Rôle du laboratoire de bactériologie dans le diagnostic des IOA du prélèvement … aux techniques moléculaires

Frédéric

LAURENT

Laboratoire

de Bactériologie

-

Hôpital

de la Croix Rousse

CNR des Staphylocoques

INSERM 851 –

Equipe

"Pathogénie

des Staphylocoques"

Trois acteurs majeurs dans la prise en charge bactériologique des IOA

Chirurgien orthopédiste / Pédiatre/ RhumatologueEvacuer

/ Nettoyer

Prélever

Microbiologiste

DétecterIdentifierMesurer la sensibilité

aux antibiotiques

Antibiothérapeute

Interpréter Choisir de l’antibiothérapie optimale

Points critiques pour le microbiologiste

•

Gestion des prélèvements

•

Conditions / Délais de cultures

•

Détection et identification de variants ou de souches différentes

•

Interprétation et rendu clair et cohérent des résultats qui puissent aider à

la décision thérapeutique

Difficultés rencontrées avec les IOA par le bactériologiste

•

Bactéries IOA = +/-

bactéries

de la flore cutanée

•

Infections plurimicrobiennes

•

Bactéries fragiles

•

Bactéries physiologiquement peu actives•

Antibiothérapie préalable au prélèvement

•

Bactéries cachées–

intracellulaires

–

biofilm

•

Bactéries normale (IOA aiguë) vs bactéries stressées (IOA chronique)

Contamination ou pas ?

Gestion des prélèvements +++

Cultures longuesMilieux richesMultiplicité

des milieux

Traitement adéquat des prélèvements

Expression phénotypique variée

Gestion des prélèvements

Eviter

toute contamination

Bactéries IOA = +/- bactéries de la flore cutanée

. nature du prélèvement. fistule, trajet de fistule = Se et Sp

médiocre

. biopsies tissulaires, pus, tissus per-op, liquide articulaire, synoviale, …

+++

. post-prélèvement. pots ou tubes secs stériles / seringue sans

aiguilles et closes

. Hotte PSM, gants stériles, matériel stérile et ou à

usage unique

Ensemencer dans les meilleurs délais

Bactéries fragiles

. transport rapide (<4 heures) / Portagerm®

ou équivalent / ensemencement au bloc ?. prévenir si arrivée tardive au laboratoire

Sélectionner les prélèvements …

pour IOA sur prothèseni trop

... ni trop peu

-

↑

risque contamination-

pb

gestion au laboratoire

. 15 minutes/prelts/technicienne

. matériel pour broyage

. identification/localisation-

taux positifs = critère d’interprétation

Spe

1+ / 5 à

7 prelts

26%2+ / 5 à

7 prelts

53%

3+ / 5 à

7 prelts

85%

Altweg, JSJB, 2003

Gestion des prélèvements

+ identification du patient, du service, du prescripteur, du prélèvement

Examen direct

Permettre éventuellement une orientation diagnostic rapide

. présence de bactéries et morphologie (sensibilité

faible) Gram, Ziehl, auramine

. présence d’une réaction cellulaire signant une infectioncoloration MGG : PNN, macrophagesNumération des éléments et formule pour liquide articulaire

Liquide articulaire sans prothèse

< 1 000 GB 5 000 - 60 000 GB/mm3 100 000 GB

< 20% PNN 50% PNN 60-80% PNN > 90%PNN > 90% PNN

Arthrose P R Cristaux Réactionnelle Cristaux Infection

Trauma Lupus Chlamydia, Yersinia, Salmonelle, Shigelle, Campylo, Neisseria,

Lyme………PCR

Infection

Algodystrophie Psoriasis

Mécanique Inflammatoire +/-

septique Septique

Mathews, Ann. Rheum

Dis., 2007

Examen direct

Permettre éventuellement une orientation diagnostic rapide

. présence de bactéries (sensibilité

faible) et morphologie Gram, Ziehl

, auramine

. présence d’une réaction cellulaire signant une infectionMGG (PNN, macrophages)Numération des éléments et formule pour liquide articulaire

Liquide articuliare

avec prothèse

Infection sur PTG Sensibilité Spécificité

GB > 1700 / mm3 94% 88%

PNN > 65% 97% 98%

** Trampuz, Am

J Med

, 2004sensibilité

= vrais (+), spécificité

= vrais (-)

Mise en culturePrésence de bactéries ? Lesquelles ? Quels sont les antibiotiques actifs ?

X 2940

Mise en culture

4 hDébut de fabrication du "slime

"

8 h La surface du matériel est recouverte par une couche épaisse de "slime"

24 hDes bactéries émergent du biofilm, libres et prêtes à

se fixer ailleurs

OlsonOlson, et , et alal. J. . J. BiomedBiomed

Mater Mater ResRes

19881988

2 hFixation des S. aureus

sur des irrégularités à

la surface du matériel

Bactéries IOA = +/-

biofilm

/ intracellulaire

Présence de bactéries ? Lesquelles ? Quels sont les antibiotiques actifs ?

Cocci au fond d'une cassure d'une couche épaisse de biofilm d'un séquestre infecté

Evans et al., Clin Orthop. 1998, 243-249

X 2940

COCCI

Mise en cultureBactéries IOA = +/-

biofilm

/ intracellulaire

Mise en cultureBactéries IOA = +/-

biofilm

/ intracellulaire

Bactéries (points noirs) internalisées dans les ostéocytes entourés par des lamelles osseuses.

(Internalization

of S. aureus by osteoblasts

in a patient with

long term

recurrent

osteomyelitis

JBJS 2005)

X 1000

Mise en culture

Bactéries IOA = biofilm

/ intracellulaire

Bactéries IOA = très diverses

donc des bactéries aérobiesdes bactéries anaérobiesdes bactéries à

croissance rapide / lente

des bactéries classiques / des bactéries exigeantes/non cultivables

donc des bactéries cachées, engluées et adhérentesdes bactéries stresséesdes bactéries physiologiquement peu actives

Mise en culture

Recommandation Référentiel de Microbiologie REMIC 2007

–

Broyage avant ensemencement (merci de nous adresser des morceaux pas trop gros !!!)

. mortier/pilon, broyeur à

billes, …. sonication

(Trampuz, 2007 NEJM)

–

Cultures . prolongées

au moins 10 jours. en aérobiose et anaérobiose . sur géloses riches

sang et chocolat isovitalex

/ J1-J10. en bouillons d’enrichissement

J10 à

J21repiquage systématique des bouillons même si clairs +++

. en bouillons d’hémoculture pour liquides articulaires

+ recherche de mycobactéries pas systématique mais y penser (surtout si négatif)

Mise en culture

•

Gélose Sang aérobie + gélose chocolat CO2

(lecture à

J2)•

Gélose Sang anaérobie + gélose chocolat CO2

(lecture à

J10)•

Bouillon liquide (lecture jusqu’à

J21)

+ repiquage sytématique:. gélose sang anaérobie + gélose chocolat lecture CO2

. lecture

48h

Diagnostic bactériologiqueInfections aiguës à

espèces classiques

Bactéries " normales " • facile• ED +• réaction cellulaire ++• culture rapide

Infections chroniquesBactéries "stressées"

• ED –• Peu de PNN• culture lente >> 48 heures• populations d'aspects différents• perturbation de l'activité

des ATB

• antibiogrammes différents Staphylocoques à

coagulase

négative

S. aureus

J2J10

J2

J10

Interprétatation

des cultures

J2

J10

Interprétation des cultures

ou culture uniquement en bouillon liquide (sachant qu’un seul cocci ou un seul bacille suffit à positiver)

PolymorphismePolymicrobismeContamination

????

Aide : caractères biochimiques (galerie), génétique éventt

Interprétation des cultures

Infection polymicrobienne (>15% des cas)

•

Rare (1 colonie) Staphylococcus aureus culture positive en 24h

•

Quelques colonies de Staphylocoque à

coagulase

négative à

J4

•

Nombreuses petites colonies de P. acnes à J10

Interprétation des cultures

Souches Témoin

Electrophorèse Champs pulsés

Péni R

Genta S Genta R

Peflo S Peflo R Peflo I

Rif S Rif I Rif R

Fosfo S Fosfo I Fosfo S

2 morphologies 2 morphologies1 morphologie

Variation phénotypique de la morphologie et de la résistance

d ’un même S. aureus

Interprétation des cultures

Interprétation des cultures

Variants microcolonies

ou SCV "Small Colony

Variants"Faciles à

méconnaître :

•

décrits pour beaucoup d’espèces bactériennes (os, mucoviscidose)•

croissance lente

et culture retardée

•

colonies de petite taille•

perte pigmentation, perte d’hémolyse

•

auxotrophisme

(Hémine, Thymidine, ménadione...)•

métabolisme de l

’ATP profondément perturbé

•

forme de résistance des bactéries ?

Variants microcolonies

ou SCV

Même souche (génétiquement)En bas : normaleEn haut SCV

SCV

Particularités des micro-colonies in vitro:. adhérence +++. tps de génération (doublement) x 10. perte de l

’activité

bactéricide de certains ATB

. persistance des bactéries dans des niches cellulaires protectrices (Cellules endothéliales des vaisseaux, ostéoblastes, …)….

. peu de réaction inflammatoire locale

. à

l’origine d’échec thérapeutique

Infection polymicrobienne Infection chronique depuis 8 ans, PTH 4 changée fois

Cotyle et synoviale gauche (4 prélèvements):•

S. aureus : Péni R, S à

tout

•

S. epidermidis multi R

Fémur gauche (4 prélèvements) •

S. aureus : Péni R, S à

tout

•

S. epidermidis : 3 antibiogrammes différents (oxa

S/R, Genta

S/R, Ery

S/R, Fosfo S/R, Pef S/R, Rif S/R)

•

S. warneri : 2 antibiogrammes différents

Culture et identification

•

Isoler tous les aspects avec au moins:–

identification et antibiogramme sur les colonies différentes

–

sur au moins deux prélèvements différents (si possible)

Staphylocoques :. recherche systématique du gène mecA

(meti-R) ? (recommandations

CA-SFM). CMI Vanco

et Teico

systématique ?

•

Rendu des résultats

avec–

pour chaque prélevement

+ :

•

Nombre de milieux + et lesquels•

nombre de colonies / milieu

•

Antibiogramme(s)

–

synthèse type "Anapath"

Que faire des prélèvements restés stériles ?

10 à

50 % des IOA selon les séries et les contextes épidémio-cliniques

•

patient sous antibiotique (arrêt minimum 15 j)

•

prélèvement mal fait

•

transport trop long

•

culture inadéquate

•

bactérie trop fragile

•

espèce particulière et/ou méconnue ou non cultivable

•

mycobactérie

Comment améliorer le diagnostic ?

Un exemple : ostéo-arthrite de l’enfant et Kingella kingae

S. aureus

38K. kingae

25S. Pyogenes

4S. Agalactiae

3S. Pneumoniae

6H. influenzae

2Others

8

1+

Gélose sang12+

Flacon Hémoc

ana24+ Flacon Hémoc

aéro

Bilan Kingella kingaeCulture gélose 1/190Culture gélose + flacon hémoculture 25/190Culture gélose + flacon hémoculture + PCR 54/190

29 + 29 + 60

-

29

K. Kingae

N. meningitidis W13 (1)S. pyogenes (1)S. constellatus (1)S. aureus (1)Streptococcus spp. (1)Enterobacteria

(2)Pseudomonas spp. (1)

8 + 52 -

PCR Universel16SrDNA

89 des 104 prélèvements culture négative

PCR spécifiqueK. kingae

<4 ans >4 ans

190 prélèvements

Positif : 86 Negatif

: 104

Culture

Nouveaux outils

travail encore possible pour l’optimisation de conditions de culture (flacon d’hémoculture) et délais de mise en culture

biologie moléculairerapidité, sensibilité potentielle à optimiser +pas de miracle mais prometteurencore en phase d’évaluationnécessité de coordonner des études prospectives d’évaluation

. de la PCR universelle

. des PCR spécifiques

. des schémas diagnostiques optimisés stratifiés par groupe patients

pour l’instant : à

réserver quand culture –

et suspicion ++

Conclusion

•

Points clés–

gestion des prélèvements

–

conditions de cultures–

travail délicat et difficultés rencontrées

–

résultats échellonnés

parfois longs à

obtenir

•

Nouveaux outils–

amélioration des cultures

–

outils moléculaires

Remerciements

•

Anne-Marie FREYDIERE (CBE, HCL)

•

Sylvestre TIGAUD•

Chantal ROURE-SOBAS

•

Hélène SALORD•

Olivia RAULIN

et …

l’ensemble des techniciennes du laboratoire de la Croix Rousse

•

Bactériologistes du CBE et CBL des HCL

Laboratoire bactériologieCBN, HCL