseases

caused by fungi and bacteria. In : The dynamics of host defenee

(Ed. by J.A. Bailey et B.J. Deverall). Academie Press. London.

- 168 -

Langcake P., Drysdale R.B. et Smith H., 1972 - Post-infectional pro­duction of an inhibitor of Fusarium ozysporum f. Zyaopersiai

by tomato plants. Physiol. Plant Pathol.,~, 17-25.

Lazarovits G. 'et Higgins V.G., 1976a - Histological comparison of

CZadosporium fuZvum race 1 on ~une, resistant, and suscep­tible tomato varieties. Cano Journal of Bot., 54, 224-234.

Lazarovits G. et Higgins V.G., 1976b - Ultrastructure of susceptible,resistant, and ~une reactions of tomato to races of CZados­

porium fuZvum. Cano Journal of Bot., 54, 235-249.

Le Baut G., Sparfel L., Claire C., Floc'h R., Ducrey P., Benazet F.,

Lacroix L. et Leroy J.L., 1983 - Dérivés modifiés de l'acidehexadiène - 2,4 oïque - (2E, 4E) à activités antifongique et

bactériostique potentielles. Eur. J. Med. Chem., 18 (5),447-455.

Lewis F.O., Oxman J.O. et Huffman J.C., 1984 - Photodimerization of

lew1s acid complexes of cinnamate esters in solution and thesolid ·state. J. Am. Chem. Soc., ~, 466-468.

Massala R., Legrand M. et Fritig B., 1980 - Effect of a-aminooxyacetate,

a competitive inhibitor of phenylalanine ammonia-Iyase, on the

hypersensitive resistance of tobacco to tobacco mosaic virus.Physiol. Plant Pathol., 16, 213-226.

Massala R., 1981 - Utilisation d'inhibiteurs compétitifs de la phényl­alanine ammoniac-Iyase en pathologie végétale. Thèse de doctorat

d'état, Université Louis Pasteur, Strasbourg.

Matta A., Abbattista-Gentile l. et Giai l., 1967 - Variazioni deIcontenuto in ferroli solubili indotte dal Fusarium oxysporum f.

Lyaopersiai in piante di pomodoro suscettibili e resistenti.

Annali. Fac. Sci. agr. Univ. Torino, !, 17-32.

- 169 -

Matta A., Gentile l. et Giai l., 1969 - Accumulation of phenols in

tomate plants infected by different forms of Fusarium ozysporum.

Phytopathology, 59, 512-513.

Maule A.J. et Ride J.P., 1982 - Ultrastructure and autoradiography of

lignifying cells in wheat leaves wounded-inoculated with Botrytis

ainerea. Physiol. Plant Pathol., 20, 223-233.

McCance D.J. et Drysdale R.B., 1975 - Production of tomatine and

rishitin in tomate plants inoculated with Fusarium oxysporum f.sp. Zyaopersiai. Physiol. Plant Pathol., 7, 221-230.

Moede J., 1983 - Wasserdampffüchtige stoffwechselprodukte aus

kartoffelpflanzen mit antimykotischer wirkung.

Naturwissenschaften, 70, 258-259.

Mohanakumaran N., Gilbert J.C. et Buddenhagen l.W., 1969 - Relation­

ship between tomatine and bacterial wilt resistance in tomato.

Phytopathology, 59, 14-19.

Newby V.K., Sablon R.M., Synge R.L.M., Casteele K.V. et Van Sumere C.F.,

1980 - Free and bound phenolic acids of Lucerne (Mediaago sativa

C.V. Europe). Phytochemistry, ~, 651-657.

Oesch F., 1973 - Mamalian epoxide hydrases : inducible enzymes cata­

lysing the inactivation of carcinogenic and cytotoxic metabo­

lites derived from aromatic and olefinic compounds.

Xenobiotica, ~, 305-340.

Ohguchi T. et Asada Y., 1975 - Dehydrogenation polymerization products

of p. hydroxycinnamyl alcohols by isoperoxydases obtained from

downy mildew infected roots of Japanese radish (Raphanus sativus)

Physiol. Plant Pathol., ~, 1771-1784.

Pecaut P. et Laterrot H., 1966 - Perspectives sur la sélection de

variétés de tomate résistantes aux maladies. Genetica agraria,

20, 110-120.

- 170 -

Pollock C.J. et Drysdale R.B., 1976 - The rôle of phenolic compounds

in the resistance of tomato cultivars to VeptiailZium albo­

atpum. Phytopath. Z., 86, 56-66.

Quarmby J., 1968 - Chromatographie separation of flavonolds on polyclar.

J. Chromatog., 34, 52 - 55.

Randerath K., 1964 - Chromatographie sur couches minces. Edition fran­

çaise Gauthier - Villars, Paris

Ravisé A., 1966 - Observations sur la reproduction sexuée de souches

de Phytophthopa palmivopa (Butl.) Butl. parasites de cultures

tropicales. Cah. O.R.S.T.O.M., Sér. biologie, ~' 93-104.

Ravisé A., 1970 - Etude comparative des aptitudes parasitaires de sou­

ches de Phytophthopa parasites de cultures tropicales. Agron.

Trop., 25, 1015-1031.

Ravisé A., 1972 - Observations sur la nutrition de souches de Phytoph­

thopa de Bary parasites de cultures tropicales. Ag~on. Trop.,

27, 309-320.

Ravisé A. et Boccas B., 1969 - Première liste annotée des pythiacées

parasites des plantes cultivées au Congo - Cahier Maboké, 1,41-69.j

Ravisé A., Bompeix G., Fettouche F. et Durand M.C., 1981 - Stimulation

des réactions de défense de la tomate aux Phytophthopa sp. par

le tris-O-éthyl phosphonate d'aluminium. Communication au Con­

grès international de protection des cultures tropicales, Lyon.

Ravisé A. et Chopin J., 1981 - Influence de la structure de composés

phénoliques sur l'inhibition du Phytophthopa papasitiaa et

d'enzymes participant aux processus parasitaires. Phytopath. Z.,

100, 257-269.

- 171 -

Ravisé A. et Kirkiacharian B.S., ~976 - Effects of the structure of

phenolic compounds on the inhibition of Phytophthora parasi­

tica and on lytic enzymes. Phytopath. Z., 85, 74-85.

Ravisé A., Kirkiacharian B.S., Chopin J. et Kunesch G., 1980 - composés

phénoliques et analogues structuraux de phytoalexines : influ­

ence des structures et des substituants sur l'inhibition in

vitro de micromycétes et d'enzymes lytiques. Ann. Photopathol.,

12, 335-336.

Ravisé A. et Tanguy J., 1971 - Relations entre les constituants phéno­

liques de divers Lycopersiaum Mill. et leur résistance à plu­

sieurs espèces de Phytophthora de Bary. C.R. Acad. Sc., 272,

1252-1255.

Ravisé A. et Trique B., 1972a - Réactions de plantules de Gossypium L.

au parasitisme de Phytophthora de By. tropicaux. Propriétés de

composés phénoliques élaborés par des plantules de Gossypium L.

et de Lycopersicum Mill. Coton et fibres tropicales, XXVII,

295-310.

Ravisé A. et Trique B., 1972b - Réactions phénoliques et production de

phytoalexine chez des plantules de Lycopersicum Mill. infectées

par des souches de Phytophthora de Bary. C.R. Acad. Sc., 274,

1505-1508.

Raynal G., Ravisé A. et Bompeix G., 1980 - Action du tris-O-ethyl

phosphonate d'aluminium sur la pathogénie de PZasmopara viticoZa

et sur la stimulation des réactions de défense de la vigne.

Ann. Phytopathol., 12, 163-174.

Reid W.W., 1968 - Accumulation of squalène 2,3 oxide during inhibition

of phytostérol biosynthesis in Nicotania tabacum. Phytochemistry,

l, 451-452.

Retig N. et Chet I., ~974 - Catechol-induced resistance of tomato plants

of Fusarium wilt. Physiol. Plant Pathol. !, 469-475.

- 172 -

Rick C.M., 1978 - La tomate. Pour la Science, 12, 76-86.

Ride J.P., 1980 - The effect of induced lignification on the resis­

tance of wheat cell walls to fungal degradation. Physiol. Plant

Pathol., 16, 187-196.

Riou S. et Ravisé A., 1970 - Etude des chlamydospores chez quelques

espêces de Phytophthora de Bary. Cahier Maboké, ~, 93-106.

Robb J., Brisson J.D., Busch L. et Lu B.C., 1978 - Ultrastructure of

wilt syndrome coused by VertiaiZZium dahZiae. V : Attempted

localization of phenolic compounds in the vascular region. Cano

J. Bot. ~, 2594-2612.

Roddick J.G., 1974 - The steroidal glycoalkaloid tomatine. Phyto­

chemistry, 13, 9-25.

Roddick J.G., 1976 - Intracellular distribution of the steroidal ~ly­

coalkaloid ~-tomatine in Lyaopersiaon esauZentum fruit. Phyto­

chemistry, ~, 475-477.

Roddick J.G., 1978 - Effect of ~-tomatine on the integrity and bio­chemical activities of isolated plant cell organelles. J. of

Exp. Bot. 29 (113), 1371-1381.

Shimura M., Iwata M., Tashiz;o N., Sekizawa Y., Suzuki Y., Mase S. et

Watanabe T., 1981 - Anti-conidial germination factors induced in

the presence of probenazole in infected host leaves. l - Isola­tion an~ properties of 4 actives substances. Agric. Biol. Chem.45 (6), 1431-1435.

Stahl E., 1969 - Thin-Layer chromatography. Edition anglaise, SpringerNew York

stoessl A., Unwin C.H. et Ward E.W.B., 1973 - Post-infectional inhibi­

tors from plants : fungal oxidation of capsidiol in pepper fruit.Phytopathology, 63, 1225-1231.

- 173 -

Stoessl A., Stothers J.G. et Ward E.W.B., 1976 - Sesquiterpenold

stress compounds of the Solanoaceae. Phytochemistry, 15,

835-872.

Stoessl A., 1980 - Phytoalexins, a biogenetic perspective. Phytopath.,

Z., ~, 251-272.

Stoessl A., 1982 - Biosynthesis of phytoalexins. In phytoalexins J.A.

Bailey et J.W. Mansfield edit. - Halsted Wiley, New York.

Stoessl A., 1983 - Secondary plant metabolites in preinfectional and

posinfectionalresistance in the dynamics of host defense (Eds.Bailey J.A. and Deverall B.J.), Academie Press London.

Sugai T. et Mori K., 1984 - Both enautiomers of 8-hydroxy-hexadecanoic

acid inhibit the spore germination of Lygodium japoniaum. Agric.

Biol. Chem., 48 (8), 2155-2156.

Tanguy J., 1970 - Quelques aspects du métabolisme des composés phéno­

liques chez les Niaotiana hypersensibles au virus de la mosalque

du tabac, souche commune. Thèse de ~octorat es Sciences. Paris.

Theodorou M.K., Scanlon J.C.M. et Smith I.M., 1982 - Infection and

phytoalexin accumulation in french bean leaves injected with

spores of CoZZetotriahum Zindemuthianum. Phytopath. Z., 103,

189-197.

Tippett J.T., O'Brien T.P. et Holland A.A., 1977 - Ultrastructural

changes in Eucalypt roots caused by Phytophthora ainnamomi.

Physiol. Plant Pathol., !l (3), 279-286.

Tjamos E.C. et Smith I.M., 1974 - The rôle of phytoalexins in the

resistance of tomato to VertiaiZZium wilt. Physiol. Plant

Pathol. !, 249-259.

Tjamos E.C. et Smith I.M., 1975 - The expression of resistance to

VertiaiZZium aZbo-atrum in monogenically resistant tomate

varieties. Physiol. plant Pathol., ~, 215-225.

- 174 -

Trique B., 1975 - Elaboration de Phytoalexines fluorescentes chez le

Lyaopepsiaum esculentum L. en réponse à l'infection par les

Phytophthopa palmivopa, Butl. et P. papasitica. Dastur. Phyto­

path. Z., 83,1-9.

Trique B., 1977 - Réactions biochimiques des fruits isolés de Lyaopep­

sicum esaulentum Mill., infectés expérimentalement par le Phyto­

phtopa niaotianae var. papasitiaa. C.R. Acad. Sc., 284,

1533-1536.

Trique B., 1981 - Interactions métaboliques précoses dans quelques

relations parasitaires Lycopepsicon-Phytophthopa. Thèse de doc­

torat es Sciences, Brest, 106 p.

Typas M.A. et Heale J.B., 1976 - Heterokaryosis and the rôle of cyto­

plasmic inheritance in dark resting structure formation in

Veptiaillium sp. Mol. gen. genet. 146, 17-26.

Vo Thi Hai, Bompeix G. et Ravisé A., 1979 - Rôle du tris-O-éthyl phos­

phonate d'aluminium dans la stimulation des réactions de défense

des tissus de tomate contre le Phytophthopa aapsiai. C.R. Acad.

Sc., 288, 1171-1174.

Ward E.W.B., Unwin C.B., Bill J. et Stoessl A., 1975 - Sesquiterpenoid

phytoalexins from fruits of Eggplants. Phytopathology, 65 (8),

859-863.

Whitmore F.W., 1976 - Binding of ferulic acid to cell walls by peroxi­

dases of Pinus elliottii. Phytochemistry, 15, 375-378.